JP2000511419A - Ｒａｆ―１または１４―３―３タンパク質のＩＬ―２受容体β鎖への結合を阻害する化合物およびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents
Ｒａｆ―１または１４―３―３タンパク質のＩＬ―２受容体β鎖への結合を阻害する化合物およびそれを含有する医薬組成物Info
- Publication number
- JP2000511419A JP2000511419A JP09542654A JP54265497A JP2000511419A JP 2000511419 A JP2000511419 A JP 2000511419A JP 09542654 A JP09542654 A JP 09542654A JP 54265497 A JP54265497 A JP 54265497A JP 2000511419 A JP2000511419 A JP 2000511419A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- raf
- chain
- compound
- flag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 title claims abstract description 219
- 101710141955 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 title claims abstract description 219
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 111
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 88
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 56
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 title description 43
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 title description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 123
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 claims abstract description 7
- 101000723543 Homo sapiens 14-3-3 protein theta Proteins 0.000 claims description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 27
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 26
- 108700020469 14-3-3 Proteins 0.000 claims description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 21
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 21
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 claims description 14
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 12
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 12
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 108040006849 interleukin-2 receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000001612 separation test Methods 0.000 claims 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 abstract description 44
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 40
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 6
- 108010066684 Proto-Oncogene Proteins A-raf Proteins 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 109
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 43
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 40
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 32
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 32
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 30
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 30
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 27
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 22
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 21
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 15
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 15
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 15
- 210000005221 acidic domain Anatomy 0.000 description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 8
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 7
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 6
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 description 5
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 description 5
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 101100400991 Caenorhabditis elegans mek-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 4
- 102000001788 Proto-Oncogene Proteins c-raf Human genes 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 3
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 2
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- RSWGJHLUYNHPMX-UHFFFAOYSA-N Abietic-Saeure Natural products C12CCC(C(C)C)=CC2=CCC2C1(C)CCCC2(C)C(O)=O RSWGJHLUYNHPMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000156724 Antirhea Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100287595 Caenorhabditis elegans kin-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 241000975394 Evechinus chloroticus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 101000619542 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase parkin Proteins 0.000 description 1
- 101000915562 Homo sapiens Palmitoyltransferase ZDHHC2 Proteins 0.000 description 1
- 108030003815 Inositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-UHFFFAOYSA-N L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-proline amide Natural products NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001553014 Myrsine salicina Species 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102100028614 Palmitoyltransferase ZDHHC2 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- KHPCPRHQVVSZAH-HUOMCSJISA-N Rosin Natural products O(C/C=C/c1ccccc1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 KHPCPRHQVVSZAH-HUOMCSJISA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000627 Thyrotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102400000336 Thyrotropin-releasing hormone Human genes 0.000 description 1
- 101800004623 Thyrotropin-releasing hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000011409 Transcobalamins Human genes 0.000 description 1
- 108010023603 Transcobalamins Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 108010053098 biotin receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002861 immature t-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012750 in vivo screening Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 1
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 102000045222 parkin Human genes 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 231100000435 percutaneous penetration Toxicity 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N phosphonotyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940034199 thyrotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- KHPCPRHQVVSZAH-UHFFFAOYSA-N trans-cinnamyl beta-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC=CC1=CC=CC=C1 KHPCPRHQVVSZAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/81—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, immunotolerance, or anergy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、Raf-1または14-3-3タンパク質とIL-2のβ鎖との結合相互作用を遮断または阻害できるタンパク質、ペプチドおよび有機化合物などの化合物、および該化合物を含む医薬組成物に関する。Raf-1または14-3-3タンパク質とIL-2Rβとの相互作用を阻害できる該化合物を単離、同定または特性化するためのインビトロ検定法も提供される。
Description
【発明の詳細な説明】
Raf-1または14-3-3タンパク質のIL-2受容体β鎖への結合を阻害する化合物およ
びそれを含有する医薬組成物
発明の技術分野
本発明は、Raf-1タンパク質および／または14-3-3タンパク質とインターロイ
キン−２受容体分子のβ鎖(IL-2Rβ)の細胞内ドメインとの相互作用を遮断する
能力およびそれによるIL-2Rβ仲介の細胞内シグナルプロセスを遮断する能力を
特徴とするタンパク質、ペプチドおよび有機化合物などの化合物に関する。本発
明の化合物は、例えば、一般的に自己免疫疾患または特定的に移植片と宿主反応
においてIL-2またはIL-15の活性を阻害することを意図している。本発明はまた
、上記化合物の単離、同定および特性化のためのインビトロ検定法、および本発
明の１以上の化合物を活性成分として含有する医薬組成物に関する。
発明の背景技術
インターロイキン−２(IL-2)は、Ｔ細胞増殖を刺激することによりＴ細胞の抗
原に対する応答を増幅するＴ細胞誘導因子である。抗原活性化に伴って起きるＴ
細胞の増殖において主要な役割を演じる決定的に重要なＴ細胞増殖因子であり、
この増殖は特定の抗原に応答し得るＴ細胞の数を増加する。ＩＬ−１５は、ＩＬ
−２活性の多く(全てではない)を発揮する点において一般的にIL-2に代わり得る
(Bamford et al.，1994)。
高アフィニティー(Kd:10-11M)IL-2受容体(IL-2R)は、少なくとも次の３種の非
共有的結合IL-2結合タンパク質からなる。すなわち、低アフィニティー(Kd:10-8
M)P55(α鎖)、および中程度アフィニテーサブユニット(Kd:10-9M)のP75(β鎖)お
よびp64(γ鎖)である(Smith，K.A.，1988;Waldmann，T.A.，1993)。Ｔ細胞につ
いての増殖シグナルは、全３種のサブユニットからなる高アフィニティーIL-2受
容体を通って配送されるが、低アフィニティー部位を経由しない(Robb，R.J．et
al.，1984;Siegal，J.P．et al.，1987;Hatakeyama，M．et al.，1989)。IR-2R
α、IL-2RβおよびIR-2Rγ鎖は、それぞれ13、286および86個のアミノ酸の細
胞質内ドメインを有している。
多くのIL-2様活性を有するサイトカインであるIL-15も、その受容体複合体の
一部としてIL-2Rβを利用する(Giri et al.，1994)。このIL-2Rβ依存シグナル
プロセスは、IL-2とその受容体との結合により誘発される細胞作用およびIL-15
とその受容体との結合により誘発される作用にとって肝要である。IL-2Rβ-およ
びγ−鎖(α鎖ではない)は、IL-2およびIL-15仲介シグナル導入について必須で
ある(Nakamura，Y．et al.，1994)。64kDaのIL-2Rβ鎖タンパク質は、IL-2での
刺激後にチロシン残基上で容易にリン酸化される。γ鎖はIL／-4およびIL-7の受
容体などの他の受容体複合体の一部であることも明らかにされている(Noguchi，
M．et al.，1993;Russell，S.M．et al.，1993)。γ鎖が存在しないことは、ヒ
トにおいて重い併合免疫不全疾患の原因となる(Noguchi,M．et al.，1993)。IR-
2Rγは、いくつかのリンタンパク質のホスホチロシン残基に結合し得るSrc相同
領域２(SH2)に相同的な288から321位までの配列を含む。pp97と呼ばれる他の分
子は、IR-2Ry鎖に物理的に結合したチロシンキナーゼであることが示唆されてい
る(Michiel，D.F．et al.，1991)。
一連のIL-2Rβ鎖欠失変異体で形質転換した細胞を調べて、増殖促進シグナル
導入に重要であるIL-2Rβ鎖の46個のアミノ酸のセリンおよびプロリンに富む細
胞質内領域(アミノ酸267-312)であると同定した(Hatakeyama，M．et al.，1989)
。この同じ領域がIL-15仲介作用を促進するのに決定的に重要である。IL-2での
刺激に際し、本発明者の研究所が前に明らかにしたような(Remillard，B．et al
.，1991)酵素的に活性なタンパク質チロシンキナーゼおよび新規なリピドキナー
ゼであるホスフアフィニティージイノシトール−３−キナーゼの活性が増殖を遮
断する。この46個のアミノ酸領域を欠く野生型IR-2Rα-およびγ-鎖、および変
異体IL-2Rβ鎖を発現する細胞は、IL-2を結びつけて、内在化するが、IL-2に応
答して増殖することはない(Hatakeyama，M．et al.，1989)。同様の状態がIL-15
応答で起きる。IL-2Rβ-およびγ−鎖の細胞質内ドメインはタンパク質チロシン
キナーゼ共通配列を欠くが、いくつかの細胞タンパク質はIL-2刺激に続いてチロ
シン残基上でリン酸化される(Benedict，S.H．et al.，1987;Ferris，D.K，et a
l.，1989;Saltzmann，E.M．et al.，1988;Asao，H．et al.，1990;Mills，
G.B．et al.，1990;Merida，I．and Gaulton，G.N.，1990)。IL-2誘発タンパク
質チロシンキナーゼ活性は、少なくとも部分的にはp561ck(lck)、srcファミリー
タンパク質チロシンキナーゼの活性化による。IL-2Rβ鎖のセリン／プロリンに
富む(Fung，M.R．et al.，1991)または隣接のチロシンに富む“酸性”領域(Hata
keyama，M．et al.，1991)がlck結合部位であるかどうかについては、議論があ
る。
IL-2もいくつかのタンパク質セリン残基でのリン酸化を刺激する(Turner，B．
et al.，991;Valentine，M.V．et al.，1991)。セリン／トレオニンキナーゼで
あるRaf-1は、いくつかの増殖因子受容体のシグナル導入様エレメントとして同
定されている(Carroll，M.P．et al.，1990;Morrison，D.K．et al.，1988;Bacc
arini．M．et al.，1991;Kovacina，K.S．et al.，1990;Blackshear，P.J．et a
l.，1990;App，H.et al.，1991)。Raf-1分子は、74kDの分子量を持ち、２つの機
能的ドメインであるアミノ末端調節半分とカルボキシ末端キナーゼドメインに分
割され得る(総説について、Heidecker，G．et al.，1991参照)。Raf-1はリガン
ド活性EPO受容体について決定的に重要なシグナル導入エレメントとして同定さ
れている(Carroll，M.P．et al.，1991)。IL-2Rβ鎖およびEPO受容体は同じファ
ミリーの受容体に属し、その細胞質内ドメインにおいて相同性を共有する(D'And
rea，A.D．et al.，1989)。IR-2Rαの刺激は、細胞質基質のRaf-1セリン／トレ
オニンキナーゼのリン酸化と活性化をもたらす。IR-2Rα刺激は、新たに単離さ
れた休止Ｔ細胞上でc-raf-1 mRNA発現の5-10倍の即時型／初期型誘導をもたらし
(Zmuidzinas，A．et al.，1991)、Raf-1タンパク質発現を12倍までに増加する。
さらに、Raf-1タンパク質発現のサブ個体数群のリン酸化が急速にますますＧ１
を経て増加する。
酵素的に活性なRaf-1は、IL-2刺激CTLL-2の細胞質基質(Hatakeyama，M．et al
.，1991)およびヒトＴ芽細胞(Zmuidzinas，A．etal.，1991)に出現する。IL-2刺
激に続いて、細胞質基質のRaf-1分子はチロシンおよびセリン残基においてリン
酸化される(Turner，B．et al.，1991)。本発明者の研究所は、IL-2がＴ細胞の
分裂開始をシグナルする経路を研究してきた。この研究において、Raf-1はIL-2R
β鎖の免疫沈降体中に同定され、Raf-1がIL-2シグナルにおける重要なエレメ
ントとして関与しているであろうことが示唆された。さらに、IL-2刺激の前に、
酵素的に活性なRaf-1分子はIL-2Rβ鎖に物理的に結合すること、そしてIL-2の刺
激後に、タンパク質チロシンキナーゼがRaf-1をリン酸化して、それによりIL-2
から細胞質基質へのRaf-1の転座をもたらすことが明らかにされた(Maslinski,W
．et al.，1992)。さらに、IL-2Rβ鎖からの酵素活性Raf-1の解離は、IR-2Rα関
連キナーゼ活性の維持でなく、強力なチロシンキナーゼ阻害剤の一つであるゲニ
ステインにより完全に除かれる(Maslinski，W．et al.，1992)。上記に示唆され
たIL-2シグナルについてRaf-1が必要であることは、Raf-1発現を遮断することに
よりIL-2がRaf-1の不存在ではＴ細胞増殖を誘発し得ないことを示す証拠で支持
されている。このように、上記のことからRaf-1セリン／トレオニンキナーゼの
活性化がIL-2仲介Ｔ細胞増殖にとって決定的に重要であることが広く認められた
(Riedel et al.，1993も参照)。
IL-2刺激に先立って、IR-2Rβ鎖のいくつかのセリン残基(チロシンやトレオニ
ンでない)はリン酸化される(Asao，H．et al.，1990)。IL-2は追加のセリン、チ
ロシンおよびトレオニンの急速な(すなわち、10-30分)リン酸化を起こす(Asao，
H．et al.,1990;Htakeyama，M．et al.，1991)。Tyr355およびTyr358がIR-2Rα
の主要な(のみではない)チロシンリン酸化部位である(インビトロでp561ckによ
り触媒されて(Hatakeyama，M．et al.，1991))。IL-2Rβ鎖のリン酸化部位は、I
L-2Rβ鎖シグナル導入および補助分子(p561ckおよびRaf-1のような)との相互作
用において重要な役割をするようである。
Raf-1のリン酸化は、CD4橋かけ結合に続いてヒトＴ細胞系においても見られた
。Raf-1の活性化もCD3またはThy1橋かけ結合によるTCR/CD3複合体刺激に続いて
認められ、c-raf-1 mRNAが約４倍増加した。この場合、Raf-1リン酸化はセリン
上でのみ起こり、PKCを下方調節すると、観察されない。このことと関連して、G
TPアーゼ活性タンパク質(GAP)活性および結果としてTCR刺激後のRas誘導もPKC仲
介であることは興味深い(Downward，J．et al.，1990)。
しかし、p561ckkチロシンキナーゼおよびPI-3-キナーゼのIL-2Rβ鎖との接触
点を形成する正確な残基ははっきりしていない。実際、２グループ(GreeneとTan
iguchi)が、大まかに末端切除したIL-2Rβ cDNA遺伝子移入体を用いて、IR-
2Rの１ckとの結合部位を解析した(Hatakeyama、M．et al.，1991;Greeneグルー
プ;Turner,B．et al.，1991;Taniguchiグループ)。彼らは基本的に同じ技法と試
薬を使用したが、その研究の結論は相反している。大幅に末端切除した変異体を
使用すると、発現したタンパク質における構造的変化が、リガンドとリガンドの
相互作用に要する残基と残基の接触点を正確に地図に示そうとすることを難しく
するのかもしれない。その上、Greeneグループの最近のデータはTaniguchiグル
ープのデータにより近くなっている(Williamson，P．et al.，1994)。しかし、
両研究グループが用いたモデル細胞系(Baf/3)は、Ｔ細胞系CTLL2よりも異なって
シグナルするのが明らかにされている(Nelson、B.H．et al.，1994)。このよう
に、IL-2Rβ鎖のどの部分が正常なＴ細胞に最も重要かは完全には分かっていな
い。
IL-2についてのいわゆる“ノックアウト”マウス(すなわち、IL-2を欠くマウ
ス)の特性が最近に調べられたところによると、約50%が年齢９週までに死亡する
(Schorle，H．et al.，1991)。これらのマウスは表現型的には正常とみられ、い
くつかの細胞仲介応答を起こし得るが(Kundig，T.M．et al.，1993)、最終的に
炎症疾患が生じる。最近、マウスがなお比較的正常である理由としてIL-2受容体
β-およびγ-鎖を経由しシグナルする追加のサイトカイン(IL-15)の存在にある
ことが示唆されている。このように、これらのマウスにおいてIL-2分子の欠失に
対しIL-15によるなんらかの補いがあるようである。他方、ヒトでのIR-2Rγ鎖の
欠失は、成熟および未成熟両方のＴ細胞がほとんど存在しないことを特徴とする
重い併合免疫不全を起こす(Noguchi，M．et al.，1993)。インビボでのIL-2の重
要性はアンチIL-2抗体を用いた研究によってさらに支持されている。移植および
自己免疫の両方のモデルにおいて顕著な免疫抑制効果がアンチIL-2Rαモノクロ
ーナル抗体を用いて得られた(Strom，T.B．et al.，1993)。同様のアンチヒトIR
-2Rα抗体(モノクローナル抗体としてマウスで産生)での臨床結果でなんらかの
効果が見られたが、ヒト患者におけるネズミモノクローナル抗体に対する速い免
疫応答に限られていた。すなわち、患者においてヒトアンチマウス抗体(HAMA)が
マウスアンチヒトIR-2Rαモノクローナル抗体での処置後短時間で産生した。
高度に保存された14-3-3タンパク質ファミリーのメンバーは、最初は脳組織に
おける豊富な27-30kD酸性タンパク質として同定され(Moore et al.，1967)、後
に広範な組織および生体に見出された(Aitken et al.，1992)ものであるが、最
近、Raf-1、Bcr-Ab1などの癌原遺伝子や癌遺伝子の産物およびポリオーマウイル
ス中腫瘍抗原MTと結合しているのが見られた(Fu et al.，1994;Reuther et al.
，1994;Pallas et al.，1994;Irie et al.，1994;Freed et al.，1994)。14-3-3
は、Raf-lと多くの部位で、すなわちRaf-1のアミノ末端調節領域、Raf-1のキナ
ーゼドメイン、Raf-1のジンクフィンガー様領域で、アミノ末端調節ドメインに
位置する相互作用の一次部位を持って、結合し、相互反応するようである(Fu et
al.，1994;Freed et al.，1994)。14-3-3との相互作用部位でのBcr、Bcr-Ab1お
よびMTの配列を比較して、システインおよびセリンに富む領域が共通エレメント
であることが分かり、14-3-3結合に関与する何らかの決定因子であり得る(Morri
son，1994)。
Freed et al.(1994)およびIrie et al.(1994)の報告結果は、14-3-3がイース
トでのRaf-1活性を調節することを示唆している。例えば、Freed et al.(1994)
によると、イーストでの哺乳動物14-3-3タンパク質の過剰発現は哺乳動物Raf-1
の生物活性を刺激し、14-3-3過剰発現イースト株から免疫沈降した哺乳動物Raf-
1が、14-3-3発現を欠くイースト株からのRaf-1よりも３−４倍の酵素活性を有し
ていた。しかし、14-3-3タンパク質のみではRaf-1のキナーゼを活性化するのに
十分でなく、14-3-3がRaf-1活性に関与する補因子であろうことを示唆している(
Morrison，1994;Freed et al.，1994)。細胞レベル下での位置付けまたはRaf-1
活性状態またはRaf-1がRasと結合しているかどうかにかかわらず、14-3-3はイン
ビボでRaf-1と本質的に結合するので(Fu et al.，1994;Freed et al.，1994)、1
4-3-3の他の機能がタンパク質シグナル活性または立体配座を安定化するのに構
造的役割を有し得ることを示唆している(Morrison，1994)。
本明細書における文献の引用は、それらの文献が本発明の請求項の特許性に関
連する先行技術あるいは資料であることを認める意図ではない。文献の内容また
はデータについての記述は、出願時において出願人が利用できた情報に基づいて
おり、かかる記述が常に正しいと認めるものでもない。
発明の概要
先行技術の上記相違からして、本発明の目的の一つは、IL-2Rβ鎖とRaf-1、お
よびIL-2またはIL-15仲介細胞内プロセスに関与する可能な他のタンパク質また
はペプチドとの相互作用の本質を決定することである。従って、本発明の他の目
的は、Raf-1とIL-2Rβとの結合、およびIL-2Rβと14-3-3およびIL-2またはIL-15
仲介細胞内プロセスに関与する他のタンパク質との結合を阻害する方法を見出し
、それによって一般的に自己免疫疾患または特定的に移植片と宿主反応うまく処
置し得る方法を提供することである。
本発明は、Raf-1とIL-2Rβ鎖細胞内ドメインとの結合の性質および特異性を調
べるビトロ検定システムの開発、およびIL-2Rβ鎖の酸性領域がRaf-1のIL-2Rβ
への結合に必須であるとの知見に基づいている。Raf-1のIL-2Rβへの結合は、IL
-2／IL-15刺激に続くIL-2およびIL-15により仲介される細胞内シグナルプロセス
において必須であり、とりわけ、一般的に自己免疫疾患または特定的に移植片-
宿主反応に関連している。
さらに特に、本発明において、IL-2Rβ鎖の細胞内ドメインがRaf-1およびいわ
ゆる14-3-3タンパク質に直接結合することを見出した。IL-2Rβ鎖細胞内ドメイ
ンのは酸性ドメインは、Rasエフェクタードメインに相同的であって、Raf-1結合
に決定的に重要であり、一方、IL-2Rβ鎖細胞内ドメインのＣ末端部分は14-3-3
タンパク質と相互作用する。さらに、Raf-1および14-3-3タンパク質はIL-2Rβ鎖
細胞内ドメイン上に複合体を形成し、酵素的活性p561ckの存在で(p59fymではな
い)Raf-1／14-3-3複合体はIL-2Rβ鎖の細胞内ドメインから解離する。このよう
に、Raf-1／14-3-3タンパク質のIL-2Rβ鎖細胞内ドメインへの直接結合は、他の
システムにおける活性化Ras経由の膜局在に必要な条件を迂回する。
上記のことから、IL-2Rβ鎖の細胞質内セグメントの酸性ドメインおよびＣ末
端部分上におけるRaf-1と14-3-3の両方の共局在が、IL-2Rβ鎖により仲介される
細胞内シグナル形質導入プロセスにおいて重要な工程であることが分かってくる
。従って、この相互作用は、本発明により、この相互作用を壊しあるいは阻害す
ることのできる目的化合物についての標的である。上記相互作用のかかる破壊ま
たは阻害は、IL-2Rβ経由でIL-2／IL-15開始細胞内シグナルの特殊な阻害を提供
する。かかる阻害は一般的に自己免疫疾患および特殊的に移植片−宿主反応の処
置
に望ましい。
従って、本発明は、Raf-1タンパク質、14-3-3タンパク質に、またはIL-2Rβ鎖
の細胞内ドメインに結合し得て、Raf-1および／または14-3-3タンパク質のIL-2R
βへの結合を阻害することのできる化合物を提供する。
本発明のこの態様には次の具体化を含む。(i)タンパク質、ペプチド、それら
の同族体または誘導体および有機化合物から選択された化合物、(ii)図１２の成
熟ヒトIL-2Rβ鎖の酸性領域から誘導され、配列番号２のアミノ酸残基370-396に
対応する27個のアミノ酸ペプチドである化合物およびその同族体または誘導体、
(iii)１以上のアミノ酸が附加、削除または置換されている該27個のアミノ酸ペ
プチドの同族体から選択される化合物、該同族体はRaf-1および/または14-3-3と
IL-2Rβとの結合を阻害し得る。
本発明は、活性成分として本発明の化合物またはその１以上の混合物および薬
学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、Raf-1、14-3-3タンパク質またはIR-2Rβ鎖細胞内ドメイン
と結合し得る本発明の化合物を単離、同定および特性化するインビトロスクリー
ニング検定法を提供する。この方法は、(a)IL-2Rβ鎖タンパク質、Raf-1タンパ
ク質、14-3-3タンパク質、これらの部分またはこれらのいくつかの混合物から選
択され、合成的に産生されるか、微生物的に産生されるか、または哺乳動物細胞
で産生されるタンパク質を準備し；(b)(a)の該タンパク質を、原核または真核細
胞溶解質、自然誘導または化学合成のペプチドを含有する溶液、または化学合成
の有機化合物を含有する溶液から選ばれる試験サンプルに接触せしめ、該タンパ
ク質と該試験サンプルとの複合体を形成し；(c)(b)で形成した複合体を単離し；
(d)(c)で単離された複合体についてタンパク質から試験サンプルを分離し；(e)(
d)の該分離試験サンプルを分析して、その性質を決定することを含む。上記検定
法の具体例は、実施例１−６に記載の、Raf-1、14-3-3タンパク質またはIR-2Rβ
鎖細胞内ドメインと結合し得る本発明の化合物を単離、同定および特性化するイ
ンビトロスクリーニング検定法である。
本発明の上記スクリーニング検定法の他の具体化は、本明細書に記載される細
胞なしの検定システムであるインビトロスクリーニング検定法；本明細書に記載
される全く細胞なしの検定システムであるインビトロスクリーニング検定法；Ra
f-1および/または14-3-3タンパク質またはIL-2Rβ細胞内ドメインと結合でき、R
af-1とIL-2Rβとの結合を阻害し得る化合物をスクリーニングするためのインビ
トロ検定法(該検定法は実施例１−６に記載のタンパク質キナーゼ反応を測定す
る工程を含む)；本発明によりインビトロ検定法で単離、同定および特性化され
た化合物を含む。
従って、本発明はまた、(i)上記インビトロ検定法のいずれかにより単離、同
定または特性化された化合物；(ii)自己免疫疾患または移植片-宿主反応の処置
のための、本発明の化合物を含有する医薬組成物；(iii)自己免疫疾患,移植拒絶
または移植片-宿主反応の処置のための、本発明化合物の使用を含む。
図面の簡単な説明
図１は、実施例１に記載のIL-2Rβ融合タンパク質を模式的に表す。
図２は、実施例１に記載の、Ｔ細胞溶解質由来Raf-1のFLAG-HMK-IR-2Rβ鎖関
連タンパク質との結合に関する結果を表す。
図３は、実施例２に記載の、微生物的に誘導された(His)6-Raf-1タンパク質の
FLAG-HMK-IR-2Rβ鎖関連タンパク質との相互作用に関する結果を表す。
図４は、実施例３に記載の、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖でコートされ，Ｔ細胞溶解質
に暴露されたアンチFLAGビード上でなされるタンパク質キナーゼ反応の産物に関
する結果を表す。
図５は、実施例３に記載の、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖でコートされ，Ｔ細胞溶解質
に暴露されたアンチFLAGビード上でなされるセリン／トレオニンキナーゼ反応の
産物に関する結果を表す。
図６は、実施例３に記載の、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖関連タンパク質でコートされ
、Ｔ細胞溶解質に暴露された-FLAGビード上でなされるタンパク質キナーゼ反応
の産物に関する結果を表す。
図７(a-c)は、実施例４に記載の、哺乳動物(COS)細胞(図７ａ、IL-2Rβ鎖構築
体)および細菌細胞(図７b、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖構築体)における発現のためにつ
くられたIL-2Rβ融合タンパク質の構造、およびこれらの融合タンパク質の発現
結果(図７c)を模式的に表す。
図８(a-c)は、実施例４に記載の、Raf-1および14-3-3タンパク質とIL-2Rβま
たはその部分との直接的相互作用に関する結果を表す。
図９は、実施例４に記載の、IL-2Rβ鎖(ヒト)(配列番号２のアミノ酸残基372-
396)とRas(ヒト)タンパク質(配列番号３)との相同性を模式的に表す。
図１０は、実施例４に記載の、酵素的活性のp561ckによる、IL-2Rβ鎖に結合
したRaf-1および14-3-3の解離に関する結果を表す。
図１０ｃは、実施例４記載の、Ｔ細胞溶解質からのRaf-1および14-3-3タンパ
ク質のIL-2Rβとの結合に関する結果を表す。
図１１は、実施例４記載の、Raf-1／IL-2Rβ鎖接触点の決定を模式的に表す。
図１２は、実施例５記載の、ヒトIL-2Rβ鎖のアミノ酸配列(配列番号２)の模
式的表示である。細胞質外ドメインは図上部の大文字である。ペプチドリーダー
は小文字で、透過膜領域は下線で示される。酸性領域(アミノ酸313-382)は点線
で、IL-2Rβ／Raf-1相互作用に関与する推定領域(アミノ酸345-371)はイタリッ
クで示される。
発明の詳細な記述
本発明を次の非制限的実施例および関連する図でより詳細に説明する。
実施例１：
IL-2Rβ鎖のRaf-1タンパク質との相互作用：Raf-1結合に関与するIL-2Rβ鎖領域
上記したように、IL-2Rβ鎖とRaf-1との結合の直接的相互作用は、以前には知
られていない。Raf-1のIL-2Rβ仲介活性は他のタンパク質の仲介によると一般に
思われていた。さらに、14-3-3タンパク質がIL-2Rβ鎖に直接的に結合し得るか
どうかについて測定されていなかった。また、他の中間的タンパク質が14-3-3結
合に介在している。さらには、IL-2Rβ鎖に結合するタンパク質の特性化は、Ｔ
細胞当りの受容体の低いコピー数(2-3 X 103受容体／細胞)、受容体と無数の関
連タンパク質との相互作用の複雑さにより、限られていた。
従って、IL-2Rβ鎖とRaf-1および／または14-3-3との相互作用を解析するため
の、特にRaf-1および／または14-3-3タンパク質に結合するのに必須であるIL-2R
β鎖の領域を同定するための、細胞なしのシステムが本発明でもって開発された
。14-3-3のIL-2Rβとの結合は実施例４に示す。この細胞なしシステムは最初に
次
のようにつくられた。
(i)IL-2Rβ鎖細胞質ドメインを細菌発現系でクローン化し、17個の親水性アミ
ノ酸から下流の融合タンパク質の部分として発現した。これは、抗原性エピトー
プ(FLAG)、および[ν32P]-ATPおよひHMKで融合タンパク質のインビトロ放射標識
を可能とする心筋キナーゼ(HMK)についての認識部位を含む(LeClair，K.P．et a
l.，1992;Blanar，M.A．and Rutter，R.J.，1992)。FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖細胞質
ドメイン発現プラスミドは、IL-2Rβ鎖由来の適当な1107bp(NcoI-BamHI)cDNAフ
ラグメントをFLAG-HMKベクター(LeClair et al.，1992;Blanar and Rutter，199
2)に、クローニングを容易にし、適当な翻訳フレームを維持する合成リンカーを
用いて連結することにより構築した。B1-21 pLysS細菌をFlag-HMK-IL-2Rβ構築
体で形質転換し、タンパク質発現を記載(LeClair et al.，1992)のように誘発し
た。
(ii)IL-2Rβ鎖の細胞内分子との相互作用を研究するために、FLAG-HMK-IL-2R
β鎖細胞質ドメイン融合タンパク質を、標準アフィニティークロマトグラフィー
におけるM２アンチFLAGモノクローナル抗体を用いて、細菌溶解質から精製した
。より特異的に、細菌溶解質タンパク質をアンチFLAG(M2)アフィニティーカラム
(IBI-Kodak，New Haven，Ct.，USA)に吸収した。カラムを洗った後、吸収された
タンパク質をグリシン緩衝液(pH3)またはFLAGペプチド(10-4M)で溶出した。種々
のフラクションのタンパク質をSDS-PAGEおよびCommassieブルー染色での分離後
に、望む大きさ(約33kDa)および純度について分析した。機能的HMK認識部位の存
在は、HMKによる精製33kDa IL-2Rβ鎖融合タンパク質のリン酸化で確認した。
さらに特殊的に、溶出融合タンパク質のリン酸化に対する感受性を調べるため
に、20mM Tric-HCl,pH7.5，1mM DTT，100mM NaCl，10mM MgCl2および1μCi[γ32
P］ATPを含む緩衝液中で30分37℃で、ウシ心筋キナーゼ(Sigma)の触媒量(1U/ul)
とともにインキュベートし、次いでSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィを行っ
た。IL-2Rβ鎖に結合するヒトＴ細胞溶解質(代謝的に[35S]-メチオニンで標識さ
れている)中に存在の細胞質基質タンパク質についてプローブするアフィニティ
ー試薬として精製FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖融合タンパク質を用いた。末梢血単核細胞
であるヒトＴ細胞をFicoll-Hypaqueを用いて単離し、フィトヘマググルチニン(5
μg/ml)で培養基中72時間刺激し、水洗し、IL-2(10U/ml)の存在下に培養基中に3
日間保持し、次いでIL-2なしで24時間インキュベートした。[35S]-メチオニン標
識のために、細胞を4 X 107細胞/mlで37℃で懸濁し、[35S]-メチオニン0.5mCiを
4時間で加えDounce均質化緩衝液中に溶解し、アフィニティーカラムに掛けた。
いくつかの[35S]標識タンパク質はアフィニティーカラムに結合したFLAG-HMK-IL
-2Rβ鎖細胞質基質ドメイン融合タンパク質により保持された。これらのタンパ
ク質の一つは、Raf-1のＣ末端フラグメントに対応するSP-63ペプチドに特異的な
ポリクロナール抗体を用いた免疫ブロッティングによりRaf-1であると同定され
た。競合のSP-63ペプチドの分子過剰はアンチSP-63抗体のRaf-1との結合を遮断
した。
(iii)セリン／トレオニンキナーゼ活性を調べるために、FLAG-HMKまたはFLAG-
HMK-IL-2Rβ鎖アフィニティーカラムからFLAGペプチドにより溶出したタンパク
質をゲニスタインと共に(10g/ml)またはなしで、キナーゼ緩衝液(25mM HEPES，p
H7.5，10mM MgCl2，1mM DTT)に1：1で希釈し、ヒストンH1(20μｇ/ml)加えた。
キナーゼ反応は、［γ32P]-ATP １μCiおよび25μM ATPの添加により始まった。
25℃30分後、還元SDS-PAGEサンプル緩衝液の添加および煮沸で反応を止めた。結
果からして、IL-2Rβ鎖アフィニティーカラムに結合したタンパク質から誘導の
ヒトＴ細胞中にセリン/トレオニンキナーゼ活性が存在し、このタンパク質キナ
ーゼ活性はチロシンキナーゼ阻害剤であるゲニステインでの処置により阻害され
なかった。これらの結果より、IL-2Rβ細胞質ドメイン鎖融合タンパク質がイン
ビトロすなわち細胞なしのシステムにおいてIL-2Rβ鎖と細胞Raf-1セリン／トレ
オニンキナーゼの結合の研究に用い得るのが確認された。
上記した基本的な細胞なしシステムを用いて、いくつかのFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖
野性型およびFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖欠失変異タンパク質についてＴ細胞溶解質中に
存在するRaf-1タンパク質とのこの特殊な相互作用を調べた。これらのFLAG-HMK-
IL-2Rβ鎖野性型（WT）およびIL-2Rβ鎖の特定のドメインを欠く欠失変異体を、
Raf-1結合に関与するIL-2Rβ鎖ドメインを同定するのに用いた。検定条件は上記
と同様である。簡単に言えば、細菌で産生したタンパク質：(a)FLAG-HMK-IL-2R
β鎖野性型WT）；(b)プロテインに富むC末端(CT+)のみを含むFLAG-HMK-IL-2Rβ
鎖;(c)セリンに富む領域を欠く(Ｓ-)；(d)酸性ドメインを欠く(A-)；(e)酸性ド
メインおよびプロリンに富むＣ末端の両方を欠く(A-CT-)、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖
変異体；またはIL-2Rβ鎖配列を含まないFLAG-HMKベクター(V)(ネガティブコン
トロール)をアンチFLAGアフィニティービードに吸収し、次いで洗う。すべての
構成体すなわち形質転換細菌細胞中に産生され、本研究に用いられるFLAG-HMK-I
L-2Rβ鎖を図１に模式的に表す。これらのFLAG-HMK融合タンパク質コートビード
は、アフィニティー試薬として使用され、Ｔ細胞溶解質中に存在するRaf-1タン
パク質を吸収した。FLAG-HMK融合タンパク質に結合したＴ細胞誘導タンパク質は
、FLAGペプチド含有の緩衝液を用いて溶出し、SDS-PAGEで分離し、Immobilon膜
に移し、アンチRaf-1抗体でブロットした。
これらの実験を何回か繰り返した。結果は次の通りである。FLAG-HMK-IL-2Rβ
鎖WTまたはFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖S変異体でコートしたアフィニティービードは、
Ｔ細胞誘導Raf-1タンパク質を等しくよく結合する；FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖変異体
Ａ-タンパク質は、Raf-1タンパク質の結合を低下する(WTコントロールに比較し
てRaf-1結合の50-80％低下が観測された)；そして酸性およびＣ末端ドメインの
両方を欠くFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖変異体(変異体A-CT-)、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖CT+タ
ンパク質(すなわち、プロリンに富むＣ末端のみを含む)またはFLAG-HMKベクター
(V)コントロールとのRaf-1タンパク質の結合が存在しない。ひとつの代表的実験
の結果を図２に示す。これは、上記の融合タンパク質に関するイムノブロットバ
ンドを表し、SDS-PAGEで分離し、Immobilon膜に移行し、Raf-1でブロットしたも
のである。関連バンド強度はイムノブロットから明らかであり、各々異なる融合
タンパク質に対応する各バンドの計算量をバンドの下に示した。
実施例２：(His)6-Raf-1タンパク質のFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖WTおよびFLAG-HMK-IL-
2Rβ鎖欠失変異体タンパク質との相互作用
IL-2Rβ鎖とRaf-1タンパク質との直接相互作用を調べるために、２種のRaf-1
関連融合タンパク質、すなわちFLAG-HMK-Raf-1および(His)6-Raf-1タンパク質を
構築し、細菌で発現し、次いでアフィニティー樹脂で精製した。
FLAG-HMK-IL-Raf-1発現プラスミドの構築のために、鋳型としてRaf-1 cDNAお
よびFLAG-HMKベクター(FLAG-HMK-ベクターについては、実施例１参照)へのクロ
ー
ニングを容易にするよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR
を実施した。FLAG-HMK-Raf-1タンパク質をIPTG導入によりBL−21 pLysS菌中に産
生し、アンチFLAGアフィニティー樹脂で精製した。アフィニティー精製は、アン
チRaf-1抗体により認識された72−74kDのタンパク質を作った。
(His)6-Raf-1発現プラスミドの構築のために、鋳型としてRaf-1 cDNAおよび製
造者のプロトコール(QIAGEN，QIAexpressionist;Chatsworth，CA)によるpQE-30
プラスミドへのクローニングを容易にするよう設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いてPCRを実施した。(His)6-Raf-1タンパク質をIPTG導入によりMl5
菌中に産生し、Ni-NTA樹脂(QIAGEN)で精製した。アフィニティー精製は、アンチ
Raf-1抗体により認識された72−74kDのタンパク質を作った。
上記結果に基づき、Raf-1との結合についてIL-2Rβ鎖領域の特殊な必要条件を
調べた。この分析において、上記クローン、すなわち細菌で産生されたRaf-1タ
ンパク質を用い、これはRaf-1配列の発現ベクターへのクローニングの結果とし
て、(His)6-Raf-1タンパク質であった。これはRaf-1活性に対する作用がない。
これらの結合研究において細菌で産生された(His)6-Raf-1タンパク質の使用は
、完全に細胞なしのシステムが得られるシステム、すなわち精製された細菌産生
IL-2Rβ鎖融合タンパク質が精製Raf-1と反応し、Ｔ細胞溶解質内のRaf-1と反応
しない基本的に細胞なしシステムより優れた他の長所を提供する。
従って、この完全な細胞なし検定法において、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖野生型およ
びIL-2Rβ鎖のいくつかの特定ドメインの少なくとも１つを欠失する欠失変異体(
実施例１参照)を、Raf-1結合に関与するIL-2Rβ鎖ドメインを同定するのに用い
られた。検定条件は実施例１に記載の条件と同様である。簡単にいえば、細菌で
産生されたタンパク質：FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖野生型(WT)、プロリンに富むＣ末端
のみを含むFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖(CT+)；セリンに富む領域を欠く(S-)、酸性ドメ
インを欠く(A-)、酸性ドメインおよびプロリンを富むＣ末端を欠く(A-CT-)、FLA
G-HMK-IL-2Rβ鎖変異体を、細菌で産生した(His)6-Raf-1(すべての構築体につい
て図１参照)とインキュベートし、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖／Raf-1複合体をアンチFL
AGアフィニティービードに吸収せしめた。よく洗った後、IL-2Rβ鎖／Raf-1複合
体をFLAGペプチド含有の緩衝液を用いてアンチFLAGビードから競合的に溶出
した。溶出タンパク質をSDS-PAGEで分離し、Immobilon膜に移行し、アンチRaf-1
抗体でブロットした。
ひとつの代表的実験の結果を図３に示す。これは、上記の融合タンパク質に関
するイムノブロットバンドを表し、SDS-PAGEで分離し、Immobilon膜に移行し、R
af-1でブロットしたものである。関連バンド強度はイムノブロットから明らかで
あり、各異なる融合タンパク質に対応する各バンドの計算量をバンドの下に示し
た。図３において、２種の右側サンプル、すなわち二番目の“WT”と“v”とが
ポジティブおよびネガティブのコントロールであり(下記参照)、およびIL-2RβF
LAG構築体がRaf-1タンパク質と反応するかどうかを“＋”と“−”が表している
のに注意。これらの実験は何回も繰り返され、基本的に同じ結果が得られた。
(i)FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖(WT)およびIL-2Rβ鎖のセリンに富む領域を欠く(S-)欠
失変異体は、Raf-1タンパク質を等しくよく結合する。(ii)他方、IL-2Rβ鎖の酸
性ドメインを欠く(A-)変異体は、Raf-1を結合する能力を顕著に下げる。Raf-1の
FLAG-HMK-IL-2Rβ A-変異体に結合する量をHew1ett Packard ScanJetを用いて
測定したところ、ポジティブコントロール値の17％から50％、すなわちFLAG-HMK
-IL-2Rβ鎖WTとのRaf-1結合の17−50％であった。(iii)酸性およびＣ末端プロリ
ンを欠く変異体(A-CT-)および指定のFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖S+は、Raf-1を結合しな
い(ポジティブコントロールの0％)。(iv)プロリンに富むＣ末端のみを含有するF
LAG-HMK-2Rβ鎖変異体(CT+)は、Raf-1タンパク質に対する結合を発現した(0％-
１０％)。実施された２種のネガティブコントロールは：
１)FLAG-HMKベクター(V)のみ(挿入されていない)で形質転換された細菌の溶解
質を(His)6-Raf-1タンパク質含有の細菌溶解質の等量と共にインキュベートし、
タンパク質をアンチFLAGビードに吸収し、FLAGペプチド含有の緩衝液で洗い、溶
出した。このコントロールサンプルは、図３の右側にある(“V”)。
２)FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖WTタンパク質含有の細菌溶解質も挿入のない(His)6-タ
ンパク質をコードするベクターで形質転換した細菌からつくった溶解質の等量と
ともにインキュベートした。FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖タンパク質と相互作用するかも
しれないRaf-1様タンパク質をM15細菌が含有する可能性を除外するためにこのコ
ントロールが置かれた。このコントロールは右側から２番目(第２“WT”)である
。
上記結果からして、IL-2Rβ鎖の酸性ドメインがRaf-1タンパク質の最適結合に
明らかに必要である。プロリンに富む細胞質テイルの部分がRaf-1の直接結合に
必要であろう。
実施例３：Raf-1タンパク質とのIL-2Rβの相互作用：セリン／トレオニンキナー
ゼ活性
Ｔ細胞におけるRaf-1セリン／トレオニンキナーゼの活性化をもたらすものは
、知られていない。Raf-1は、セリンに富む蝶番領域により分離されているＮ末
端調節ドメインとＣ末端触媒ドメインとを有する。調節ドメインは触媒ドメイン
上に蝶番領域で折りたたまれ、それによりキナーゼ活性が抑制されていると考え
られている(McGrew，B．R．et al.，1992;Brunder，J.T．et al.，1992;Stanton
，V.P．et al.，1989)。このモデルに合致して、Ｎ末端切断Raf-1タンパク質が
基本的なキナーゼ活性を発現する(Stanton，V.P．et al.，1989)。IL-2RβのRaf
-1調節ドメインへの結合は、立体配座的変化を経てキナーゼを活性化する(Masli
nski，W．et al.，1992)。Raf-1のIL-2Rβ鎖との直接結合がRaf-1セリン／トレ
オニンキナーゼの活性化を誘発するかどうかを決定するために、FLAG-HMK-Raf-1
融合タンパク質を構築し、発現した。
IL-2Rβ鎖細胞質ドメインとRaf-1との直接相互作用がRaf-1キナーゼの活性を
誘発するかどうかを調べるために、標準的セリン／トレオニンキナーゼ検定法(
実施例１および２の引用参照)を用い、Raf-1のみのキナーゼ活性およびIL-2Rβ
鎖融合タンパク質との相互作用後の活性をモニターした。精製FLAG-HMK-IL-2Rβ
鎖細胞質ドメインタンパク質もFLAG-HMK-Raf-1タンパク質のみもセリン／トレオ
ニンキナーゼ活性を発現しなかった。同様に、両タンパク質を等量の濃度で混ぜ
合わせたとき、セリン／トレオニンキナーゼ活性は認められなかった。これらの
結果は、(i)IL-2Rβ鎖とRaf-1タンパク質の直接相互作用がRaf-1の酵素活性を活
性化するのに十分でないこと、(ii)Ｔ細胞中に存在する他の因子がRaf-1キナー
ゼ活性を仲介するのに必要であることを示している。後者を調べるために、上記
の方法を用いて、Ｔ細胞誘導タンパク質(Raf-1を含め)とのFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖
の相互作用の結果としてのセリン／トレオニンキナーゼ活性を検査した。
(a)上記の方法を用いて、Ｔ細胞誘導タンパク質(Raf-1を含め)とのFLAG-HMK-
IL-2Rβ鎖の相互作用の結果としてのセリン／トレオニンキナーゼ活性を検査し
た。
FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖野生型およびIL-2Rβ鎖のいくつかの特定ドメインを欠失
する欠失変異体(実施例１および２、図１を参照)を、Ｔ細胞誘導活性セリン／ト
レオニンキナーゼ結合に関与するIL-2Rβ鎖ドメインを同定するのに用いた。検
定条件は上記の条件と同様である。簡単にいえば、細菌で産生されたタンパク質
：FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖野生型（WT）、プロリンに富むＣ末端のみを含むFLAG-HMK
-IL-2Rβ鎖(CT+)；セリンに富む領域を欠く（S-)、酸性ドメインを欠く(A-)、酸
性ドメインおよびプロリンを富むＣ末端を欠く(A-CT-)、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖変
異体、またはIL-2Rβ鎖配列を含有しないFLAG-HMKベクター(ネガティブコントロ
ール)(すべての構築体について図１参照)をアンチFLAGアフィニティービードに
吸収せしめ、洗った。FLAG-HMK融合タンパク質コートビードをさらにアフィニテ
ィー試薬として用い、Ｔ細胞溶解質中に存在するタンパク質を吸収した。FLAG-H
MK融合タンパク質に結合したＴ細胞誘導タンパク質について、外性基質すなわち
ヒストンH-1または(His)6-Mek-1の存在または不存在におけるセリン／トレオニ
ンキナーゼ活性を調べた。キナーゼ反応の産物をSDS-PAGEサンプル緩衝液中で煮
沸し、Immobilon膜およびオートラジオグラフィーに移行した。
下記は、実施した実験とその結果である。
(i)外的附加基質の不存在で実施されたキナーゼ反応。FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖(WT
)またはFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖S-変異体(S-)でコートしたアフィニティービードは
、セリン／トレオニンキナーゼ活性を発現するＴ細胞誘導タンパク質をp70タン
パク質のリン酸化の結果として結合する。このタンパク質は、Raf-1タンパク質
と共に移動する限りRaf-1であり得る。一方、他のFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖関連溶融
タンパク質(変異体A-，A-CT-，CT+)でコートしたビート上に保持されるＴ細胞溶
解質またはベクター(Ｖ)コントロールを含む細菌溶解質には、リン酸化p70が存
在しない。これらの実験は何回も繰り返されて基本的に同じ結果が得られた。代
表的実験の結果を図４に示す。これは、タンパク質キナーゼ反応の産物について
のオートラジオグラムを表し、種々のIL-2Rβ溶融産物でコートされたアンチFLA
Gビードで反応は行われ、Ｔ細胞溶解質でインキュベートされ、SDS-PAGEおよ
びオートラジオグラフィーに掛けられたものである。
(ii)ヒストン-H-1の存在で実施されたキナーゼ反応。FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖でコ
ートされたアフィニティービード上に保持したＴ細胞溶解質においてヒストン-H
-1のゲニスタイン(チロシンキナーゼ阻害剤)非依存性リン酸化が増加する。ベク
ターのみで形質転換された細菌から単離のタンパク質でコートされ、Ｔ細胞溶解
質に暴露されたコントロールアフィニティービードは、セリン／トレオニンキナ
ーゼ活性を目立たないレベルでのみ保持する。これらの実験は数回繰り返した。
代表的実験の結果を図５に示す。これは、キナーゼ反応の産物についてのオート
ラジオグラムを表し、ヒストンH-1の存在下で、IL-2Rβ鎖構築体(WT)でコートさ
れ、ゲニステインの存在(レーン3)またはゲニステインの不存在(レーン2)でＴ細
胞溶解質に暴露されたアンチFLAビードで行われ、SDS-PAGEおよびオートラジオ
グラフィーに掛けられた。コントロール(レーン１)はFLAG-HMKベクターのみ(挿
入なし)で実施された。
(iii)キナーゼ欠失(His)6-Mek-1タンパク質の存在で実施されたキナーゼ反応
。FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖WTおよびs-でコートされ、Ｔ細胞溶解質に暴露されたアン
チFLAGビードの存在において、(His)6-Mek-1キナーゼリン酸化が増加する。他の
FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖関連変異体(変異体A-、A-CT-、CT+)またはベクターコントロ
ールを含む細菌溶解質の存在で(His)6-Mek-1キナーゼリン酸化が目立たないレベ
ルで観察された。代表的実験の結果を図６に示す。これは、キナーゼ反応の産物
についてのオートラジオグラムを表し、(His)6-Mek-1タンパク質の存在下で、Ｔ
細胞溶解質に暴露された種々のIL-2Rβ鎖構築体について反応は行われ、次いでS
DS-PAGEおよびオートラジオグラフィーに掛けられた。
図４−６の結果から、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖野性型(WT)またはセリンに富む領域
を欠くFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖変異体(変異体S-)でコートされ、Ｔ細胞溶解質に暴露
されたアンチFLAGアフィニティービードが、(i)Raf-1タンパク質と共に移動する
p70バンドをリン酸化する、(ii)キナーゼ非活性(His)6-Mek-1タンパク質をリン
酸化する活性セリン／トレオニンキナーゼを保持することは、明らかである。他
のFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖関連タンパク質(変異体A-、A-CT-、CT+)またはベクターコ
ントロールを含有する細菌溶解質の存在で平行的に実施された実験では、この
ようなキナーゼ活性が存在しない。これらの結果を合わせると、酵素的に活性な
セリン／トレオニンキナーゼRaf-1がIL-2Rβ鎖の酸性領域に結合することを示し
ている。
(b)上記(a)の方法に従い、細菌で産生された(His)6Raf-1タンパク質とFLAG-HMK-
IL-2Rβ鎖との相互作用の結果としてのセリン／トレオニンキナーゼ活性を調べ
た。上記実施例２に記載したように、この完全に細胞なしのシステムは、Ｔ溶解
質がRaf-1タンパク質を含み用いられた上記(a)での細胞なしシステムより優れて
いる。
FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖野性型および(His)6-Raf-1タンパク質を含有する細菌溶解
質を用い実(施例２参照)、IL-2Rβ鎖がRaf-1の触媒的活性を誘発するという仮説
を検証した。検定条件は上記に同じである。簡単にいえば、細菌で産生されたタ
ンパク質：FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖野生型(WT)またはFLAG-HMK(ネガティブコントロ
ール)(すべての構築体について図１参照)を(His)6Raf-1または(His)6のいずれか
を含む細菌溶解質とともにインキュベートし、アンチFLAGアフィニティービード
にタンパク質複合体を吸収せしめた。よく洗ったビードを外的に加えられた基質
、酵素的に非活性(His)6-Mek-1キナーゼタンパク質の存在下にセリン／トレオニ
ンキナーゼ活性の存在を調べた。キナーゼ反応産物をSDS-PAGEサンプル緩衝液中
で煮沸し、次いでSDS-PAGEで分離し、Immobilon膜に移行し、オートラジオグラ
フィーに掛けた。これらの実験を何回も繰り返し同様の結果が得られた。FLAG-H
MK-IL--2Rβ鎖と(His)6Raf-1タンパク質との相互作用は、Mek-1キナーゼに対す
るキナーゼ活性を誘発しなかった。
従ってこれらの結果は、いくつかの他の因子(共因子A)がRaf-1キナーゼ活性を
仲介するのに必要であり、これはＴ細胞溶解質(上記(a)参照)に存在し、形質転
換細菌細胞からつくられた精製(His)6Raf-1に存在していないことを表している
。14-3-3ファミリーのタンパク質がRaf-1との結合に関与し、それによりこの活
性を仲介する可能性がある。このような14-3-3ファミリーは最近報告され(Freed
et al.，1994;Irieetal.，1994;Morrison，1994)、下記実施例４で研究された
。
実施例４：Raf-1および／または14-3-3タンパク質とのIL-2Rβ鎖相互作用：Raf-
1および／または14-3-3タンパク質結合に関与するIL-2Rβ鎖領域
Raf-1および／または14-3-3タンパク質と相互作用をなすであろうIL-2Rβ鎖ド
メインを同定するための他の実験において、IL-2Rβ鎖をコードするcDNAまたは
その細胞質ドメインのセグメントを欠く変異体をつくり、COS細胞で発現せしめ
た。
(i)これらの実験(上記実施例１a(i)および(ii)参照)において、IL-2Rβ鎖野生
型(IL-2Rβ WT)をコードするcDNA(Hatakeyama et al.，1989)をXbaIで消化し、
発現ベクターpRcCMV(Invitrogene)に挿入した。71個のアミノ酸(アミノ酸252-32
2)を欠くIL-2RβをコードするcDNAは、box 1(Murakami et al.，1991)およびシ
グナル形質導入に極めて重要なセリンに富む領域(Hatakeyama et al.，1989)、I
L-2Rβbox 1-S-を全長野生型IL-2Rβ鎖cDNA(配列番号１)をpBluescript IISK(St
ratagene)のXbaI部位にクローニングして製した。Nco1／AflII部位は、次のオリ
ゴヌクレオチドからなる２本鎖リンカーで連結した。
5'CATGGCTGAAGAAGGTC3'(センス、塩基946-962、配列番号４)および
5'TTAAGACCTTCTTCAGC3'(アンチセンス、塩基950-962 プラスAflII部位、配列
番号5)この構築体をXbaIで消化し、IL-2Rβ鎖をコードする配列含有のフラグメ
ントをpRcCMVに再クローンした。IL-2RβA-変異体の構築のために、pRcCMV-IL-2
RβをXbaIで消化し、pTZ19R(Pharmacia)のXbaI部位にクローンした。次いでこの
構築体をNcoI-BstXIで消化した。IL-2Rβ鎖の細胞質ドメインの大部分をコード
する配列含有の964bpフラグメントを、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖変異体コードcDNA(下
記参照)含有のAR(DRI)59/608プラスミド(Le Clair et al.，1992;Blanar et al.
，1992)のNcoIおよびBstXI消化から得た754bpフラグメントで置きかえた。得たp
TZ-IL-2Rβ-A-プラスミドは、IL-2Rβ鎖をコードするが、酸性ドメインコードの
210塩基を欠く配列を含ものであり、XbaIで消化し、IL-2Rβ-A-をコードする配
列含有のフラグメントをpRcCMVに再クローンした。
プラスミドFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖細胞質ドメイン野生型(FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖WT)
の構築のために、1107bp cDNA(上記(i)参照)をIL-2Rβ鎖cDNAからNcoI-BamHIで
切除し、合成枠内2本鎖リンカーEcoRI/NcoI(オリゴヌクレオチド：センス5'AATT
CAATCGCAGGAACACCGGGC3'(EcoRI部位プラス塩基927−944；配列番号６)お
よびアンチセンス5'CATGGCCCGGTGTTCCTGCAGTTG3'(塩基927-949；配列番号７)か
らつくられた)でもって、EcoRI-BamHIで消化されたpAR(DRI)59/60プラスミドの
基底に連結した。FLAG-HMK-IL-2RBS-変異体(セリンに富むドメインを削除した)
の構築のために、FLAG-HMK-IL-2RWTをコードするプラスミドをSac-Af1IIで消化
した。両端を満たした後、プラスミドを平滑末端とし、連結した。FLAG-HMK-IL-
2Rβ-A-変異体(酸性ドメインを削除した)の構築のために、FLAG-HMK-IL-2Rβ-WT
のSacI-BamHI消化から得た1048bpフラグメントをさらにPstIで消化して、701、2
10および136bpの３フラグメントを得た。フラグメント701および136をSacI-BamH
I消化FLAG-HMK-IL-2Rβ-WT構築体の基底に再連結リゲートした。各導入変異の正
しいことは、DNA配列分析により確認した。
(ii)図７aは、COS細胞における発現のために上記のようにつくられた野生型(W
T)および変異体(box 1-S-;A-)IL-2Rβ鎖タンパク質構築体を模式的に表す。図7b
は、COS細胞における発現のために上記のようにつくられた野生型(WT)および変
異体(S-;A-)IL-2Rβ鎖タンパク質構築体を模式的に表す。これらの構築体はCOS
細胞および細菌細胞に導入されて、タンパク質が発現され、細胞溶解質からアフ
ィニティー精製され、精製タンパク質をSDS-PAGEで分離し、Commassie blue(基
本的手法について、Le Clair et al.，1992;Blanar and Rutter，1992)で着色し
た。細菌細胞での構築体の発現、アフィニティー精製、SDS-PAGE分離およびComm
assie blue着色についての手法は上記した(実施例１、a(i)および(ii))。COS細
胞での構築体の発現、アフィニティー精製、SDS-PAGE分離およびCommassie blue
着色については、下記の通り。
COS細胞をDOTAP方法(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)で、製造者の
指示どおりにトランスフェクトした。トランスフェクト反応混液は、最終量のHB
S 150ml(25mM HEPES，pH7.4，100mM NaCl)中に全DNA 5μgおよびIOTAP 30mlを含
んでいた。10％熱不活性化牛胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、25mM
HEPES、pH7.4およびL−グルタミンを補充したDMEM培地でCOS細胞を生育した。C
OS細胞をトランスフェクト反応混液に24時間接触せしめ、水洗し、次いで新鮮な
培地に培養した。水洗24時間後、約3X106細胞を採取し、冷PBSで2度洗った。溶
解緩衝液をつくり、これは、150mM NaCl，50mM Tris pH=7.4，0.5%
CHAPS(Pierce),10% グリセロール(Sigma)からなり、さらに使用直前に次のプロ
テアーゼ阻害剤を補充した。アプロチニン(Sigma)2.5mg/ml、ロイペプシン（Boe
hringer-Mannheim）2.5mg/ml、ペプスタチンA（Boehringer-Mannheim）2mg/ml、
PMSF(Sigma)150mg/ml、 NaF(Sigma)100mMおよびナトリウム・オルトヴァナデー
ト(Sigma)1mM。トランスフェクトした細胞を溶解緩衝液0.5mlに10分間氷冷し、
次いで5分間12,000xgで遠心分離し、残った上澄み液を収集し、プレ免疫血清お
よびタンパク質G−アガロースビード(BRL-Gibco，Gaithersburg，MD)(溶解緩衝
液で予め洗ってある)を補充した。サンプルを4℃で30分間インキュベートした。
上澄み液を集め、適当な抗体を補い、後にタンパク質G-アガロースビードを加え
た。サンプルを溶解緩衝液で3回各15分間洗い、Laemmli緩衝液に再懸濁し、常法
によってSDS-PAGE、Commassie blue着色を行った(Maslinski，et al.，1992)。
上記アフィニティー精製工程において用いられた抗体(タンパク質Ｇ-アガロー
スビードとともに)は次のものを含む。標準手法を用いて細菌中に発現された14-
3-3タンパク質に対する兎アンチ血清、これはポリクローナルアンチ14-3-3抗体
タンパク質である；Upstate Biotechnologyから購入した細菌性14-3-3タンパク
質に交叉活性である兎アンチヒト14-3-3抗体；Santa Cruz Biotechnologyから購
入したアンチRaf-1(C1)抗体；Mik-β1と呼ばれるアンチヒトIL-2Rβ抗体(Tsudo
et al.,に記載され、M Tsudo，Kyoto，Japanから得た)。
図７(c)は、COS細胞で発現されたアフィニティー精製、SDS-PAGE分離、Commas
sie blue着色のFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖関連(野生型および変異体)融合タンパク質に
ついてのバンドを表す。
(iii)Raf-1および14-3-3タンパク質とのIL-2Rβ鎖の結合性質を決定するため
に、上記したように、COS細胞をヒトIL-2Rβ鎖の全長または欠失変異体をコード
する構築体でトランスフェクトし、アンチIL-2Rβ鎖抗体Mik-β1(上記(ii)参照)
で免疫沈降し、アンチRaf-1またはアンチ14-3-3抗体(上記(ii)参照)でブロット
した。
Ｔ細胞におけるRaf-1および14-3-3タンパク質とのIL-2Rβの相互作用を調べる
ために、さらに、フィトヘマググルチニン(PHA)活性末梢血単核細胞の溶解質を
精製FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖関連タンパク質を含むアンチFLAGアフィニティービード
(上記(i),(ii)および実施例1-3参照)に通した。吸収されたタンパク質を洗い、F
LAGペプチドで溶出し、イムノブロット法でRaf-1および14-3-3タンパク質の存在
を調べた。末梢血単核細胞をFicoll-Hypaque(Pharmacia)を用いて単離し、培養
基中72時間PHA(Sigma)5mg/mgで刺激し、洗い、IL-2(Hoffman-La Roche)10U/mlの
存在下に3日間培養基に保持し、次いでIL-2なしで24時間インキュベートした。
洗った細胞(約4x107)をDounce均質緩衝液に溶解し、遠心分離し(15x103xg 15分
間)、上澄み液を、FLAG-HMK融合タンパク質の一つと相互作用した細菌溶解質で
コートしたアンチFLAG(M2)アフィニティーカラム(IBI-Kodak)にかけた。50mM Tr
is pH=7.4および150mM NaClを含有する緩衝液15mMで洗った後、アンチFLAGアフ
ィニティーカラムに吸収されたタンパク質をFLAGタンパク質(10-4M)補充の同じ
緩衝液で溶出し、上記したSDS-PAGEおよびイムノブロット法にかけた。
インビトロにおけるIL-2Rβ／Raf-1の相互作用を調べるために、FLAG-HMK-IL
−2Rβ鎖関連および(His)6Raf-1融合タンパク質を含有する細菌溶解質(実施例２
および３、参照)を混合し、アンチFLAGビードに吸収せしめた。ビードに結合し
たタンパク質を洗い、FLAGペプチドで溶出し、イムノブロット法でRaf-1および1
4−3-3タンパク質の存在を調べた。
この実験結果は図８a-cに示す。
図８aは、種々の構築体IL-2Rβ-WT、IL-2Rβ-box 1-S-、IL-2RβA-またはコン
トロールとしてIL-2Rβ構築体を有さないベクターでトランスフェクトされたCOS
細胞からの溶解質についてなされたイムノブロットを表す。COS細胞溶解質をア
ンチRaf-1またはアンチ14-3-3抗体で免疫沈降した。図８aに示す結果から、IL-2
Rβ-WTおよびIL-2Rβ-box 1-S-の両者がRaf-1および14-3-3の両者に結合したこ
とは、明らかである。一方、IL-2RβA-はRaf-1に結合しないで、14-3-3タンパク
質のみと結合した。
図８bは、精製FLAG-HMK-IL-2Rβ関連タンパク質を含有するアンチFLAGアフィ
ニティービードを通したPHA活性末梢血単核細胞からの溶解質についてなされた
イムノブロットを表す。吸収されたタンパク質を洗い、FLAGペプチドで溶出し、
イムノブロット法でRaf-1および14-3-3の存在を調べた。図８ｂに示す結果から
、
Ｔ細胞溶解質がIL-2Rβ鎖誘導アフィニティーカラムを通ったときに、同じ特異
的相互作用(図８aと同様に)が起きたこと、すなわちIL-2RβWTおよびIL-2Rβ-bo
x 1-S-変異体がRaf-1に結合し、IL-2Rβ鎖A-がRaf-1に結合しなかったことは、
明らかである。これらのＴ細胞溶解質において、Raf-1タンパク質は、外的に加
えられたキナーゼ非活性MEKタンパク質のリン酸化(実施例２および３参照)で示
されるように基本的レベルにある。
図８aおよび８bの結果からして、IL-2Rβ鎖の70個のアミノ酸領域(A-領域)がR
af-1結合に必要であり、一方、IL-2Rβ鎖の144個のアミノ酸Ｃ末端部分が14-3-3
タンパク質との相互作用に必要であると結論された。
(iv)A-領域およびＣ末端領域が夫々Raf-1および14-3-3タンパク質に直接結合
しているかどうかを確認するために、一連の細菌で発現したFLAG-HMK-IL-2Rβ鎖
融合タンパク質を調べた。これらの実験においては、細菌で発現の(His)6Raf-1
タンパク質を用いた(細菌性構築体について実施例２および３、図７ｂ参照)。図
８cの実験結果は、FLAG-HMK-IL-2Rβ鎖関連および(His)6Raf-1融合タンパク質を
含有する細菌溶解質を混合し、アンチFLAGビードに吸収し、行ったイムノブロッ
トを表す。ビードに結合したタンパク質を洗い、FLAGタンパク質で溶出し、イム
ノブロット法で調べた。細菌溶解質が28kDタンパク質を含み、これは14-3-3タン
パク質の高度に保存された領域(ヒト14-3-3の残基119-129)に対する抗体に免疫
活性であったので、ヒト14-3-3タンパク質を共発現することはなさなかった。図
８cから明らかなように、Raf-1とIL-2Rβの酸性領域との直接結合が存在する。
さらに、COS細胞におけるように、細菌溶解質に存在する14-3-3タンパク質は、I
L-2Rβ鎖のＣ末端部分に直接結合した。このように、哺乳動物と細菌の14-3-3タ
ンパク質の相同性は、Raf-1との14-3-3結合部位およびIL-2Rβ鎖を保持するのに
十分であることは、明らかである。
しかし、図８cから分かるように注意すべきことは、細菌性14-3-3がRaf-1タン
パク質の存在においてのみIL-2Rβに結合したことである。したがって、Raf-1お
よび14-3-3はIL-2Rβ鎖のA-領域(Raf-1)およびＣ末端部分(14-3-3)との結合前に
複合体を形成するようである。一旦14-3-3タンパク質がIL-2Rβに結合すると、R
af-1との結合を維持するための必要条件は、酸性領域を欠く変異IL-2Rβタンパ
ク質がRaf-1に結合しない事実（図８bおよびc）からして、ストリンジェントが
低い。
従って、上記の結果は、Raf-1がこれらの３分子相互作用(Raf-1‐14-3-3IL-2R
β)において中心的役割を演じることを示唆している。この考えは、IL-2Rβ鎖の
A-領域がRaf-1に結合するエフェクタードメインすなわちRasおよびRap1Aに相同
的であることから支持される(例えば、Zhang et al,．1993;Nassar et al.，199
5参照)。Ras(H-Ras)とIL-2RβのA領域との相同性は、図９に模式的に示す。従が
って、IL-2Rβ鎖(アミノ酸371-395)間の相互作用が細胞質膜でのIL-2Rβ鎖を経
由するRaf-1の固定化における決定的因子のようである。
(v)IL-2受容体複合体をきっかけとして、Ｔ細胞におけるいくつかのチロシン
キナーゼが活性化される。それには、Jak-1(Miyazaki et al,．1994)、Jak-3(例
えば、Johnstein et al.，1994)およびp561ck(Minami et al.，1995)がある。前
に、IL-2RβからのRaf-1のチロシンキナーゼ依存性解離がIL-2によるRaf-1の活
性化に不可欠であることを本発明者は明らかにした(Maslinski et al.，1992)。
Jak-1およびp561ckの両者は非活性化IL-2Rβ鎖に結合するが、p561ckはA-領域と
も結合するのが観察され(Minami et al.，1993)、IL-2RβからのRaf-1／14-3-3
タンパク質の解離におけるその役割を本発明者が調べるきっかけとなった。この
研究をなすために、COS細胞をIL-2Rβ鎖のみでトランスフェクトし、またはlck
あるいはfynと共トランスフェクトして、ついでアンチIL-2Rβ鎖抗体で溶解した
。免疫沈降体をイムノブロットによりRaf-1および14-3-3タンパク質の存在につ
いて検査した(すべての手法は詳しく上記した通り)。
上記イムノブロットについての結果を図１０aに示す。これらの結果から、COS
細胞のIL-2Rβ鎖およびp561ckとの共トランスフェクトは、IL-2Rβ鎖とのRaf-1
／14-3-3結合の解消をもたらした。一方、他のsrc-様キナーゼであるp56fynはこ
のような解離を起こさなかった。さらに、IL-2Rβ／Raf-1／14-3-3複合体の酵素
的活性p561ckによる解離についても研究した。予め形成したIL-2Rβ鎖／(His)6R
af-1／細菌性14-3-3複合体を準備し(図a-cについて参照)、触媒的活性p561ck(Up
state Biotechnology)に接触せしめ、洗い、FLAGペプチドで溶出した。溶出物を
SDS-PAGEで分離し、Raf-1タンパク質の存在を調べた。この研究の結果
は、図１０bにRaf-1バンドを表すSDS-PAGEゲルを示す。これらの結果から、予め
形成したIL-2Rβ鎖／Raf-1／細菌性14-3-3複合体の酵素的活性p561ckによる解離
がインビトロでもみられることは明らかである。従がって、p561ckの活性化がIL
-2仲介Raf-1活性化におけるIL-2RβからのRaf-1／14-3-3の解離に関与している
と結論された。p561ckがIL-2Rβ鎖のRas様配列と相互作用をしている様子がない
ので、Raf-1およびp561ckが同じA領域の別個のサブドメインに結合することが、
IL-2R活性化において生じる迅速な酵素反応についてのキナーゼおよびその基質
を共局在化するようである。
上記の結果を総合すると、Raf-1／14-3-3複合体はIL-2Rβ鎖に直接結合する。
すなわち、受容体のA領域はRaf-1結合に必要であり、分子のＣ末端部分は14-3-3
と相互作用する。これらの結果は、(i)IL-2Rβ鎖の酸性ドメインとRaf-1を結合
するRasおよびRap1Aのエフェクタードメインとの相同性(図９)、および(ii)細胞
質基質における、または細胞質膜に共局在する前に形成したRaf-1／14-3-3タン
パク質複合体の存在に合致する(Fanti et al.，1994参照)。従がって、IL-2Rβ
鎖はRaf-1の膜局在化におけるRas活性化のための必要条件を回避する(Leevers e
t al.，1994;Stokoe et al.，1994)。Raf-1および14-3-3タンパク質の最適結合
に関与するIL-2Rβ鎖の２つの別個の領域(酸性Ａ領域およびＣ末端領域)が“寛
大な”Raf-1の結合および活性化、すなわちＡ領域を欠くIL-2Rβ鎖変異体が、受
容体のＣ末端部分(14-3-3結合ドメイン)と結合する14-3-3タンパク質との結合を
通して、Raf-1タンパク質のいくつかと結合し得ることを可能とする。例えば、
Ａ領域を欠く変異IL-2Rβ鎖を発現するBAF細胞は、野生型分子を発現するこの細
胞よりも弱くではあるが、なおIL-2に応答する(Hatakeyama et al.，1989)。他
方、IL-2RβＡ領域の不存在で起きるRaf-1の活性化は、RasのIL-2誘発活性化を
経て達成され得る(例えば、Izquierdo-Pastor et al.，1995)。
実施例１−４に上記した結果から、本発明においてIL-2Rβ鎖とRaf-1が直接相
互作用すること、およびIL-2Rβ鎖と14-3-3タンパク質も直接相互作用すること
が明らかにされたと、結論し得る。さらに、Raf-1と14-3-3はIL-2Rβ鎖の相違す
る部位に結合し、複合体を形成する。Raf-1との結合に必要なIL-2Rβ鎖の細胞内
ドメインの部分は、ここにおいて明確にされた。これは成熟ヒトIL-2Rβ鎖のア
ミノ酸残基313‐382を含むいわゆる酸性領域である(実施例６下部、図１１およ
び１２参照)。さらに、IL-2Rβ鎖の同じ部分(酸性ドメイン)がRaf-1酵素活性(い
わゆるタンパク質キナーゼ活性)の活性化に必要であることも明らかにした。さ
らに、IL-2Rβ鎖の上記酸性ドメインは、Rasエフェクタードメインに相同的であ
り、Raf-1結合に決定的に重要であるが、14-3-3タンパク質と相互作用するのは
受容体のＣ末端部分である。酵素的に活性なp561ckの存在において、p56fy-の存
在でなく、IL-2Rβ鎖からのRaf-1／14-3-3複合体が解離し、これはIL-2RのIL-2
仲介活性化に直接関係し、次いで細胞内シグナル化をもたらす。２種のインビト
ロ結合検定法が開発された。遮断活性を有する化合物や物質の存在について多く
のサンプルをスクリーニングするのに適している。遮断活性は、すなわちIL-2R
β鎖のRaf-1との結合あるいは相互作用を遮断し、この遮断によってIL-2/IL-15
のその受容体との結合により開始されるシグナル経路を遮断するものである(下
記の実施例５および６参照)。このような化合物または物質は、IL-2/IL-15仲介
シグナル経路を遮断することによって、一般的に自己免疫疾患または特定的に移
植拒絶および移植片-宿主反応における処置に有用である。
実施例５：IL-2Rシグナル経路を破壊し得る化合物を試験するためのインビトロ
検定法
上記実施例１−４に述べたように、本発明において２種のビトロ検定法が開発
された。第一の検定法は細胞なしシステムであって、細菌産生または哺乳動物細
胞(COS細胞)産生のIL-2Rβ鎖融合タンパク質をＴ細胞溶解質と相互作用せしめ、
IL-2Rβ鎖細胞内ドメインまたはその部分と特異的に結合し得るRaf-1および14-3
-3などの化合物を単離、同定または特性化するものである。第二の検定法はいわ
ゆる完全な細胞なしシステムであって、細菌産生または哺乳動物細胞(COS細胞)
産生のIL-2Rβ鎖融合タンパク質を細菌産生Raf-1タンパク質((His)6-Raf1)およ
び14-3-3タンパク質と相互作用せしめ、IL-2Rβ鎖細胞内ドメインまたはその部
分とRaf-１および14-3-3との結合の本質を単離、同定または特性化するものであ
る。この両検定法において、IL-2Rβ鎖細胞内ドメインまたはその部分とRaf-1お
よび14-3-3との結合について、定性的および定量的に測定することが可能である
。細胞なしシステムにおいては、Raf-1および14-3-3タンパク質のIL-2Rβ細胞
内ドメインの特殊な領域(酸性ドメイン、および酸性およびプロリンに富むＣ末
端領域)との結合後に起きるタンパク質キナーゼ反応を測定することができる。
このタンパク質キナーゼ反応の測定は、Raf-1および／または14-3-3のIL-2Rβと
の結合により明らかに始まる細胞内シグナルプロセス開始の指標である。従って
、インビトロでのタンパク質キナーゼ活性の測定は、Raf-1および14-3-3のIL-2R
βとの結合を破壊し、それによりIL-2R仲介の細胞内シグナルに必須であるキナ
ーゼ反応を阻害し得るかどう決定するための信頼できる検定法を提供する。
完全な細胞なしシステムにおいて、Raf-1タンパク質キナーゼ反応を測定する
ために、追加の因子を要し、これは多くの場合14-3-3ファミリーのタンパク質で
ある。この完全な細胞なしシステムの確立および相互作用測定の成功、すなわち
Raf-1、14-3-3タンパク質およびIL-2Rβの結合は、本発明のさらなる開発、すな
わち本発明を利用して、システムの使用に必要な追加の因子を単離および同定し
て、Raf-1および14-3-3のIL-2Rβとの結合後のタンパク質キナーゼ活性を測定す
るのを可能とする。
IL-2Rβ鎖細胞内ドメインまたはその特殊な必須領域のいずれかに結合する能
力およびそれによりIL-2RβのRaf-1および14-3-3との結合の阻害を起こすために
、ビトロ検定システムにおいて上記のいずれをも使用することができる。このよ
うなスクリーニング検定において、細菌産生または哺乳動物細胞(COS細胞)産生
のIL-2Rβ鎖細胞内ドメイン(WT)および／または酸性ドメインのみを含むか、ま
たは酸性およびプロリンに富むＣ末端ドメインを含むなどのIL-2Rβ鎖細胞内ド
メイン同族体が、IL-2Rβと特異的に結合するものを単離するためにスクリーニ
ングするペプチドや有機化合物含有のサンプルが接触する基質として、用いられ
る。これらの化合物が得られると、Raf-1および／または14-3-3結合あるいは結
果のタンパク質キナーゼ反応を阻害する能力についてのスクリーニング検定にお
けて更に調べられる。この検定に用いられる方法については、実施例１−４に詳
記した。
上記スクリーニング検定法において、FLAG抗体のミクロタイタープレートとの
結合により、次いでスクリーンされるべき阻害剤の存在(不存在＝コントロール)
における、細菌で発現または哺乳動物細胞で発現のIL-2Rβ鎖-FLAG融合タンパク
質、および細菌で発現または哺乳動物細胞で発現のRaf-1および14-3-3タンパク
質により、そして最終的に、Raf-1および／または14-3-3に対する抗体により、E
LISA型検定システムを容易に開発することが可能である。この抗体は標準的標識
例えば放射活性、蛍光などで標識されるか、またはその基質の存在で着色物をつ
くる酵素に結合している。
実施例６：Raf-1および／または14-3-3タンパク質のIL-2Rβ鎖との結合を阻害し
得るIL-2Rβ細胞内ドメインの酸性領域に結合できる化合物
実施例１−４で述べたように、IL-2Rβ鎖の酸性領域はRaf-1との直接結合のた
めの領域であり、Ｃ末端領域は14-3-3タンパク質との直接結合のための領域であ
る。酸性領域は成熟人IL-2Rβ鎖のアミノ酸313‐382を含む。Raf-1および14-3-3
は複合体も形成し、IL-2Rβに結合し、それより複合体の形態において解離する
ようである。
IL-2Rβのプロリンに富むＣ末端部分(アミノ酸383‐525)は、Raf-1合に必ずし
も必要でないが、14-3-3結合に決定的に重要である。IL-2Rβ鎖のこの部分は、R
af-1に複合するこの領域において14-3-3結合経由でRaf-1結合をせいぜい安定化
し得る。図１１は、Raf-1との結合に関与し、IL-2R仲介細胞内シグナルに直接関
与するIL-2Rβの基本的部分を表す。図１２は、ヒトIL-2Rβのアミノ酸配列を模
式的に表す。図１２において、細胞質外ドメインは図の上部(大文字)であり、ペ
プチドリーダー領域は小文字で、透過膜領域は下線文字で表し、細胞質内ドメイ
ンは図の下部であり、酸性領域(アミノ酸313‐382)は点線で示し、IL-2Rβ相互
作用に直接関与するアミノ酸残基(アミノ酸345‐371)はイタリック大文字で示し
、うち酸性残基をイタリック太文字で示す。細胞質内ドメインにおけるセリンに
富む領域のセリン残基は、クロスアウトS大文字で示される。
Raf-1とIL-2Rβの結合およびRaf-1／14-3-3とIL-2Rβの結合を破壊し得るであ
ろうペプチドは、欠失変異体の分析から誘導された27個のアミノ酸ペプチドであ
り(実施例１‐４参照)、酸性ドメインの部分であり、成熟IL-2Rβ鎖タンパク質
のアミノ酸370-396に対応する配列を有する(すなわち、配列番号２のアミノ酸37
0‐396に対応するアミノ酸残基を有するペプチド、図１２参照)。
上記27個のアミノ酸ペプチドの同族体は、既知の標準的化学合成技法および標
準的組換えDNA技法によりつくられる。このような同族体には、上記27個のアミ
ノ酸について１以上のアミノ酸を欠失、附加または置換し、Raf-1および／また
は14-3-3タンパク質とIL-2Rβとの結合を阻害する能力を特徴とするものが含ま
れる。
Raf-1および／またはIL-2Rβと特異的に結合し得るようであり、Raf-1および
／または14-3-3タンパク質とIL-2Rβとの結合を阻害し得る他のタンパク質また
はペプチドは、14-3-3ファミリーのタンパク質から誘導された１以上のタンパク
質、それから誘導された特殊なペプチドまたはその同族体、誘導体を含む。
実施例４に述べたように、Raf-1および／または14-3-3タンパク質またはIL-2R
β鎖細胞内ドメインと特異的に結合し、それによりRaf-1および／または14-3-3
タンパク質のIL-2Rβとの結合を阻害し得る他のタンパク質、ペプチドまたは有
機化合物は、インビトロスクリーニング検定法を用いて容易に得られる。
スクリーンされるべきRaf-1／IL-2RβまたはRaf-1／14-3-3／IL-2Rβ結合の阻
害能力を有する化合物のうち、なんらかの親油特性を有する有機化合物が、薬学
的に用いられて細胞膜を通過する能力を有するであろうことから最も有用であろ
う。例えば、ペプチドを化学的に修飾または誘導して、細胞膜透過性を高め、該
ペプチドの膜経由または細胞質への移行を容易にすることができる。Muranishi
et al．(1991)の報告によると、ラウリン酸でのチロトロピン放出ホルモン誘導
化は、細胞膜を透過する優れた特性を有する親油性ラウロイル誘導体を形成する
。Zachari ae tal．(1991)の報告によると、メチオニンのスルフォキシドへの酸
化およびペプチド結合のケトメチレンイソエステル(C0CH2)での置換が細胞膜経
由のペプチド移行を容易にする。当業者によく知られているいくつかの既知の修
飾または誘導化がある。
さらに、Raf-1および／または14-3-3タンパク質のIL-2Rβ細胞質ドメインとの
結合を阻害し得る本発明の化合物は、細胞への移入を容易にする分子とコンジュ
ゲートまたは複合体形成をすることができる。
米国特許5,149,782は、細胞膜を通過させようとする分子を膜混成剤、例えば
フソゲニク(fusogenic)ポリペプチド、イオンチャネル形成ポリペプチド、他の
膜ポリペプチドおよびミリスチン酸、パルミチン酸などの長鎖脂肪酸でコンジュ
ゲートすることを開示している。これらの膜混成剤は、分子コンジュゲートを細
胞膜の脂質二層に挿入し、その細胞質への移入を容易にする。
Low et al.の米国特許5,108,921は、受容体仲介細胞内取り込み活性のメカニ
ズムによりタンパク質または核酸など(限定するものでない)の分子の透過膜輸送
に用いられる方法を総説している。これらの受容体システムには、ガラクトース
、マンノース、マンノース 6-ホスフェート、トランスフェリン、アシアロ糖タ
ンパク質、トランスコバラミン(ビタミンB12)、α-2マクログロブリン、インス
リンおよび表皮成長因子(EGF)などの他の成長因子を認識するものを含む。Low e
t al.によると、ビオチンおよび葉酸塩についての受容体などの栄養素受容体は
、多くの細胞の膜表面上でのビオチンおよび葉酸塩の局在および多様性、および
関連受容体仲介透過膜輸送プロセスにより細胞膜通過を高めるのに好都合に用い
られる。このように、細胞質に輸送しようとする化合物とビオチン、葉酸塩など
のリガンドとが形成する複合体は、ビオチンまたは葉酸塩受容体を持つ細胞膜に
接触し、受容体仲介透過膜輸送メカニズムを開始し、それにより望む化合物の細
胞への移入をもたらす。
さらに、例えば上記したような小さいペプチド(20‐30個のアミノ酸)のスクリ
ーニングも、より安定なペプチド模倣型薬剤の単離および開発に有利である。こ
れらの化合物、ペプチドなどがスクリーニングされ、Raf-1および／または14-3-
3またはIL-2Rβと結合可能であり、それによりこれらのタンパク質間の結合を遮
断することが分かると、次いで、一般的に自己免疫疾患の阻止および特異的に移
植拒絶反応の防止について期待される利用が検証される。
本発明についての上記ペプチドは、インビトロスクリーニング検定において単
離された天然からのいかなるペプチドおよび標準ペプチド合成方法により作られ
るいかなるペプチドでもあり得る。適当なペプチドは、Raf-1および／または14-
3-3のIL-2Rβとの相互作用に関与して、IL-2Rβ仲介の細胞内シグナルプロセス
を阻害し得るものである。
このように、本発明における上記有機化合物は、薬学的に用いられるいかなる
既知化合物および標準的化学合成方法でつくられるいかなる新規合成化合物でも
あり得る。これらの適当なペプチドは、Raf-1および/または14-3-3のIL-2Rβと
の相互作用に関与して、IL-2Rβ仲介の細胞内シグナルプロセスを阻害し得るも
のである。
本発明の上記ペプチド、有機化合物などは、一般的に自己免疫疾患、特異的に
宿主‐移植片反応の処置のための医薬組成物における活性成分として使用される
。この本発明の医薬組成物には、薬学的に許容される担体、安定剤または賦形剤
、および本発明の活性成分が含まれる。
医薬組成物は、投与形態の必要性に応じて許容される方法で製剤化される。い
かなる投与形態も当業者により用いられ、決定される。例えば、皮下、静脈内、
皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮膚透過またはバッカルなどの経路による種々
の非経口的投与がある。非経口投与は一度の注射あるいは時間をかけての徐々の
注入でなし得る。
通常理解されているように、投与用量は、投与を受ける者の年齢、性別、健康
状態および体重、同時に行われる処置の種類、処置の頻度、および期待する効果
の性質に依存する。当業者に理解され、決定されるように、用量は個々の対象者
ごとに決められる。
各処置に要する全用量は、複数用量で、あるいは一回量で投与される。本発明
の医薬組成物は、指向する状態または他の症候に応じて、単独でまたは他の治療
剤と併用して投与される。
非経口投与剤形に無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルション
があり、これらは技術的に知られる補助剤または賦形剤を含むことができ、通常
の方法によりつくられる。
本発明の阻害化合物を含有する医薬組成物は、その意図する目的を達成するの
に効果的な量で阻害化合物を含有する全ての組成物を含む。さらに、この医薬組
成物は、薬学的に使用できる製剤に活性成分を仕上げるのを容易にする賦形剤お
よび補助剤を含む薬学的に許容される適当な担体を含有する。
非経口投与の適当な剤形に水溶型、例えば水溶性塩の活性化合物の水溶液があ
る。さらに、適当な油性注射用懸濁液として活性化合物の懸濁液が投与され得る
。適当な親油性溶媒すなわち運搬剤には、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂
肪酸エステル、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリドを含む。懸濁液の
粘
度を高める物質を含有する水性注射用懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセ
ルロースソルビトールおよび／またはデキストランを含む。選択的に、懸濁液は
安定剤も含み得る。
医薬組成物には注射用の適当な溶液があり、0.01‐99％、好ましくは20‐75％
の活性成分(すなわち、Raf-1または14-3-3タンパク質のIL-2Rβとの結合を阻害
する化合物)を賦形剤とともに含有する。直腸に投与される組成物に座剤がある
。
公表の文献または抄録、対応の米国または外国特許出願、発行の米国または外
国特許または他の文献などここに引用された全ての文献は、引用文献に示された
すべてのデータ、表、図および内容を含み、出典明示により本明細書の一部とす
る。さらに、本明細書に引用する参考文献に引用のすべての内容も出典明示によ
り本明細書の一部とする。
既知方法工程、通常方法工程、既知方法または通常方法についての言及が、本
発明のいかなる態様、記述または具体化を開示、教示または示唆していると認め
るものでない。
特殊な実施態様についての上記の説明は、本発明の一般的性質を完全に表すも
のであって、関連技術分野の知識(本明細書に引用した内容を含む)を適用して、
本発明の一般的概念から離れることなしに、第三者が過度の実験をせずに種々の
適用のために、かかる特殊な具体化を容易に修飾および／または採用することが
できるものである。従って、かかる適用および修飾は、ここに提示された教示お
よび説明に基づき、開示の実施態様に均等の意味と範囲内にあることを意図して
いる。本明細書での語法および用語は説明のためであり、制限のためのものでな
く、当業者によって本発明の教示および説明に照らして、通常の技術分野知識と
併用して解釈されるべきものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 33/566
33/566 Ａ６１Ｋ 37/02
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．Raf-1タンパク質、14-3-3に、またはIL-2Rβ鎖の細胞内ドメインに結合し得 て、そしてRaf-1および／または14-3-3タンパク質のIL-2Rβとの結合を阻害し得 る化合物。 ２．タンパク質、ペプチドおよびそれらのフラグメント、同族体または誘導体、 および有機化合物から選択される、請求項１の化合物。 ３．化合物が成熟ヒトIL-2Rβ鎖の酸性領域から誘導される配列番号２のアミノ 酸残基370-396に対応する27個のアミノ酸ペプチドまたはその同族体または誘導 体である、請求項１または２の化合物。 ４．化合物が１以上のアミノ酸残基を附加、欠失または置換した該27個のアミノ 酸ペプチドの同族体から選択され、該同族体がRaf-1および／または14-3-3タン パク質とIL-2Rβとの結合を阻害し得る、請求項３の化合物。 ５．自己免疫疾患、移植拒絶または移植片-宿主反応を処置するための医薬組成 物であって、活性成分として請求項１−４のいずれかの化合物またはその１以上 の混合物、および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物。 ６．Raf-1、14-3-3タンパク質に、またはIL-2Rβ鎖細胞内ドメインに結合し得る 請求項１−４のいずれかの化合物を単離、同定および特性化するためのインビト ロスクリーニング検定法であって、 (a)IL-2Rβ鎖タンパク質、Raf-1タンパク質、14-3-3タンパク質、およびこれ らのフラグメントおよび混合物よりなる群から選ばれる細菌で産生または哺乳動 物細胞で産生したタンパク質を準備し、 (b)(a)の該タンパク質をスクリーンすべき化合物含有の試験サンプル(該試験 サンプルは真核または原核細胞溶解質、精製タンパク質含有の溶液、天然誘導ま たは化学的合成のペプチド含有の溶液および化学的合成の有機化合物含有の溶液 より選択される)に接触せしめて、該タンパク質と該試験サンプルの複合体を形 成し、 (c)(b)で形成した複合体を単離し、 (d)(c)で単離した複合体中のタンパク質から試験サンプルを分離し、 (e)(d)の該分離試験サンプルを分析して、Raf-1タンパク質、14-3-3タンパク 質またはIL-2Rβ鎖細胞内ドメインに結合し得る該試験サンプル中に含有の化合 物を同定および特性化する、 工程を含む検定法。 ７．工程(a)の該産生タンパク質を工程(b)の真核または原核細胞溶解質に接触せ しめる、請求項６のインビトロスクリーニング検定法。 ８．工程(a)の該タンパク質が精製タンパク質含有の溶液、天然誘導または化学 的合成のペプチド含有の溶液および化学的合成の有機化合物含有の溶液より選択 される試験サンプルに接触する、請求項６のインビトロスクリーニング検定法。 ９．工程(b)で形成した該複合体のタンパク質キナーゼ活性を測定する工程を更 に含む、請求項６のインビトロスクリーニング検定法。 １０．Raf-lおよび／または14-3-3タンパク質のIL-2Rβとの結合を阻害し、タン パク質キナーゼ活性を有する複合体の形成を防止する該化合物の活性(結合を阻 害する活性は該タンパク質キナーゼ活性の不存在または低下により測定される) を測定する工程をさらに含む、請求項６のインビトロスクリーニング検定法。 １１．実施例１−６記載のように、請求項１−４のいずれかの化合物を単離、同 定または特性化するためのインビトロスクリーニング検定法。 １２．請求項６−１１のいずれかのインビトロ検定法により単離、同定または特 性化された化合物。 １３．自己免疫疾患または移植片-宿主反応を処置するための医薬組成物の製造 に用いる、請求項１−４および１２のいずれかの化合物またはその１以上の混合 物。 １４．自己免疫疾患、移植拒絶または移植片-宿主反応を処置するための医薬組 成物の製造における、請求項１−４および１２−１３のいずれかの化合物または その１以上の混合物の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1818396P | 1996-05-23 | 1996-05-23 | |
| US60/018,183 | 1996-05-23 | ||
| PCT/US1997/008542 WO1997044058A1 (en) | 1996-05-23 | 1997-05-22 | Compounds that inhibit the binding of raf-1 or 14-3-3 proteins to the beta chain of il-2 receptor, and pharmaceutical compositions containing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000511419A true JP2000511419A (ja) | 2000-09-05 |
| JP2000511419A5 JP2000511419A5 (ja) | 2005-01-13 |
Family
ID=21786680
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09542654A Ceased JP2000511419A (ja) | 1996-05-23 | 1997-05-22 | Ｒａｆ―１または１４―３―３タンパク質のＩＬ―２受容体β鎖への結合を阻害する化合物およびそれを含有する医薬組成物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6281193B1 (ja) |
| EP (1) | EP0910401A1 (ja) |
| JP (1) | JP2000511419A (ja) |
| AU (1) | AU728701B2 (ja) |
| CA (1) | CA2256109A1 (ja) |
| IL (1) | IL127210A0 (ja) |
| WO (1) | WO1997044058A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PE20070427A1 (es) * | 2005-08-30 | 2007-04-21 | Novartis Ag | Compuestos derivados de benzimidazoles sustituidos como inhibidores de tirosina quinasas |
| EP2046292B1 (en) * | 2006-07-21 | 2010-03-03 | Novartis AG | Formulations for benzimidazolyl pyridyl ethers |
| US20100004253A1 (en) * | 2006-09-19 | 2010-01-07 | Novartis Ag | Biomarkers of target modulation, efficacy, diagnosis and/or prognosis for raf inhibitors |
| WO2010100127A1 (en) | 2009-03-04 | 2010-09-10 | Novartis Ag | Disubstituted imidazole derivatives as modulators of raf kinase |
| US8242260B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-08-14 | Novartis Ag | Compounds and compositions as protein kinase inhibitors |
| JO3002B1 (ar) | 2009-08-28 | 2016-09-05 | Irm Llc | مركبات و تركيبات كمثبطات كيناز بروتين |
| JP5728499B2 (ja) | 2010-02-05 | 2015-06-03 | アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＩｒｍ，Ｌｌｃ | タンパク質キナーゼ阻害剤としての化合物および組成物 |
| AU2011268906A1 (en) | 2010-06-25 | 2013-01-31 | Novartis Ag | Heteroaryl compounds and compositions as protein kinase inhibitors |
| JP6286359B2 (ja) | 2011-11-23 | 2018-02-28 | ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク | 形状測定のためのシステム、方法および媒体 |
| WO2022125694A1 (en) * | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Asher Biotherapeutics, Inc. | Fusions of interleukin polypeptides with bispecific antigen binding molecules for modulating immune cell function |
| WO2024050383A2 (en) * | 2022-08-29 | 2024-03-07 | The Regents Of The University Of California | Ras biosensors |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0408790A1 (en) * | 1989-07-20 | 1991-01-23 | Taniguchi, Tadatsugu, Dr. | Recombinant protein receptor |
-
1997
- 1997-05-22 IL IL12721097A patent/IL127210A0/xx unknown
- 1997-05-22 EP EP97926618A patent/EP0910401A1/en not_active Withdrawn
- 1997-05-22 CA CA002256109A patent/CA2256109A1/en not_active Abandoned
- 1997-05-22 WO PCT/US1997/008542 patent/WO1997044058A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-05-22 AU AU31339/97A patent/AU728701B2/en not_active Ceased
- 1997-05-22 US US09/194,145 patent/US6281193B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-22 JP JP09542654A patent/JP2000511419A/ja not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6281193B1 (en) | 2001-08-28 |
| EP0910401A1 (en) | 1999-04-28 |
| IL127210A0 (en) | 1999-09-22 |
| US20010016194A1 (en) | 2001-08-23 |
| CA2256109A1 (en) | 1997-11-27 |
| AU728701B2 (en) | 2001-01-18 |
| AU3133997A (en) | 1997-12-09 |
| WO1997044058A1 (en) | 1997-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baughman et al. | Tissue distribution and abundance of human FKBP51, an FK506-binding protein that can mediate calcineurin inhibition | |
| Sharma et al. | Subtype-selective induction of wild-type p53 and apoptosis, but not cell cycle arrest, by human somatostatin receptor 3. | |
| US5916755A (en) | Methods of characterizing ligands for the erbB-3 receptor, methods of influencing erbB-3 activities and methods of diagnosing erbB-3-related neoplasm | |
| EP0590030B1 (en) | A receptor-type tyrosine kinase [human eph/elk-like kinase - hek] and use thereof | |
| KR100331363B1 (ko) | 사이클린복합체재배열및그것과관련된용도 | |
| JP2002518010A (ja) | ９４個のヒト分泌タンパク質 | |
| JPH06505561A (ja) | レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質 | |
| US5621075A (en) | Insulin receptor substrate | |
| JP2000511419A (ja) | Ｒａｆ―１または１４―３―３タンパク質のＩＬ―２受容体β鎖への結合を阻害する化合物およびそれを含有する医薬組成物 | |
| US5981201A (en) | Methods of detection and treatment of breast cancer | |
| AU736316B2 (en) | Mitogen-activated protein kinase p38-2 and methods of use therefor | |
| US5972674A (en) | Stimulus-inducible protein kinase complex and methods of use therefor | |
| WO2011091716A1 (zh) | 表皮生长因子受体变异体 | |
| Hurteau et al. | Overexpression of a stabilized mutant form of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27kip1 inhibits cell growth | |
| KR102111030B1 (ko) | Jab1을 포함하는 신경세포 분화 탐지용 바이오마커 또는 신경세포 분화 촉진용 조성물 | |
| KR100482249B1 (ko) | 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대한 항체 | |
| EP1100929B1 (en) | Identification and functional characterization of a novel ribosomal s6 protein kinase | |
| JP4419077B2 (ja) | Ｃａｐ結合蛋白質 | |
| JP4522855B2 (ja) | ＧＥＦ−Ｈ１ｂ：バイオマーカー，その複合体，アッセイおよび治療用途 | |
| US7452983B2 (en) | Protein which binds to Akt2 | |
| KR20120109824A (ko) | Ｐａｕｆ 및 그의 결합 파트너를 상호작용을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법 | |
| WO1997012971A1 (en) | Ring finger protein | |
| JP2000504576A (ja) | エストロゲン応答エレメント結合タンパク質およびそれをコードするヌクレオチド | |
| SI20585A (sl) | Gen PRV-1 in njegova uporaba | |
| KR101099650B1 (ko) | 인테그린알파５를 이용한 항암제 또는 ｓｉｐ１／ｚｅｂ２ 저해제의 스크리닝 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040510 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040510 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070703 |
|
| A313 | Final decision of rejection without a dissenting response from the applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A313 Effective date: 20071121 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090421 |