JP2000509376A

JP2000509376A - カテプシンｓの阻害を通しての免疫応答の抑制

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Publication number: JP2000509376A
Application number: JP9538333A
Authority: JP
Inventors: エル．プルッフ，ヒッデ; エイ．チャップマン，ハロルド; ジェイ．リーゼ，リチャード; アール．ウォルフ，ポーラ; エス．ボギョー，マシュー
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-22
Publication date: 2000-07-25
Also published as: DK0912601T4; DE69726426T2; PT912601E; US20050080010A1; ATE255126T1; CA2251714A1; EP0912601B1; US20050095248A1; EP0912601B2; US6608030B1; AU723447B2; US20030166534A1; DE69726426D1; AU2741897A; EP0912601A1; ES2208898T5; US7285525B2; NZ332390A; WO1997040066A1; ES2208898T3

Abstract

(57)【要約】哺乳動物または哺乳動物細胞におけるクラスII MHC拘束性免疫応答を抑制するための方法および生成物が、記載される。この方法は、クラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのカテプシンＳによるインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害し、それにより抗原性ペプチドの結合についてのクラスII MHC分子の能力を減少すること、クラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少すること、および免疫応答を抑制することに依存する。この方法は自己免疫疾患、アレルギー応答、および器官または組織移植片拒絶の処置において使用され得る。カテプシンＳのペプチドベースインヒビターである、新しい薬学的および治療的な組成物もまた記載される。

Description

【発明の詳細な説明】カテプシンＳの阻害を通しての免疫応答の抑制関連出願書本出願は、1996年４月22日に出願された米国暫定出願第60/018,100号に対する優先権の利益を請求する。発明の分野本発明はカテプシンＳの阻害を通しての免疫抑制に対する新規な方法および生成物に関する。本方法および生成物は、自己免疫疾患の処置および抗原性ペプチドの結合に対するクラスII MHC分子の能力の減少に使用され得る。発明の背景クラスII MHC（主要組織適合遺伝子複合体）細胞性タンパク質（αβヘテロ二量体）は、生合成の間に初期に、タイプII膜ポリペプチドであるインバリアント鎖（Ii）と会合してクラスII MHC/インバリアント鎖複合体（αβIi）を形成する。インバリアント鎖は、その管腔ドメイン（CLIPと称される）の残基81〜104 とクラスII MHCの抗原結合溝との直接的な相互作用を通してクラスII MHC分子と会合することが報告されている。インバリアント鎖は、その細胞質テールにクラスII MHC/インバリアント鎖複合体を細胞内エンドサイトーシスコンパートメントに送達するシグナルを含み、ここでクラスII MHC分子は抗原性ペプチドに遭遇し、そして結合する。クラスII MHC分子の抗原性ペプチド装填の必要条件は、クラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解破壊である。このタンパク質分解を担う特異的な重要なプロテアーゼの同定は、以前には報告されていない。インバリアント鎖のタンパク質分解は、抗原性ペプチドがクラスII MHC分子に結合し、クラスII MHC/抗原性ペプチド複合体を形成することを可能にする。次いで、これらの複合体における抗原性ペプチドは、CD4+ Ｔ細胞による認識のために細胞表面上に置かれる。これらのＴ細胞はサイトカインの産生に関連し、従って免疫応答を組織化するのに役立ち、ついに抗体の適切な産生となる。時々、 CD4+細胞は不適切に活性化され、そして自己免疫疾患の病因に寄与すると考えられている。発明の要旨１つの局面において、本発明はクラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害するための方法を提供する。この方法は、カテプシンＳによるインバリアント鎖のタンパク質分解を実質的に阻害するのに有効な量のカテプシンＳのインヒビターを、インビボまたはインビトロで哺乳動物細胞に投与することにより、抗原性ペプチドの結合についてのクラスII M HC分子の能力を減少させ、そしてクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少させる。別の局面において、本発明はクラスII MHC拘束性免疫応答を調節する方法を提供する。このような免疫応答は自己免疫疾患、アレルギー反応、および同種異系組織拒絶に対して必須である。従って、本発明はまた、哺乳動物（例えば、ヒトの患者）にカテプシンＳのインヒビターの治療有効量を投与してクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少させ、従ってこれらの状態からのある程度の軽減を提供することにより、クラスII MHC拘束性免疫応答、特に自己免疫応答、アレルギー応答、および同種異系免疫応答を抑制するための方法を提供する。好ましい実施態様において、若年発症糖尿病（インスリン依存性）、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、グレーヴズ病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、橋本甲状腺炎を含む自己免疫疾患の処置のための方法が提供される。他の好ましい実施態様において、喘息を含むアレルギー応答の処置、および、器官移植（腎臓移植、肺移植、肝臓移植、および心臓移植を含む）からまたは皮膚もしくは他の組織移植から生じる同種異系免疫応答を含む同種異系免疫応答を処置するための方法が提供される。カテプシンＳのインヒビターは、そうでなければ活性なカテプシンＳを発現するのに適格である哺乳動物細胞にインビボまたはインビトロで投与した場合、カテプシンＳ遺伝子の転写、カテプシンＳ mRNAのプロセシングもしくは翻訳、またはカテプシンＳタンパク質のプロセシング、輸送、もしくは活性を阻害する任意の分子種であり得る。詳細には、インヒビターは、リプレッサー、またはアンチセンス配列、または競合的インヒビターおよび非競合的インヒビター（例えば、カテプシンＳの天然基質を構造的に模倣するが、酵素のタンパク質分解活性に耐性である低分子、または抗体、リボザイムなど）であり得る。好ましくは、インヒビターはシステインプロテアーゼインヒビターである。好ましい実施態様において、カテプシンＳインヒビターはカテプシンＳの「選択的」インヒビターであり、これはカテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの少なくとも１つを阻害できないかまたは実質的に低い程度で阻害する。そして最も好ましい実施態様において、インヒビターはカテプシンＳの「特異的な」インヒビターであり、これはカテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの各々を阻害できないかまたは実質的に低い程度で阻害する。さらに、好ましいインヒビターは、天然に存在するカテプシンＳ基質の部分を模倣するペプチドベースインヒビターを含む。このようなペプチドベースインヒビターは、ペプチジルアルデヒド、ニトリル、α-ケトカルボニル、ハロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、（アシルオキシ）-メチルケトン、ビニルスルホン、ケトメチルスルホニウム塩、エポキシド、およびＮ-ペプチジル-Ｏ-アシル- ヒドロキシルアミンを含む。カテプシンＳの好ましいペプチドベースインヒビターはまた、配列Leu-Leu-Leu、およびLeu-Hph（例えば、Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン、およびモルホリンウレア-Leu-Hph -ビニルスルホンフェニル（LHVS））に基づくインヒビターを含む。別の局面において、本発明は、インバリアント鎖配列のＮ末端側では約68〜75 位からＣ末端側では約83〜90位にわたる新たに開示された好ましい鎖切断部位に基づく、カテプシンＳの新しいクラスのペプチドベースインヒビターを提供する。従って、この部位内からの２〜20、より好ましくは２〜10、そして最も好ましくは２〜３の連続した残基に基づく、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターが提供される。特に好ましいのは、配列Asn-Leu、Glu-Asn-Leu、Arg-Met、およびLeu-Arg-Met（77位、78位、および79位；つまりLys₈₀切断点と比較して-3位、-2位、および-1位）に基づく、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターが、ペプチドベースインヒビターを選択または設計するための基礎として好ましくは使用されることである。従って、例えば、本発明は、Asn-Leu-ビニルスルホン、Arg-Met-ビニルスルホン、Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、およびGlu-Asn-Leu-ビニルスルホンを含むビニルスルホン化合物のような新規なペプチドベースインヒビターを提供する。これらのペプチドビニルスルホンの修飾物もまた本発明に含まれる。例えば、カルボキシベンジルはＮ末端に存在して、以下の化合物を与え得る：Ｎ-(カルボキシベンジル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、およびＮ-( カルボキシベンジル)-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン。あるいは、ニトロフェニルアセチルがＮ末端に存在して、以下の化合物を与える：Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、およびＮ-(ニトロフェニルアセチル)-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン。本発明はまた、カテプシンＳの好ましいインバリアント鎖切断部位のペプチド配列に基づく他のペプチドベースインヒビターを含むことを意味し、これはペプチジルアルデヒド、ニトリル、α-ケトカルボニル、ハロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、（アシルオキシ）-メチルケトン、ビニルスルホン、ケトメチルスルホニウム塩、エポキシド、およびＮ-ペプチジル-Ｏ-アシル-ヒドロキシルアミン、および当業者に公知のようにアミノ末端に様々な他の置換置を含するものを含む。本発明の他の実施態様は、前記ならびに以下に示す詳細な説明および実施例から当業者に明らかである。詳細な説明本発明は、哺乳動物システインプロテアーゼカテプシンＳが、クラスII MHCα βヘテロダイマーに複合体化したインバリアント鎖ポリペプチドのタンパク質分解において主に重要であるとの知見に部分的に基づく。詳細には、カテプシンＳがクラスII MHC/インバリアント鎖複合体に会合している間、カテプシンＳはインバリアント鎖ポリペプチドの正常な切断を担うようであり、それゆえ、カテプシンＳの阻害はクラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害し、そしてクラスII MHC/CLIP複合体の形成を阻害することが本明細書中で開示される。その結果として、クラスII MHC分子はクラスII MHC/インバリアント鎖複合体に会合したままであるので、カテプシンＳの阻害は、抗原性ペプチドの結合についてのクラスII MHC分子の能力を減少させ、そしてクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少させる。それゆえ、１つの局面において、本発明は、クラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害するための方法を提供し、これはカテプシンＳによるインバリアント鎖のタンパク質分解を実質的に阻害するに有効な量のカテプシンＳのインヒビターをインビボまたはインビトロで哺乳動物細胞に投与することにより、抗原性ペプチドの結合に対するクラスII MHC 分子の能力を減少させ、そしてクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少させる。別の局面において、クラスII MHC分子と複合体化した抗原性ペプチドの提示はクラスII MHC拘束性である免疫応答に必須であるので、本発明はまた、クラスII MHC拘束性免疫応答を調節するための方法を提供する。このような免疫応答は、自己免疫疾患、アレルギー反応、および同種異系組織拒絶に必須である。それゆえ、本発明はまた、哺乳動物（例えばヒトの患者）へカテプシンＳのインヒビターの治療有効量を投与してクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少させ、そして、これによりこれらの状態からのある程度の軽減を提供することにより、クラスII MHC拘束性免疫応答、そして、特に自己免疫応答、アレルギー応答、および同種異系免疫応答を抑制するための方法を提供する。本発明はさらに、カテプシンＳは通常ほぼ近接したうちの１つの好ましいインバリアント鎖切断部位でクラスII MHC/インバリアント鎖複合体に作用するという知見に部分的に基づく。特に、ヒトカテプシンＳは、通常、インバリアント鎖配列（配列番号１）の残基Arg₇₈およびLys₈₀のＣ末端側のペプチド結合でインバリアント鎖を切断することが本明細書中で開示される。それゆえ、別の局面において、本発明はカテプシンＳの新しいクラスのペプチドベースインヒビターを提供する。これらのペプチドベースカテプシンＳインヒビターは、カテプシンＳにより認識され、結合され、そして切断される切断部位を直接取り囲むアミノ酸残基配列（例えば、配列番号１の残基68〜90、または残基73〜85）に基づく。ペプチドベースカテプシンＳインヒビターは、実在のペプチドであり得、またはより好ましくは、結合活性を保持するために天然の基質に対して十分な構造類似性を保持するが、それらを非競合的インヒビターにするためかさもなければそれらの安定性を強めるために構造的に修飾され得る、ペプチド誘導体または修飾ペプチドであり得る。本発明の好ましい実施態様および例示は以下に詳細に記載される。 I. 定義本発明の主題をより明瞭にそして簡潔に記載および開示するために、本明細書および添付の請求の範囲に使用される特定の用語について以下の定義を提供する。本明細書中で使用される場合、「カテプシンＳのインヒビター」は、そうでなければ活性なカテプシンＳを発現する能力がある哺乳動物細胞にインビボまたはインビトロで投与される場合に、カテプシンＳ遺伝子の転写、カテプシンＳ mRN Aのプロセシングもしくは翻訳、またはカテプシンＳタンパク質のプロセシング、輸送、もしくは活性を阻害する任意の分子種である。従って、例えば、用語「カテプシンＳのインヒビター」は、カテプシンＳ遺伝子の誘導および/または転写を阻害するリプレッサー、またはカテプシンＳ DNAまたはmRNA配列に選択的に結合し、そしてカテプシンＳ配列の転写または翻訳を阻害するアンチセンス配列を含む。同様に、用語「カテプシンＳのインヒビター」は、カテプシンＳの天然基質を構造的に模倣するがこの酵素のタンパク質分解活性に耐性である低分子のような、カテプシンＳタンパク質の活性の競合的および非競合的インヒビターを含む。カテプシンＳのインヒビターは、構造的または機能的に関連した他の遺伝子またはタンパク質に対してある程度の阻害活性を有し得るが、用語「カテプシンＳのインヒビター」は、全ての遺伝子発現もしくはタンパク質合成、または一般的な毒素（例えば、アクチノマイシンＤおよびαアマニチンのような転写ブロッカー；ピューロマイシン、シクロヘキシミドおよびジフテリア毒素のようなタンパク質合成インヒビター）の非選択的サプレッサーを含むことを意図しない。本明細書中で使用される場合、「システインプロテアーゼインヒビター」は、システインプロテアーゼとして知られる１つ以上の哺乳動物の酵素を阻害する、そして特にカテプシンＳを阻害する、任意の分子種である。チオールプロテアーゼまたはスルフィドリルプロテアーゼまたはプロテイナーゼとしてもまた知られるシステインプロテアーゼは、触媒作用の間に求核剤として作用する活性部位システイン残基を有するタンパク質分解酵素である。システインプロテアーゼは、パパイン、カルパインI、カルパインII、クルザイン、およびカテプシンＳ、Ｋ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢを含む。（カテプシンＤはアスパルチルプロテアーゼであることに注意すること。）本明細書中で使用される場合、「カテプシンＳの選択的インヒビター」は、上記で定義されるように、カテプシンＳのインヒビターであるがカテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの少なくとも１つを阻害できないかまたは実質的に低い程度に阻害する任意の分子種である。好ましい実施態様において、カテプシンＳの不活性化または阻害の二次速度定数（これは、カテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの少なくとも１つについての対応する速度定数よりも、少なくとも２倍そしてより好ましくは５倍高い）を有するカテプシンＳの選択的インヒビターが使用される。最も好ましくは、カテプシンＳの選択的インヒビターは、カテプシンＳの不活化の二次速度定数（これは、カテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの少なくとも１つについての不活化速度定数よりも、少なくとも１桁、または最も好ましくは少なくとも２桁高い）を有する。本明細書中で使用される場合、用語「不活化の二次速度定数」は当該分野で公知のような量を意味することが意図さ Biol ．Chem. 375:343-347(1994);Palmerら、J ．Med．Chem. 38:3193-3196 本明細書中で使用される場合、「カテプシンＳの特異的インヒビター」は、上で定義されるように、カテプシンＳのインヒビターであるが、カテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの各々を阻害できないかまたは実質的に低い程度に阻害する、任意の分子種である。好ましい実施態様において、カテプシンＳの不活化の二次速度定数（これはカテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの各々についての対応する速度定数よりも、少なくとも２倍そしてより好ましくは５倍高い）を有する、カテプシンＳの特異的インヒビターが使用される。最も好ましくは、カテプシンＳの特異的インヒビターは、カテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢの各々についての二次速度定数よりも少なくとも１桁、または最も好ましくは少なくとも２桁高い、カテプシンＳの不活性化の二次速度定数を有する。クラスII MHC拘束性免疫応答に関して本明細書中で使用される場合、「抑制すること」は、免疫応答の明白な発現が、程度もしくは重篤度、または範囲もしくは持続時間において減少すること（例えば、クラスII MHC分子による抗原性ペプチドの結合および提示の減少、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化の減少、体液性および細胞媒介性応答の減少、および特定の免疫応答に適する場合、炎症、うっ血、疼痛、または壊死の減少を含む）を意味する。免疫応答の「抑制」は、免疫応答のこれらの発現の全ての完全な消去または防止を必要としないが、臨床的なまたは他の実用的に重要な発現の、程度もしくは重篤度、または範囲もしくは持続時間における減少を単に必要とする。カテプシンＳのインヒビターに関して本明細書中で使用される場合、用語「ペプチドベース」および「非ペプチドベース」は、インヒビターがペプチドまたはポリペプチドを含むかまたは含まないことを意味しないが、インヒビターの構造が、カテプシンＳの活性部位における基質として結合するポリペプチド配列の構造に基づくかまたは基づかないことを意味する。 II．インバリアント鎖のタンパク質分解、抗原結合、および抗原提示の阻害上記のように、および以下の実施例において証明するように、カテプシンＳはインバリアント鎖の正常なタンパク質分解プロセシングに重要であると考えられる。それゆえ、１つの局面において、本発明は、細胞にカテプシンＳのインヒビターを投与することにより、インビボまたはインビトロで哺乳動物細胞におけるクラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害するための方法を提供する。カテプシンＳの阻害の結果として、細胞内のクラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解もまた阻害される。さらに、正常な生理学的条件下では、インバリアント鎖のタンパク質分解の阻害は、クラスII MHC/CLIP（αβ-CLIPともいわれる）複合体の形成を阻害する。それゆえ、クラスII MHC/CLIP複合体はクラスII MHC/インバリアント鎖複合体よりも容易に抗原性ペプチドを装填するので、カテプシンＳの阻害およびMHC/CLIP 複合体形成の結果的な阻害は、抗原性ペプチドの結合に対するクラスII MHC分子の能力を減少させる。それゆえ、１つの局面において、本発明は、細胞にカテプシンＳのインヒビターを投与することにより、インビボ、またはインビトロで哺乳動物細胞における抗原性ペプチドの結合についてのクラスII MHC分子の能力を減少させるための方法を提供する。カテプシンＳの阻害の結果として、インバリアント鎖のタンパク質分解は阻害され、クラスII MHC/CLIP複合体の形成は阻害され、そして抗原性ペプチドを結合するためのMHC分子の能力は減少する。同様に、通常の生理学的条件下で、インバリアント鎖のタンパク質分解の阻害は、クラスII MHC分子の抗原性ペプチドの装填および提示を阻害する。従って、クラスII MHC/CLIP複合体は、クラスII MHC/インバリアント鎖複合体より容易に抗原性ペプチドを装填するので、カテプシンＳの阻害およびその後のMHC/CLIP複合体形成の阻害は、クラスII MHC分子による抗原性ペプチドの装填および提示を減少させる。それゆえ、一つの局面において、本発明は、細胞にカテプシンＳインヒビターを投与することにより、インビボまたはインビトロで、哺乳動物細胞におけるクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少するための方法を提供する。カテプシンＳの阻害の結果として、インバリアント鎖のタンパク質分解は阻害され、クラスII MHC/CLIP複合体の形成は阻害され、そしてクラスII MH C分子による抗原性ペプチドの装填および提示は減少される。インビトロで哺乳動物細胞について使用する場合、そのような方法はMHC分子の抗原性ペプチドの装填の防止および空のMHC分子の産生における有用性を有する。空のMHC分子は、引き続く装填、ならびに分析用、診断用および治療用の薬剤としての使用の有用性を有する。あるいは、培養中のそのような細胞に所望する抗原性ペプチドまたはそのようなペプチドの前駆体を、高濃度で曝露することにより、所望のペプチドを装填したMHC分子の大部分が産生され得る。特定のペプチドを選択的に装填したクラスII MHC分子はまた、分析用、診断用、および治療用の適用における有用性を有する。これらの方法において、カテプシンＳのインヒビターは、インヒビターが細胞内へ侵入し、そしてカテプシンＳを阻害することを可能にする任意の方法で、細胞へ投与されるか、細胞に提供されるか、または細胞と接触させられる。インビトロで使用される場合、インヒビターは、代表的には細胞培養培地に添加されるが、所望であれば、マイクロインジェクションが使用され得る。インビボで使用される場合、インヒビターは、治療法に関して以下に記載するように投与され得る。 III．クラスII MHC拘束性免疫応答の抑制上記のように、そして下記の実施例で証明されるように、カテプシンＳは、哺乳動物において正常なクラスII MHC拘束性免疫応答に重要であると考えられる。それ故、一つの局面において、本発明は、哺乳動物にカテプシンＳのインヒビターを投与することにより、哺乳動物におけるクラスII MHC拘束性免疫応答を抑制するための方法を提供する。カテプシンＳの阻害の結果として、インバリアント鎖のタンパク質分解、クラスII MHC/CLIP複合体の形成、ならびに抗原性ペプチドの装填および提示が阻害され、そしてそれ故クラスII MHC拘束性免疫応答が抑制される。一連の実施態様において、本方法は、自己免疫疾患の危険性がある、または自己免疫疾患に冒された哺乳動物（特にヒト）の処置に使用される。自己免疫は、宿主の免疫応答が、それ自体の構成部分に向かい、病状をもたらす現象を意味する。多くのヒト自己免疫疾患は、特定のクラスII MHC複合体に関連する。Ｔ細胞（自己免疫を引き起こす細胞）により認識される構造が、クラスII MHC分子および抗原性ペプチドからなる複合体であるので、この関連が生じる。自己免疫疾患は、宿主自体の遺伝子産物に由来するペプチドと複合体化する場合の宿主のクラスII MHC分予とＴ細胞が反応する場合に生じ得る。これらのクラスII MHC/抗原性ペプチド複合体が形成を阻害される場合、自己免疫応答は減少または抑制される。クラスII MHC/抗原性ペプチド複合体が役割を果たす任意の自己免疫疾患は、本発明の方法に従って処置され得る。そのような自己免疫疾患は、例えば、若年発症糖尿病（インスリン依存性）、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、グレーブス病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、および橋本甲状腺炎を含む。別の一連の実施態様において、本方法は、アレルギー応答の危険性にある、またはアレルギー応答に冒された哺乳動物（特にヒト）の処置に使用される。「アレルギー応答」は、特定の抗原に対する宿主の免疫応答が、不必要または不均衡であり、病状をもたらす現象を意味する。アレルギーは当該分野で周知であり、そして用語「アレルギー応答」は、医学分野での標準的な使用に従って本明細書中に使用される。アレルギーの例は、花粉、「ブタクサ」、甲殼類、家畜（例えば、ネコおよびイヌ）、ハチ毒などに対するアレルギーを含むが、これらに限定されない。別の特に意図されるアレルギー応答は、喘息を引き起こすものである。アレルギー応答は、部分的に、Ｔ細胞が特定のクラスII MHC/抗原性ペプチド複合体を認識するので引き起こされ得る。これらのクラスII MHC/抗原性ペプチド複合体がその形成を阻害される場合、アレルギー応答は減少または抑制される。クラスII MHC/抗原性ペプチド複合体が役割を果たす任意のアレルギー応答は、本発明の方法に従って処置され得る。本発明の方法による免疫抑制が、一般のアレルギーに対する日常的な予防的または治療的処置になるとは予想されないが、喘息性発作またはアナフィラキシーショックの間に生じ得るような重篤なまたは生命を危うくするアレルギー応答は、これらの方法に従って処置され得る。別の一連の実施態様において、本方法は、器官移植物または組織移植片を受けたまたは受けようとする哺乳動物（特にヒト）の処置に使用される。組織移植（例えば、腎臓、肺、肝臓、心臓）または皮膚移植において、ドナーおよびレシピエントのクラスII MHC遺伝子型(HLA型)間で不一致が存在する場合、ドナー細胞の表面上に抗原性ペプチドを提示する非自己または同種異系のクラスII MHCペプチド分子が存在することに起因する、ドナー組織に対する重篤な「同種異系」免疫応答が存在し得る。この応答がクラスII MHC/抗原性ペプチド複合体の形成に依存する程度まで、カテプシンＳの阻害は、この応答を抑制し得、そして組織拒絶を緩和し得る。カテプシンＳのインヒビターは、免疫抑制を達成するためおよび移植片の生存を促進するために、単独または他の治療的薬剤（例えば、シクロスポリンＡおよび／または抗リンパ球γグロブリンの補助剤として）との組合せで使用され得る。好ましくは、投与は、手術前および／または後の宿主への全身適用により達成される。あるいはまたはさらに、移植(transplantation)または移植(grafting)の前または後のいずれかの、ドナーの器官または組織の灌流が有効であり得る。所望されない副作用の可能性を最小化するために、上記実施態様のそれぞれにおいて、カテプシンＳのインヒビターが、カテプシンＳおよび？？の選択的インヒビター、カテプシンＳの特異的インヒビター、またはカテプシンＳの高度に特異的なインヒビターから選ばれることが好ましい。従って、例えば、細胞内または生物内の全てのプロテアーゼまたは全てのシステインプロテアーゼを、一時的にでも阻害することは所望されないかもしれない。なぜなら、正常なタンパク質のプロセシングおよび代謝回転が破壊されるからである。そのような偶発的な阻害が有害であるかまたは所望されない程度まで、漸増的により選択的なカテプシンＳインヒビターの使用が好ましくあり得る。より選択的なカテプシンＳインヒビターの使用は、例えば、より高い投薬量またはより延長された処置期間の使用を可能にし得る。インヒビターの投与は、インヒビターの標的細胞（例えば、クラスII MHC抗原提示細胞）への到達を可能にする任意の方法により達成され得る。これらの方法は、例えば、注射、注入、沈着、移植、肛門または膣への坐薬(supposition)、経口摂取、吸入、局所投与、またはインヒビターによる標的細胞への接近が得られる任意の他の投与方法を含む。注射は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内であり得る。例えば、インヒビターは、多発性硬化症の処置のために静脈内もしくは筋肉内に注射され得、または関節炎疾患の処置のために関節内へ直接注射され得、または尋常性天疱瘡の処置のために病巣内へ直接注射され得る。特定の実施態様において、注射は、複数の位置で与えられ得る。移植は、移植可能な薬物送達システム（例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーレザーバー、コレステロールマトリックス、ポリマーシステム（例えば、マトリックス浸食および／または拡散システム）、および非ポリマーシステム（例えば、圧縮された、融合されたまたは部分的に融合されたペレット））の挿入を含む。吸入は、吸入器内でエアロゾルとともにインヒビターを、単独または吸収され得るキャリアーに付着してのいずれかで投与することを含む。全身投与については、インヒビターがリポソーム内にカプセル化されることが好ましくあり得る。局所投与は、例えば、皮膚の患部に局所的に塗布される、軟膏、クリーム、またはローションを用いて達成され得る。そのような組成物において、インヒビターは、当業者には周知のように、例えば溶媒に溶解され、そして次いで、例えば、乳剤またはゲル化剤と混合され得る。本発明の特定の実施態様において、投与は、ある期間（例えば、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、または数年）にわたって、インヒビターへの連続的な曝露をもたらすように設計され得る。これは、上記の方法の一つによるインヒビターの投与の繰り返しにより、あるいは、インヒビターが投与の繰り返しなしに長期間にわたって哺乳動物へ送達される制御放出送達システムにより達成され得る。制御放出送達システムは、インヒビターの全ての放出が、投与に際して即時に起こらないが、むしろある期間遅延させることを意味する。放出は、突発的に生じ得るか、または徐々にそして連続的に生じ得る。そのようなシステムによる投与は、例えば長時間作用性の経口投薬形態、ボーラス注射、経皮パッチおよび皮下移植物であり得る。放出が突発的に生じるシステムの例は、例えば、ポリマーマトリクッス中にカプセル化されたリポソーム内にインヒビターが取り込まれているシステム、特定の刺激（例えば、温度、pH、光または分解酵素）に感受性であるリポソーム、およびインヒビターが、マイクロカプセルコア分解酵素を有するイオン的に被覆されたマイクロカプセルによりカプセル化されているシステムを含む。インヒビターの放出が徐々にそして連続的であるシステムの例は、例えば、インヒビターが、マトリックス内の形態で含まれている浸食システム、およびインヒビターが、（例えば、ポリマーを介して）制御された速度で浸透する拡散システムを含む。そのような持続性放出システムは、例えばペレットまたはカプセルの形態であり得る。インヒビターは、液体中に、例えば溶解形態またはコロイド状形態で懸濁され得る。液体は溶媒、部分溶媒、または非溶媒であり得る。多くの場合、水または有機液体が使用され得る。インヒビターは、哺乳動物に治療有効量で投与される。治療有効量は、処置される特定の免疫応答を、少なくとも部分的に防止、逆転、低下、減少、回復、またはそうでなければ抑制し得る量を意味する。治療有効量は、個体の基準で決定され得、そして哺乳動物の種；哺乳動物の年齢、性別、サイズ、および健康状態；使用されるインヒビター；使用される送達システムの型；疾患の重篤度に比例しての投与の時間；および単回、複数、または制御放出用量療法が使用されるかどうかの考慮に少なくとも部分的に基づく。治療有効量は、当業者によって、そのような因子を用いて、そして日常的な実験以下を使用して、決定され得る。好ましくは、全身に投与される場合、インヒビターの濃度は70kgの体重の成体に対し、１日当たり約1.0mg〜約2000mgの用量である。より好ましくは、用量は約10mg〜約1000mg/70kg/日である。最も好ましくは、用量は約100mg〜約500mg/7 0kg/日である。好ましくは、局所的に塗布される場合、インヒビターの濃度は、約0.1mg〜約500mg/g軟膏であり、より好ましくは、約1.0mg〜約100mg/g軟膏であり、そして最も好ましくは、約30mg〜約70mg/g軟膏である。いくつかはその他より有効であるので、特定の濃度は、使用される特定のインヒビターに部分的に依存する。実際に投与されるインヒビターの投薬濃度は、処置される特定の免疫応答、作用部位で所望されるインヒビターの最終濃度、投与の方法、特定のインヒビターの効力、特定のインヒビターの寿命、および疾患の重篤度に比較しての投与のタイミングに少なくとも部分的に依存する。好ましくは、投薬形態は、哺乳動物に実質的に有害に影響しないような形態である。投薬は、当業者によりそのような因子を用いて、そして日常的な実験以下を使用して、決定され得る。 III．カテプシンＳのインヒビター本発明は、上記のように、カテプシンＳのインヒビターを種々の方法で使用し、そしてまた、新しいクラスの新規なペプチドベース(peptide-based)カテプシンＳインヒビターを提供する。それ故、本発明は、クラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解の阻害、抗原性ペプチド結合に対するクラスII MHC分子の能力の減少、クラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示の減少、クラスII MHC拘束性免疫応答の抑制、または自己免疫疾患、アレルギー応答、および同種異系間の免疫応答の処置のための医薬、または薬学的もしくは治療的調製物内でのカテプシンＳのインヒビターの使用を提供する。本発明の方法において使用される場合、カテプシンＳのインヒビターは、先行技術のカテプシンＳのインヒビター、本明細書中に開示されるカテプシンＳの新規なペプチドベースインヒビター、または本発明の目的のために、先行技術のインヒビターおよび現在開示されているインヒビターと同等の、現在公知でないかもしくは開示されていない、カテプシンＳのインヒビターであるとしてみなされ得る。あるいは、および下記のように、カテプシンＳのインヒビターは、上記に定義したように、非ペプチドベースインヒビターまたはペプチドベースインヒビターであるとして広くみなされ得る。Ａ．非ペプチドベースインヒビターカテプシンＳの非ペプチドベースインヒビターは、リプレッサー、アンチセンス配列、ならびに非ペプチドベースの競合的インヒビターおよび非競合的インヒビターを含む。現在は、本明細書中に使用されるようなカテプシンＳのインヒビターの定義を満足させる、カテプシンＳの誘導または転写のリプレッサーは知られていない。それにもかかわらず、そのようなリプレッサーの発見に際して、本発明の方法におけるそれらの使用および産物は、現在公知のインヒビターよりも非常に好ましくあり得、そして開示される方法および産物の同等の実施態様としてみなされる。カテプシンＳへのアンチセンス配列は、当業者によりカテプシンＳ遺伝子の公知の核酸配列(例えば、GenBank受託番号M86553，M90696，S39127；およびWieder srandersら，J ．Biol．Chem. 267：13708-13713(1992)を参照のこと)、および開発途上の分野のアンチセンス技術に基づいて容易に選択および産生され得る。カテプシンＳの阻害のために十分に選択的かつ強力であるためには、このようなカテプシンＳアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも10塩基、より好ましくは、少なくとも15塩基を含むべきである。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、18〜20塩基を含む。カテプシンＳ遺伝子またはmRNA転写産物の任意の領域に対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カテプシンＳのmRNAのＮ末端または転写開始領域、あるいはmRNAスプライシング部位に対応する。さらに、カテプシンＳアンチセンスは、好ましくは、mRNAの２次構造が予想されない(例えば、Sainioら，(1994)Cell ．Mol．Neurobiol. 14(5):439-4 57を参照のこと)、およびタンパク質が結合することが予測されない部位に標的化され得る。当業者に明らかなように、本発明のカテプシンＳ阻害アンチセンスオリゴヌクレオチドは、有効であるために、カテプシンＳ遺伝子またはmRNA転写産物と完全に相補的である必要はない。むしろ、アンチセンスオリゴヌクレオチドが十分な長さである場合、ある程度のミスマッチは受け入れられる。しかし、全ての場合において、オリゴヌクレオチドは、生理学的条件下でカテプシンＳ転写産物に選択的にハイブリダイズするように十分な長さおよび相補性を有するべきである。好ましくは、もちろん、ミスマッチは非存在または最小限である。さらに、推奨されないが、カテプシンＳアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そうでなければ相補的なカテプシンＳアンチセンスオリゴヌクレオチド配列へ挿入された１つ以上の非相補的配列の塩基を有し得る。このような非相補的配列は、カテプシンＳ転写産物および非相補的領域に隣接する塩基により形成される２重鎖からループ (loop)し得る。それ故、オリゴヌクレオチド全体は、相補性の割合が明らかに低いにもかかわらず、阻害効果を保持し得る。本発明のカテプシンＳアンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せにより構成され得る。１つのヌクレオチドの5'末端および別のヌクレオチドの3'末端は、天然系におけるように、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を介して共有結合され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、手動または自動合成機によって実行され得る(Agraw alら，(1992)Trends Biotechnol. 10:152-158に概説される)ホスホルアミデート、H-ホスホネート化学反応、またはメチルホスホルアミデート化学反応のような当該分野で認知された方法によって調製され得る(例えば、Uhlmannら，(1990)Ch em ．Rev. 90:543-584;Agrawal(編)Meth ．Mol．Biol.，Humana Press，Totowa，N J(1993)第20巻;および米国特許第5,149,798号を参照のこと)。本発明のカテプシンＳアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、修飾されたオリゴヌクレオチドを含み得る。すなわち、オリゴヌクレオチドは、カテプシンＳ遺伝子の転写開始領域またはコード領域内に含まれるヌクレオチド配列にハイブリダイズするそれらの能力を損なわない多数の方法において修飾され得る。本明細書中で使用される修飾オリゴヌクレオチドの用語は、少なくとも２つのそのヌクレオチドが、合成的連結（即ち、ホスホジエステル連結以外の連結）を介して１つのヌクレオチドの5'末端と別のヌクレオチドの3'末端の間で共有結合されるオリゴヌクレオチドを記載する。最も好ましい合成的連結は、ホスホロチオエート連結である。さらなる好ましい合成的連結は、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、およびカルボキシメチルエステルを含む。これらの連結または他の修飾を有するオリゴヌクレオチドは、公知の方法に従って調製され得る（例えば、Agrawal およびGoodchild(1987)Tetrahedron Lett. 28:3539-3542;Agrawalら，(1988)Pro c ．Natl．Acad．Sci．(USA) 85:7079-7083;Uhlmannら，(1990)Chem ．Rev. 90:534 -583;Agrawalら，(1992)Trends Biotechnol. 10:152-158;Agrawal(編)Meth ．Mol ．Biol. ，Humana Press，Totowa，NJ(1993)第20巻を参照のこと）修飾オリゴヌクレオチドの用語はまた、修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、3'位の水酸基以外および5'位のリン酸基以外で化学基に結合された大部分の3'位および／または大部分の5'位に糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。他の修飾リボヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドは、2'-Ｏ-メチル化リボースのような2'-Ｏ-アルキル化リボース基、またはリボースの代わりにアラビノースを有するオリゴヌクレオチドを含み得る。さらに、分子内にヌクレオチドあたり１つの非架橋(non bridging)酸素の置換を有する非酸化または部分的酸化オリゴヌクレオチドもまた、修飾オリゴヌクレオチドと考えられる。このような修飾は、ヌクレオシド間連結のいくつかまたは全てで、オリゴヌクレオチドの端のいずれかもしくは両方で、および／または分子の内部においてであり得る(Agrawalら，(1992)Trends Biotechnol. 10:152-158、およびAgrawal (編)Meth ．Mol．Biol.，Humana Press，Totowa，NJ(1993)第20巻に概説される) 。その3'および／もしくは5'末端におけるヌクレアーゼ耐性を与えるかさ高い置換基、ならびに／または人間の介入なしにはインビボで見出されない種々の他の構造的修飾を有するオリゴヌクレオチドもまた、修飾オリゴヌクレオチドとして考えられる。他の修飾は、アミノ基と末端リボースとの間に種々の数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン化合物のようなヌクレオシド間リン酸連結の付加を含む。カテプシンＳの他の非ペプチドベースインヒビターは、カテプシンＳに選択的に結合しその活性を阻害する、Fcのような抗体のフラグメントを含む抗体；およびカテプシンＳ mRNAの転写、プロセシング、または翻訳を妨害するリボザイムを含む。Ｂ．ペプチドベースインヒビター：通例カテプシンＳのペプチドベースインヒビターは、分子レベルにおいて、カテプシンＳの活性部位へ基質として結合する天然のポリペプチド配列の少なくとも一部分の模倣体または類似体である。それらの最も単純な型において、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターは、公知のカテプシンＳ切断部位に近接した配列に基づく単純なペプチドである。このようなペプチドベースインヒビターは、競合的インヒビターである。しかし、好ましくは、ペプチドベースインヒビターは、その活性、安定性、および／または特異性を変化させる修飾されたポリペプチド構造（ペプチドから合成されるかまたは合成されない）を有する。コンビナトリアルケミストリーの技術は、ペプチドベースインヒビターの設計において顕著に進歩しており、その結果、１つまたは少数のペプチド配列または配列モチー Biochem ．J. 315:85-89(1996)，Palmerら，J ．Med．Chem. 38:3193-3196(1995) を参照のこと）。従って、例えば、カテプシンＳがタンパク質Ｘを位置Ｙで切断することが知られている場合、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターは、位置Ｙの近接した領域内でタンパク質Ｘと同じ配列、またはタンパク質Ｘの配列に構造的類似を有するポリペプチドまたは修飾ポリペプチドとして選択または設計され得る。実際に、切断部位Ｙの近接した領域(位置ＹのＮ末端およびＣ末端の10残基、またはより好ましくは５残基離れた(removed by)残基にわたる(span) )は、ペプチドベースインヒビターの選択または設計のための「好ましいタンパク質Ｘ切断部位」として規定され得る。従って、位置Ｙの周辺で好ましいタンパク質Ｘ切断部位にわたるように選択または設計された多数のペプチドベースインヒビターは、生産され、阻害活性を試験され、そして活性、安定性、および／または特異性を最適化または変化させるように連続的に修飾され得る。好ましくは、本発明のペプチドベースインヒビターのペプチド部分は、化合物がカテプシンＳによるタンパク質分解を阻害し得る限り任意の長さであり得る。好ましくは、ペプチド部分は約２〜約20のアミノ酸またはアミノ酸等価物の長さであり、より好ましくは、それは約２〜約10のアミノ酸またはアミノ酸等価物の長さであり、そして最も好ましくは、それは約２〜約３のアミノ酸またはアミノ酸等価物の長さである。システインプロテアーゼの修飾されたペプチドベースインヒビター、ならびに他の酵素は、当該分野で周知である。従って、例えば、システインプロテアーゼのペプチドベースインヒビターは、ペプチジルアルデヒド、ニトリル、α−ケトカルボニル、ハロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、(アシルオキシ)-メチルケトン、ビニルスルホン、ケトメチルスルホニウム塩、エポキシド、およびＮ- J. 315:85-89(1996);Palmerら，J ．Med．Chem. 38(17):3193-3196(1995);Br 文献を参照のこと）。現在好ましい、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターは、配列Leu-Leu- LeuおよびLeu-Hph(Hphはホモフェニルアラニンを示す)に基づくインヒビター、ならびに、下記の好ましいインバリアント鎖の切断部位配列を含む。従って、例えば、モルホリンウレア-Leu-Hph-ビニルスルホンフェニル(LHVS)は一つの好ましいカテプシンＳインヒビターである。例えば、カルボキシベンジル基またはニトロフェニルアセチル基のようなＮ末端基の付加を有するかまたは有さない他のペプチジルビニルスルホン（例えば、Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン、およびＮ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホンもまた好ましい。最も好ましくは、ペプチジル部分が、下記のようにカテプシンＳの好ましいインバリアント鎖切断部位より選択された２〜３の残基に対応する。Ｃ．ペプチドベースインヒビター：新規カテプシンＳインヒビター上記および下記の実施例に証明されるように、カテプシンＳは、クラスII MHC /インバリアント鎖複合体に会合する一方、インバリアント鎖を、２つの主要な、ほとんど近接する位置で切断する。これらの主要な切断は、ヒトインバリアント鎖の配列（配列番号１）の78位のArg残基または80位のLys残基のＣ末端で起こる。実施例８を参照のこと。それ故、好ましいインバリアント鎖切断部位は、Ar g７８周辺において、Ｎ末端側の約68〜73位からＣ末端側の約83〜88位までに及ぶ。同様に、好ましいインバリアント鎖切断部位は、Lys₈₀周辺において、Ｎ末端側の約70〜75位のからＣ末端側の約85〜90位までに及ぶ。これらの領域の重複のため、カテプシンＳは、およそ、Ｎ末端側の約68〜75位からＣ末端側の約83〜 90位までにわたる好ましいインバリアント鎖切断部位を有する。従って、この部位の内由来の、２〜20、より好ましくは２〜10、そして最も好ましくは２〜３の連続する残基の配列に基づく、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターが提供される。 J. 315:85-89(1996)を参照のこと)、切断部位のＮ末端側の１、２、および（必要に応じて）３つの位置の残基がペプチドベースインヒビター内に含まれることが、特に好ましい。それ故、例えば、残基Asn-Leu(76位および77位；つまりArg₇ ₈ 切断点に対して-2および-1)、または残基Glu-Asn-Leu(75位、76位および78位; つまりArg₇₈切断点に対して-3、-2および-1)が、ペプチドベースインヒビターの選択または設計のための基礎として好ましく使用される。同様に、残基Arg-Met( 78位および79位；つまりLys₈₀切断点に対して-2および-1)、または残基Leu-Arg- Met（77位、78位および79位；つまりLys₈₀切断点に対して-3、-2および-1）が、ペプチドベースインヒビターの選択または設計のための基礎として好ましく使用される。従って、例えば、本発明は、Asn-Leu-ビニルスルホン、Arg-Met-ビニルスルホン、Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびLeu-Le u-Leu-ビニルスルホンを含むビニルスルホン化合物のような新規なペプチドベースインヒビターを提供する。これらのペプチドビニルスルホンの修飾もまた、本発明中に含まれる。例えば、カルボキシベンジルはＮ末端に存在して、以下の化合物を与え得る：Ｎ-(カルボキシベンジル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Leu-Arg- Met-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびＮ-(カルボキシベンジル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン。代替物において、ニトロフェニルアセチルは、Ｎ末端に存在して、以下の化合物を与え得る：Ｎ -(ニトロフェニルアセチル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびＮ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン。ペプチドベースビニルスルホンは、例えば、ペプチドビニルスルホンまたは修飾ペプチドビニルスルホンを含むことを意味する。本発明はまた、ペプチドベースビニルスルホンの他の修飾を包含することを意味し、例えば、当業者に公知のように、例えば、Ｎメチル置換基または任意の他のアルキルもしくは置換アルキル鎖により、あるいは、例えばフェニル、ベンジル、アリール、または修飾アリール置換基での置換により、ペプチドベースビニルスルホンのアミノ末端で付加され置換が付加され得る。これらの例は、単に例示であり網羅的ではない。例えば、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターは、好ましいインバリアント鎖切断部位の一部（例えば、好ましいインバリアント鎖切断部位中の任意の2-3、3-5、5-7、またはそれ以上の連続する残基）にわたる他のペプチド配列に基づき得る。同様に、ペプチドベースインヒビターはペプチジルアルデヒド、ニトリル、α-ケトカルボニル、ハロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、(アシルオキシ)-メチルケトン、ビニルスルホン、ケトメチルスルホニウム塩、エポキシド、Ｎ-ペプチジル-Ｏ-アシルヒドロキシルアミン、または当業者に公知の他のこのような化合物であり得る。さらに、カテプシンＳのこれらのペプチドベースインヒビターのＮ末端は、Ｎメチル置換基または他のアルキルもしくは置換アルキル鎖；フェニル、ベンジル、アリール、または修飾アリール置換基；あるいは当業者に公知の他のこのような置換基を含む種々の置換基でブロックされ得る。実施例実施例１：システインプロテアーゼの活性部位標識本実施例は、カテプシンＳを含むシステインプロテアーゼの活性部位標識を例示する。いくつかのプロテアーゼインヒビター（新規なものおよび以前に記載のものの両方）の特性を利用することにより、Iiのタンパク質分解性プロセシングにおけるカテプシンＳの役割を研究した。システインプロテアーゼインヒビター Cbz-Tyr-Ala-CN₂は、システインプロテアーゼ活性に比例して、その活性部位に不可逆的に結合する。特定の細胞型の中に存在する活性システインプロテアーゼのプロフィールは、細胞を本インヒビターCbz-[¹²⁵I]-Tyr-Ala-CN₂のヨウ素化型と一緒にインキュベートし、そしてSDS-PAGE（Masonら、Biochem．J. 257:125-1 29(1989)）で標識されたプロテアーゼを可視化することにより、直接的に確立し得る。Cbz-[¹²⁵I]-Tyr-Ala-CN₂とのインキュベーションの前に、他のシステインクラスインヒビターでまず不活化された細胞におけるシステインプロテアーゼが、相当する標識の減少を生ずる。特定のプロテアーゼに特異的な阻害は、そのプロテアーゼのCbz-[¹²⁵I]-Tyr-Ala-CN₂でのその後の標識には影響を及ぼすが、サンプル中に存在する他の酵素には影響しない。専門の抗原提示細胞のシステインプロテアーゼプロフィールを研究し、そしてカテプシンＳ活性を特異的に測定するため、Ｂリンパ芽細胞株HOM2（Benarochら、EMBO J. 14:37-49(1995)）を用いた。10％ FBS、1/1000ユニット/mlペニシリン、100/μｇ/mlストレプトマイシン、および２mMグルタミンを含むRPMI中で、Ｂリンパ芽細胞株HOM2（HLA-DR1と同型接合性）を維持した。0.1nMおよび５nMの特異的カテプシンＳインヒビターLHVS（モルホリンウレア-ロイシン-ホモフェニルアラニン-ビニルスルホンフェニル）（Palmersら、J ．Med．Chem. 38(17):319 3-3196(1995)）とのインキュベーションの後に、HOM2細胞をCbz-[¹²⁵I]-Tyr-Ala -CN₂で標識した。標識細胞から調製された溶解物を、直接またはカテプシンＳおよびＢに特異的な抗体を用いた免疫沈降に供し、120％ SDS-PAGEにより分析した。ヒトカテプシンＳの抗体をShiら、J ．Biol．Chem. 269:11530-11536(1994)に記載のように調製し、そしてカテプシン３の抗体をVital Products，Inc．(St．Louis ，MO)から入手した。カテプシンＳインヒビターの非存在下で、（この12％ゲルで泳動先端色素（dye front）と泳動して）33kDa、28kDa、および６kDaに移動する３つのポリペプチドを標識した。33kDaおよび６kDaのポリペプチドをカテプシンＢに特異的な抗血清で免疫沈降させ、そしてそれぞれ活性酵素の一本鎖型および軽鎖型に相当する。33kDaのタンパク質と比較した６kDaポリペプチドのより強度な標識から、HOM2細胞に存在するカテプシンＢのほとんどは、軽鎖型であることが示唆された。28kDaポリペプチドは、カテプシンＳに特異的な抗体で免疫沈降したので、カテプシンＳの活性型と同定された。カテプシンＳの標識は、LHVS 濃度１nMにおいて効果的に阻害されたが、カテプシン３は阻害されなかった。インヒビター濃度が５nMである場合、カテプシンＢの標識は減少したが、いくらかの活性は残存していた。従って、LHVSを濃度１〜５nMで利用して、HOM2細胞において他のシステインプロテアーゼが機能的に活性なまま、カテプシンＳを特異的に阻害し得た。次いで、Cbz-[¹²⁵I]-Tyr-Ala-CN₂でのシステインプロテアーゼの活性部位標識を用いて、その後の実験に用いられた精製ヒトカテプシンＢおよびＳがその他のプロテアーゼと相互汚染していないことを決定した。システインプロテアーゼインヒビターCbz-Tyr-Ala-CN₂を、以前に報告されたようにヨウ素化した（Masonら、Biochem ．J. 257:125-129(1989)）。HOM2細胞（５×10⁶細胞／サンプル）を、インヒビター（2S,3S-トランス-エポキシスクシニル-L-ロイシン-アミド-3-メチルブタンエチルエステル（E64D）（20μｍ）（Sig ma Chemical Co.，St．Louis，MOより入手）、ロイペプチン（0.5mM）（Sigma C hemical Co.，St．Louis，MOより入手）、コンカナマイシンＢ（20nM）（Ajinom oto Co.，Kanagawa，Japanより入手）、またはLHVS（１または５nM）（Khepri P harmaceuticals，Inc.，South San Francisco，CAより入手））との標識の１時間前に37℃でインキュベートした。細胞を１時間37℃でのCbz-[¹²⁵I]-Tyr-Ala-C N ₂ とのインキュベーションにより標識し、PBSで２回洗浄し、そしてSDS-PAGEサンプル緩衝液に溶解した。Cbz-[¹²⁵I]-Tyr-Ala-CN₂を含む50μｌの消化緩衝液（50 mM酢酸ナトリウム、pH5.5、１％Triton-X-100、３ｍＭシステイン、１mM EDTA）への精製酵素ストックの２μｌアリコートの添加により、精製したカテプシンＢおよびＳを標識した。サンプルを１時間37℃でインキュベートし、そして50μｌの２×SDS-PAGEサンプル緩衝液の添加により標識反応を終結した。上記のように５×10⁶HOM2細胞を標識し、次いで、１mlの10mM Tris-HCL、pH7. 5、１mM EDTA、0.2．SDS、１％ TritonX-100を用いて氷上で細胞溶解することにより、カテプシンＢおよびＳの免疫沈降を実施した。溶解物を集め、５分間煮沸し、そしてプロテインA-アガロース（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN ）および正常ウサギ血清（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を用いて前処理した。タンパク質アガロースにカップリングさせた抗カテプシンＳ抗体および抗カテプシンＢ抗体で、システインプロテアーゼを免疫沈降させた。沈澱物を、還元SDS-PAGEサンプル緩衝液で洗浄および溶出した。実施例２：カテプシンＳの阻害のIiのプロセシングの阻害本実施例は、カテプシンＳの阻害がIiのプロセシングおよびその後のクラスII 分子によるペプチド結合に干渉することを例示する。HOM2細胞を、以下のように³⁵ S-メチオニン／システインでパルス標識した。0.25mCi³⁵S-メチオニン／システインで１時間、37℃での標識の前に、HOM2細胞の５×10⁶/サンプルを、プロテアーゼインヒビターまたは適切な溶媒を補充した１mlのメチオニン、システイン非含有DMEM中で１時間、37℃でプレインキュベートした。細胞を遠心分離し、そしてRPMI/10％FBSに１×10⁶/mlで再懸濁し、そしてLHVSの非存在または１nMもしくは５nMのLHVSの存在において５時間チェイスした。次いで、HOM2細胞を冷PBS で２回洗浄し、そして１mlの50mM Tris-HCl、pH7.4、0.5％ NP-40、5nM MgCl₂に溶解した。溶解物をプロテインAアガロースで前処理した。クラスIIαβ二量体およびαβII複合体のモノクローナル抗体Tu36での免疫沈降に続いて、７μｌの正常ウサギ血清および２μｌの正常マウス血清を、プロテインAアガロースにカップリングさせた。免疫沈降物を、１mlの50mM TrIs-HCl、pH7.4、0.5％ NP-40 、５mM EDTA、150mM NaClで４〜６回洗浄した。これらのペレットを非還元SDS-PAG Ｅまたは還元SDS-PAGEサンプル緩衝液で直接溶出するか、またはタンパク質分解的消化およびさらなる免疫沈降のための出発材料として用いた。免疫沈降物のタンパク質分解的消化を、50μｌの50mM酢酸ナトリウム、pH5.5 、１％ TritonX-100、３mMシステイン、１mM EDTA、37℃に希釈した精製プロテアーゼおよび沈澱したペレットとのインキュベーションにより実施した。サンプルを、SDS-PAGEサンプル緩衝液で溶出した。サンプルの２分の１を、14％ SDS-PAGEによって緩和な変性（非加熱、非還元）条件下で分析し、約50kDaに移動するSDS安定複合体を可視化した。これらのSD S安定複合体はペプチド含有αβ二量体に相当し、ロイペプチン（Neefjesおよび Ploegh，EMBO J. 11:411-416(1992)）（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MOより入手）によるシステインプロテアーゼの阻害下で減少した。１nMおよび５nMの LHVSでの特異的な阻害は、クラスIIに会合した13kDaのIiフラグメントが蓄積を生じ、そしてSDS安定複合体形成の著しい減少により証明されるようにペプチド装填における付随的な減少を生じた。システインクラスのインヒビター2S,3S-トランス-エポキシスクシニル-L-ロイシン-アミド-3-メチルブタンエチルエステル（E64D）での全システインプロテアーゼの阻害の結果、クラスII結合23kDa Iiフラグメントが蓄積し、ロイペプチンで見られるのと同様に、SDS安定性二量体の形成が減少した。この結果から、カテプシンＳは比較的後期のIi分解中間生成物に作用し、そして以後のペプチドローディングに必要なIiの効果的なタンパク質分解に必要とされたことを示した。実施例３：カテプシンＳはαβIi複合体に関係するIiを選択的に消化する本実施例は、カテプシンＳがクラスII MHC/非変異鎖複合体における非変異鎖をタンパク質分解的に消化するが、クラスII MHC分子はインタクトで、その後の抗原性ペプチドと結合し得るままであることを例示する。個々のα、β、および Iiポリペプチドを、複合体形成と両立できる条件下で別々におよび一緒にインビトロで翻訳した（Bijlmakersら、J ．Exp．Med. 180:623-629(1994)）。α、β、およびIiのインビトロ翻訳を以下のように実施した：HLA-DR1αのcDNA（Larham marら、Cell 30:153-161(1982)）およびβ鎖（Bellら、Proc ．Natl．Acad．Sci ．(USA) 82:3405-3409(1985))、およびヒトp33IiをコードするcDNA(Claessonら、Proc ．Natl．Acad．Sci．(USA) 80:7395-7399(1983))を全てpSP72（Promega、Mad ison,WI）に、上記（Bijlmakersら、J ．Exp．Med. 180:623-629(1994)）のようにクローニングした。cDNAを、インビトロで一緒にまたは別々のいずれかでT7RN Aポリメラーゼを用いて転写した。RNAを、70％エタノールに−80℃で保存した。別々のバッチごとに、利用したRNAの最適量を経験的に決定した。得られたRNAをウサギ網状赤血球溶解物（Flexi，Promega，Madison，WI）にインビトロで翻訳し、イヌのミクロソームに補充した。上記のように（Bijlmakersら、J ．Exp．Me d. 180:623-629(1994)）、翻訳を90分間30℃で実施した。翻訳の完了後、４分間、12,000rpmでの遠心分離によりミクロソームをペレットにし、そして20μｌの溶解物／反応緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、pH5.5、１％ TritonX-!00、3mMシステイン、１mM EDTA）にカテプシンＳを入れたものと入れないものに再懸濁した。カテプシンＳ濃度は、0.19または0.38μＭであった。Sf9細胞におけ ProteinSci.，印刷中、1996）を用いて精製したヒトカテプシンＳを得た。上記の可溶化されたミクロソームの４時間37℃でのインキュベーションにより、タンパク質分解的消化を実施した。反応を、還元性SDSサンプル緩衝液の添加により終結し、サンプルを煮沸し、そして変性条件下で15％ SDS-PAGEにより直接分析した。カテプシンＳは、単一で翻訳された場台、α、β、およびIi鎖を速やかに消化した。しかし、αおよびβ鎖を一緒に翻訳し、二量体形成がおこった場合、タンパク質分解に対して抵抗性を提示した。３成分の全てを一緒に翻訳し、カテプシンＳと反応した場合、Iiのみが分解され、IiのカテプシンＳ反応への顕著な感受性を例示した。免疫沈降により各段階を追跡し、αβ二量体およびαβIi三量体の形成を確認した。従って、カテプシンＳは、αβ二量体はインタクトなままで、αβIi複合体の一部であるII分子を選択的に分解する。カテプシンＳおよびＢのαβIi三量体に参加するIiの分解能力を直接比較するためには、基質特異性における相違および無関係に二つのプロテアーゼの活性を測定しなければならない。全タンパク質の一部のみが活性を示すので、全タンパク質含有量の標準化は誤解をまねく。この難点を克服するために、基質Z-Phe-Ar g-AMCとともにE64D（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MOより入手）を活性部位滴定基準液として使用することにより、精製カテプシンＢ（Calbiochem-Novabio chem Corp.，San Diego，CAより入手）およびカテプシンＳ調製物の分子活性を、以前に記載（BarrettおよびKirschke、Methods in Enzymology Vol．80，Prot eo lytic Enzymes，L．Lorand(編)、New York，New York:Academic Press，Inc. ，pp535-560(1981)）のように測定した。この方法で測定した酵素活性は、E64D が不可逆的にカテプシンＳおよびＢを等モルにおいて阻害するので、使用した基質に依存しない。上記の方法により決定した濃度を用いて、カテプシンＳおよびＢがIiをHOM2細胞から免疫沈降させたαβIiヘテロ三量体から消化する能力を決定した。HOM2細胞を、インヒビターのない状態、またはインヒビターE64DもしくはLHVSのある状態でインキュベートし、その間³⁵S-メチオニン／システインパルス／チェイスを行った。カテプシンＳは、2.3kDaおよび13kDaのIi中間体と同様に、特異的にインタクトなIiを分解した一方で、αβ二量体およびαβペプチド複合体を分解しなかった。対照的に、カテプシンＢは、免疫沈降させたαβIiヘテロ三量体またはαβIiフラグメント複合体に対してほとんどタンパク質分解活性を示さず、カテプシンＳの100倍のモル濃度でさえ示さなかった。カテプシンＢのIi分解不能は、単に使用した濃度で酵素が活性状態にならなかった結果でないことが、クラスIIβ鎖の移動の微少な変化により証明されたが、これはβ鎖の細胞質部分へのカテプシンＢの活性を示唆する（RocheおよびCresswell、Proc ．Natl．Acad．Sc i．(USA) 88:3150-3154(1991)）。クラスII分子の成熟において定義された中間体は、IiのCLIP領域に結合したα βヘテロ二量体（AvvaおよびCresswell．Immunity １:763-774(1994)）から成る複合体である。HLA-DMの基質であるとして提唱されたのは、この中間体である（WolfおよびPloegh、Ann ．Rev．Cell Biol. 11:267-306(1995)を参照のこと）。カテプシンＳがαβIiからαβ-CLIPを生成し得るかどうかを決定するために、HOM2細胞をインヒビターの存在または非存在で標識し、モノクローナル抗体Tu 36 と免疫沈降させ、0.23μＭカテプシンＳで１時間37℃で消化し、そしてIiに対する抗体と免疫沈降させた。Tu36は、マウスのモノクローナル抗体（Shawら、Huma n Immunol. 12:191-211(1985)）で、HLA-DR1αβ二量体を単独でもしくはIiを伴った状態で認識する。二つのIi反応性マウスモノクローナル抗体を使用した：Ii のＮ末端に特異的なPIN-1（AvvaおよびCresswell，Immunity １:763-774(1994) ）、およびIiのＣ末端に対するモノクローナル抗体LN-2。次いでαβII複合体をバラバラにするために、１％ SDSの存在下で免疫沈降物を３分間煮沸し、10倍に希釈し、そしてIiのCLIP領域、細胞質テール（PIN-1抗体）および内腔ドメイン（LN-2抗体）に対する抗体と、連続的に再度免疫沈降を行った。変性条件下で、 10〜20％濃度勾配トリシンSDS-PAGEによりサンプルを分析した。未反応サンプルに見られなかった３kDaのポリペプチドを、抗CLIP抗体と免疫沈降を行った。インタクトなヒトIiの81〜104残基の領域にまたがっている、KLHに結合させた、二つのオーバーラップするペプチドのウサギへの注射により抗CLIP試薬を生成した。Ｎ末端細胞質テールに対して指向した抗体PIN-1は、23kDaおよび13kDaのIi鎖フラグメントと同様にインタクトなIiを免疫沈降させ得たので、23kDaおよび13k Daの中間体は二つともＮ末端フラグメントであることが示唆される。Ii内腔ドメインに対するLN2抗体は、全長Iiのみを沈澱させた。従って、カテプシンＳは、 αβIiのタンパク質分解における中間体として知られるαβ-CLIPを生成し得た。カテプシンＳと対照的に、精製したカテプシンＢ（66μＭ）もＤ（2.4μＭ）（Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CAから入手）もαβIiからαβ- CLIPを生成し得なかった。HOM2細胞を0.5mMロイペプチン存在下でパルス／チェイスし、クラスII分子をTu36と免疫沈降させた。次いで、単離されたクラスII複合体を、異なった精製カテプシンにより、pH5.5で37℃１時間で消化した。次いで、この消化複合体を変性条件下で10〜20％；トリシンゲルにより分析した。カテプシンＳ（0.23μＭ）のみでの消化の結果、αβ二量体と結合した３kDaのポリペプチドを生成した。この3kDaフラグメントはまた、上記で使用した抗CLIP試薬と再度免疫沈降し得た。カテプシンＢもＤも、高濃度で使用した場合、大きな分子量のIi開裂産物を生成し得たが、アップCLIPは生成しなかった。このことは、完全で効果的なIiのプロセシングにおけるカテプシンＳの必須な役割を例示する。 HLA-DMの封入がαβ-CLIP複合体に結合したCLIPの抗原性ペプチド（Denzinら、Cell 82:155-165(1995);Shermanら、Immunity 3:197-205(1995):Sloanら、Nat ure 375:802-806(1995)）への交換を促進する一方、効率は悪いが、添加したHLA -DMの非存在下でも、反応も起こり得る。抗原性ペプチドとのより大きなIi残遺物の置換はさらに効率が悪かった。カテプシンＳでのαβIiヘテロ三量体のタンパク質分解は、以下のように、得られたクラスIIαβ-CLIP複合体上にペプチドをのせ得ることを示した：HOM2細胞を大量のαβIi三量体（Benarochら、EMBO J . 14(1):37-49(1995)）を蓄積するために20nMコンカナマイシンＢで処理した。アミノ酸306〜318を含む赤血球凝集素ペプチド（HA）を、DR1制限ペプチド（Rot hbardら、Cell 52(4):515-523(1988)）として使用した。HAをBiosearch SAM 2ペプチド合成機で台成(t-boc chemistry）し、水に溶解し、−70℃で保存した。コンカナマイシンＢ処理細胞由来のαβIi複合体をまず内腔ドメインに対する抗体（LN-2）と免疫沈降させ、インタクトなαβIi複合体のみを沈殿させた。これらの複合体を、pH5.5において0.23μＭのカテプシンＳの非存在および存在下でインキュベートし、そして次いで¹²⁵I-HAにpH5.5で４時間照射した。非結合¹²⁵I-H Aの除去の後、緩和な変性（非煮沸、非還元）条件下で、14％SDS-PAGEにより、複合体形成を評価した。HA（50μｌの１mM溶液）の¹²⁵Iおよび50mM NaPO₄（20μ ｌ）とのpH7.5においてヨウ素産生物質（iodogen）でコートしたガラス管で氷上にて10分間のインキュベーションにより、HAペプチドをヨウ素化した。¹²⁵I-HA は、C18Sep-packカラムを通して遊離した¹²⁵Iから単離し、そしてアセトニトリルで溶出した。¹²⁵I-HAのアリコートをスピード吸引器で乾燥させ、そしてカテプシンＳ処理および非処理の免疫沈降物とのインキュベーションのために反応緩衝液に再溶解した。ペプチドとのインキュベーションの後、サンプルを溶解緩衝液（pH7.4）で0.8mlに希釈し、プロテインＡアガロースでLN-2抗体を除去し、そしてTu36と免疫沈降させた。サンプルは、SDS-PAGEサンプル緩衝液の添加前に完全に洗浄し、非結合ペプチドを除去した。カテプシンＳによるαβIiの酵素反応およびその後の¹²⁵I-HA照射の結果、標識されたαβペプチド複合体が形成された。しかし、SDSに不安定なクラスII分子が継続的に存在したことにより証明されるように、この変換は不完全であった。従って、カテプシンＳは、クラスII分子は機能的にインタクトなまま、Iiをプロセスし得、αβ二量体がペプチドを結合し得る様式で効果的にIiを分解するのにそれだけで充分であることを示す。実施例４：カテプシンＤの阻害はIiのプロセシングに影響を及ぼさない本実施例は、IiのプロセシングにカテプシンＤもカテプシンＨも必要とされないことを例示する。Maricら、Proc ．Natl．Acad．Sci．(USA)91:2171-2175(1993 )は、Ii分解の初期段階におけるアスパルチルプロテアーゼカテプシンＤの関連を示唆した。カテプシンＤをナノモルの範囲で阻害する強力なアスパルチルクラスのプロテアーゼインヒビター、CGP53437（Alteriら、Antimic ．Ag．Chemother ap. 37:2087-2092(1993)）を利用することにより、この疑問を研究した。CGP534 37は、ヒトの単球におけるカテプシンＤ活性を、５μＭおよび50μＭの濃度で、それぞれ75％および90％阻害する。HOM2細胞を³⁵Sメチオニン／システインで標識し、0.5mMロイペプシン、５nMのLHVS、５μＭのCGP53437、または50μＭのCGP 53437の存在下で、インヒビターなしに５時間チェイスした。サンプルを14％のS DS-PAGEにより緩和な変性条件下で分析した。カテプシンＤ（Calbiochem-Novabi ochem Corp.，San Diego，CAより入手）のCGP53437での阻害で、Iiフラグメントの蓄積も生じず、またSDS安定複合体の減少を生じることもなく、IiのプロセシングにカテプシンＤは必須でないことを示唆する。良好なアミノペプチダーゼ活性を有するが弱いエンドペプチダーゼ活性を有するリソソームのシステインプロテアーゼであるカテプシンＨは、マウスの腹膜マクロファージにおけるγ-インターフェロンによりアップレギュレートされる（L afuseら、J ．Leuk．Biol．57:663-669(1995)）。精製されたヒトカテプシンＨ（ Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CAより入手）は、LHVSに阻害されず、免疫沈降させたαβIiに対して少しのタンパク質分解活性も提示しなかったので、カテプシンＨがIiの分解に必須なプロテアーゼでないことを示唆する。実施例５：Ｎ-(カルボキシベンジル)-Leu-Leu-Leuビニルスルホンの合成本実施例は、カルボキシベンジル-Leu-Leu-Leuビニルスルホンの合成工程を例示する。 a)Boc- ロイシンのWeinrebアミド Boc-ロイシン-H₂O（１当量）、トリエチルアミン（２当量）、およびPyBOP（１当量）のジクロロメタン溶液を数分間、室温で撹拌した後、HCl-N,O-ジメチルヒドロキシアミン（２当量）を乾燥した状態で、さらなるトリエチルアミン（２当量）と共に添加した。一晩撹拌の後、この反応混合物をジクロロメタンで希釈し、次いで３ＮのHCl、飽和NaHCO₃、および飽和NaClで２回ずつ洗浄した。ジクロロメタン層を（MgSO₄で）乾燥させ、そして回転エバポレーションにかけ、次いで産物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、３：１）により精製した。 b)Boc- ロイシナル BocロイシンのWeinrebアミドを乾燥Et₂Oに溶解し、そして０℃で等モル量のLi AlH4のEt₂O懸濁液にカニューレにより添加した。１時間の撹拌の後、反応フラスコを０℃から移し、室温にまで温まるように放置した。80分間の反応時間の後、 KHSO₄の水溶液（２当量のKHSO₄、5mlのH₂O/ミリモルWelnrebアミド）を撹拌しながらゆっくりと添加した。Et₂Oで水層を抽出し、そして隣のEt₂O層を３ＮのHCl 、飽和NaHCO₃、および飽和NaClで洗浄した。乾燥（MgSO₄）および回転エバポレーションの後、薄層クロマトグラフィーにより、オイルに一つの化合物が含まれていることを見出した。 c)ホスホネートスルホン室温で撹拌しつつあるジメチルメチルチオメチルホスホネートのジオキサン溶液（１当量）に、５当量の過酢酸を添加した。３時間以上撹拌の後、炭素電極上のptを添加して、未反応過酸化物をクエンチさせた（quench）。水の添加（10ml /ミリモルのホスホネートスルフィド）により反応をクエンチし、酢酸エチルで生成物を抽出した。乾燥（MgSO₄）および回転エバポレーションの後、少量のヘキサンを使用して酢酸エチルから再結晶によりホスホネートスルホンを精製した。 d)Boc-Leu- ビニルスルホンアルゴン下で、室温で撹拌しつつあるNaH（２当量）のテトラヒドロフラン溶液に、カニューレによりテトラヒドロフランの中の２当量のホスホネートスルホンを添加した。数分間の撹拌の後、テトラヒドロフラン中の１当量のBoc-ロイシナルをカニューレにより添加した。３時間後、水で反応を終結させ、そして水層をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を飽和NaClで戻し抽出し、乾燥（ MgSO₄）させ、そして黄色のオイルになるまでロータリーエバポレーターにかけた。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン、１：１）により精製し、凍結乾燥の後、オイルを得た。 e)Leu- ビニルスルホントシレート塩無水p-トルエンスルホン酸（Tosic acid）（３当量）のEt₂O溶液をBoc-Leu-ビニルスルホン（1.5当量）の乾燥オイルに添加し、そして室温で一晩撹拌した。生成物は、白色の沈澱物を形成し、遠心分離により回収した。 f)カルボキシベンジル-Leu-ロイシン３倍容量の室温で撹拌しつつあるロイシン（1.5当量）のH₂O/NaHCO₃溶液に、１倍容量のカルボキシベンジル-Leu-Osu（１当量）のジオキサン溶液を添加し、そして一晩撹拌した。水性クエン酸ナトリウムの添加により生成物を沈澱させ、次いで酢酸エチルにより抽出した。混合した酢酸エチル層を乾燥（MgSO₄）させ、ロータリーエバポレーターにかけて清澄なオイルにした。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール、12：１、１％TFAを含む）により精製した。 g)カルボキシベンジル-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホン撹拌したカルボキシベンジル-Leu-ロイシン（１当量）のテトラヒドロフラン溶液に、−10℃でアルゴン下において各１当量のＮ-メチルモルフォリンおよびイソブチルクロロホルメートを添加した。数分後、各１当量のLeu-ビニルスルホントシレートおよびＮ-メチルモルフォリンのテトラヒドロフラン懸濁液を添加し、75分間−10℃で撹拌を続けた。３ＮのHClの添加により反応を終結させ、そしてジクロロメタンで生成物を抽出した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン、３：２）の後、生成物を温エタノールから再結晶させた。実施例６：その他の、ペプチドを基礎にしたビニルスルホンこの実施例は、ペプチドビニルスルホンおよび修飾されたペプチドビニルスルホンの合成工程を例示する。 (i)Asn-Leu- ビニルスルホンこの化合物は、(g)工程においてカルボキシベンジル-Leu-ロイシンのかわりにアスパラギンを使用したことを除いて、実施例５に記載のように合成される。 (ii)Arg-Met- ビニルスルホンこの化合物は、(g)工程においてカルボキシベンジル-Leu-ロイシンのかわりにアルギニンを使用すること、そして(b)におけるように、そして(d)および(e)で使用するように(a)工程においてBoc-L-メチオニンを使用し、Boc-メチオナルに変換することを除いて、実施例５に記載のように合成される。 (iii)Leu-Arg-Met ビニルスルホンこの化合物は、(g)工程においてLeuアルギニンを使用することを除いて、化合物(ii)についての上記のように合成される。 (iv)Glu-Asn-Leu- ビニルスルホンこの化合物は、(g)工程でGlu-アスパラギンを使用することを除いて、化合物( i)についての上記のように合成される。 (v)Ｎ-（カルボキシベンジル）-Asn-Leu-ビニルスルホンこの化合物は、カルボキシベンジル保護アスパラギンを使用することを除いて、化合物(i)についての上記のように合成される。 (vi)Ｎ-（カルボキシベンジル）-Arg-Met-ビニルスルホンこの化合物は、カルボキシベンジル保護アルギニンを使用することを除いて、化合物(ii)についての上記のように合成される。 (vii)Ｎ-（カルボキシベンジル）-Leu-Arg-Met-ビニルスルホンこの化合物は、カルボキシベンジル保護Leu-アルギニンを使用することを除いて、化合物(iii)についての上記のように合成される。 (viii)Ｎ-（カルボキシベンジル）-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホンこの化合物は、カルボキシベンジル保護Glu-アルギニンを使用することを除いて、化合物(iv)についての上記のように合成される。 (ix)Ｎ-（ニトロフェニルアセチル）-Asn-Leu-ビニルスルホンこの化合物は、ニトロフェニルアセチル保護アスパラギンを使用することを除いて、化合物(v)についての上記のように合成される。 (x)Ｎ-（ニトロフェニルアセチル）-Arg-Met-ビニルスルホンこの化合物は、ニトロフェニルアセチル保護アルギニンを使用することを除いて、化合物(vi)についての上記のように合成される。 (xi)Ｎ-（ニトロフェニルアセチル）-Leu-Arg-Met-ビニルスルホンこの化合物は、ニトロフェニルアセチル保護Leu-アルギニンを使用することを除いて、化合物(vii)についての上記のように合成される。 (xii)Ｎ-（ニトロフェニルアセチル）-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホンこの化合物は、ニトロフェニルアセチル保護Glu-アスパラギンを使用することを除いて、化合物(viii)についての上記のように合成される。実施例７：カテプシンＳの阻害が免疫反応を変化させるこの実施例は、カテプシンＳの阻害が破傷風トキソイドへの免疫反応を変化させたことを例示する。破傷風に免疫性の個体から（PBMCの）末梢血単核細胞を単離し、そして破傷風トキソイド（250ng/cc）、システインクラスプロテアーゼインヒビターE64D（20μＭ）（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MOより入手）およびカテプシンＳに特異的なインヒビターLHVS（Khepri Pharmaceuticals，Inc. ，South San Francisco，CAから入手したモルホリンウレア-ロイシン-ホモフェニルアラニン-ビニルスルホンフェニル（10〜20nM））の存在下で３〜５日間培養した。培養の最後の18時間の間、³H-チミジンの取り込みによってＴ細胞の増殖をアッセイした。破傷風トキソイド（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MOより入手）の存在下で、³H-チミジンの取り込みは４倍以上に増加した。E64DもLHV Sも、この反応を約60％減少させた。従って、カテプシンＳの特異的な阻害が免疫反応を調節した。Ｔ細胞の刺激の変化が、全システインプロテアーゼの完全な阻害により生じた変化と同程度であったという事実は、カテプシンＳがインバリアント鎖のプロセシングおよびその後の抗原提示に関与する主要なシステインプロテアーゼであるという結論を支持する。実施例８：カテプシンＳの特異的インバリアント鎖開裂部位この実施例は、CLIPのＮ末端におけるカテプシンＳの特異的開裂部位を例示する。HOM2細胞（Benarochら、EMBO J. 14:37-49(1995)）を20mMのE64D存在下において５時間、５mCi³⁵S-メチオニンでパルス／チェイスし、溶解し、そしてクラスII MHC分子をmAbTu 36で免疫沈降させた。免疫沈降物を、pH5.5、37℃で60分間0.23μＭのカテプシンＳと消化した。クラスII MHC分子を再度ペレットにし、 10〜20％のトリシンゲル上で分析し、そしてナイロンメンブレンに転写した。３ kDaに位置する放射活性を示すバンドをメンブレンから摘出し、放射線配列決定に供した。最初のサイクルに高レベルのカウントが見られ、インバリアント鎖の残基79におけるメチオニンに相応した。サイクル11では、それより小さな増加もまた明らかであり、存在するペプチドの一部がロイシン残基81においてＮ末端を有することが提示された。従って、これらの開裂部位に広がるバイペプチドおよびトリペプチド-ビニルスルホンは、カテプシンＳが媒介するインビボでのインバリアント鎖のプロセシングを阻害する有力な候補である。実施例９：Leu-Arg-Met- ビニルスルホンを用いた多発性硬化症の治療この実施例は、カテプシンＳによるインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害するペプチドベースのビニルスルホンを用いたヒトの多発性硬化症の治療方法を例示する。患者は一日一回、静脈注射によりLeu-Arg-Met-ビニルスルホンを投与される。その用量は、500mg/70kg体重である。この治療は、患者の多発性硬化症の影響を軽減させる。実施例10：Ｎ-（カルボキシベンジル）-Arg-Met-ビニルスルホンを用いた尋常性天疱瘡の治療この実施例は、カテプシンＳによるインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害するペプチドベースのビニルスルホンを用いたヒトの尋常性天疱瘡の治療方法を例示する。病気の結果生じる損傷に、軟膏の形態でＮ-（カルボキシベンジル）- Arg-Met-ビニルスルホンを局所的に投与する。その用量は、軟膏50mg/gmで、そして患部に毎日投与する。この治療は、患者の尋常性天疱瘡の効力を軽減させる。当業者は、日常の実験法のみで本明細書中に記載された発明の特定の実施態様との多くの同等な態様を確認し得る。これらの、およびその他の全ての同等の態様は、以下の請求の範囲により包含され得ると意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２５Ｂ 37/06 ６３７Ｄ 43/00 ６４３ＡＡ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 5/06 Ｃ０７Ｋ 5/06 5/08 5/08 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者プルッフ，ヒッデエル. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02146，ブルックリン，トクステスストリート１ (72)発明者チャップマン，ハロルドエイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02168，ニュートン，ワバンアベニュー 435 (72)発明者リーゼ，リチャードジェイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02172，ウォータータウン，スプルースストリート 178 (72)発明者ウォルフ，ポーラアール. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02140，ケンブリッジ，ヤークサロード 18 (72)発明者ボギョー，マシューエス. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02143，サマービル，エイボンストリート 69，アパートメント３

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物におけるクラスII MHC拘束性免疫応答を抑制するための医薬の製造におけるカテプシンＳを阻害する薬剤の使用であって、ここで、該哺乳動物に該薬剤の有効量を投与することは、カテプシンＳによるインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害しそれにより該哺乳動物におけるクラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのクラスII/抗原性ペプチド複合体の形成を阻害する、薬剤の使用。２．前記哺乳動物が自己免疫疾患の危険性があるか、または自己免疫疾患に罹っており；そして前記薬剤が自己免疫応答を抑制するために有効な量で投与される、請求項１に記載の薬剤の使用。３．前記自己免疫疾患が、若年発症糖尿病（インスリン依存性）、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、グレーヴズ病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、および橋本甲状腺炎からなる群から選択される、請求項２に記載の薬剤の使用。４．前記哺乳動物が、アレルギー応答の危険性があるか、またはアレルギー応答に罹っており；そして前記薬剤がアレルギー応答を抑制するために有効な量で投与される、請求項１に記載の薬剤の使用。５．前記アレルギー応答が喘息性応答である、請求項４に記載の薬剤の使用。６．前記哺乳動物が、器官移植または組織移植を受けたかまたは受けようとしており；そして前記薬剤が同種異系免疫応答を抑制するために有効な量で投与される、請求項１に記載の薬剤の使用。７．哺乳動物細胞におけるクラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害するための医薬の製造におけるカテプシンＳを阻害する薬剤の使用。８．哺乳動物細胞における抗原性ペプチドの結合についてのクラスII MHC分子の能力を減少するための医薬の製造におけるカテプシンＳを阻害する薬剤の使用であって、ここで、該薬剤を該細胞へ投与することは、クラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害して該細胞における抗原性ペプチドの結合についてのクラスII MHC分子の能力を減少させる、薬剤の使用。９．哺乳動物細胞におけるクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少するための医薬の製造におけるカテプシンＳを阻害する薬剤の使用であって、ここで、該薬剤を該細胞へ投与することは、クラスII MHC/インバリアント鎖複合体からのインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害して、該哺乳動物におけるクラスII MHC分子による抗原性ペプチドの提示を減少させる、薬剤の使用。１０．前記哺乳動物細胞が、哺乳動物においてインビボで処理される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。１１．前記哺乳動物細胞がインビトロで処理される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。１２．前記薬剤がシステインプロテアーゼインヒビターである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。１３．前記薬剤が、カテプシンＫ、Ｌ、Ｈ、Ｏ２、およびＢからなる群から選択されるシステインプロテアーゼに比較してカテプシンＳの選択的インヒビターである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。１４．前記薬剤がカテプシンＳの特異的インヒビターである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。１５．前記薬剤がカテプシンＳのペプチドベースインヒビターである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤の使用。１６．前記カテプシンＳのペプチドベースインヒビターが、カテプシンＳの好ましいインバリアント鎖切断部位の2〜20の連続した残基を含むペプチド配列に基づく、請求項１５に記載の薬剤の使用。１７．前記ペプチド配列が、Asn-Leu、Glu-Asn-Leu、Arg-Met、Leu-Arg-Met、Le u-Leu-Leu、およびLeu-Hphからなる群から選択される、請求項１５に記載の薬剤の使用。１８．前記ペプチドベースインヒビターが、モルホリンウレア-ロイシン-ホモフェニルアラニン-ビニルスルホンフェニル（LHVS）である、請求項１５に記載の薬剤の使用。１９．前記ペプチドベースインヒビターが、ペプチドベースビニルスルホンまたは修飾ペプチドベースビニルスルホンである、請求項１５または１６に記載の薬剤の使用。２０．前記ペプチドベースインヒビターが、ペプチジルアルデヒド、ニトリル、 α-ケトカルボニル、ハロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、（アシルオキシ）-メチルケトン、ビニルスルホン、ケトメチルスルホニウム塩、エポキシド、およびＮ-ペプチジル-Ｏ-アシル-ヒドロキシルアミンからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の薬剤の使用。２１．前記薬剤が、Asn-Leu-ビニルスルホン、Arg-Met-ビニルスルホン、Leu-Ar g-Met-ビニルスルホン、Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびLeu-Leu-Leu-ビニルスルホンからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の薬剤の使用。２２．前記薬剤が、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Leu-Ar g-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびＮ-(カルボキシベンジル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホンからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の薬剤の使用。２３．前記薬剤が、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ -(ニトロフェニルアセチル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Glu-Asn-Le u-ビニルスルホン、およびＮ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホンからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の薬剤の使用。２４．カテプシンＳのインヒビターであって、カテプシンＳのペプチドベースインヒビターを含み、ここで、該カテプシンＳのペプチドベースインヒビターは、カテプシンＳの好ましいインバリアント鎖切断部位由来の少なくとも約２〜20の連続した残基を含むペプチド配列に基づく、インヒビター。２５．前記ペプチド配列が、Asn-Leu、Glu-Asn-Leu、Arg-Met、Leu-Arg-Met、Le u-Leu-Leu、およびLeu-Hphからなる群から選択される、請求項２４に記載のインヒビター。２６．前記ペプチドベースインヒビターが、ペプチドベースビニルスルホンまたは修飾ペプチドベースビニルスルホンである、請求項２４に記載のインヒビター。２７．前記ペプチドベースインヒビターが、ペプチジルアルデヒド、ニトリル、 α-ケトカルボニル、ハロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、（アシルオキシ）-メチルケトン、ビニルスルホン、ケトメチルスルホニウム塩、エポキシド、およびＮ-ペプチジル-Ｏ-アシル-ヒドロキシルアミンからなる群から選択される、請求項２４に記載のインヒビター。２８．前記インヒビターが、Asn-Leu-ビニルスルホン、Arg-Met-ビニルスルホン、Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびLeu-Leu- Leu-ビニルスルホンからなる群から選択される、請求項２４に記載のインヒビター。２９．前記インヒビターが、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル )-Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(カルボキシベンジル)-Glu-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびＮ-(カルボキシベンジル)-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホンからなる群から選択される、請求項２４に記載のインヒビター。３０．前記インヒビターが、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Asn-Leu-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Arg-Met-ビニルスルホン、Ｎ-(ニトロフェニルアセチル)-Gl u-Asn-Leu-ビニルスルホン、およびＮ-(ニトロフェニルアセチル)-Leu-Leu-Leu- ビニルスルホンからなる群から選択される、請求項２４に記載のインヒビター。３１．前記インヒビターが、哺乳動物細胞へのインビボまたはインビトロでの投与に適する薬学的調製物または治療的調製物として処方される、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載のインヒビター。３２．カテプシンＳによるインバリアント鎖のタンパク質分解を阻害するための医薬の製造における、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のインヒビターの使用。