JP2000513225A - 抗コカイン触媒抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コカインを分解することができる触媒性の抗体およびポリペプチドが開示される。前記触媒性の抗体およびポリペプチドは、その相補性決定領域およびフレームワーク領域のアミノ酸配列を特徴とする。本発明はまた、患者におけるコカイン濃度を低下させるための薬学的組成物および方法を開示する。最後に、本発明は、患者におけるコカインの過剰等よおよび中毒を治療するための薬学的組成物および方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗コカイン触媒抗体 発明の背景 本出願書を通して、様々な出版物が著者名及び発行年により引用される。これ らの出版物の完全な引用は、本明細書の末尾に、配列表および請求項の直ぐ前に アルファベット順で列挙される。これら刊行物の開示は全体として、ここに開示 され且つ特許請求された本発明の時点において当業者に公知の技術の状態をより 完全に既述するために、本明細書の一部をなす参照して本願に組み込まれる。 触媒抗体類はコカイン嗜癖及び過量投与を治療する独創的な可能性を有してい る。コカインは中辺縁皮質の(mesolimbocortical)「報酬経路(reward pathway)」 において、ドーパミンの再取込み輸送体を阻害することにより(１)、その投与効 果を増強する。コカインに対する拮抗薬は知られていないが(２)、これはおそら く遮断薬をブロックすることの固有の困難さを反映しているものと思われる。受 容体に基づく治療薬の代替物質として、循環する薬剤は、脳におけるコカインの 結合部位へのコカイン供給を遮断することができるであろう(３)。単にコカイン に結合するに過ぎない抗体のような作用物質は、複合体の形成によって化学量論 的に消費されてしまうが、コカインに結合し、これを変化させ、さらに生成物を 遊離させる酵素は、追加の結合のために利用できるであろう。新しい種類の人工 酵素である触媒抗体類は広範囲の多数の反応を誘発することができ、それらの基 質特異性はコカインのような小さな分子に対してプログラムすることが可能であ る(４)。 コカインの解毒は、触媒抗体アプローチにとって特に申し分なく適している。 第１に、コカインのベンゾイルエステルの加水分解は、生物学的に不活性な生成 物であるエクゴニンメチルエステルと安息香酸とを産生する（５）(図１)。血漿 酵素ブチリルコリンエステラーゼは、この反応によってヒトの体内に含まれるコ カイン（６）を不活性化する。第２に、アシル加水分解は全ての抗体触媒変換の 中で最も良く研究されている(７、８)。触媒抗体類について、天然酵素の活性 に近似したエステラーゼ活性のあることが報告されており(７)、ベンゾイルエス テルの大きな疎水性表面は強力な結合及び触媒作用を備えた抗体類を引き出すの に特に申し分なく適している。 以前、コカインを分解する最初の触媒抗体であるMab 3Ｂ9及びMab 6Ａ12が報 告されている(９)。これらの抗体類は、ホスホン酸モノエステル遷移状態近似体 の免疫原性抱合体（ＴＳＡ１）によって誘起された(略図１)。これら最初の人工 コカインエステラーゼ類の速度加速（１０²−１０³）の大きさは、基底状態に対 する遷移状態の相対的な安定化に相応していた(〜Ｋ_m／Ｋ_i)。より強力な触媒機 序及びより高い代謝回転速度を備えた触媒抗体類を産生することは可能で、臨床 適用にはそれが必要であると判断されている。活性の増大は、ハイブリドーマ作 成の繰返し又は既存の触媒抗体の突然変異誘発を通して達成することができる。 しかし、Mab 3Ｂ9及びMab 6Ａ12の可変ドメインの配列決定によって、相補性決 定領域で９３％の相同性が明らかになった(下記参照)。触媒抗体類についてのこ のような多様性の欠如は以前から言及されており(１０)、特定クラスの相同性触 媒抗体類の望ましい活性への最適化は成功しない可能性があるので、活性を向上 させる機会を制限している。近似体のコア構造を弱体化させずにこの問題を解決 できる方法は、輸送タンパク質へ付着させることによって、近似体の表面を接近 不能になるように変化させ、それによって免疫認識のための別個のエピトープ類 を提供することであろう。 今回は、同一のホスホネート置換基を備えているが、免疫抱合体の構造が異な るコカイン加水分解の３種の近似体の合成について報告する。これらの近似体に よって誘起された触媒抗体類の速度論的及び構造的多様性が特徴付けられた。さ らに変異原性試験のための好ましい触媒抗体類が同定された。 発明の概要 特定アミノ酸を表示するために、本明細書を通して下記の標準略号が使用され る： Ｅはグルタミン酸を表す。 Ｓはセリンを表す。 Ｒはアルギニンを表す。 Ｇはグリシンを表す。 Ｔはトレオニンを表す。 Ｉはイソロイシンを表す。 Ｎはアスパラギンを表す。 Ｙはチロシンを表す。 Ｃはシステインを表す。 Ｐはプロリンを表す。 Ｌはロイシンを表す。 Ｗはトリプトファンを表す。 Ｈはヒスチジンを表す。 Ｄはアスパラギン酸を表す。 Ｆはフェニルアラニンを表す。 Ｑはグルタミンを表す。 Ｖはバリンを表す。 Ｋはリシンを表す。 Ｍはメチオニンを表す。 Ａはアラニンを表す。 Ｘは何れかのアミノ酸を表す。 本発明は、Ｘが何れかのアミノ酸であり得るときに、相補性決定領域１のアミ ノ酸配列がＲＳＳＸＧＴＩＴＸＸＮＹＡＮ（配列番号：７３）であり、相補性決 定領域２のアミノ酸配列がＸＮＮＹＲＰＰ（配列番号：７４）であり、相補性決 定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号：７５）であるＬ鎖（ 軽鎖）と、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配列番号：７６）で あり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＤＰＸＮＧＸＸＦＹＮＱＫＦＸＧ (配列番号：７８)であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＸ（ 配列番号：７８）であるＨ鎖（重鎖）とを含有していることを特徴とする、コカ インを分解できる触媒抗体を提供する。 本発明はさらに、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＳＧＴＩＴＡＮＮ ＹＧＳ（配列番号：４０）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＶＳＮＮ ＲＧＰ（配列番号：４１）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＮ ＳＮＨＦＶ（配列番号：４２）であるＬ鎖と、相補性決定領域１のアミノ酸配列 がＴＹＹＩＹ（配列番号：６７）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＧ ＭＮＰＧＮＧＶＴＹＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号：６８）であり、相補性決定領域 ３のアミノ酸配列がＶＧＮＬＦＡＹ（配列番号：６９）であるＨ鎖とを含有して いる、コカインを分解できる触媒抗体を提供する。 本発明はさらに又、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＸＳＬＬＹＸＤ ＧＫＴＹＬＮ（配列番号：７９）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬ ＭＳＴＲＸＳ（配列番号：８０）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＱ ＸＦＸＸＹＰＦＴ（配列番号：８１）であるＬ鎖と、相補性決定領域１のアミノ 酸配列がＳＤＹＡＷＸ（配列番号：８２）であり、相補性決定領域２のアミノ酸 配列がＹＩＲＸＸＸＸＴＲＹＮＰＳＬＸＳ（配列番号：８３）であり、相補性決 定領域３のアミノ酸配列がＸＨＹＹＧＸＸＸ（配列番号：８４）であるＨ鎖とを 含有している、コカインを分解できる触媒抗体を提供する。 本発明はさらに又、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤ ＧＫＴＹＬＮ（配列番号：４４）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬ ＶＳＫＬＤＳ（配列番号：４５）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＶ ＱＧＹＴＦＰＬＴ（配列番号：４６）であるＬ鎖と、相補性決定領域１のアミノ 酸配列がＤＨＷＭＨ（配列番号：７１）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配 列がＴＩＤＬＳＤＴＹＴＧＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号：７２）であり、相補性決 定領域３のアミノ酸配列がＲＧＦＤＹ（配列番号：７３）であるＨ鎖とを含有し ている、コカインを分解できる触媒抗体を提供する。 別の実施態様では本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入されている 、アミノ酸配列ＲＳＳＸＧＴＩＴＸＸＮＹＡＮ（配列番号：７３）を有する相補 性決定領域１、アミノ酸配列ＸＮＮＹＲＰＰ（配列番号：７４）を有する相補性 決定領域２及びアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号：７５）を有する相 補性決定領域３を備えたＬ鎖ドメインを含有しているポリペプチドを提供するが 、前記Ｌ鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインを分解するために適したコ ン フォメーションを有するように、適切なフレームワーク領域の間に挿入されてた アミノ酸配列ＤＹＮＭＹ（配列番号：７６）を有する相補性決定領域１、アミノ 酸配列ＹＩＤＰＸＮＧＸＩＦＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号：７８）を有する相補性 決定領域２、アミノ酸配列ＧＧＧＬＦＡＸ（配列番号：７８）を有する相補性決 定領域３を備えたＨ鎖ドメインに連結されている。 別の実施態様では本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入されたアミ ノ酸配列ＲＳＳＳＧＴＩＴＡＮＮＹＧＳ（配列番号：４０）を有する相補性決定 領域１、アミノ酸配列ＶＳＮＮＲＧＰ（配列番号：４１）を有する相補性決定領 域２及びアミノ酸配列ＡＬＷＮＳＮＨＦＶ（配列番号：４２）を有する相補性決 定領域３を備えたＬ鎖ドメインを含有しているポリペプチド類を提供するが、前 記Ｌ鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインを分解するために適したコンフ ォメーションを有するように、適切なフレームワーク領域の間に挿入されたアミ ノ酸配列ＴＹＹＩＹ（配列番号：６７）を有する相補性決定領域１、アミノ酸配 列ＧＭＮＰＧＮＧＶＴＹＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号：６８）を有する相補性決定 領域２及びアミノ酸配列ＶＧＮＬＦＡＹ（配列番号：６９）を有する相補性決定 領域３を備えたＨ鎖ドメインに連結されている。 別の実施態様では本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入されたアミ ノ酸配列ＲＳＳＸＳＬＬＹＸＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号：７９）を有する相補性 決定領域１、アミノ酸配列ＬＭＳＴＲＸＳ（配列番号：８０）を有する相補性決 定領域２及びアミノ酸配列ＱＸＦＸＸＹＰＦＴ（配列番号：８１）を有する相補 性決定領域３を備えたＬ鎖ドメインを含有しているポリペプチド類を提供するが 、前記Ｌ鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインを分解するために適したコ ンフォメーションを有するように、適切なフレームワーク領域の間に挿入された アミノ酸配列ＳＤＹＡＷＸ（配列番号：８２）を有する相補性決定領域１、アミ ノ酸配列ＹＩＲＸＸＸＸＴＲＹＮＰＳＬＸＳ（配列番号：８３）を有する相補性 決定領域２、及びアミノ酸配列ＸＨＹＹＧＸＸＸ（配列番号：８４）を有する相 補性決定領域３を備えたＨ鎖ドメインに連結されている。 別の実施態様において、本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入され たアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号：４３）を有する 相補性決定領域１、アミノ酸配列ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号：４４）を有する相 補性決定領域２及びアミノ酸配列ＶＱＧＹＴＦＰＬＴ（配列番号：４５）を有す る相補性決定領域３を備えたＬ鎖ドメインを含有しているポリペプチド類を提供 するが、前記Ｌ鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインを分解するために適 したコンフォメーションを有するように適切なフレームワーク領域の間に挿入さ れたアミノ酸配列ＤＨＷＭＨ（配列番号：７２）を有する相補性決定領域１、ア ミノ酸配列ＴＩＤＬＳＤＴＹＴＧＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号：７１）を有する相 補性決定領域２及びアミノ酸配列ＲＧＦＤＹ（配列番号：７２）を有する相補性 決定領域３を備えたＨ鎖ドメインに連結されている。 本発明はさらに、ヒト化触媒抗体を提供する。 本発明はさらに、ヒト化触媒ポリペプチドを提供する。 本発明は、抗体のＬ鎖をコードする単離された核酸分子を提供する。さらに本 発明は、抗体のＨ鎖をコードする単離された核酸分子を提供する。 本発明はさらに、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するために有効な量の請求 の範囲に記載の抗体と、薬学的に容認できる担体とを含有する、被験者の体内の コカイン濃度を低下させるための医薬組成物を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するために有効な量の請求 の範囲に記載の抗体を被験者に投与することを含む、被験者の体内のコカイン濃 度を低下させる方法を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するために有効な量の請求 の範囲に記載の抗体と、薬学的に容認できる担体とを含む、被験者におけるコカ イン過量投与を治療するための薬学的組成物を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解して被験者におけるコカイ ン過量投与を低下させるために有効な量の請求の範囲に記載の抗体を、被験者に 投与することを含む、被験者におけるコカイン過量投与を治療するための方法を 提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するために有効な量の請求 の範囲に記載の抗体と、薬学的に容認できる担体とを含む、コカインの達成可能 な濃度を低下させることによって被験者におけるコカイン嗜癖を治療するための 薬学的組成物を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解して被験者におけるコカイ ンの到達可能な濃度を低下させるために有効な量の請求の範囲に記載の抗体を投 与することを含む、コカインの達成達可能な濃度を低下させることによって被験 者におけるコカイン嗜癖を治療するための方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１． コカインのベンゾイルエステル加水分解。反応経路に沿って形成され る予想されるテトラヘドラル中間体が示されている。ベンゾイルエステルのリン 酸塩モノエステル近似体の一般構造：ＴＳＡ１、ＴＳＡ２、ＴＳＡ３。ＴＳＡ４ 。 図２．ＴＳＡ−１の合成。 図３．ＴＳＡ−２の合成。 図４．ＴＳＡ−３の合成。 図５．ＴＳＡ１、２、及び３により生じた触媒抗体についての ｌｏｇ（Ｋ_m／Ｋ_TSA4 ）対ｌｏｇ（ｋ_cat／ｋ_uncat）のプロット。 この図に示されているデータは表１及び２に記載されているデータである。最小 二乗法による線形関係：Mab 15Ａ10及び8Ｇ4Ｇを除きr＝0.85 図６．ラムダＬ鎖のアミノ酸配列のアラインメント。 このとき、 9Ａ(lam9)variは、抗体9Ａ3のラムダＬ鎖における可変ドメインのアミノ酸 配列を示しており、 19Ｇ(lam5)variは、抗体19Ｇ8のラムダＬ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列 を示しており、 15Ａ10ＬVariは、抗体15Ａ10のラムダＬ鎖における可変ドメインのアミノ酸 配列を示しており、 Ｇ7(lam4)varlは、抗体8Ｇ4ＧにおけるラムダＬ鎖の可変ドメインのアミノ 酸配列を示している。 図７．カッパＬ鎖のアミノ酸配列のアラインメント。 このとき、 3Ｂ9 Ｋ variは、抗体3Ｂ9のカッパＬ鎖における可変ドメインのアミノ酸配 列を示しており、 6Ａ12 Ｋ variは、抗体6Ａ12のカッパＬ鎖における可変ドメインのアミノ酸 配列を示しており、 12Ｈ(Ｌ2)k variは、抗体12Ｈ1のカッパＬ鎖における可変ドメインのアミノ 酸配列を示しており、 2Ａ k variは、抗体2Ａ10のカッパＬ鎖における可変ドメインのアミノ酸配 列を示しており、 Ｅ2(Ｌ7)k Variは、抗体8Ｇ4ＥのカッパＬ鎖における可変ドメインのアミノ 酸配列を示している。 図８．Ｈ鎖のアミノ酸配列のアラインメント。 このとき、 3Ｂ9 Ｋ variは、抗体3Ｂ9のＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列を 示しており、 6Ａ12 Ｋ Heavyは、抗体6Ａ12のＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配 列を示しており、 12Ｈ Ｈ variは、抗体12Ｈ1のＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列を 示しており、 2ＡＨ-3は、抗体2Ａ10のＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列を示し ており、 9(Ｈ-3)variは、抗体9Ａ3のＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列を 示しており、 19h6-3 variは、抗体19Ｇ8のＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列を 示しており、 15Ａ10 Variは、抗体15Ａ10のＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列 を示しており、 Ｅ2(Ｈ8)Variは、抗体8Ｇ4ＥのＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列 を示しており、 Ｇ7(Ｈ8)variは、抗体8Ｇ4ＧのＨ鎖における可変ドメインのアミノ酸配列 を示している。 図９．抗コカイン触媒抗体15Ａ10におけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図１０．抗コカイン触媒抗体15Ａ10におけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図１１．抗コカイン触媒抗体19Ｇ8におけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図１２．抗コカイン触媒抗体19Ｇ8におけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図１３．抗コカイン触媒抗体9Ａ3におけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図１４．抗コカイン触媒抗体9Ａ3におけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図１５．抗コカイン触媒抗体8Ｇ4ＧにおけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図１６．抗コカイン触媒抗体8Ｇ4ＧにおけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図１７．抗コカイン触媒抗体3Ｂ9におけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図１８．抗コカイン触媒抗体3Ｂ9におけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図１９．抗コカイン触媒抗体6Ａ12におけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図２０．抗コカイン触媒抗体6Ａ12におけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図２１．抗コカイン触媒抗体2Ａ10におけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図２２．抗コカイン触媒抗体2Ａ10におけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図２４．抗コカイン触媒抗体12Ｈ1におけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図２５．抗コカイン触媒抗体8Ｇ4ＥにおけるＬ鎖のヌクレオチド配列。 図２６．抗コカイン触媒抗体8Ｇ4ＥにおけるＨ鎖のヌクレオチド配列。 図２７．3Ｂ9触媒モノクローナル抗体のｓｃＦｖ。 Ｈ１は抗体3Ｂ9のＨ鎖の相補性決定領域１を示しており、 Ｈ２は抗体3Ｂ9のＨ鎖の相補性決定領域２を示しており、 Ｈ３は抗体3Ｂ9のＨ鎖の相補性決定領域３を示しており、 Ｌ１は抗体3Ｂ9のＬ鎖の相補性決定領域１を示しており、 Ｌ２は抗体3Ｂ9のＬ鎖の相補性決定領域２を示しており、 Ｌ３は抗体3Ｂ9のＬ鎖の相補性決定領域３を示しており、 ＦＬＡＧは既知の抗体によって認識されるエピトープを示しており、６ｘ Hisは金属ニッケルへ結合することができ、Flag及び６x Hisはどち らもscFvを精製するために有用である。 図２８Ａ及び２８Ｂ． (ａ)ベンゾイルエステル及びメチルエステルの状態でのコカインの加水分解 。 (Ｂ)ベンゾイルエステル加水分解の予想される四面体中問体及び対応するリ ン酸塩モノエステル近似体。 図２９．ＬＤ₉₀コカインの投与後の生存率に関するMab 15Ａ10についての対数 用量反応関係。雄性ラットに５分間をかけて総量５ｍｌの静注生理食塩水(ｎ＝ ８)又は５ｍｇ／ｋｇ(ｎ＝５)、１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）又は５０ｍｇ／ｋｇ （ｎ＝５）の用量のMab 15Ａ10が投与された。５分後に、全動物に以前に記載し た通りに１８、カテコールアミン注射液が静脈注射され、さらに１ｍｇ／ｋｇ／ ｍｉｎの速度でコカイン注射液（１６ｍｇ／ｋｇ）が投与された。「生存動物」 は心肺停止を発生せずに注射を完了し、注射後１時間に渡って観察された。Ｘ二 乗検定によって判定した生存率へのMab 15Ａ10の作用は有意であった(ｐ＜０． ００１)。 図３０Ａ−３０Ｄ。 コカインによるMab 15Ａ10の飽和。 （Ａ及びＢ）発作時（Ａ）及び死亡時（Ｂ）の平均コカイン用量。 （Ｃ及びＤ）死亡時のエクゴニンメチルエステル（ＥＭＥ）（Ｃ）及びコカイ ン（Ｄ）の血漿濃度。図２に示したように準備されたラットに、総量５ｍ ｌの生理食塩水（ｎ＝１７）又はMab 15Ａ10 １００ｍｇ／ｋｇ(ｎ＝４） 又はMab 1Cl １００ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）が５分間かけて静脈内投与され た。次いで心肺停止となるまでコカインが１ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎの速度で 静脈内投与された。エクゴニンメチルエステル及びコカインの血漿濃度を 測定するために死亡時に動脈血サンプルが入手された。本文に記載されて いるように、多重比較についてボンフェロ−ニの修正を加えたウィルコク ソン順位符合検定によって群間差の有意性が判定された。 発明の詳細な説明 本発明は、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＸＧＴＩＴＸＸＮＹＡＮ （配列番号：７３）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＸＮＮＹＲＰＰ （配列 番号：７４）であり、さらに相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＹＳＮＨ ＷＶ（配列番号：７５）であるＬ鎖（軽鎖）と、相補性決定領域１のアミノ酸配 列がＤＹＮＭＹ（配列番号：７６）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列が ＹＩＤＰＸＮＧＸＸＦＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号：７８）であり、相補性決定領 域３のアミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＸ（配列番号：７８）であるＨ鎖（重鎖）を 含むことを特徴とする、コカインを分解することができる触媒抗体を提供する。 本発明はまた、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＳＧＴＩＴＡＮＮＹ ＧＳ（配列番号：４０）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＶＳＮＮＲ ＧＰ（配列番号：４１）であり、さらに相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬ ＷＮＳＮＨＦＶ（配列番号：４２）であるＬ鎖と、相補性決定領域１のアミノ酸 配列がＴＹＹＩＹ（配列番号：６７）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列 がＧＭＮＰＧＮＧＶＴＹＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号：６８）であり、さらに相補 性決定領域３のアミノ酸配列がＶＧＮＬＦＡＹ（配列番号：６９）であるＨ鎖を 含む、コカインを分解することができる触媒抗体を提供する。 本発明はまた、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＸＳＬＬＹＸＤＧＫ ＴＹＬＮ（配列番号：７９）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＭＳ ＴＲＸＳ（配列番号：８０）であり、さらに相補性決定領域３のアミノ酸配列が ＱＸＦＸＸＹＰＦＴ（配列番号：８１）であるＬ鎖と、相補性決定領域１のアミ ノ酸配列がＳＤＹＡＷＸ（配列番号：８２）であり、相補性決定領域２のアミノ 酸配列がＹＩＲＸＸＸＸＴＲＹＮＰＳＬＸＳ（配列番号：８３）であり、さらに 相補性決定領域３のアミノ酸配列がＸＨＹＹＧＸＸＸ（配列番号：８４）である Ｈ鎖を含む、コカインを分解することができる触媒抗体を提供する。 本発明は、相補性決定領域１のアミノ酸配列がＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹ ＬＮ（配列番号：４３）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＶＳＫＬ ＤＳ（配列番号：４４）であり、さらに相補性決定領域３のアミノ酸配列がＶＱ ＧＹＴＦＰＬＴ（配列番号：４５）であるＬ鎖と、相補性決定領域１のアミノ酸 配列がＤＨＷＭＨ（配列番号：７２）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列 がＴＩＤＬＳＤＴＹＴＧＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号：７１）であり、さらに相補 性決定領域３のアミノ酸配列がＲＧＦＤＹ（配列番号：７２）であるＨ鎖を含む 、コカインを分 解することができる触媒抗体を提供する。 ５つのクラスのヒト抗体がある。各々が、Ｈ鎖と呼ばれる２つの同一ポリペプ チド（分子量約50,000ダルトン）と２つの同一Ｌ鎖（分子量約25,000ダルトン） から成る同じ基本構造を有している。 ５つの抗体クラスの各々は、同様のセットのＬ鎖と異なるセットのＨ鎖を有す る。 Ｌ鎖は１つの可変ドメインと１つの定常ドメインから成り、一方Ｈ鎖は１つの 可変ドメインと３つまたはそれ以上の定常ドメインから成る。対合したＬ鎖とＨ 鎖の可変ドメインはＦｖ領域として知られている。かかるＦｖが免疫グロブリン の特異性を決定し、定常ドメインは他の機能を有する。アミノ酸配列データは、 各々の可変ドメインが、４個の比較的保存されたフレームワーク領域（２４）に 隣接した、相補性決定領域と呼ばれる３つの超可変領域あるいはループを含むこ とを示唆している。超可変領域は、個々の抗体の抗体特異性の原因となり、タン パクとしての抗体結合の多様性を説明すると考えられてきた。 もうひとつの態様において、本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入 されたアミノ酸配列ＲＳＳＸＧＴＩＴＸＸＮＹＡＮ（配列番号：７３）を有する 相補性決定領域１、アミノ酸配列ＸＮＮＹＲＰＰ（配列番号：７４）を有する相 補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号：７５）を 有する相補性決定領域３を備えたＬ鎖部分を含むポリペプチドを提供し、かかる Ｌ鎖部分は、かかるポリペプチドがコカインを分解するのに適したコンフォメー ションを取るように、適切なフレームワーク領域の間に挿入されたアミノ酸配列 ＤＹＮＭＹ（配列番号：７６）を有する相補性決定領域１、アミノ酸配列ＹＩＤ ＰＸＮＧＸＩＦＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号：７８）を有する相補性決定領域２、 およびアミノ酸配列ＧＧＧＬＦＡＸ（配列番号：７８）を有する相補性決定領域 ３を備えたＨ鎖部分に連結されている。 もうひとつの態様において、本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入 されたアミノ酸配列ＲＳＳＳＧＴＩＴＡＮＮＹＧＳ（配列番号：４０）を有する 相補性決定領域１、アミノ酸配列ＶＳＮＮＲＧＰ（配列番号：４１）を有する相 補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＡＬＷＮＳＮＨＦＶ（配列番号：４２）を 有する相補性決定領域３を備えたＬ鎖部分を含むポリペプチドを提供し、かかる Ｌ鎖部分は、 該ポリペプチドがコカインを分解するのに適したコンフォメーションを取るよう に、適切なフレームワーク領域の間に挿入されたアミノ酸配列ＴＹＹＩＹ（配列 番号：６７）を有する相補性決定領域１、アミノ酸配列ＧＭＮＰＧＮＧＶＴＹＦ ＮＥＫＦＫＮ（配列番号：６８）を有する相補性決定領域２、およびアミノ酸配 列ＶＧＮＬＦＡＹ（配列番号：６９）を有する相補性決定領域３を備えたＨ鎖部 分に結合している。 もうひとつの態様において、本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入 されたアミノ酸配列ＲＳＳＸＳＬＬＹＸＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号：７９）を有 する相補性決定領域１、アミノ酸配列ＬＭＳＴＲＸＳ（配列番号：８０）を有す る相補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＱＸＦＸＸＹＰＦＴ（配列番号：８１ ）を有する相補性決定領域３を備えたＬ鎖部分を含むポリペプチドを提供し、か かるＬ鎖部分は、該ポリペプチドがコカインを分解するのに適したコンフォメー ションを取るように、適切なフレームワーク領域の間に挿入されたアミノ酸配列 ＳＤＹＡＷＸ（配列番号：８２）を有する相補性決定領域１、アミノ酸配列ＹＩ ＲＸＸＸＸＴＲＹＮＰＳＬＸＳ（配列番号：８３）を有する相補性決定領域２、 およびアミノ酸配列ＸＨＹＹＧＸＸＸ（配列番号：８４）を有する相補性決定領 域３を備えたＨ鎖部分に結合している。 もうひとつの態様において、本発明は、適切なフレームワーク領域の間に挿入 されたアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号：４３）を有 する相補性決定領域１、アミノ酸配列ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号：４４）を有す る相補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＶＱＧＹＴＦＰＬＴ（配列番号：４５ ）を有する相補性決定領域３を備えたＬ鎖部分を含むポリペプチドを提供し、か かるＬ鎖部分は、該ポリペプチドがコカインを分解するのに適したコンフォメー ションを取るように、適切なフレームワーク領域の間に挿入されてたアミノ酸配 列ＤＨＷＭＨ（配列番号：７２）を有する相補性決定領域１、アミノ酸配列ＴＩ ＤＬＳＤＴＹＴＧＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号：７１）を有する相補性決定領域２ 、およびアミノ酸配列ＲＧＦＤＹ（配列番号：７２）を有する相補性決定領域３ を備えたＨ鎖部分に結合している。 天然の免疫グロブリン分子におけるＨ鎖およびＬ鎖の各々の可変ドメインの相 補 性決定領域が、抗原の認識と結合の役割を担う。 また、免疫グロブリン結合部位における２つの鎖の構造を模倣した生合成ドメ インは、これらをポリペプチドリンカーによって連結する一方、それらの全体的 結合特性に極めて近似し、それを保持し、しばしばそれを改善し得ることも発見 されている。 該ポリペプチドの結合部位は２つのドメインを含み、ひとつのドメインは免疫 グロブリンＬ鎖の可変ドメインを含み、他の部分は免疫グロブリンＨ鎖の可変ド メインを含む。かかる２つの部分はポリペプチドによって結合されている。ポリ ペプチドはこれら２つのドメインを、コカインを分解するための適当なコンフォ メーションに保持している。 好ましい実施態様では、本発明は、相補性決定領域とフレームワーク領域が別 個の免疫グロブリンに由来する、Ｌ鎖の可変断片とＨ鎖の可変断片を含むハイブ リッドの単一ポリペプチド鎖を提供する。 もうひとつの好ましい実施態様では、本発明は、フレームワーク領域がヒトま たは哺乳類に由来するものであるヒト化一本鎖ポリペプチドを提供する。 マウス非ヒト抗体の使用は、特に反復治療処方においてある種の弱点を有する 。マウス抗体は、たとえば、ヒトにおいて使用した時、ヒトの補体を十分に固定 せず、また他の重要な免疫グロブリンの機能特性を欠く。おそらく、より重要な 点として、該抗体は、ヒト患者に注入した時免疫原性となる長さのアミノ酸配列 を含んでいる。異種抗体の注入後、該抗体に対して患者が惹起する免疫反応が極 めて強く、初期治療後の抗体の治療的有用性を排除してしまう場合があることが 試験で示された。 本発明は、それ故、組換えＤＮＡテクノロジーを用いることにより、コカイン を分解することができる、「ヒト化(humanized)」抗体のようなハイブリッド抗 体（たとえばヒトあるいは他の哺乳類の定常領域に連結されたマウス可変領域） を提供する。請求の範囲に記載のハイブリッド抗体は、１つの哺乳類ソースから の１つまたはそれ以上の相補性決定領域と、ヒトあるいは他の哺乳類ソースから のフレームワーク領域を有する。 本発明のハイブリッド抗体は、様々な組換えＤＮＡ手法によって容易に作製す ることができ、トランスフェクションされた細胞、好ましくは骨髄腫あるいはハ イブ リドーマ細胞のような不滅化された真核細胞において最終的に発現される。ヒト 様抗体のフレームワーク領域をコードする第一配列と、所望する抗体の相補性決 定領域をコードする第二配列セットを含むポリヌクレオチドは、合成によって、 あるいは適当なＤＮＡ断片とゲノムＤＮＡ断片を組合わせることによって作製で きる。 本発明のハイブリッド抗体の免疫原性を改善するために、アクセプターと呼ば れるヒト様免疫グロブリンを、免疫グロブリンドナーの対応部分と最も相同な配 列のひとつを有するように選択する。ヒト様免疫グロブリンフレームワーク配列 は、代表的にはドナーの免疫グロブリンフレームワーク配列と約６５％〜７０％ 、あるいはそれ以上の相同性を有する。 ハイブリッド抗体は、代表的には相補性決定領域に加えてドナーの免疫グロブ リンからの少なくとも約３個のアミノ酸を含む。通常、相補性決定領域のすぐ隣 にあるアミノ酸の少なくとも１個が置換されている。また、アクセプター免疫グ ロブリンのヒトフレームワーク領域の該アミノ酸は、その位置に関してはまれで あり、ドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸は、ヒト免疫グロブリン 配列におけるその位置に関しては一般的である。 最後に、該アミノ酸は、三次元免疫グロブリンモデルにおける約３オングスト ロームの相補性決定領域内にあり、抗原あるいはヒト化抗体の相補性決定領域と 相互作用することができると予想される。 ハイブリッド抗体に結合された時、本発明のヒト化ＬおよびＨ鎖あるいは相補 性決定領域とフレームワーク領域は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、 ドナー抗体のようにコカインを分解する能力を保持する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するのに有効な量の特許請 求される抗体と薬学的に許容される担体を含む、被験者においてコカインの濃度 を低下させるための薬学的組成を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するのに有効な量の請求の 範囲に記載の抗体を被験者に投与することを含む、被験者においてコカインの濃 度を低下させる方法を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するのに有効な量の請求の 範囲に記載の抗体と薬学的に許容される担体を含む、被験者においてコカインの 過量 を治療するための薬学的組成を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解し、被験者におけるコカイ ンの過量を低減するのに有効な量の請求の範囲に記載の抗体を被験者に投与する ことを含む、被験者においてコカインの過量を治療するための方法を提供する。 本発明はさらに、被験者の血液中のコカインを分解するのに有効な量の請求の 範囲に記載の抗体と製薬学的に許容される担体を含む、コカインの達成可能濃度 を低下させることによって被験者のコカイン嗜癖を治療するための薬学的組成を 提供する。 本発明はさらに、コカインを分解するのに有効な量の特許請求される抗体を被 験者に投与し、それによって被験者の血液中のコカインの達成可能濃度を低下さ せることを含む、コカインの達成可能濃度を低下させることにより被験者のコカ イン嗜癖を治療するための方法を提供する。 以下の「実験の詳細」の項において本発明を例示する。これらの項は本発明の 理解を助けるためのであって、いかなる意味においても後述の請求の範囲に述べ られている本発明を制限することを意図せず、またそのように解釈すべきではな い。第一実験シリーズ 一般的方法 特に記載されない限り、反応は、アルゴンの雰囲気下でオーブン乾燥したガラ ス器具で行った。オーブン乾燥したシリンジと針で試薬および溶媒の移動を行っ た。ジクロロメタン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、およびベンゼンを、水素化 カルシウムから連続して蒸留させた。ヒュームフードを、ベンゼンまたはクロロ ホルムを必要とする手段について使用した。³Ｈ−フェニルコカインを、先に報 告されたとおりに製造した（８）；放射性標識材料は、適切な注意を払って取り 扱った。全ての試薬は、アルドリッチ・ケミカル社(Aldrich Chemical Co.)から 購買した。全てのクロマトグラフィー溶媒は、市販で入手し、そして受取ったま ま使用した。反応は、イー．メルク(E.Merck)のシリカゲル６０Ｆガラスプレー ト（0.25ｍｍ）を使用した分析用薄相クロマトグラフィー法（ＴＬＣ）によって 観察した。フラッシュ・クロマトグラフィーを、Ｓｔｉｌｌ（２９）によって 記述されたとおりイー．メルク(E.Merck)のシリカゲル−６０（230.400メッシュ ）を使用して行った。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、ダイナマッ クス(Dynamax)−Ｃ₈（21.4×250ｍｍ）カラムと２２０ｎｍに設定された検出器 を使用するウォーターズ(Waters)５９０の系で行った。溶媒系は、アセトニトリ ル−水（0.1％トリフルオロ酢酸）であった。 ５ｍｍの広範なバンドの反転プローブを具備したブラッカー(Bruker)ＡＭＸ− ５００（500MHz）分光計、バリアン(Varian)ＶＸＲ−３００（3O0MHz）またはバ リアン・ジェミニ・バリアン(Varian Gemini Varian)（50MHz）のいずれかで、 周囲温度で全ての炭素ＮＭＲスペクトルを得た。全てのプロトンＮＭＲスペクト ル（400MHz）を、ブルッカーＡＭ−４００分光計で周囲温度で得て、化学シフト （δ）を内部テトラメチルシラン（0.00ｐｐｍ）に対する１００万分の１で記録 する。 ミシガン州立大学の質量分光光度の施設でＦＡＢ高解像能質量分光光度分析を 行った。ＥＩ質量分光光度分析を、コロンビア大学、質量分光光度の施設のＪＥ ＯＬＤＸ303 ＨＦ装置で行った。全ての結果は、計算値の５ｐｐｍ以内であった 。 遊離ＴＳＡ４。アメルライト（Amerlite）ＩＲＮメトキシ交換カラム（ポリサ イエンス社(Polyscience,Inc.)）に、塩酸エクゴニンメチルエステルのＭｅＯＨ 溶液を通過させることによって、エクゴニンメチルエステル遊離塩基を生成した 。０℃でCH₂Cl₂（10ml）中のエクゴニンメチルエステル（0.049g、0.25ミリモル ）に、フェニルリン酸ジクロライド(0.042ml、0.30ミリモル)、１Ｈ−テトラゾ ール（触媒）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（0.11ｍl、3.4ミリモ ル）を添加した。反応液を、室温まで加温させた。１２時間攪拌後、ＭｅＯＨ（ 0.150ｍｌ）を添加し、そして４時間後、反応液を真空で濃縮した。クロマトグ ラフィー精製（SiO₂、CHCl₃/MeOH 99:1）により、混合ジエステル４（0.042g、5 2％）を油状物として得た。CH₂Cl₂（3ｍｌ）中に溶解した４のメチルエステル（ 0.030g、0.095ミリモル）に、室温で２時間臭化トリメチルシリル（0.05ｍl、0. 38ミリモル）を添加した。反応液を真空で濃縮した。水（5ｍｌ）を添加し、そ して反応液をCHCl₃（5ｍｌ×２）で抽出した。有機部分を別の５ｍｌの水で抽出 した。混合水性画分を真空で濃縮した。残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ） に取り、そしてプロピレンオキシド（過剰）を添加した。真空で濃縮した後、遊 離ＴＳＡ４（29ｍｇ、90％）を白色固形物として、CHCl₃中の粗生成物の溶液か ら沈殿させた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）δ ７．５１(ｍ、２Ｈ)、 ７．３２(ｍ、３Ｈ)、４．３７(ｍ、１Ｈ)、３．８３(ｍ、１Ｈ)、３．６７(ｍ 、１Ｈ)、３．５４(ｓ、３Ｈ)、２．９５(ｍ、１Ｈ)、２．５４(ｓ、３Ｈ)、２ ．１４−１．９２(ｍ、３Ｈ)、１．９１−１．７４(ｍ、３Ｈ)。¹³Ｃ ＮＭＲ （３００ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）δ １７９．２１、１３９．３１、１３６．９２、１ ３６．４３、１３６．３０、１３４．００、１３３．８１、６９．２４、６９． ０４、６８．５７、５８．４５、５３．４９、４３．９６、４０．１７、２８． ９５、２７．８３；高解像能質量スペクトル（ＦＡＢ）Ｃ₁₆Ｈ₂₂ＮＯ＿Ｐとした 。（Ｍ＋１）計算値３４０．１３１４、実測値３４０．１３１９。 化合物５。ＭｅＯＨ（４ｍｌ）中のエクゴニンＨＣｌ（０．３５ｇ、１．６ミ リモル）に、ＤＭＦ(４０ｍｌ)、Ｍｅ₄ＮＯＨ（２．７ｍｌ、６．４ミリモル） および１−アジド−４−インドブタン（１．８ｇ、８ミリモル）を添加した。反 応液を５０℃で１２時間攪拌し、そしてその後真空で濃縮した。クロマトグラフ ィー精製（ＳｉＯ₂、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＮＨ₄ＯＨ ９：０．９：０．１） により、エステル（０．３５ｇ、７８％）を油状物として得た。¹Ｈ ＮＭＲ（ ４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ４．２３(ｍ、１Ｈ)、４．１２(ｍ、１Ｈ)、３ ．８１(ｍ、１Ｈ)、３．５８(ｍ、１Ｈ)、３．２６(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ) 、３．１８(ｍ、１Ｈ)、２．７４(ｔ、１Ｈ、Ｊ＝４．７Ｈｚ)，２．１９(ｓ、 ３Ｈ)、２．０３(ｍ、２Ｈ)、１．９８−１．６３(ｍ)６Ｈ)、１．６１−１．４ ７(ｍ、２Ｈ)；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１７３．７３、６ ４．３７、６４．２９、６３．５６、６１．５８、５１．７４、５０．９４、４ １．２３、４０．２６、２５．９２、２５．６１、２５．５１、２４．８２；高 解像能質量スペクトル（ＦＡＢ）Ｃ₁₃Ｈ₂₃Ｎ₄Ｏ₃とした。（Ｍ＋１）計算値２８ ３．１７７０、実測値２８３．１７８３。 化合物６。０℃でベンゼン（１０ｍｌ）中のアルコール５（０．４３ｇ、１． ５ミリモル）に、フェニルリン酸ジクロライド(０．２７ｍｌ、１．７ミリモル) 、 １Ｈ−テトラゾール(８ｍｇ)、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０ ．６ｍｌ、３．４ミリモル）を添加した。反応液を、室温まで加温させ、そして 沈殿物が１５分後に観察された。１２時間攪拌した後、ＭｅＯＨ（０．１ｍｌ） を添加し、そして４時間後、反応液を真空で濃縮した。クロマトグラフィー精製 （ＳｉＯ₂、ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ／ＮＨ₄ＯＨ ９．５：０．５：０．０２）に より、混合ジエステルをジアステレオマー（０．５３ｇ、８９％）の混合物で、 油状物として得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ７．７３(ｍ 、２Ｈ)、７．６０(ｍ、１Ｈ)、７．４９(ｍ、２Ｈ)、５．０９(ｍ、１／２Ｈ) 、４．９８（ｍ、１／２Ｈ)、４．２４(ｍ、２Ｈ)、４．１５−３．９６(ｍ、２ Ｈ)、３．７１(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１４．６Ｈｚ)、３．６８(ｄ、２Ｈ、Ｊ＝１ ４．６Ｈｚ)、３．３５−３．１５(ｍ、３Ｈ)、２．９１(ｓ、３／２Ｈ)、２． ８９(ｓ、３／２Ｈ)、２．８７(ｔ、１／２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ)、２．５９(ｔ 、１／２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ)、２．４３−２．２２(ｍ、５／２Ｈ)、２．１７ −１．９５(ｍ、５／２Ｈ)、１．７１−１．５７(ｍ、２Ｈ)、１．３９(ｍ、₂Ｈ )；¹³Ｃ ＮＭＲ(５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１６１．５５、１４９．１２、 １３４．３２、１３２．５５、１２９．８０、１２９．６６、６６．７２、６６ ．５４、６６．４５、６６．２８、６４．８０、６３．９０、６３．８１、５３ ．８１、５１．６０、５１．５０、４９．５８、４９．１５、４０．３０、３５ ．６０、３５．２７、２６．３５、２６．０６、２６．０２、２５．８２、２５ ．１０、２３．９８；高解像能質量スペクトル（ＦＡＢ）Ｃ₂₀Ｈ₃₀Ｎ₄Ｏ₅とした 。（Ｍ＋１）計算値４３７．１９５４、実測値４３７．１９５３。 化合物７。Ｍｅ３Ｐ（１．１ｍｌ、ＴＨＦ中１Ｍ、１．１ミリモル）を、６ｍ ｌＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏ（９：９：２）中のアジド６（０．２１７ｇ、０． ５ミリモル）に添加し、そして反応液を室温で５時間攪拌した。真空で濃縮した 後、不安定な粗成アミン（３６ｍｇ、０．０８４ミリモル）を、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂ （５ｍｌ）に取り、そして１，４−¹⁴Ｃ−琥珀酸無水物（９ｍｇ、０．０９３ミ リモル）を添加した。反応液をＡｒ下で１２時間攪拌し、そしてその後濃縮した 。精製のために、粗成酸７（４４ｍｇ、０．０８７ミリモル）をＤＣＣ(３６ｍ ｇ、０．１７ミリモル)、ベンジルアルコール（３６μｌ、０．３５ミリモ ル）およびＤＭＡＰ（触媒）を用いてＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）中でエステル化し た。反応液を、１２時間攪拌し、そして濃縮した。クロマトグラフィー精製（Ｓ ｉＯ₂、０．５：９９．５ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃、および２：９８ＭｅＯＨ／Ｃ ＨＣｌ₃）により、７のベンジルエステルをジアステレオマーの混合物（３２ｍ ｇ、５９％）で、油状物として得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃） δ ７．７３(ｍ、２Ｈ)、７．６２(ｍ、１Ｈ)、７．４９(ｍ、２Ｈ)、７．３３ (ｍ、５Ｈ)、６．６４(広範なｓ、１／２Ｈ)、６．５６(広範なｓ、１／２Ｈ)、 ５．１０(ｓ、２Ｈ)、４．９６(ｍ、１／２Ｈ)、４．８９(ｍ、１／２Ｈ)、４． ３８−３．８５(ｍ)４Ｈ)、３．７４(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１５．２Ｈｚ)、３． ６８(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１５．２Ｈｚ)、３．３２−３．１２(ｍ、３Ｈ)、２． ８９(ｓ、３／２Ｈ)、２．８７(ｓ、３／２Ｈ)、２．７０−２．５９(ｍ、３Ｈ) 、２．５２−２．２６(ｍ、４Ｈ)、２．１０−１．９７(ｍ、２Ｈ)、１．６８( ｍ、１Ｈ)、１．５５(ｍ、１Ｈ)、１．３８(ｍ、２Ｈ)；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１７３．５５、１７２．６６、１７１．３７、１６１． ６２、１６１．２８、１３６．５９、１３４．１７、１３２．３７、１２９．５ ６、１２９．２４、１２８．８８、１２８．７１、６７．０４、６６．８１、６ ６．６４、６６．２５、６４．６６、６３．７５、５３．７４、４９．３７、４ ９．００、４０．１１、３９．４２、３５．５５、３５．２６、３１．３５、３ ０．３１、２６．１９、２６．０６、２４．８９、２３．９１；高解像能質量ス ペクトル（ＦＡＢ）Ｃ₃₁Ｈ₄₂Ｎ₂Ｏ₈Ｐとした。（Ｍ＋１）計算値６０１．２６７ ９、実測値６０１．２６８２。 メタノール（１０ｍｌ）中の７のベンジルエステル（１７ｍｇ、０．０２８ミ リモル）をＨ₂（１気圧）下での触媒量のＣ（１０％）上のＰｄと一緒に４時間 攪拌した。反応混合液を濾過し、そして真空で濃縮して、酸７を定量的に供した 。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ ７．６９(ｍ、２Ｈ)、７．６０ (ｍ、１Ｈ、７．５１(ｍ、２Ｈ)、４．９９(ｍ、１Ｈ)、４．２０−４．０８(ｍ 、２Ｈ)、３．８９(ｍ、１Ｈ)、３．７３(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝２１．５Ｈｚ)、 ３．６６(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝２１．５Ｈｚ)、３．６２(ｍ、１Ｈ)、３．２２( ｍ、１Ｈ)、３．１０(ｍ、１Ｈ)、３．０１(ｍ、１Ｈ)、２．７６ (ｓ、３／２Ｈ)、２．７５(ｓ、３／２Ｈ)、２．５０(ｍ、２Ｈ)、２．３８−２ ．２８(ｍ、５Ｈ)、２．０４(ｍ、２Ｈ)、１．６１(ｍ、１Ｈ)、１．５０(ｍ、 １Ｈ)、１．３４(ｍ、３Ｈ)；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ１７ ６．２２、１７４．５２、１７３．４７、１６２．２２、１３４．９７、１３２ ．７９、１３０．１８、６７．６６、６７．５３、６６．９９、６５．４７、６ ４．４４、５３．８９、３９．６３、３９．３３、３５．９９、３１．５０、３ ０．２３、２６．７１、２４．６５、２３．６７；高解像能質量スペクトル（Ｅ Ｉ）Ｃ₂₄Ｈ₃₆Ｎ₂Ｏ₈Ｐとした。計算値５１１．２２０９(Ｍ＋１)、実測値５１１ ．２２１８。 化合物８。アセトニトリル（５ｍｌ）に溶解させた酸７（４０ｍｇ、０．０７ ８ミリモル）に、Ｎ−ヒドロキシフタルアミド（１４ｍｇ、０．０８６ミリモル ）およびＤＣＣ（３２ｍｇ、０．１６ミリモル）を添加した。室温で１時間後、 白色沈殿物が形成した。反応液を真空で濃縮した。粗活性化エステルをＣＨ₂Ｃ ｌ₂（５ｍｌ）に取り、そして臭化トリメチルシリル（１００μｌ、０．７８ミ リモル）を添加した。反応液を、１時間攪拌し、そして真空で濃縮した。粗反応 混合液をアセトニトリル（５ｍｌ）に取り、そしてアミルアミン（１００μｌ、 ０．７８ミリモル）を添加した。すぐに、明るいオレンジ色に発色し、そして１ 時間で明るい黄色に退色した。別の部分のアミルアミン（１００μｌ）を添加し た。反応液を１２時間、室温で攪拌し、そして真空で濃縮した。水（３ｍｌ）を 添加し、そして反応液をＣＨＣｌ₃（５ｍｌ×２）で抽出した。有機部分を新た な５ｍｌの水で抽出した。混合水層画分を真空で濃縮した。４％−４０％ＣＨ₃ ＣＮ／Ｈ₂Ｏ勾配（０．１％トリフルオロ酢酸）で溶出したダイナマックス（Ｄ ｙｎａｍａｘ）３００Å、１２μ、Ｃ−８（１０×２５０ｍｍ）カラムでの高圧 液体クロマトグラフィーで、アミド８（１６ｍｇ、３６％収率）を供した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ ７．７２(ｍ、２Ｈ)、７．５６(ｍ、 １Ｈ)、７．４７(ｍ、２Ｈ)、４．１２(ｍ、３Ｈ)、３．８７(ｍ、１Ｈ)、３． ２３(ｍ、２Ｈ)、３．１４(ｍ、３Ｈ)、２．７７(ｍ、４Ｈ)、２．５８(ｍ、４ Ｈ)、２．３４(ｍ、３Ｈ)、２．１６(ｍ、１Ｈ)、１．９７(ｍ、２Ｈ)、１．５ ５−１．４８(ｍ、６Ｈ)、１．２６(ｓ、４Ｈ)、０．８４６(ｔ、３Ｈ、Ｊ ＝６.３Ｈｚ)；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ１７５．７６、１ ７３．６２、１３３．８３、１３２．２３、１３１．０１、１２９．０７、６６ ．５６、６６．５２、６５．２６、６４．３３、４１．１３、４０．３６、３９ ．３３、３５．９３、３１．１３、２９．９１、２９．４８、２８．９５、２６ ．５７、２６．２８、２４．７３、２３．６６、２３．２２；高解像能質量スペ クトル（ＦＡＢ）Ｃ₂₈Ｈ₄₅Ｎ₃Ｏ₇Ｐとした。計算値５６６．２９９５(Ｍ＋１)、 実測値５６６．２９９７。 ＴＳＡ１。ＣＨ₃ＣＮ（５ｍｌ）中の酸７（１４ｍｇ、０．０２７ミリモル） を、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（４．８ｍｇ、０．０２９ミリモル）およびＤ ＣＣ（１１ｍｇ、０．０５３ミリモル）と共に室温で攪拌した。すぐに赤色に発 色した。２．５時間後、反応液を真空で部分的に濃縮し、小さなコットン製プラ グを通して濾過し、そしてその後十分に濃縮した。不安定な粗成活性化エステル （見掛け上０．０２７ミリモル）をＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）に取り、そして臭化ト リメチルシリル（２０μｌ、０．１５ミリモル）を添加した。反応液を、１時間 攪拌し、そして真空で濃縮した。０℃でのＮａＨＣＯ₃（５ｍｌ、１Ｎ、ｐＨ８ ．０）中のＢＳＡ（５ｍｇ）または卵白アルブミン（５ｍｇ）を添加し、そして 混合液を激しく攪拌した。反応液を室温に加温させ、そして１時間後、ゲル濾過 クロマトグラフィー（セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５Ｍ、ｐＨ７ ．４ＰＢＳ）によって停止させた。タンパク質含有画分を混合し、そして４℃で 一夜ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、３×１０００ｍｌ）で透析した。結合効率は、放射 性標識の組込みに基づいて、ＢＳＡについては６：１と、そして卵白アルブミン については１５：１と算定された。 化合物９ａ。２−（ｐ−ブロモフェニル）エタノール（１．３ｇ、６．５ミリ モル）に、塩化メチレン(２０ｍｌ)、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（１．０７ ｇ、７．１ミリモル）およびイミダゾール（６６０ｍｇ、９．７ミリモル）を添 加した。反応液を室温で１２時間攪拌し、濾過し、そして真空で濃縮した。クロ マトグラフィー精製（ＳｉＯ₂９５：５ヘキサン：ＣＨＣｌ₃）により、シリルエ ーテル（１．２８ｇ、６６％）を供した。−７８℃でのＡｒ下でＴＨＦ（２５ｍ ｌ）中のエーテル（７９２ｍｇ、２．５１ミリモル）に、ｎ−ＢｕＬｉ（１． ２ｍｌ、２．３Ｍヘキサン、２．７６ミリモル）を滴下した。反応液を３０分間 攪拌し、そしてジエチルクロロホスフェート（３７０μｌ、２．５Ｍ ＴＨＦ、 ０．９３ミリモル）の溶液を添加した。反応液を−７８℃でさらに５分間攪拌し 、そして室温に加温した。水性ＮＨ₄Ｃｌ（２０ｍｌ）を添加し、そして反応液 をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍｌ）で抽出した。混合有機層をブラインで洗浄し、無 水ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、そして真空で濃縮した。ＴＨＦ（１０ｍｌ） および水性Ｂｕ₄ＮＦ（２．５ｍｌ、１Ｍ、２．５ミリモル）を残渣に添加した 。この溶液を３０分間室温で攪拌し、そして真空で濃縮した。クロマトグラフィ ー精製（ＳｉＯ₂、９：１ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）により、アルコール９ａ（２ ２９ｍｇ、３５％）を供した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ７ ．７４(ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝１２．５、７．１Ｈｚ)、７．３３(ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝ １２．５、４．５Ｈｚ)、４．１１(ｍ、４Ｈ)、２．９２(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．５ Ｈｚ)、２．８９(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ)、１．３２(ｔ、６Ｈ、Ｊ＝７．８ Ｈｚ)。¹³Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ、ＣＤＣＬ₃）δ１４４．３２、１３２．５１ 、１２９．７８、１２９．４７、６３．６１、６２．６９、３９．７４、１６． ９８；高解像能質量スペクトル（ＥＩ）Ｃ₁₂Ｈ₂₀Ｎ₃Ｏ₄Ｐとした。計算値２５９ ．１０９９(Ｍ＋１)、実測値２５９．１０９２。 化合物９ｂ．アルコール９ａ（１９３ｍｇ、０．７５ミリモル）に、ＣＨ₂Ｃ ｌ₂(７．５ｍｌ)、Ｅｔ₃Ｎ（１１５μｌ、０．８３ミリモル)、ＴｓＣｌ（１４ ５ｍｇ、０．７５ミリモル)、ＤＭＡＰ（触媒）を添加した。反応液を室温で１ ２時間攪拌した。濃縮および精製（ＳｉＯ₂、３：１ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）に より、トシレート（２５１ｍｇ、８１．５％）を供し、そしてこの生成物の一部 （２３２ｍｇ、０．５６ミリモル）に、ベンゼン(３ｍｌ)、水(３ｍｌ)、塩化ア ンモニウム・トリカプリルメチル(触媒)、およびＮａＮ₃（１５０ｍｇ、２．２ ５ミリモル）を添加した。反応液を６５℃で１２時間還流した。ＮＨ₄Ｃｌ飽和 水溶液（５ｍｌ）を添加し、そして反応液をＥｔＯＡｃで抽出した。混合有機層 をＭｇＳＯ₄で処理し、濾過し、そして真空で乾燥させた。クロマトグラフィー （ＳｉＯ₂、１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により、アジド９ｂ（１３７ｍｇ、 ８６％）を供した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ７． ７４(ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝１２．５、７．１Ｈｚ)、７．３２(ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝１ ２．５、４．５Ｈｚ)、４．０９(ｍ、４Ｈ)、３．８６(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈ ｚ)、２．９２(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ)、１．３２(ｔ、６Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈ ｚ)。¹³Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ、ＣＤＣＬ₃）δ１４３．３１、１３２．６５、 １２９．５０、１２９．２０、１２５．３１、６２．５８、５２．４７、３５． ８９、１６．９４；高解像能質量スペクトル（ＥＩ）Ｃ₁₂Ｈ₁₉Ｎ₃Ｏ₃Ｐとした。 計算値２８４．１１６４(Ｍ＋１)、実測値２８４．１１６８。 化合物１０。ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）中のジエチルリン酸エステル８ｂ（６００ ｍｇ、２．１２ミリモル）を臭化トリメチルシリル（１ｍｌ、１１ミリモル）と 共に攪拌し、そして４５℃に加温した。２０分後、真空で濃縮させた。残渣をＣ Ｈ₂Ｃｌ₂（３．２ｍｌ）に溶解させ、そして塩化オキサリル（３．２ｍｌ、ＣＨ₂ Ｃｌ₂中２Ｍ、６．３６ミリモル）およびＤＭＦの１滴を添加した。室温で２０ 分攪拌した後、揮発分を真空で除去した。不安定なリン酸ジクロライドを直接使 用した。 化合物１１。エクゴニンメチルエステル遊離塩基を、化合物４について記述し たとおりに生成した。０℃でのベンゼン（２０ｍｌ）中のエクゴニンメチルエス テル（１７０ｍｇ、０．８５４ミリモル）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルア ミン(０．７４ｍｌ、４．２６ミリモル)、１Ｈ−テトラゾール（触媒）およびリ ン酸ジクロライド１０（２２５ｍｇ、０．８５４ミリモル）を添加した。反応液 を、室温で加温させ、そして１２時間攪拌した。メタノール（３ｍｌ）を添加し 、そして２０分後、反応混合液を真空で濃縮した。クロマトグラフィー精製(Ｓ ｉＯ₂、１：９ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ₃)により、混合ジエステルを、ジアステレオ マーの混合物（１０８ｍｇ、３０％）として供した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨ ｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ７．７１(ｍ、２Ｈ)、７．２９(ｍ、２Ｈ)、４．６３(ｍ、 １Ｈ)、３．７３(ｓ、３／２Ｈ)、３．７０(ｓ、３／２Ｈ)、３．６３(ｄ、３／ ２Ｈ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ)、３．６２(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ)、３． ５１(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ)、３．４８−３．３９(ｍ、１Ｈ)、３．２３− ３．１５(ｍ、１Ｈ)、３．０５(ｍ、１／２Ｈ)、２．９１(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７． ２Ｈｚ)、２．７５(ｍ、１／２Ｈ)、２．５７−２．２６(ｍ、１ Ｈ)、２．１４(ｓ、３Ｈ)、２．０９−１．５２(ｍ、５Ｈ)。¹³Ｃ ＮＭＲ（５ ０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１７０．９１、１７０．６５、１４３．２７、１３２ ．８０、１３２．６１、１２９．４５、１２９．１１、１２５．０８、７８．２ ２、７７．７３、７６．９５、７０．１５、６５．３１、６２．１４、５２．５ ０、５２．８４、５２．１５、４１．５６、３７．８４、３５．９７、２５．７ ０、２５．５８；高解像能質量スペクトル（ＥＩ）Ｃ₁₉Ｈ₂₇Ｎ₄Ｏ₅Ｐとした。計 算値４２２．１７１９(Ｍ⁺)、実測値 化合物１２。アジド１１（３７０ｍｇ、０．８７７ミリモル）に、ＴＨＦ（９ ｍｌ）およびトリフェニルホスフィン（４００ｍｇ、１．７５ミリモル）を添加 した。室温で１２時間攪拌した後、水（１ｍｌ）を添加した。混合物を３時間攪 拌し、そして真空で濃縮した。粗アミン（２００ｍｇ、０．５１ミリモル）に、 ＣＨ₂Ｃｌ₂（７．５ｍｌ）および琥珀酸無水物（３．５ｍｇ、０．３５ミリモル ）を添加した。反応液を１２時間攪拌し、そして真空で濃縮した。粗成酸１２（ ２９０ｍｇ、０．５１ミリモル）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に溶解させ、そし てＤＣＣ(２００ｍｇ、０．９７ミリモル)、ＤＭＡＰ（触媒）およびベンジルア ルコール（０．２ｍｌ、１．９ミリモル）を添加した。反応液を１２時間室温で 攪拌し、そして真空で濃縮した。クロマトグラフィー ＳｉＯ₂、１０：１０： ０．４ＣＨＣｌ₃：ＥｔＯＡｃ：ＮＨＯ₄Ｈ）により、１２のベンジルエステル( １９７ｍｇ、６５％)をジアステレオマーの混合物として供した。¹Ｈ ＮＭＲ（ ４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ７．７９−７．６１(ｍ、４Ｈ)、７．３３−７ ．２５(ｍ、５Ｈ)、５．１１(ｓ、２Ｈ)、４．６９−４．５８(ｍ、１Ｈ)、３． ７３(ｓ、３／２Ｈ)、３．６９(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１８．１Ｈｚ)、３．６２( ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１８．１Ｈｚ)、３．５９(ｓ、３／２Ｈ)、３．４６(ｍ、２ Ｈ)、３．２７−３．０３(ｍ、３Ｈ)、２．８１(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ)、 ２．６９(ｔ、２Ｈ)Ｊ＝６．８Ｈｚ)、２．４２(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．８Ｈｚ)、 ２．１５(ｓ、３Ｈ)、２．０８−１．８０(ｍ、３Ｈ)、１．６９−１．５１(ｍ 、３Ｈ)。¹³Ｃ ＮＭＲ（５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１７３．３５、１７１．４ ２、１３２．３８、１３２．１１、１２９．９９、１２ ９．９３、１２９．８０、１２９．６７、１２９．６１、１２９．５６、１２９ ．４８、１２９．９４、１２８．６６、１２８．４９、６７．０７、６６．１６ 、６６．４３、６３．４０、５３．２８、５０．４９、５０．１８、５０．０６ 、４９．６４、４９．３６、４９．２１、４８．７９、３９．５８、３６．１４ 、３１．１４、３０．０７、２４．７３；高解像能質量スペクトル（ＥＩ）Ｃ₃₀ Ｈ₃₉Ｎ₂Ｏ₈Ｐとした。計算値５８６．２４４４(Ｍ⁺)、実測値５８６．２４２８ 。 酸１２を、酸７で記述したとおりにベンジルエステルからジアステレオマーの 混合物として定量的に再生した。¹Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃)δ ７ ．７４(ｍ、２Ｈ)、７．６０(ｍ、１Ｈ)、７．４９(ｍ、２Ｈ)、５．０２(ｍ、 １／２Ｈ)、４．９２(ｍ、１／２Ｈ)、４．２４(ｍ、２Ｈ)、３．８３(ｓ、３／ ２Ｈ)、３．７４(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１２Ｈｚ)、３．６７(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝ １２Ｈｚ)、３．５１(ｓ、３／２Ｈ)、２．７９(ｍ、１Ｈ)、２．７５(ｓ、３／ ２Ｈ)、２．７４(ｓ、３／２Ｈ)、２．４５(ｍ、１Ｈ)、２．３５(ｍ、６Ｈ)、 ２．０２(ｍ、２Ｈ)、１．２０(ｍ、４Ｈ)；¹³Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ₃ ＯＤ）δ１７５．９２、１７４．３３、１７３．７２、１４７．０６、１３２ ．８５、１３２．７２、１３０．６２、１３０．４１，１２９．５６、１２９． ２９、６７．３１、６５．２８、６４．３７、５３．６９、５３．４３、５３． ２４、４１．２５、３９．２１、３６．４２、３５．８３、３５．７０、３１． ３５、３０．５８、３０．０７、２４．５２、２３．５０；高解像能質量スペク トル（ＥＩ）Ｃ₂₃Ｈ₃₄Ｎ₂Ｏ₈Ｐとした。計算値４９７．２０５３(Ｍ＋１)、実測 値４９７．２０６４。 化合物１３。アセトニトリル（５ｍｌ）中に溶解させた酸１２（２３ｍｇ、０ ．０４９ミリモル）に、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（９ｍｇ、０．０５４ミリ モル）およびＤＣＣ（２０ｍｇ、０．０９７ミリモル）を添加した。臭化トリメ チルシリル（０．６５ｍｌ、０．４９ミリモル）とアミルアミン（０．５７ｍｌ 、０．４７ミリモル）との反応が、化合物８について開発されたプロトコールに よって進行して、アミド１３（８ｍｇ、３０％収率）を生成した。¹Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）７．６９(ｍ、２Ｈ)、７．３２(ｍ、２Ｈ)、４． ７５(ｍ、１Ｈ)、４．０８(ｍ、１Ｈ)、３．８６(ｍ、１Ｈ)、３．７１(ｓ、３ Ｈ)、３．３９(ｍ、３Ｈ)、３．１４(ｍ、２Ｈ)、２．８２(ｍ、５Ｈ)、２．４ ２(ｓ、３Ｈ)、２．３８−２．２２(ｍ、４Ｈ)、２．１３−２．００(ｍ、３Ｈ) 、１．４９(ｍ、２Ｈ)、１．３２(ｍ、４Ｈ)、０．９１(ｔ、３Ｈ、Ｊ＝１．５ Ｈｚ)。¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ１７３．３９、１５９．５ ３、１５９．２２、１４４．１０、１３２．２３、１３０．９５、１２９．６１ 、１１７．０４、６４．８３、６４．６２、６４．１２、６３．９２、６２．５ ３、４０．８９、３９．５４、３６．８３、３６．２３、３４．３１、３１．２ １、３０．５２、３０．１４、２９．２４、２７．９４、２３．９５，２１．４ ７；高解像能質量スペクトルＥＩ Ｃ₂₇Ｈ₄₃Ｎ₃Ｏ₇Ｐとした。計算値５５２．２ ８３９(Ｍ＋１)、実測値５５２．２８６３。 ＴＳＡ２。酸１２（７０ｍｇ、０．１４ミリモル）に、ＤＭＦ(４ｍｌ)、ＤＣ Ｃ（１１６ｍｇ、０．５７ミリモル）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（９２ ｍｇ、０．５７ミリモル）を室温で添加した。反応液を１２時間４℃で攪拌し、 真空で濃縮し、そしてＣＨＣｌ₃（１０ｍｌ）で洗浄しながら小さなコットン製 プラグを通して濾過した。この溶液のアリコート（２ｍｌ）に、ブロモトリメチ ルシラン（０．１ｍｌ、０．７６ミリモル）を添加した。準備と結合は、ＴＳＡ１ について開発されたプロトコールによって進行した。ＢＳＡに対する結合効率 は、１５対１であり、卵白アルブミンに対しては１０対１であった。 化合物１４。ＴＨＦ（３０ｍｌ）中のＮ−ノルコカイン（２０６ｍｇ、０．７ １３ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１８６μｌ、１． ０７ミリモル）に、１−アジド−４−インドブタン（１６０ｍｇ、０．７１３ミ リモル）を室温で添加した。反応混合液を２日間６０℃に加熱した。真空での濃 縮およびクロマトグラフィー精製（ＳｉＯ₂、１：９ ＥｔＯＡｃ：ヘキサン） により、エクゴニンエステル１４（２０５ｍｇ、７５％）を無色油状物として生 成した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ８．０２(ｄ、２Ｈ、Ｊ ＝６．０Ｈｚ)、７．５８(ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．１Ｈｚ)、７．４１(ｔ、２Ｈ、Ｊ ＝７．０Ｈｚ)、５．２５(ｍ、１Ｈ)、３．７０(ｓ、３Ｈ)、３．６８(ｍ、１Ｈ )、３．５０(ｍ、１Ｈ)、３．２８(ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．４Ｈｚ)、３．０ ３(ｍ、２Ｈ)、２．４３(ｍ、１Ｈ)、２．２６(ｍ、２Ｈ)、２．０４−２．００ (ｍ、２Ｈ)、１．８６(ｍ、１Ｈ)、１．７３−１．６５(ｍ、４Ｈ)、１．４７( ｔ、２Ｈ)；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１７１．４７、１６６ ．９６、１３３．７７、１３１．２４、１３０．５９、１２９．１６、６８．１ ０、６３．５５、６１．２４、５２．８９、５２．２１、５２．０５、５３．１ ３、３６．４９、２７．２９、２６．９５、２６．８６、２６．３４；高解像能 質量スペクトル（ＦＡＢ） Ｃ₂₀Ｈ₂₇Ｎ₄Ｏ₄とした。（Ｍ＋１）計算値３８７． ２０３２、実測値３８７．２０４１。 化合物１５。Ｎ−置換コカイン１４（２０５ｍｇ、０．５３ミリモル）を、９ ０℃で４時間水性ＨＣｌ（１０ｍｌ、０．７Ｎ）で加水分解した。混合液をエー テルで抽出し、濃縮し、そしてＨＣｌ（ｇ）で飽和したＭｅＯＨ（２５ｍｌ）に 溶解させた。６０℃で２時間後、溶媒を真空で除去し、そして残渣をＭｅＯＨに 溶解させ、そしてアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＩＲＮメトキシド交換 カラム（ポリサイエンシズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）(１ｍｌ)を 通過させて、粗遊離塩基を生成した。クロマトグラフィー精製（ＳｉＯ₂、５： ９５ ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ₃）により、アルコール１５（１０２ｍｇ、７２％） を生成した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ３．８０(ｍ、１Ｈ) 、３．６９(ｓ、３Ｈ)、３．０３(ｍ、１Ｈ)、３．６６(ｍ、２Ｈ)、３．２４( ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ)、３．１８(ｍ、１Ｈ)、２．７５(ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５ ．１Ｈｚ)、２．２１(ｍ、１Ｈ)、１．９５−１．７８(ｍ、４Ｈ)、１．６１− １．３８（ｍ、６Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１６９． ５８、６５．５５、６２．８９、６１．２７、５３．１０、５２．６１、５２． ２６、５２．１８、４１．２０、２７．３６、２７．０８、２７．０２、２５． ８３；高解像能質量スペクトル（ＦＡＢ） Ｃ₁₃Ｈ₂₃Ｎ₄Ｏ₃とした。（Ｍ＋１） 計算値２８３．１７７０、実測値２８３．１７７９。 化合物１６。０℃でのベンゼン（１５ｍｌ）中のエクゴニン誘導体１５（１０ ２ｍｇ、０．３７ミリモル）に、１Ｈ−テトラゾール(触媒)、Ｎ，Ｎ−ジイソプ ロピルエチルアミン（０．１６３ｍｌ、０．９４ミリモル）およびフェニルリン 酸ジクロライド（０．６７ｍｌ、０．４７ミリモル）を添加した。反応混合液 を一夜室温に加温させた。過剰のＭｅＯＨを添加し、そして混合液を室温で３時 間攪拌した。クロマトグラフィー精製（ＳｉＯ₂、５：９５のＭｅＯＨ中の４％ ＮＨ₄ＯＨおよび１：１混合のヘキサンとＣＨＣｌ₃）および前ＴＬＣ(２．５： ９７．５ ＭｅＯＨ：ＣＨ₂Ｃｌ₂)により、混合ジエステル１６をジアステレオ マーの混合物（７８ｍｇ、４９％）として得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、 ＣＤＣｌ₃）δ ７．６６(ｍ、２Ｈ)、７．６２(ｍ、１Ｈ)、７．４９(ｍ、２Ｈ )、５．０８(ｍ、１／２Ｈ)、４．９７(ｍ、１／２Ｈ)、４．３２(ｍ、１Ｈ)、 ４．１８(ｍ、１Ｈ)、３．８８(ｓ、３／２Ｈ)、３．７５(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝ １６．４Ｈｚ)、３．７１(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１６．４Ｈｚ)、３．４９(ｓ、３ ／２Ｈ)、３．４５−３．２５(ｍ、４Ｈ)、２．９８(ｍ、１Ｈ)、２．６３−２ ．２２(ｍ、４Ｈ)、２．１９−２．０１(ｍ、２Ｈ)、１．９２−１.６３(ｍ、４ Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１６０．１０、１５９．７ ２、１３３．３７、１３３．２３、１３１．６１、１３１．５３、１３１．４６ 、１３０．２９、１２８．８６、１２８．７６、１２８．６４、６６．７６、６ ３．７４、６３．５８、６２．５５、６２．４３、５４．４６、５４．１７、５ ２．６４、５１．６７、４９．１１、４８．７９、３６．５７、３６．２８、２ ６．９１、２５．５８、２５．１８、２４．１８；高解像能質量スペクトル（Ｆ ＡＢ）Ｃ₂₀Ｈ₃₀Ｎ₄Ｏ₅Ｐとした。（Ｍ＋１）計算値４３７．１９５４、実測値４ ３７．１９２８。 化合物１７。Ｍｅ₃Ｐ（０．１５６ｍｌ、ＴＨＦ中１Ｍ、０．１５７ミリモル ）を、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のアジド１６（１２ｍｇ、０．０２６ミリモル）に 添加し、そして反応液を、２時間室温で攪拌した。真空で濃縮した後、粗アミン をＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）に取り、琥珀酸無水物（２．６ｍｇ、０．０２６ミリモ ル）を添加した。反応混合液を室温で一夜攪拌し、そして濃縮した。粗成酸１７ をＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に溶解させ、そしてベンジルアルコール(０．０５ｍ ｌ、０．０４８ミリモル)、ＤＣＣ（１０ｍｇ、０．０４８ミリモル）およびＤ ＭＡＰ（触媒）を添加した。反応液を一夜室温で攪拌し、濃縮した。カラムクロ マトグラフィー（ＳｉＯ₂、５：９５ ＭｅＯＨ：ＣＨ₂Ｃｌ₂）および前ＴＬＣ （５：９５ ＭｅＯＨ ＣＨ₂Ｃｌ₂）により、ベンジルエステルをジアス テレオマーの混合物（１１ｍｇ、１３から得た７０％）として得た。¹Ｈ ＮＭ Ｒ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ７．７６ (ｍ、２Ｈ)、７．６３(ｍ、１Ｈ )、７．５１(ｍ、２Ｈ)、７．３２(ｍ、５Ｈ)、７．０１(広範なｓ、１Ｈ)、５ ．０９(ｓ、２Ｈ)、５．０３(ｍ、１／２Ｈ)、４．９４(ｍ、１／２Ｈ)、４．２ ９−４．０９(ｍ、２Ｈ)、３．８３(ｓ、３／２Ｈ)、３．７７(ｄ、３／２Ｈ、 Ｊ＝１７．１Ｈｚ)、３．６９(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝１７．１Ｈｚ)、３．４９(ｓ 、３／２Ｈ)、３．３８−３．２２(ｍ、４Ｈ)、３．０１(ｍ、２Ｈ)、２．６９ −２．３３(ｍ、８Ｈ)、２．０４−１．６０(ｍ、６Ｈ)；¹³Ｃ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１７２．９４、１７２．６８、１７２．０９、１３５． ８６、１３３．３０、１３１．６４、１２８．９０、１２８．７８、１２８．６ ５、１２８．５４、１２８．１７、１２８．８２、６６．２４、６５．８１、６ ２．７１、６２．５４、６１．１６、６１．０３、５２．９５、５１．４９、４ ７．６９、３７．６４、３５．１８、３０．４１、２９．３９、２５．６７、２ ４．００、２３．５４、２１．９５；高解像能質量スペクトル（ＦＡＢ）Ｃ₃₁Ｈ₄₂ Ｎ₂Ｏ₈Ｐとした。（Ｍ＋１）計算値６０１．２６７９、実測値６０１．２６７ ６。 酸１７を、酸７について記述されたとおりにベンジルエステルから定量的に再 生した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ７．７４(ｍ、２Ｈ)、７ ．６０(ｍ、１Ｈ)、７．４８(ｍ、２Ｈ)、５．０２(ｍ、１／２Ｈ)、４．９２( ｍ、１／２Ｈ)、４．３３−４．０９(ｍ、２Ｈ)、３．８３(ｓ、３／２Ｈ)、３ ．７４(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝２３Ｈｚ)、３．６７(ｄ、３／２Ｈ、Ｊ＝２３Ｈｚ) 、３．５１(ｓ、３／２Ｈ)、３．３３−３．１９(ｍ、６Ｈ)、２．９８(ｍ、１ Ｈ)、２．６３(ｍ、２Ｈ)、２．４９(ｍ、４Ｈ)、２．３４(ｍ、２Ｈ)、２．０ ６−１．９６(ｍ、２Ｈ)、１．８１−１．７６(ｍ、２Ｈ)、１．５７（ｍ、２Ｈ ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ１７５．２３、１７３．４１ 、１７２．０６、１３３．２１、１３１．６５、１２８．９０、１２８．５８、 ６５．８７、６２．７５、６０．８９、５３．３０、５２．９８、５１．５４、 ４８．１６、４７．７５、３７．６１、３１．０２、３０．３３、２５．７６、 ２４．１５、２３．５４、２１．９２；高解像能質量スペクトル（Ｅ Ｉ）Ｃ₂₈Ｈ₃₆Ｎ₂Ｏ₈Ｐとした。計算値５１１．２２０９(Ｍ＋１)、実測値５１１ ．２２１３。 化合物１８。ＣＨ₃ＣＮ（３ｍｌ）中に溶解した酸１７（６ｍｇ、０．０１２ ミリモル）に、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（２．２ｍｇ、０．０１３ミリモル ）およびＤＣＣ（５ｍｇ、０．０２４ミリモル）を添加した。臭化トリメチルシ リル（０．０１６ｍｌ、０．１２ミリモル）とアミルアミン（０．１４ｍｌ、０ ．０１２ミリモル）との反応は、化合物８について開発されたプロトコールによ って進行して、アミド４（４．４ｍｇ、６５％）を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ ７．８１(ｍ、２Ｈ)、７．５６−７．３８(ｍ、３Ｈ) 、５．９５(ｍ、１Ｈ)、５．３９(ｍ、１Ｈ)、５．０５(ｍ、１Ｈ)、４．７９( ｓ、３Ｈ)、４．２９−４．１２(ｍ、６Ｈ)、３．６１−３．０４(ｍ、１０Ｈ) 、２．８３−２．３４(ｍ、１１Ｈ)、０．９４(ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ)。¹³ Ｃ ＮＭＲ(３００ＭＨｚ)、δ１７５．１２、１７４．９８、１７４．３９、１ ３２．４９、１２９．３６、１２９．２１、６５．７９、６４．７２、６２．２ ６、５３．３３、５２．５２、４０．４４、３９．０１、３６．７８、３２．１ ７、３１．９１、３０．２３、３０．１４、２７．３９、２４．６９、２４．３ ２、２３．４５、２３．２２、１４．３６；高解像能質量スペクトル（ＦＡＢ） Ｃ₂₈Ｈ₄₅Ｎ₃Ｏ₇Ｐとした。（Ｍ＋１）計算値５６６．２９９５、実測値５６６． ２９９７。 ＴＳＡ３。ＤＭＦ（２ｍｌ）中の酸１７（１２ｍｇ、０．０２３ミリモル）お よびＮ−ヒドロキシフタルイミド（１６ｍｇ、０．０９６ミリモル）に、ＤＣＣ （１９ｍｇ、０．０９６ミリモル）を添加した。反応液を、４℃で一夜攪拌し、 真空で濃縮し、そしてＣＨＣｌ₃（１０ｍｌ）で濾過した。活性化エステルを、 −２０℃でＣＨＣｌ₃溶液（１０ｍｌ）として保存し、そして精製なしに使用し た。臭化トリメチルシリル（０．０５０ｍｌ、０．３７９ミリモル）を、５ｍｌ アリコートの活性化エステルに室温で添加した。準備および結合はＴＳＡ１につ いて開発したプロトコールによって進行した。ＢＳＡに対する結合比は、１１： １であり、卵白アルブミンに対しては１２：１であった。 ハイブリドーマ作成 先に記述（９）したとおり、ＢＡＬＢ／ｃマウスを類似担体で免疫化し、そし て免疫応答をＥＬＩＳＡによって行った。ハイブリドーマを標準法（９，１７） によって製造した。 ハイブリドーマ細胞（〜２×１０⁶）を、プリスタンで前処理されたマウスの 腹膜に注入するか、またはＴ−１５０フラスコ細胞培養にプレーティングした。 回収した腹水または細胞培養上清を、分取プロテインＡ ＨＰＬＣカラム（バイ オーラッド(Ｂｉｏ−Ｒａｄ)）でアフィニティークロマトグラフィーにかけた( ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって純度＞９０％)。触媒的に活性 な抗体のサンプルを、コカインエステラーゼ活性を損失することなく、０．０２ Ｍトリスと、ｐＨ８．８／０．０Ｍ ＮａＣｌからｐＨ７．０／０．３Ｍ Ｎａ Ｃｌまでのリニヤー勾配とを使用した分析用ＤＥＡＥカラム（トーショー・ハス （ＴＯＳＯＨ ＨＡＳＳ）ＴＳＫ−ゲル）を用いた陰イオン交換ＨＰＬＣによっ て精製した。 結合試験のためのプロトコール（ＣＩＥＩＡ） プレートを、ＣＩＥＩＡの目的である触媒抗体を誘起するＴＳＡ（卵白アルブ ミンに結びついた）で被覆した。遊離ＴＳＡ４またはＴＳＡ関連アミド類８、１ ３ または１４を、公表されたプロトコールによって、誘起性ＴＳＡへの抗体の結 合の阻害を試験した(２０ｂ)。 速度論的測定についてのプロトコール ５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ８．０（２Ａ１０および６Ａ１２はｐＨ７ ．０であることを除く）中の触媒抗体を、特に５つの濃度で、³Ｈ−コカインと インキュベートした。３回の間隔で、アリコート量を冷ＨＣｌ（水溶液）で、最 終ｐＨ２に酸性化し、ヘキサン−ジエチルエーテル（１：１）に分配し、そして 有機相をシンチレーション計数によって分析した。抗体がない以外は同一の反応 でバックグラウンドの加水分解を測定し、そして観察された速度を修正した。ア ッセイを、標準誤差＜１０％で三重に行った。対照として、アセトニトリル−水 （０． １％トリフルオロ酢酸）勾配および２２０ｎｍに設定された検出器を伴う分析用 逆相Ｃ₁₈カラム（ＶＹＤＡＣ）を使用して、ＨＰＬＣ（パーキン−エルマー(Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ)）によって、安息香酸の放出が確認された。 抗体を有しない反応混合物のＨＰＬＣ分析では、コカインのメチルエステルが 、ｔ_1/2＝２０時間（ｐＨ７）で、自然にベンゾイルエクゴニンに加水分解する ことが示された。したがって、ベンゾイルエクゴニンは、³Ｈ−コカイン加水分 解アッセイの初期反応時間でのベンゾイルエステラーゼ基質としては利用できず 、そして安息香酸の放出はコカイン加水分解物にのみ起因する。 アミノ酸配列決定 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって軽および重鎖を分離し、そ してその後、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ）４７０Ａまたは４７７Ａシーケンサーでの自動エドマン（Ｅｄｍａｎ） 分解による直接ＮＨ₂−末端シーケンシングについてのポリビニリデンジフルオ ライド膜（３０）にエレクトロブロットした。内部配列を得るために、２Ａ１０ ，１９Ｇ７，９Ａ３および１５Ａ１０から得た別々のバンドを、ジチオスレイト ールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、そして１Ｍ尿素、０.０５ Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃、ｐＨ８．０中のトリプシン（３１）で切断した。ペプチド断 片を膜から抽出し、アセトニトリル−水（０．０７％トリフルオロ酢酸）勾配を 用いた逆相Ｃ₄カラム(ＶＹＤＡＣ)上でのＨＰＬＣ（ヒューレット−パッカード( Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ)）によって分離し、そして配列した。 可変ドメインのＰＣＲクローニング 触媒抗体を生成するマウスのハイブリドーマセルラインを、１×１０⁸細胞に 育成し、そしてグアニジンチオシアネート／フェノール手段（３２）の微細適応 およびオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム上での選択を使用して総ＲＮＡを製造し た。 分解および非分解オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを、アミノ酸配列（２ Ａ１０，１５Ａ１０）またはＫａｂａｔらのデータベース（２４）を使用して設 計した。制限エンドヌクレアーゼ部位を、それらの５’プライマー末端でプライ マーに組込んで、クローニングを促進した。利用した制限部位は、Ｅｃｏ ＲＩ 、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｂａ ＩまたはＸｈｏ Ｉであった。各ハイブリドーマ・ライ ンの軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）のセンスおよびアンチセンス・オリゴヌク レオチドプライマーは、以下のとおりであった：９Ａ３、１９Ｇ８、１５Ａ１０ 、８Ｇ４Ｅおよび８Ｇ４Ｇについては、ＬＣ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＩＡ ／ＴＣ／ＧＩＣＣＩＧＧＩＧＡＡ／ＧＡＣＩＧ−３’および５’ＧＣＴＣＧＡＧ ＣＣ／ＴＴＣＡ／ＧＴＧＩＧＴＩＡＣＩＴＧＡ／ＧＣＡ−３'。３Ｂ９、６Ａ１ ２ および１２Ｈ１については ＬＣ：５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡ ＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’および５’−ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧ ＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡ ＴＴＣＣＴＧＴ ＴＧＡＡ−３'。２Ａ１０につい てＬＣ：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＡＴ／ＣＡＴＩＧＴＩＡＴＧＡＣＩＣＡ Ａ／ＧＧＡＴ／ＣＧＡ−３’および５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡ／ＧＴＴＡ／ＧＴ ＧＩＣＴ／ＣＴ／ＣＴＣＡ／ＧＴＡＴ／ＣＴＣＡ／ＧＴＣ−３'。３Ｂ９、６Ａ １２ 、１２Ｈ１、９Ａ３、１９Ｇ８、８４Ｇ４Ｅにつて ＨＣ：５’−ＡＧＧＴ ＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’および５’−ＡＧＧＣＴＴＡＣＴ ＡＧＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴ−３'。２Ａ１０については Ｈ Ｃ ：５’−ＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣ−３’および５’ −ＡＴＡＡＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣ−３'。１５Ａ１０については ＨＣ：５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴ ＣＣ−３’および５’−ＡＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴ ＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３'。 ０．５μｇのハイブリドーマｍＲＮＡおよびモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）のネ ズミの白血病ウイスル逆転写酵素を用いて、ＤＮＡテンプレートを合成した。３ ０サイクルの変性（９６℃、１分間）、アニーリング（５０℃、１分間）および 伸長（７２℃、３分間）について、パーキン−エルマー／キャッズ（Ｐｅｒｋｉ ｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃａｄｓ）熱サイクルで増幅を行った。ＰＣＲ産物を１．５％ アガロースゲルでの電気泳動によって精製した。各反応から得た単離ＰＣＲ産物 を・ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミドにサブクローニング し、そして開放読取り枠の存在についてＤＮＡ配列分析法によって分析した。Ｉ ＢＩマックベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）３．０プログラムを使用してヌクレ オチド配列を配列させた。実験結果 遷移状態近似体の合成 水酸化物による二次エステル加水分解反応に関する遷移状態の幾何学的形態及 び電荷分布を安定に模擬するホスホナートモノエステルは、いくつかの例におい て高活性の触媒抗体を生じさせた(８)。しかしながら、そのような近似体はあら ゆる触媒抗体を特異的に誘起しないことも知られており、従って、近似体の構成 に関する法則を経験的に定義しなければならない(１１)。近似体の効率を改善す るための戦略が「おとり商法(bait and switch)」（１１）及び基質希釈（１２） を含めて考案されたが、そのような手段のコストは、平均してＫ_m値が高い触媒 抗体を生じる近似体と基質構造の間の相違である。蒸発させたコカインの吸入は １０〜２０μＭの最高肺動脈濃度をもたらし(１３)、これはエステラーゼ活性を 有するほとんどの触媒抗体のＫ_mより小さい。コカインの飽和下濃度では、より 高いＫｍは、回転速度を低くし、既に極限となっている高Ｋ_catの必要性を高め るものである。従って、アシル基におけるホスホネート置換により、そして免疫 原性複合体の構成へのテザー（tether）の組み込みによってのみコカインと異な る高い忠実度の近似体の構成を選択した。それらの反応の座からの距離及びそれ らの相互の間隔に基づいて、近似体１に関するメチルエステル、近似体２に関す るフェニル基の４’位及び近似体３に関するトロパン窒素の３つのテザー部位を 選択した(図１)。「遊離のＴＳＡ」はテザーを有さない構造４に相当していた。 ＴＳＡ１の合成は市販の出発物質（−）エクゴニン（図２）を用いて開始した 。（−）エクゴニンのカルボン酸塩の４−アジド−１−ヨードブタンによる選択 的アルキル化によりエステル５が７８％の収率で得られた。Ｃ−２におけるエピ マー化が存在しないことは、¹Ｈ−ｎｍｒ分光法により確認した。アルキルエク ゴニン５の塩基に対して不安定で、立体障害性のアルコールは１Ｈ−テトラゾー ル 触媒反応の手順（１４）を用いてフェニルホスフィン酸ジクロリドと円滑に反応 し、メタノールの付加によりホスホナートジエステル６が８９％の収率で得られ た。Ｐ（ＣＨ₃）₃による不安定アミンへの還元及び１，４−¹⁴Ｃ−無水コハク酸 によるアシル化によりアジド部分においてテザーが形成された。ヘミスクシナー トを精製したところ、６から得られたベンジルエステルとして特徴付けられ、触 媒水素化分解により酸が定量的に再生された。酸７はＮ−ヒドロキシフタルイミ ドエステルとして活性化され、トリメチルシリルブロミドによりホスホナートメ チルステルにおいて選択的に脱エステル化された(１５)。不安定なモノホスホナ ート生成物は直ちに担体タンパク質と結合して、ＴＳＡ−１が生成する。近似体 対担体の結合比率は、タンパク質への放射性標識物質の取り込みに基づいて、ウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）では６：１で、卵白アルブミンで１５：１であった 。担体結合近似体への構造の我々の帰属を支持して、モノホスホナートの試料の 一部をｎ−アミラミンに結合させたところ、予期されたアミド８が得られた。 ＴＳＡ−２の合成には、テザーの形成のための４’位においてフェニルホスフ ィン酸ジクロリドを適切に置換させることが必要であった(図３)。２−（ｐ−ブ ロモフェニル）エタノールのシリル化の後、ｎ−ブチルリチウムを用いて金属交 換反応を行わせ、ジエチルクロロホスファートでクエンチングし、脱シリル化し て、アルコール９ａを２３％の収率で得た。９ａのトシラートをアジドで置換し 、トリメチルシリルブロミドを用いてエステル交換反応を行わせた後、オキサリ ルクロリドと反応させ(１６)、必要とするフェニルホスフィン酸ジクロリド１０ を得た。上記のテトラゾール触媒反応法を用いて、塩化物１０をエクゴニンメチ ルエステルと結合させ、メタノールの付加の後に、混合ジエステル１１を２５％ の収率で得た。ＴＳＡ−１に用いたのと同じ一連の反応によってアジドからテザ ーが形成された。 ＴＳＡ−３の合成のために、（図４）Ｎ−ノルコカインを７５％の収率でモノ アルキル化し、酸加水分解の後に、酸性メタノールで再エステル化してアルコー ル１５を７２％の収率で得た。混合ホスホナートジエステル１６のテトラゾール を触媒とする合成は４８％の収率で進行し、上記のようにアジドからテザーが形 成された。 抗コカイン触媒抗体の生成 Ｂａｌｂ／ＣマウスをＢＳＡに結合させた個々の近似体で免疫し、高力価の抗 血清を各抗原により引き出された。モノクローナル抗体を標準的なプロトコール （９，１７）により調製し、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により決定される近似体 特異性の抗体を分泌するハイブルドーマを選択した。すべてのＩｇＧ抗近似体抗 体をサブクローンし、腹水又は細胞培養フラスコ中で増殖させ、プロテインＡア フィニティークロマトグラフィーにより精製した。触媒抗体は、³Ｈ−フェニル コカインから³Ｈ−安息香酸を放出させるその能力により同定した。放射性標識 安息香酸は、都合のよいことに酸性化反応混合物の抽出によって³Ｈ−コカイン から有機溶媒中に分配される。市販のカルボキシルエステラーゼによるコカイン の加水分解を陽性対照として用い、安息香酸の生成を高性能液体クロマトグラフ ィーにより確認した。９種の融合細胞（fusion）からの１０７種の抗近似体抗体 のうち合計９種の触媒抗体が同定され、ＴＳＡ１は５０種のうち６種を生成させ 、ＴＳＡ３は４９種のうち２種を生成させた。ＴＳＡ−２は８種の抗近似体抗体 を生成させ、そのうち１種が触媒抗体であった。触媒抗体を更にＤＥＡＥアニオ ン交換クロマトグラフィーにより精製したところ、それらは活性を保持していた 。すべての酵素は５０μＭの遊離のＴＳＡ４によって完全に阻害され(下記参照) 、試験した各抗体のＦａｂ部分は触媒活性を保持しており、また、血清エステラ ーゼ類の強力な阻害物質であるエセリン（１８）は１ｍＭであらゆる触媒ｍＡｂ の活性を阻害せず、１５０μＭの遊離のＴＳＡ４は血清中に存在するコカインエ ステラーゼ活性を阻害しなかった(結果は示さず)。 触媒抗体の特性の検討 各モノクローナル抗体の存在下及び非存在下における基質濃度の関数としての³ Ｈ−フェニルコカインの加水分解速度を測定した。５％未満の反応に対応する 時点における放射性標識安息香酸の生成から初期速度を求めた。各人工酵素につ いて動力学的飽和及び線形のLineweaver-Burkプロットが得られることが認めら れた。９種の触媒抗体の一次速度定数（ｋ_cat）及びミカエリス定数（Ｋ_m） は、表１に示すようにそれぞれ０．０１１〜２．３ｍｉｎ^-1及び１５０〜３００ ０μＭの範囲にあった。 表１ ³Ｈ−コカインのＭａｂによる加水分解の動力学的パラメータ Ｍａｂ ＴＳＡ Ｋ_m（μＭ） ｋ_cat(min^-1) ｋ_cat／ｋ₀ ３Ｂ９ １ ４９０ ０．１１ １１００ ６Ａ１２ １ １０２０ ０．０７２ ８８０ ２Ａ１２ １ ３０００ ０．０１１ ４２０ ９Ａ３ １ ２７０ ０．０１５ １４０ １９Ｇ８ １ ９００ ０．０９１ ８３０ １５Ａ１０ １ ２２０ ２．３ ２３０００ １２Ｈ１ ２ １５０ ０．１６ １５００ ８Ｇ４Ｇ ３ ５３０ ０．６０ ５５００ ８Ｇ４Ｄ ３ １２００ ０．１２ １１００ ミカエリス定数 Ｋ_m； 触媒速度定数 ｋ_cat； 及び自発速度 ｋ₀。 アッセイは、ｋ_cat／ｋ₀を最適にするｐＨ、すなわち一般的にｐＨ７．８、６Ａ １２についてはｐＨ７．４、２Ａ１０についてはｐＨ７．０で行った。 最も活性な触媒抗体であるＭａｂ １５Ａ１０の速度の加速はＭａｂ ３Ｂ９ について以前に報告された（９）ものより高く、そしてミカエリス定数は低かっ た。これはコカインの飽和下濃度における活性のほぼ２桁の大きさの向上に相当 している。Ｍａｂ ３Ｂ９は遊離のＴＳＡ ４に関するＫ_mとＫ_iの比に見合った 速度加速を示したことも報告された。この比は、遷移状態を基準とした基底状態 における抗体の親和性を近似するものであり、Ｍａｂ ３Ｂ９の場合、速度の加 速が主として遷移状態の安定化に起因していたことを示唆していた(１９)。 Ｍａｂ １５Ａ１０に対する遊離のＴＳＡ ４の阻害定数（Ｋｉ）は０．２３μ Ｍと測定され、この触媒抗体の速度の加速（ｋ_cat／ｋ_uncat＝２．^{3 ×}１０⁴）は Ｋ_m／Ｋｉ（９．６×１０²）を有意に超えていた。 すべての触媒抗体に関する解離定数Ｋ_TSAは、競合的阻害酵素免疫定量法(２ ０)により表２のように測定された(ＣＩＥＩＡ)。 表２ 触媒Ｍａｂの競合的阻害酵素免疫定量 ＭＡｂ（ＴＳＡ） Ｋ ₄ (μＭ) Ｋ ₈ (μＭ) Ｋ ₁₃ (μＭ) Ｋ ₁₈ (μＭ) ３Ｂ９ （１） ０．０１ ０．０２ ３ １００ ６Ａ１２ （１） ０．０１ ０．０１ ４ ９０ ２Ａ１０ （１） ０．５ ３ ２０ １５０ １２Ｈ１ （２） ０．００１ ０．０１ ２ ６０ ９Ａ３ （１） ０．０５ ０．０２ − ０．００３ １９Ｇ８ （１） ０．００８ ０．００１ − ０．００１ １５Ａ１０（１） ０．００９ ０．００３ − ０．０００５ ８Ｇ４Ｇ （３） ０．００３ ０．００１ − ０．００１ ８Ｇ４Ｅ （３） ０．００３ ０．０００５ − ０．００３ Ｍａｂを誘起したＴＳＡ（卵白アルブミンにテザーした１、２又は３）に対す るＭａｂの結合の競合的阻害により、遊離のＴＳＡ ４及びＴＳＡ関連アミド８ 、１３又は１８に関する解離定数を各触媒ＭａｂについてＣＩＥＩＡにより測定 した。 ＣＩＥＩＡにより測定したＫ_TSAは、Ｋ_iの相対的な尺度となり、非常に低い抗 体濃度でのアッセイを可能にする。図１に示すように、ｋ_cat／ｋ_uncat対Ｋ_m／ Ｋ_TSAの両対数プロットは９種の触媒抗体のうちの７種について直線関係（ｒ＝ ０．８５）を示した。Ｋ_TSAはＫ_i比例するので、Ｍａｂ ３Ｂ９に関するｋ_cat ／ｋ_uncat≒Ｋ_m／Ｋ_iという関係は７種類の抗体すべてについて成り立つと考え られる。Ｍａｂ １５Ａ１０は、上記のようにｋ_cat／ｋ_uncatはＫ_m／Ｋｉを超 えていたので、予測通りこの直線から逸脱した。Ｍａｂ ８Ｇ４Ｇも示されてい るように明らかに逸脱していた。従って、１５Ａ１０及びおそらく８Ｇ４Ｇに関 する速度の加速はあまりにも大きくて遷移状態の安定化のみに帰着させることが できないように思われ、酸−塩基又は求核触媒作用のような化学的触媒作用が関 与している可能性がある。 Ｍａｂ １５Ａ１０は、コカインの加水分解生成物である１ｍＭの濃度のエク ゴニンメチルエステルによる阻害を受けなかった。安息香酸は阻害を起こし、Ｋ ｉは２５０μＭであった。しかしながら、ヒトにおいては、安息香酸の血漿中濃 度は馬尿酸への速やかで、ほぼ完全な転化により著しく低減する(２１)。１ｍＭ の馬尿酸はＭａｂ １５Ａ１０を阻害しないことが見いだされた。また、ヒトに おけるコカインの顕著な代謝物である１ｍＭのベンゾイルエクゴニンによる阻害 も認められなかった(２２)。繰り返しの回転によるＭａｂ １５Ａ１０の不活性 化は認められず、６時間後で２００を超える回転で、ｋ_catはベースラインの９ ５％より大きい値に留まっていた。エクゴニンメチルエステルによる極わずかな 生成物阻害の存在は思いがけないことであり、生成物阻害を最小限にするそれの 能力及び活性な酵素の収率を増加するそれの能力のため、ＴＳＡ １、２及び３ ならびに対応するコカインの１，２−アミノアルコール近似体による異種免疫感 作（２３）が計画されている。 担体タンパク質（ＢＳＡ）に対するＴＳＡのテザー部位を変化させる根拠は、 特有のエピトープを暴露し、各免疫原に特異的な触媒抗体を選択するためである 。結合特異性を評価するために、卵白アルブミンに結合させたＴＳＡ １、２及 び３を用いて触媒抗体をＥＬＩＳＡにより検査した。意外なことに、３つの複合 体すべてに結合した「３Ｂ９群」(Ｍａｂ ３Ｂ９，６Ａ１２，２Ａ１０，１２ Ｈ１)と、ＴＳＡ−１及び３のみに結合した「９Ａ３群」(Ｍａｂ ９Ａ３，１９ Ｇ８，１５Ａ１０，８Ｇ４Ｇ，８Ｇ４Ｅ)の広い親和性を有する２つの群が識別 された。 これらの群内のＴＳＡ １、２及び３に対する親和性を推定するために、対応 するアミド８、１３及び１８の相対的Ｋ_dを測定した。図２に示すように、ＣＩ ＥＩＡにより、触媒抗体の同じ２つの広い群が識別され、ＥＬＩＳＡの結果が確 認された。３Ｂ９群は次の親和性の序列を示した：８＞１３＞１８。各抗体を引 き出したＴＳＡのアミドの相対的Ｋ_dは、Ｍａｂ ３Ｂ９及び６Ａ１２における ０．０１ＭからＭａｂ １２Ｈ１における３μＭの範囲にあった。ＴＳＡ ２に より誘導されたＭａｂ １２Ｈ１は、ＴＳＡ１関連アミド８（０．０１μＭ）に 対して、ＴＳＡ２関連アミド１３（２μＭ）に対するより大きい親和性を示した 。ＴＳＡ １はＭａｂ １２Ｈ１を引き出すことができ、Ｍａｂ ３Ｂ ９、６Ａ１２及び２Ａ１０の１３に対する親和性もおそらくＴＳＡ ２がそれら を引き出すのに十分であると思われる。ＴＳＡ３関連アミドに対する３Ｂ９の非 常に低い親和性は、ＴＳＡ ３がこの群を引き出すことができなかったことを示 唆している。 ９Ａ３群は明確に異なるパターンを示し、ＴＳＡ１関連アミド８に対して非常 に高い親和性を示したが、ＴＳＡ２関連アミド１３に対して実質的に親和性を示 さなかった。明らかに、ＴＳＡ １又はＴＳＡ ３はこの群のあらゆるメンバー を引き出すことができたが、ＴＳＡ ２はどれも引き出すことができなかった。 触媒Ｍａｂの構造的多様性を評価するために、各抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領 域のｐｃｒクローニング及び配列決定を行った。プライマーは一般的に公表され た合意の配列（２４）のものとした。各反応の６００〜７００ｂｐのｐｃｒフラ グメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローンし、独立して作製したクローンの 両方向の配列決定を行った。推定された主要なアミノ酸の構造は、基準触媒抗体 サンプル由来のＮ末端アミノ酸配列を含んでいた。アミノ酸配列決定からＭａｂ ２Ａ１０及び１５Ａ１０のｐｃｒクローニングのためのプライマーも得られた。 比較のために相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）の配列決定を行った（表３）ところ 、抗コカイン触媒抗体のいくつかの別個のファミリーが同定された。表３ 触媒抗体Ｌ鎖ＣＤＲ’ｓ（パネルＡ）及びＨ鎖ＣＤＲ’ｓ（パネルＢ） の推定されたアミノ酸配列 ＴＳＡ １は２つの構造ファミリー３Ｂ９−６Ａ１２−２Ａ１０及び９Ａ３− １９Ｇ８−１５Ａ１０を生じさせた。３Ｂ９ファミリー内のペアリングのための Ｌ鎖のＣＤＲ相同性は平均９６％であり、９Ａ３ファミリー内では９３％で、一 方、これらのファミリー間ではその平均値は１４％であった。３Ｂ９ファミリー 内のＨ鎖ＣＤＲ相同性は高く、３Ｂ９と６Ａ１２は同じであり、２Ａ１０は６７ ％の相同性を示した。９Ａ３ファミリー内では平均のＨ鎖ＣＤＲ相同性は８８％ であったが、３Ｂ９及び９Ａ３ファミリー間では平均値は３２％であった。ＴＳ Ａ３は２つの単一メンバーのファミリー８Ｇ４Ｇ及び８Ｇ４Ｅを生じさせた。８ Ｇ ４ＧのＬ鎖ＣＤＲ相同性は、９Ａ３群に対して６８％の相同性を示し、他の群に 対して２０％以下の相同性を示した。８Ｇ４Ｅは、３Ｂ９群に対して５６％の相 同性を示し、他のすべての群に対して２０％以下の相同性を示した。８Ｇ４Ｇ及 び８Ｇ４Ｅ間のＨ鎖ＣＤＲ相同性は、２４％であり、それぞれ９Ａ３群に対して ４８％で、他のすべてに対して２０％未満であった。ＴＳＡ−２により誘導され たＭａｂ １２Ｈ１は、３Ｂ９−６Ａ１２−２Ａ１０群のＬ鎖ＣＤＲに対して高 い相同性（９６％）を示し、３Ｂ９及び６Ａ１２のＨ鎖ＣＤＲと同じであった。 単一鎖Ｆｖフラグメントの合成の例 触媒モノクローナル抗体の単一鎖Ｆｖフラグメントを次のような構成により調製 した。 Ｖ_H及びＶ_LのＭａｂ ３Ｂ９ ＤＮＡを次のプライマーＶ_H： ５’ＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴ ＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣ３’ 及び ５’ＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣ３’ 及び次のプライマーＶ_L： ５’ＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴ３’ 及び ５’ＴＡＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡ３’ を用いてＰＣＲによりサブクローンした。 Ｖ_LのＤＮＡをＮｃｏ Ｉ及びＸｈｏ Ｉにより消化し、ｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏ ｖａｇｅｎ）に導入した。Ｖ_HのＤＮＡをＮｄｅ Ｉ及びＳｐｈＩにより消化し 、次のリンカー配列を含むｐＵＣ１８に導入した。 （ＳｐｈＩ）−ＣＡＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧ ＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣ−（ＮｃｏＩ） このプラスミドをＮｄｅＩ及びＮｃｏＩにより消化し、Ｖ_LのＤＮＡを含むｐ ＥＴ２０ｂに導入した。次いで、このプラスミドをＸｈｏ Ｉにより消化し、フ ラッグ配列をコードする次の配列を導入した：ＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧ ＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣ。 得られたプラスミドをｂｌ２１（ｄｅ３）ｐＬｙｓＳに転換した。細胞をＬＢ培 地中、３７℃で増殖させた。ＯＤ₅₅₀が０．６でＩＰＴＧを最終濃度２ｍＭとな るまで加え、細胞を回収の前に更に２時間増殖させた。細胞を培養の２０倍の結 合緩衝液（５ｍＭ イミダゾール／０．５Ｍ ＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ Ｈ ７．９）で懸濁し、凍結により破壊し、解凍して、遠心分離（１００００ｇ ×２０分）により細胞沈殿物を除去した。上清をＨｉｓｔＢｉｎｄ樹脂カラム（ Ｎｏｖａｇｅｎ）に通し、６Ｍ尿素／１Ｍイミダゾール／０．５Ｍ ＮａＣｌ／ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．９で溶離させた。 得られた単一鎖ＦｖフラグメントのＥＬＩＳＡ分析から、結合活性が示された 。酵素活性は、³Ｈ−フェニルコカインからの³Ｈ−安息香酸の遊離により確認し た。 実験に関する考察 コカインに対する触媒抗体の臨床適用は、抗体結合によってのみ拮抗されるな らば１００ｍｇの用量のコカインは２５ｇの抗体を必要とする（抗体の分子量が １５０ｋＤで、コカイン：抗体の量論比が２：１と仮定すると）ので、動力学的 な論拠に依拠している。免疫複合体にテザーされたコカインによる能動免疫化は 、この必要量の数パーセント以上に寄与するものとは考えられない(２５)。ポリ クローナルガンマグロブリンは、この大きさの用量で投与することができるが、 明らかに酵素回転のみが抗体の必要性を実際的な大きさに低減させており、非常 に重要なことに、反復自己投与の義務（常習癖の折紙）を見込んだものである。 用量当たりのコストを著しく低減させる抗コカイン触媒抗体の最適化は、近似 体のデザインの改善、大規模な抗体選択（２６）及び抗体突然変異誘発（２７） によりアプローチすることができる。Ｍａｂ １５Ａ１０及び８Ｇ４Ｇは、最も 活性な触媒抗体であり、構造的に明確であり（下記参照）、Ｍａｂ １５Ａ１０ 及びおそらく８Ｇ４Ｇは化学的触媒作用を既に顕現していると思われることから 、最適化ための好適な候補である。コカインの古典的な受容体遮断薬を特定する 努力の数十年の失敗は、コカイン問題の人を動かさずにおかない性質とともに、 ３ つのすべてのアプローチを用いた網羅的な戦略を正当化している。この努力に対 する１つの障害は、ある近似体によって引き出される抗体の多様性が限られてい ることである。明らかに、もし偶発的に１つのクラスの抗体が最終的に望ましい 動力学的パラメーターを有するメンバーを生ずるならば、抗体の多様性は必要で はない。しかしながら、触媒抗体の構造データが不足しているため、規格に対し て最適化される抗体の能力は予測することができない。抗コカイン触媒抗体の多 様な群の発生は、反復的な大規模ハイブリドーマ製造によるか、突然変異誘発に よるかを問わず、最適化の成功の見通しを改善させるものである。 ホスホナートエステル合成のためのテトラゾール触媒反応法を用いて、コカイ ン加水分解の３種の遷移状態近似体を合成した。各々においてコアとなるホスホ ナートエステル構造は同一で、テザー部位のみが異なっている。３種の引き出さ れた触媒抗体のすべてを用い、競合的ＥＬＩＳＡ及びＣＤＲ配列決定を用いてそ れぞれ機能的及び構造的な分類を定義した。 活性な抗体のＣＤＲの比較から、ＴＳＡ １（３Ｂ９−６Ａ１２−２Ａ１０及 び９Ａ３−１９Ｇ８−１５Ａ１０）及びＴＳＡ ３（８Ｇ４Ｇ及び８Ｇ４Ｅ）に よって特異的に引き出された４種の重複のない別個のファミリーが描出された。 ＴＳＡ ２は、ＴＳＡ １より誘導された３Ｂ９−６Ａ１２−２Ａ１０ファミリ ーと高度に相同性を有し、ＴＳＡ ３により誘導された抗体と相同性を有さない １つの抗体を生じさせた。これらの構造的ファミリーは、アミド８、１３及び１ ８ （それぞれＴＳＡ １、２及び３を表す）による各触媒抗体のその引き出した ＴＳＡへの結合阻害が認められたＣＩＥＩＡ法によって定義された２つの広い群 と一部重複していた。 ＣＩＥＩＡによって定義された１つの群は、Ｍａｂ ３Ｂ９、６Ａ１２、２Ａ １０及び１２Ｈ１からなっていた。この群は、８に対して高い親和性を、１３に 対して中等度の親和性を、そして１８に対して低い親和性を示した。この群の高 度に相同性のメンバーのすべてはＴＳＡ １によって引き出されたと思われ、Ｔ ＳＡ ２によって誘導された１つの抗体Ｍａｂ １２Ｈ１は、ＴＳＡ２関連アミ ド１３より大きい親和性を有するＴＳＡ １関連アミド８に結合した。それにも かかわらず、この群における１３に対する親和性の範囲が各抗体を引き出したＴ ＳＡ’ｓのアミド類に対する親和性の範囲と重複していたことから、この群のす べてでないにしても大部分がＴＳＡ ２によって引き出されたという可能性があ る。これに対して、この群のあらゆるメンバーに対する１８の親和性が非常に低 いことは、ＴＳＡ ３はこの群のどのメンバーも生じさせることができなかった ことを示唆している。トロパン窒素においてテザーされたＴＳＡのみに基づいて コカインに対する触媒抗体を得る戦略（２８）によっては、この群の抗体の特定 することができなかったと思われる。 ＣＩＥＩＡによって定義された第二の群は、３つの構造的ファミリー、すなわ ち、ＴＳＡ １により誘導された９Ａ３−１９Ｇ８−１５Ａ１０ならびにＴＳＡ３ により誘導された８Ｇ４Ｇ及び８Ｇ４Ｅからの５種の触媒抗体からなっていた 。これらの５種の抗体はアミド８及び１８に対して同等に高い親和性を示し、そ してＴＳＡ １又は３は基本的にはこの群におけるあらゆる触媒抗体を引き出す ことができたと思われる。ＴＳＡ １及び３が共通の構造的ファミリーのメンバ ーを生じさせなかったことは、近似体当たり平均３融合細胞（fusion）という標 本の大きさが不適切であったことを反映している可能性がある。５種の抗体のい ずれもＴＳＡ ２により得ることができず、従って、４つの構造的ファミリーの うちの３つはこの複合体により特定されなかったことになる。 ＴＳＡ １は最も活性な触媒抗体Ｍａｂ １５Ａ１０を引き出した。更に、９ 種すべての触媒抗体に対するアミド８の高い親和性から、ＴＳＡ １は記載した あらゆる抗体を引き出すことができたと考えることはもっともらしいことであろ う。この結果は予期しなかったことであったが、ＴＳＡ １を好適な近似体とし て明確に支持するものではない。より集中的なスクリーニングにより、ＴＳＡ ２ 又は３がＴＳＡ １によって認識されないより活性な抗体を最終的に生じさせ る可能性がある。 明らかに、ＴＳＡ（例えば、ＴＳＡ ２）が別の免疫原性複合体から得られた 触媒抗体（例えば、１５Ａ１０）に結合しなかったことは、テザーの位置によっ て産生される触媒抗体が限定されることを確認し、担体タンパク質への付着の部 位が異なることを裏付けている。ＴＳＡ １、２及び３からのハイブリドーマの 網羅的なスクリーニング及び引き出される触媒抗体の詳細な構造研究によって、 近似体構造に関する法則を明らかになる可能性がある。高活性の抗コカイン触媒 抗体の追究は、この努力に強制的な正当性を与える。 第２実験シリーズ ＜序論＞ 潜在的な致死的症候群であるコカインの過剰投与は、これまでずっとアンタゴ ニストの開発を阻んできた。新規なアプローチを提供するために、コカインの非 毒性生成物への加水分解のための遷移状態近似体を用いて、高活性の触媒抗体が 誘導された。この抗体は、投与依存性スタイルのコカイン誘導性の痙攣及び突然 死からラットを保護した。触媒の亢進に一致して、血漿中の加水分解生成物であ るエクゴニンメチルエステルは１０倍以上に増加し、非触媒の抗コカイン抗体は 中毒性を減じなかった。この人工コカインエステラーゼは最初に作られた合理的 なコカインアンタゴニストであり、医薬使用についての可能性を備えた最初の触 媒抗体である。 現在、コカインは合衆国において約２００万人の治療不能の常用者と、４百万 人を超える正常使用者により濫用されている(1)。コカイン過剰投与の急性毒性 はしばしば濫用を悪化させ、この症候群の潜在的な医療結果には痙攣及び死が含 まれる(2)。しかしながら、１０年間の努力に拘わらず、コカインに対する有用 なアンタゴニストは見出されなかった。この失敗の幾分かは、神経伝達物質再取 り込みの競合的阻害薬として作用するこの薬物の特異な機構による(3)。したが って、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるコカインによる、ドーパミン再取り込み輸 送体の阻害は作用強化を生じさせるとの仮説が立てられ(4)、また阻害薬を阻害 することの本来の困難が、麻薬常用者のためのアンタゴニストの開発を妨げてき たと思われる。コカインの過剰投与について、この問題は、ＣＮＳ及び心血管系 における多数の受容体に対する高濃度でのコカインの結合により急速に複雑化す る。例えば、セロトニン再取り込み輸送体の阻害はコカイン誘導性の痙攣の一因 となり(5,6)、ドーパミン再取り込み阻害(6)及びドーパミンＤ1受容体の結合(7) は死亡率の一因となり、ノルエピネフリン再取り込み輸送体の阻害、並びに心臓 性ミオサイトＮａ⁺チャンネル及び他のイオン輸送体の阻害は不整脈と突然死の 一因となる(7)。したがって、コカインの過剰投与は、従来の受容体アンタゴニ ストの観点からのアプローチに対する克服しがたい問題を充分にもたらし得る。 コカイン濫用のためのアンタゴニストの開発におけるこれらの困難性は、新規 なアプローチ、すなわち、コカインを循環剤で遮り、それによりコカインを受容 体結合に利用できないようにすることである。抗体は循環阻害のための明らかな 選択であるが、抗ヘロイン抗体に対する最初の１９７４年の報告に言及されてい るように、薬物の化学量論的結合は抗体を効果的に消費する(9)。結合の限界を 克服するために、触媒抗体が開発された。それは新種の人工酵素であり(10)、コ カインと結合してこれを分解し、生成物を放出し、さらなる結合のために利用で きるようになるという能力を備えている(11)。そのベンゾイルエステル部位での コカインの分解は非毒性の生成物であるエクゴニンメチルエステル(12)及び安息 香酸(13)を生ずるので(図２８Ａ)、ベンゾイルエステル部位の加水分解用にホス ホン酸モノエステル遷移状態近似体（ＴＳＡ-Ｉ、図２８Ｂ）が合成され、これ を用いて生体外でコカインを分解する最初の触媒抗体が誘導された(11)。 これらの抗体の触媒活性は生物学的効果を示すためには充分なものとは言えな いが、試薬ＴＳＡ-Ｉ、Ｍａｂ15Ａ10を有する反復性ハイブリドーマ調製によっ て、コカイン(14)のほぼ飽和濃度において、１００倍以上よく効く抗体が発生し た。この抗体は、２２０μＭのミカエリス定数、２．３mm^-1の回転速度、および ２．３×１０⁴の加速度を有する最もよく効く人工コカインエステラーゼである 。２００回転後該抗体はその活性の９５％以上を維持し、有用な抗体触媒をたび たび阻害する生成物阻害(15)は、アルコール生成物であるエクゴニンメチルエス テルについては最高１ｍＭまでは観察されなかった。Ｍａｂ15Ａ10は生体外で安 息香酸により阻害されたにも拘わらず（Ｋｄ〜２５０μＭ）、この酸はグリシン (13,16)と結合することにより血漿から迅速に取り除かれ、付加生成物の馬尿酸 は１ｍＭの濃度において生体外で阻害剤とならなかった。したがって、Ｍａｂ15 Ａ10は、実用的な生体内触媒としての複数の本質的な特性を有する。 Ｍａｂ15Ａ10を用いたとき、ラットのコカイン過剰投与の急性毒性が阻害され るか否かを調べるために、抗体に触媒されたコカインの分解の試験が施された。 コカインの毒性は、内因性カテコールアミンレベルに依存して、個体間で有意に 変化し得、これにより監禁された動物(17)および興奮した患者(18)における突然 死の増加発生の変動が説明される。先の研究(19)においては、意識のある、監禁 されていない動物に静脈内注射することによりカテコールアミンレベルが標準化 され、連続的に注入されたコカイン(１ｍｇ/kg/ｍｉｎ)について、ＬＤ₅₀は１０ ｍｇ/kgであり、ＬＤ₉₀は１６ｍｇ/kgであることが見出された。 この方法(20)を用いると、Ｍａｂ15Ａ10で前処理した動物(21)は、ＬＤ₉₀コカ イン注入までに、有意な（ｐ＜０．００１）投与依存性の生存率増大を示した( 図２９)。１５ｍｇ/kgの抗体授与を受けた動物５匹中の４匹が、また５０ｍｇ/k gの抗体授与を受けた動物５匹中のすべてが生存した。対照的に、Ｍａｂ15Ａ10 で処理されていない８匹のラットすべてが、コカイン注入の終了前に死亡した。 Ｍａｂ15Ａ10で処理されていない動物において、コカインの平均致死量は７．５ ±０．６ｍｇ/kgであるのに対し、５ｍｇ/kgの抗体で処理された５匹は８．２± １．０ｍｇ/kgのコカインの平均服用量で死亡し、１５ｍｇ/kgの抗体で処理され た群においては、１５．９ｍｇ/kgのコカインで１匹も死ななかった。 触媒抗体の保護効果をさらに定量化するため、15A10投与群（１００ｍｇ/kg） 及び対照群に対してすべての動物が死亡するまで、１ｍｇ/kg/mimのコカインを 連続的に静脈内投与した(図３０Ａ、３０Ｂ)。食塩水対照について痙攣時のコカ イン投与量を平均すると９．４８ｍｇ/kgとなり、Ｍａｂ15Ａ1O投与群（ｐ＜０ ．０１）で処理された動物について痙攣時のコカイン服用量を平均すると３２． ５ｍｇ/kgとなる(図３０Ａ)。また、コカインの平均致死量は、対照群について の１１．５ｍｇ/kgからＭａｂ15Ａ10投与群についての３７．０ｍｇ/kgまで３倍 以上に増加した(図３０Ｂ)。 コカインの化学量論的結合はコカイン投与に対する投与量依存を１ｍｇ/kgだ け変えることが予期されたから、Ｍａｂ15Ａ10の効果について、単純な結合はあ りそうもない解釈であった。しかしながら、この可能性を排除するために、結合 性抗体であるＭａｂ1Ｃ1の作用の試験が同じ投与量で行われた。Ｍａｂ1Ｃ1はＴ ＳＡ-Ｉを用いた免疫感作により誘導されたが、抗体は類縁に対する親和性と匹 敵する親和性でＴＳＡ及びコカインと結合するため(22)、触媒作用的に活性では ない。予期したとおり、Ｍａｂ1Ｃ1はコカイン誘導性の痙攣又は死亡の阻害には 効果的ではなかった(図３０Ａ及び３０Ｂ)。 生体内の触媒性を証明するため、15Ａ10投与群及び対照群におけるコカインの 加水分解生成物の血漿濃度が、以前に開発された高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）法により測定された。15Ａ10投与群は食塩水（ｐ＜０．００１）対 照群又はＭａｂ１Ｃ１（ｐ＜０．０１）対照群のいずれかと比較したとき、エク ゴニンメチルエステル(24)において１０倍を超える増加を示した。その早い代謝 に基づいて予期されるように(13,16)、15Ａ10投与群（３．８５±０．８９μＭ ）における血漿の安息香酸濃度は、食塩水対照群（２．３６±１．０５μＭ）と 比較して有意に上がらなかった。ベンゾイルエステル部位における特異的な触媒 性に一致して、Ｍａｂ15Ａ10投与群（７．６８±１．０７μＭ）におけるメチル エステル加水分解生成物であるベンゾイルエクゴニン（図２８Ａ）は、食塩水対 照群（５．４７±１．０１μＭ）と比較して有意に増加しなかった。 Ｍａｂ15Ａ10が前受容体機構（pre-receptor mechanism）によってコカイン の毒性に対する抵抗性を授与することを確認するために、15Ａ10投与群及び対照 群における血漿コカイン濃度が、ＨＰＬＣ(23)により死亡時に測定された。コカ インとその受容体との結合時又は結合後にＭａｂ15Ａ10が作用するとすれば、血 漿コカインの顕著な増大が期待される。これとは対照的に、前受容体について期 待されるように、また触媒性分解による毒性からの保護に一致して、死亡時の血 漿コカイン濃度は、Ｍａｂ15Ａ10投与群と対照群との間で有意には異ならなかっ た(図３０Ｄ)。 本研究は、コカインの毒性効果を阻害するための循環触媒抗体の使用について の概念の立証を提供する。合衆国におけるコカインの過剰投与の発生率は１年当 たり約８０，０００件であり、コカインに関連する死亡は１年当たり３，０００ 件を超える(1)。抗コカイン触媒抗体は、痙攣及び不整脈のような過剰投与の重 度の合併症が表れた患者の治療に有用となり得る。医薬使用の可能性を備えた最 初の触媒抗体であるマウスのモノクローナル15Ａ10は、動力学(25)及びヒト適合 性を高めるための蛋白質工学(26)をさらに向上するための、突然変異誘発の候補 として適している。コカイン毒性の抗体による事後治療に基づいて、Ｍａｂ15Ａ 10及びより活性な相同体の動物モデルにおける評価がヒトに対する試験に先行し て行われた。 抗コカイン触媒抗体に対する最初の報告以来(3)、薬物がその受容体に到達す る前にコカインを阻害する概念に対する様々な他の報告が述べられてきた。例え ば、酵崇ブチリルコリンエステラーゼの腹腔内投与が、マウスの腹腔内コカイン による毒性を抑制することが示された(27)。また、非触媒性の抗コカイン抗体は 、ラットのコカインに誘導された精神運動効果及び作用の強化を減少させること が示された(28)。しかしながら、触媒抗体は、天然酵素よりも血漿中に長く存在 しそうであり、典型的な抗体とは対照的に、コカインの複合体形成による消耗を 受けない。したがって、触媒抗体はコカイン濫用の急性症状及び慢性症状の双方 を処理するための特異な可能性を有し、結果として、急性の過剰投与の実用的な 実験は慢性的な常用者の治療についての土台を提供し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 39/02 Ａ６１Ｐ 39/02 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/00 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コカインを分解できる触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＸＧＴＩＴＸＸＮＹＡＮ（配 列番号73）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＸＮＮＹＲＰＰ（配列番 号74）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番 号75）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配列番号76）であり、 相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＤＰＸＮＧＸＸＦＹＮＱＫＦＸＧ（配列 番号77）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＸ（配列番号 78）である重鎖とを有する触媒抗体。 ２．請求項１に記載の触媒抗体であって、 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＴＧＴＩＴＳＤＮＹＡＮ（配 列番号37）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＶＮＮＹＲＰＰ（配列番 号38）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番 号39）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配列番号64）であり、 相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＤＰＳＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列 番号65）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＦ（配列番号 66）である重鎖とを有する触媒抗体。 ３．請求項２に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号３に記載のアミ ノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号16に記載のアミノ酸配列を具備する触媒 抗体。 ４．請求項１に記載の触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＡＧＴＩＴＴＳＮＹＡＮ（配 列番号34）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＶＮＮＮＲＰＰ（配列番 号35）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番 号36）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配列番号61）であり、 相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＤＰＨＮＧＧＩＦＹＮＱＫＦＸＧ（配列 番号62） であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＹ（配列番号63）であ る重鎖とを有する触媒抗体。 ５．請求項４に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号２に記載のアミ ノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号15に記載のアミノ酸配列を具備する触媒 抗体。 ６．請求項１に記載の触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＴＧＴＩＴＴＳＮＹＡＮ（配 列番号31）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＩＮＮＮＲＰＰ（配列番 号32）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番 号33）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配列番号58）であり、 相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＤＰＳＮＧＧＩＦＹＮＱＫＦＫＧ（配列 番号59）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＹ（配列番号 60）である重鎖とを有する触媒抗体。 ７．請求項６に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号１に記載のアミ ノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号14に記載のアミノ酸配列を具備する触媒 抗体。 ８．コカインを分解できる触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＳＧＴＩＴＡＮＮＹＧＳ（配 列番号40）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＶＳＮＮＲＧＰ（配列番 号41）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＡＬＷＮＳＮＨＦＶ（配列番 号42）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＴＹＹＩＹ（配列番号67）であり、 相補性決定領域２のアミノ酸配列がＧＭＮＰＧＮＧＶＴＹＦＮＥＫＦＫＮ（配列 番号68）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＶＧＮＬＦＡＹ（配列番号 69）である重鎖とを有する触媒抗体。 ９．請求項８に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号４に記載のアミ ノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号18に記載のアミノ酸配列を具備する触媒 抗体。 １０．コカインを分解できる触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＸＳＬＬＹＸＤＧＫＴＹＬＮ （配列番号79）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＭＳＴＲＸＳ（配 列番号80）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＱＸＦＸＸＹＰＦＴ（配 列番号81）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＸ（配列番号82）であり 、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＸＸＸＸＴＲＹＮＰＳＬＸＳ（配列 番号83）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＸＨＹＹＧＸＸＸ（配列番 号84）である重鎖とを有する触媒抗体。 １１．請求項１０に記載の触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＲＳＬＬＹＲＤＧＫＴＹＬＮ （配列番号19）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＭＳＴＲＳＳ（配 列番号20）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＱＨＦＶＤＹＰＦＴ（配 列番号21）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＴ（配列番号46）であり 、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＨＩＹＧＴＲＹＮＰＳＬＩＳ（配列 番号47）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＹＨＹＹＧＳＡＹ（配列番 号48）である重鎖とを有する触媒抗体。 １２，請求項１１に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号５に記載の アミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号10に記載のアミノ酸配列を具備する 触媒抗体。 １３．請求項１０に記載の触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＫＳＬＬＹＥＤＧＫＴＹＬＮ （配列番号22）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＭＳＴＲＡＳ（配 列番号23）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＱＨＦＥＤＹＰＦＴ（配 列番号24）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＴ（配列番号49）であり 、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＨＩＹＧＴＲＹＮＰＳＬＩＳ（配列 番号50）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＹＨＹＹＧＳＡＹ（配列番 号51）である重 鎖とを有する触媒抗体。 １４．請求項１３に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号６に記載の アミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号11に記載のアミノ酸配列を具備する 触媒抗体。 １５．請求項１０に記載の触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＫＳＬＬＹＥＤＧＫＴＹＬＮ （配列番号25）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＭＳＴＲＡＳ（配 列番号26）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＱＱＦＶＥＹＰＦＴ（配 列番号27）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＮ（配列番号52）であり 、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＹＳＧＩＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列 番号53）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＩＨＹＹＧＹＧＮ（配列番 号54）である重鎖とを有する触媒抗体。 １６．請求項１５に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号８に記載の アミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号13に記載のアミノ酸配列を具備する 触媒抗体。 １７．請求項１０に記載の触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＲＳＬＬＹＲＤＧＫＴＹＬＮ （配列番号28）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＭＳＴＲＡＳ（配 列番号29）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＱＨＦＥＤＹＰＦＴ（配 列番号30）である 軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＴ（配列番号55）であり 、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＨＩＹＧＴＲＹＮＰＳＬＩＳ（配列 番号56）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＹＨＹＹＧＳＡＹ（配列番 号57）である重鎖とを有する触媒抗体。 １８．請求項１７に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号７に記載の アミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号12に記載のアミノ酸配列を具備する 触媒抗体。 １９．コカインを分解できる触媒抗体であって： 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹＬＮ （配列番号43）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＬＶＳＫＬＤＳ（配 列番号44）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＶＱＧＹＴＦＰＬＴ（配 列番号45）である軽鎖と； 相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＨＷＭＴ（配列番号72）であり、 相補性決定領域２のアミノ酸配列がＴＩＤＬＳＤＴＹＴＧＹＮＱＮＦＫＧ（配列 番号71）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＲＧＦＤＹ（配列番号72） である重鎖とを有する触媒抗体。 ２０．請求項１９に記載の触媒抗体であって、前記軽鎖は配列番号９に記載の アミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号17に記載のアミノ酸配列を具備する 触媒抗体。 ２１．ポリペプチドであって： アミノ酸配列ＲＳＳＸＧＴＩＴＸＸＮＹＡＮ（配列番号73）を有する相 補性決定領域１、アミノ酸配列ＸＮＮＹＲＰＰ（配列番号74）を有する相補性決 定領域２、およびアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号75）を有する相補 性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入された軽鎖ドメイ ンを具備し； 該軽鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインの分解に適したコンホ メーションを取るように、アミノ酸配列ＤＹＮＭＹ（配列番号76）を有する相補 性決定領域１、アミノ酸配列ＹＩＤＰＸＮＧＸＸＦＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号77 ）を有する相補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＧＧＧＬＦＡＸ（配列番号78 ）を有する相補性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入さ れた重鎖ドメインに結合されているポリペプチド。 ２２．請求項２１に記載のポリペプチドであって、 前記軽鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＴＧＴＩＴＳＤＮ ＹＡＮ（配列番号37）であり、前記軽鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＶ ＮＮＹＲＰＰ（配列番号38）であり、前記軽鎖の相補性決定領域３のアミノ酸配 列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号39）でり； 対応する前記重鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配 列番号64）であり、前記重鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列が ＹＩＤＰＳＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号65）であり、前記重鎖の相補性 決定領域３のアミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＦ（配列番号66）であるポリペプチド 。 ２３．請求項２２に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号３に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号16に記載のアミノ酸配列を具備 する触媒抗体。 ２４．請求項２１に記載のポリペプチドであって： 前記軽鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＡＧＴＩＴＴＳＮ ＹＡＮ（配列番号34）であり、前記軽鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＶ ＮＮＮＲＰＰ（配列番号35）であり、前記軽鎖の相補性決定領域３のアミノ酸配 列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号36）であり； 対応する前記重鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配 列番号61）であり、前記重鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＤＰＨＮ ＧＧＩＦＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号62）であり、前記重鎖の相補性決定領域３の アミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＹ（配列番号63）であるポリペプチド。 ２５．請求項２４に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号２に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号15に記載のアミノ酸配列を具備 するポリペプチド。 ２６．請求項２１に記載のポリペプチドであって： 前記軽鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＴＧＴＩＴＴＳＮ ＹＡＮ（配列番号31）であり、前記軽鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＩ ＮＮＮＲＰＰ（配列番号32）であり、前記軽鎖の相補性決定領域３のアミノ酸配 列がＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号33）であり； 対応する前記重鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＤＹＮＭＹ（配 列番号58）であり、前記重鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＤＰＳＮ ＧＧＩＦＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号59）であり、前記重鎖の相補性決定領域３の アミノ酸配列がＧＧＧＬＦＡＹ（配列番号60）であるポリペプチド。 ２７．請求項２６に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号１に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号14に記載のアミノ酸配列を具備 するポリペプチド。 ２８．ポリペプチドであって： アミノ酸配列ＲＳＳＳＧＴＩＴＡＮＮＹＧＳ（配列番号40）を有する相 補性決定領域１、アミノ酸配列ＶＳＮＮＲＧＰ（配列番号41）を有する相補性決 定領域２、およびアミノ酸配列ＡＬＷＮＳＮＨＦＶ（配列番号42）を有する相補 性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入された軽鎖ドメイ ンを具備し； 該軽鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインの分解に適したコンホ メーションを取るように、アミノ酸配列ＴＹＹＩＹ（配列番号67）を有する相補 性決定領域１、アミノ酸配列ＧＭＮＰＧＮＧＶＴＹＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号68 ）を有する相補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＶＧＮＬＦＡＹ（配列番号69 ）を有する相補性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入さ れた重鎖ドメインに結合されているポリペプチド。 ２９．請求項２８に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号４に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号18に記載のアミノ酸配列を具備 するポリペプチド。 ３０．ポリペプチドであって： アミノ酸配列ＲＳＳＸＳＬＬＹＸＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号79）を有す る相補性決定領域１、アミノ酸配列ＬＭＳＴＲＸＳ（配列番号80）を有する相補 性決定領域２、およびアミノ酸配列ＱＸＦＸＸＹＰＦＴ（配列番号81）を有する 相補性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入された軽鎖ド メインを具備し； 該軽鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインの分解に適したコンホ メーションを取るように、アミノ酸配列ＳＤＹＡＷＸ（配列番号82）を有する相 補性決定領域１、アミノ酸配列ＹＩＲＸＸＸＸＴＲＹＮＰＳＬＸＳ（配列番号83 ）を有する相補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＸＨＹＹＧＸＸＸ（配列番号 84）を有する相補性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入 された重鎖ドメインに結合されているポリペプチド。 ３１．請求項３０に記載のポリペプチドであって： 前記軽鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＲＳＬＬＹＲＤＧ ＫＴＹＬＮ（配列番号19）であり、前記軽鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列 が ＬＭＳＴＲＳＳ（配列番号20）であり、前記軽鎖の相補性決定領域３のアミノ酸 配列がＱＨＦＶＤＹＰＦＴ（配列番号21）であり； 対応する前記重鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＴ（ 配列番号46）であり、前記重鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＨＩ ＹＧＴＲＹＮＰＳＬＩＳ（配列番号47）であり、前記重鎖の相補性決定領域３の アミノ酸配列がＹＨＹＹＧＳＡＹ（配列番号48）であるポリペプチド。 ３２，請求項３１に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号５に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号10に記載のアミノ酸配列を具備 するポリペプチド。 ３３．請求項３０に記載のポリペプチドであって： 前記軽鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＫＳＬＬＹＥＤＧ ＫＴＹＬＮ（配列番号22）であり、前記軽鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列 がＬＭＳＴＲＡＳ（配列番号23）であり、前記軽鎖の相補性決定領域３のアミノ 酸配列がＱＨＦＥＤＹＰＦＴ（配列番号24）であり； 対応する前記重鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＴ（ 配列番号46）であり、相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＨＩＹＧＴＲＹ ＮＰＳＬＩＳ（配列番号47）であり、相補性決定領域３のアミノ酸配列がＹＨＹ ＹＧＳＡＹ（配列番号48）であるポリペプチド。 ３４．請求項３３に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号６に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号11に記載のアミノ酸配列を具備 するポリペプチド。 ３５．請求項３０に記載のポリペプチドであって： 前記軽鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＫＳＬＬＹＥＤＧ ＫＴＹＬＮ（配列番号25）であり、前記軽鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列 がＬＭＳＴＲＡＳ（配列番号26）であり、前記軽鎖の相補性決定領域３のアミノ 酸配列がＱＱＦＶＥＹＰＦＴ（配列番号27）であり； 対応する前記重鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＮ（ 配列番号52）であり、前記重鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＹＳ ＧＩＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号53）であり、前記重鎖の相補性決定領域３の アミノ酸配列がＩＨＹＹＧＹＧＮ（配列番号54）であるポリペプチド。 ３６．請求項３５に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号８に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号13に記載のアミノ酸配列を具備 するポリペプチド。 ３７．請求項３０に記載のポリペプチドであって： 前記軽鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＲＳＳＲＳＬＬＹＲＤＧ ＫＴＹＬＮ（配列番号28）であり、前記軽鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列 がＬＭＳＴＲＡＳ（配列番号29）であり、前記軽鎖の相補性決定領域３のアミノ 酸配列がＱＨＦＥＤＹＰＦＴ（配列番号30）であり； 対応する前記重鎖の相補性決定領域１のアミノ酸配列がＳＤＹＡＷＴ（ 配列番号55）であり、前記重鎖の相補性決定領域２のアミノ酸配列がＹＩＲＨＩ ＹＧＴＲＹＮＰＳＬＩＳ（配列番号56）であり、前記重鎖の相補性決定領域３の アミノ酸配列がＹＨＹＹＧＳＡＹ（配列番号57）であるポリペプチド。 ３８．請求項３７に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号７に記 載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号12に記載のアミノ酸配列を具備 するポリペプチド。 ３９．ポリペプチドであって： アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号43）を有す る相補性決定領域１、アミノ酸配列ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号44）を有する相補 性決定領域２、およびアミノ酸配列ＶＱＧＹＴＦＰＬＴ（配列番号45）を有する 相補性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入された軽鎖ド メインを具備し； 該軽鎖ドメインは、前記ポリペプチドがコカインの分解に適したコンホ メーションを取るように、アミノ酸配列ＤＨＷＭＴ（配列番号72）を有する相補 性決定領域１、アミノ酸配列ＴＩＤＬＳＤＴＹＴＧＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号71 ）を有する相補性決定領域２、およびアミノ酸配列ＲＧＦＤＹ（配列番号72）を 有する相補性決定領域３を備え且つ適切なフレームワーク領域の間に挿入された 重鎖ドメインに結合されているポリペプチド。 ４０．請求項３９に記載のポリペプチドであって、前記軽鎖は配列番号９に 記載のアミノ酸配列を具備し、前記重鎖は配列番号17に記載のアミノ酸配列を具 備するポリペプチド。 ４１．請求項１〜２０の何れか１項に記載の触媒抗体をコードするＤＮＡ。 ４２．請求項２１〜４０の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮ Ａ。 ４３．請求項１〜２０の何れか１項に記載のヒト化触媒抗体。 ４４．請求項２１〜４０の何れか１項に記載のヒト化触媒性単鎖抗体。 ４５．患者におけるコカイン濃度を減少させるための薬学的組成物であって、 患者の中のコカインを分解するのに有効な量の請求項１〜４０の何れか１項の抗 体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。 ４６．患者におけるコカイン濃度を減少させるための方法であって、患者に対 して、患者の中のコカインを分解するのに有効な量の請求項１〜４０の何れか１ 項の抗体を投与することを具備した方法。 ４７．患者におけるコカインの過剰投与を治療するための薬学的組成物であっ て、患者の中のコカインを分解するのに有効な量の請求項１〜４０の何れか１項 の抗体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。 ４８．患者におけるコカインの過剰投与を治療するための方法であって、患者 に対して、患者の中のコカインを分解するのに有効な量の請求項１〜４０の何れ か１項の抗体を投与することを具備した方法。