JP2002507623A - 自己免疫病の治療のための哺乳類のアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤の用途 - Google Patents

自己免疫病の治療のための哺乳類のアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤の用途

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Abstract

(57)【要約】 免疫応答の調整を必要とする患者において免疫応答を調整する方法であって、有効な量のアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤を患者に投与することを含む方法。細胞のMHCクラスII分子によりタンパク質抗原のプロセシングを無効にする方法であって、前記細胞をアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤に接触させることを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素阻害、特に我々が発見しアスパラギンエンドペプチダーゼとよん
でいる酵素の阻害に関しており、免疫系によるプロセシング(processing)抗原、
特に微生物抗原(microbial antigens)に関与している。
【０００２】
【背景の技術】
タンパク質抗原への免疫応答は多くの個々の遺伝子産物に関係し、依然として
新しい遺伝子産物が発見されている。いくつかの場合において、遺伝子産物はそ
れ自体で知られていたが、免疫応答に関与するとは知られていなかった。
【０００３】 免疫応答は外来抗原(foreign antigens)、例えば微生物に関係する抗原に対し
て引き起こされ、あるいはこの免疫応答は自己抗原(自己免疫)により引き起こさ
れるかもしれない。いずれの場合においても、免疫系を調整するための方法と手
段を必要とし、そしてこれら外来及び自己抗原にどのように応答するかを知る必
要がある。
【０００４】 免疫系のT細胞が応答する前にタンパク質はタンパク質分解的にプロセスされ(
processed)(すなわち部分的に分解され)なければならないので、免疫応答に重要
なタンパク質のうちのワンセット(one set)はタンパク質分解酵素(プロテアーゼ
)である。典型的には、それはMHCクラスＩまたはクラスII分子の抗原提示細胞(a
ntigen presenting cells)によって提示される(are presented)タンパク質分解 されたタンパク質(すなわちタンパク質断片)である。
【０００５】 いくつかの異なるアスパラギン及びシステインプロテアーゼが不変鎖(invaria
nt chain)及び抗原プロセシングに関係すると思われている(例えば、フィネスキ
ー及びミラー(Fineschi & Miller) (1997) Trends Biochem. Sci. 22, 377-382;
及びチャップマン(Chapman) (1998) Curr. Op. Immunol. 10, 93-102を参照され
たい)。例えば、カテプシンSが不変鎖プロセシングの最終段階(stages)において
重要な役割を果たすという良好な証拠がある(例えば、リース(Riese) 等 (1996)
Immunity 4,357-366;及びビラダンゴス(Villadangos)等(1997)J.Exp.Med.186,54
9-560を参照されたい)。
【０００６】 WO 97/40066は、カテプシンSを阻害することによる免疫応答の抑制(suppressi
on)に関する。
【０００７】 驚くべきことに、我々はプロセシングタンパク質抗原に関与するさらなるプロ
テアーゼを発見している。その酵素はアスパラギンエンドペプチダーゼ(AEP)活 性を有し、技術が本明細書中に記載されるまで、免疫応答に関与するとは知られ
ていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
AEP活性を有する酵素は始めにレグメス(legumes)で検出され、“レグマイン(l
egumain)”と呼ばれた。AEP活性を有する酵素はまた、ヘモグロビン分解(ヘモグ
ロビナーゼ)に関係する血液吸虫類マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)で検
出されているが、最近ではcDNAもクローンされている哺乳類でも検出されている
(チェン(Chen)等(1997) J. Biol. Chem. 272, 8090-8096)。疑いを回避するため
、異なる名称が用いられる場合において、アスパラギンエンドペプチダーゼ活性
を有する動物酵素は可換的に(interchangeably)“アスパラギンエンドペプチダ ーゼ”，“AEP”，“レグマイン”または“ヘモグロビナーゼ”のように呼ばれ てもよい。ヒトのようないかなる特定の動物もアスパラギンエンドペプチダーゼ
活性を有する酵素を一つ以上保持するかもしれないし、本発明の文脈中において
、AEPの阻害剤が一つまたはそれ以上のAEPの形態を阻害するかもしれないという
ことが認識されるだろう。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の側面は、免疫応答の調整(modulation)を必要とする患者におけ
る免疫応答を調整する方法であって、有効な量のアスパラギンエンドペプチダー
ゼの阻害剤を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】 AEP活性を有する酵素はB細胞のリソソーム中に存在し、任意のタンパク質の分
解に関与していることがわかっている。それはタンパク質の断片であり、次のタ
ンパク質加水分解により産生され、クラスII MHC分子の表面に蓄積され(are loa
ded on)、そしてクラスII MHC分子により提示される。AEP活性の阻害はアスパラ
ギン含有タンパク質の分解を妨げ、本質的にはクラスII MHC分子含有の細胞のペ
プチドの蓄積(loading)及び提示(presentation)を阻害する(及び本質的にはT細 胞活性を阻害する)ことを示している。
【００１１】 さらに、いかなるペプチドも蓄積される前にタンパク質分解により除去されな
ければならないクラスII MHCのためのささげられた(dedicated)シャペロンであ るいわゆる“不変鎖”をAEPが分解できるということが示された(クレスウエル(C
resswell) (1996) Cell 84, 505)。不変鎖には通常p31及びp41として知られてい
る二つのどちらかのスプライスされた(spliced)型(forms)がある。AEPの阻害は 抗原ペプチドを結合するためのクラスII MHC分子の応答能(competency)を減少さ
せ(reduce)、そしてクラスII MHC分子による抗原ペプチドの提示を減少させると
信じられている。従って、AEPの阻害剤は免疫阻害剤になりやすい。
【００１２】 AEP活性を有する酵素は蛍光産物を放出する基質Z-アラニン(Ala)-アラニン(Al
a)-アスパラギン(Asn)-7-(4-メチル)クマリルアミド(coumarylamide)を容易に切
断でき、Zはベンジルオキシカルボニル(benzyloxy carbonyl)である。
【００１３】 「アスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤」は、いかなる適切な阻害剤も含
まれる。この阻害剤は競争阻害剤のような酵素阻害剤であってもよいし、または
非競争阻害剤であってもよい。この用語はまた、AEP遺伝子の転写またはAEP mRN
Aのプロセシングまたは翻訳を阻害する阻害剤のような、細胞中でAEPの活性形態
(an active form)を備える阻害剤を含んでいる。後述するように、適するそのよ
うな阻害剤はAEP選択的アンチセンス試薬(antisense agents)を含んでいる。
【００１４】 AEPはシステインプロテアーゼであり、また活性システイン残基に化学的に反 応する阻害剤が適切であり、典型的には不可逆性阻害剤である。ヒスチジンのよ
うな他のアミノ酸残基が活性部位に存在してもよいし、いかなる活性部位残基に
も反応する阻害剤が適切である。
【００１５】 本発明の一つの実施例において、AEP阻害剤は競争阻害剤である。典型的に、 競争阻害剤はアスパラギン含有ペプチドを含むペプチドである。適切なことに、
このペプチドは既知のAEP切断部位を含むペプチドであるが、AEPに対して親和性
があるために、他のAEP切断部位に競合でき、もし充分な濃度に存在するなら、 本質的には前記した他の切断部位で切断するのを防ぐ。破傷風毒素(tetanus tox
in)における既知のAEP切断部位はチェン(Chen) 等 (1997) J. Biol. Chem. 272,
8090-8098に記載されている。
【００１６】 本発明の好ましい実施例において、競争阻害剤は一般構造(X1)pN(X2)Qを有し 、X1及びX2はアミノ酸残基であり、Nはアスパラギン残基であり、Pは３〜６、Q は１〜３である。pX1残基のそれぞれは独立に選択され、qX2残基のそれぞれは独
立に選択される。
【００１７】 適することには、競争阻害剤はペプチド配列アラニン(Ala)-グルタミン酸(Glu
)-アスパラギン(Asn)-リジン(Lys)を含むペプチドまたは、あまりそれより少し 劣るけれども、リジン(Lys)-アスパラギン(Asn)-アスパラギン(Asn)-グルタミン
酸(Glu)である。好ましくは、前記競争阻害剤はN及びC末端が遮断された(blocke
d)ペプチド アラニン(Ala)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-リジン(Lys)
NH(AENK)または、それよりやや劣るけれども、リジン(Lys)-アスパラギン(Asn)-
アスパラギン(Asn)-グルタミン酸(Glu)-NH(KNNE)である。
【００１８】 言及され、そして実施例２に示されるように、クラスII MHC不変鎖はAEPの基 質である。不変鎖配列の検査により前述したアスパラギン残基のいずれにもAEP によりプロセスされることがわかる：p31及びp41イソ型(isoforms)の両方に見ら
れる71,76,131,148及び154(p31及びp41は二つのいずれかにスプライスされた不 変鎖の型である)、及びp41イソ型にのみ見られる217,219,238,244及び255。
【００１９】 ヒト不変鎖の配列は以下に示されている。p41特異領域には下線が引かれてい る。
【００２０】 HLA-DR-関連不変鎖のmRNA(及びコード化されたポリペプチド)の完全配列はス トルビン(Strubin) 等 (1984) EMBO J. 3, 869-872に記載されている。ヒトIa- 関連不変(ガンマ(gamma))鎖の構造はサリバン(O'Sullivan) 等 (1986) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 83, 4484-4488に記載されている。クドウ(Kudo) 等 (1985)
Nucl. Acids Res. 13, 8827-8841には、クラスII組織適合性抗原の不変ガンマ 鎖をコード化するヒト遺伝子の構造が記載されている。
【００２１】 競争阻害剤は例えばアスパラギン残基からのそれぞれの方向において二つまた
は三つの残基を含む配列に基づいてなされてもよい。従って、例えば、競争阻害
剤は不変鎖の残基69-73,68-74,74-78,73-79,129-133,128-134等を含む。実施例 ２に記載されているように、不変鎖のp31及びp41型はAEPにより切断される。
【００２２】 図７に不変鎖のAEPプロセシングを示す。
【００２３】 ペプチドはルー(Lu) 等 (1981) J. Org. Chem. 46, 3433及びそこに記載され ている参考文献に開示されているように、固相ペプチド合成のフモックポリアミ
ドモード(Fmoc-polyamide mode)により合成される。仮のN-アミノ基保護は9-フ ルオレニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)(フモック(
Fmoc))基により与えられる。N,N-ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンの使
用に、この高度な塩基不安定保護基(base-labile protecting group)の反復切断
は影響される。それらのブチルエステル(セリン、トレオニン及びチロシンの場 合)、ブチルエステル(グルタミン酸及びアスパラギン酸の場合)、ブチルオキシ カルボニル誘導体(リジン及びヒスチジンの場合)、トリチル誘導体(システイン の場合)及び4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル誘導体(アルギニ ンの場合)として側鎖官能性(Side-chain functionalities)は保護される。グル タミンまたはアスパラギンがC末端残基である場合、側鎖アミド官能性の保護の ために4,4'-ジメトキシベンジドリル(dimethoxybenzhydryl)基が用いられる。固
相支持体は、ジメチルアクリルアミド(バックボーンモノマー)、ビスアクリロイ
ルエチレンジアミン(クロスリンカー)及びアクリロイルサクロシンメチルエステ
ル(官能性試薬)の三つのポリマーから構成されるポリジメチルアクリルアミドポ
リマーに基づいている。
【００２４】 使用されたペプチド-樹脂切断可能な連鎖試薬(linked agent)は酸不安定(acid
-labile)4-ヒドロキシメチル-フェノキシ酢酸誘導体である。アスパラギン及び グルタミンを除く全てのアミノ酸誘導体は、カップリング工程(coupling proced
ure)が仲介される逆の(reversed)N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド／1-ヒド
ロキシベンゾトリアゾール(N,N-dicyclohexyl-carbodiimide/1-hydoroxybenzotr
iazole)を用いて加えられる先に作製された対称的な無水物(anhydride)誘導体と
して加えられる。全てのカップリング及び非保護(deprotection)反応はニンヒド
リン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイソチン(isotin)試験処置を使用し
て監視される。合成を完成する上で、ペプチドは５０％スカベンジャー混合物を
含む９５％トリフルオロ酢酸処理により側鎖保護基の付随除去に伴い、樹脂支持
体から切断される。一般に用いられるスカベンジャーはエタンジチオール、フェ
ノール、アニソール及び水であり、正しい選択は合成されるペプチドの成分アミ
ノ酸に依存する。トリフルオロ酢酸はインバキュオ(in vacuo)蒸発により除去さ
れ、次にジエチルエーテルでトリチュレーション(trituration)し、粗ペプチド(
crude peptide)を産生する。存在するいかなるスカベンジャーも簡単な抽出工程
により除去され、水相の凍結乾燥でスカベンジャーのない粗ペプチドを産生する
。ペプチド合成のための試薬はCalbiochem-Novabiochem (英国) Ltd, Nottingha
m NG7 2QJ, 英国から入手可能である。精製はサイズ排除クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー及び(原理的には)逆相高性能液体クロマトグラフ
ィーのいずれか一つ、またはこれらを組み合わせることによりもたらされる。ペ
プチドの解析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー
、酸加水分解後のアミノ酸解析を使用してかつ高速原子衝撃(FAB)質量分析解析 により実施される。
【００２５】 更なる実施例において、前記阻害剤は非競争または不可逆性阻害剤であっても
よい。AEP活性は全てのシステインプロテアーゼ及びいくつかのセリンプロテア ーゼを遮断する高濃度阻害剤により遮断される。しかしながら前記阻害剤はAEP に対して選択的であることが特に好ましい。非競争(不可逆性または共有結合(co
valent))阻害剤は競争阻害剤に比べより好ましい。
【００２６】 一般に不可逆性AEP阻害剤は、ペプチドアルデヒド(peptide aldehydes)、ペプ
チドハロメチルケトン(peptide halomethyl ketones)(特にペプチドクロロメチ ルケトン(peptide chloromethyl ketones)及びペプチドフルオロメチルケトン(p
eptide fluoromethyl ketones))、ペプチドジアゾメタン(peptide diazomethane
s)(ジアゾメチルケトン(diazomethyl ketones))またはペプチドビニルスルホン(
peptide vinyl sulphones)、ペプチド(アシルオキシ)メタン(peptide(acyloxy)m
ethanes)、ペプチドN,Oジアシルヒドロキサム酸(peptide N,O diacyl hydroxama
tes)、ペプチドニトリル(peptide nitriles)、ペプチドα-ケトカルボニル(pept
ide α-keto carbonyl)、ペプチドケトメチルスルホン酸塩(peptide ketomethyl
sulfonium salts)、ペプチドエポキシド(peptide epoxides)またはAEPと結合し 、かつ活性システイン残基または他の残基の活性部位で反応する反応基を有する
ペプチドのいずれであってもよい。
【００２７】 適することには、そのペプチド配列は活性部位システインに反応する基に付着
される(is attached)アスパラギン残基のようなC末端残基を有する。ペプチド阻
害剤におけるアスパラギン残基の位置(すなわち活性基の前のC末端)は切断部位 でのＰ１位置に類似する。
【００２８】 このように、一般には、AEP阻害剤は構造B1-(X)n-アスパラギン(Asn)-Qを有し
、B1は例えばアセチル(acetyl)またはベンジルオキシカルボニル(benzyloxycaar
bonyl)を含む適切なN-末端遮断基であり；Xはアミノ酸残基であり；nは１から１
００の間、好ましくは１から５０の間、より好ましくは１から１０の間及び典型
的には２〜６であり；アスパラギン(Asn)はアスパラギン残基であり、かつQは活
性部位システインまたは他のAEP活性部位残基と反応でき、かつ、好都合に、共 有結合複合体(covalent complex)を形成でき、それによって触媒活性を失う基で
ある。ペプチドXn-アスパラギン(Asn)のアミノ酸残基がL立体配置(configuratio
n)ならば好ましく、Xnアミノ酸残基がL-立体配置であろうとなかろうと、アスパ
ラギン(Asn)がL-立体配置であることが特に好ましい。アミノ酸残基Xは天然のア
ミノ酸残基であってもよいし、非天然(non-natural)側鎖を有する残基であって もよい。
【００２９】 C末端アスパラギン及び活性基の前のペプチド配列は好ましいどんなペプチド 配列であってもよいが、それは既知のAEP切断部位のある配列であると認識され るだろう。AEPの切断部位は、例えば、図７及び８に記載されている。
【００３０】 注目すべきこととして、AEPは不変鎖のp31及びp41イソ型両方を切断する。非 競争(または不可逆性)阻害剤は、切断されたアスパラギンの残基N-末端に基づい
て容易に設計される。前述したように、次のアスパラギン残基のいずれもAEPに よりプロセスされる(be processed)；p31及びp41両方にみられる71,76,131,148 及び151、及びp41イソ型にのみみられる217,219,238,244及び252。従って、アス
パラギン残基が、活性部位システインまたは他のAEP活性部位残基と反応でき、 好都合なことには、共有結合複合体を形成でき、それによって触媒活性を失う基
(Q)に連結するようなこれら特定の部位に対するアミノ酸残基N末端のいくつかを
含む非競争阻害剤であってもよい。従ってAEP阻害剤はB1-セリン(Ser)-グルタミ
ン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-ロイシン(Leu)-グルタミン酸(Glu)-アスパラ
ギン(Asn)-Q；B1-ロイシン(Leu)-グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-プ
ロリン(Pro)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-ロイシン(Leu)-リジ
ン(Lys)-アスパラギン(Asn)-Q(アスパラギン71,76,131,148及び154に対応)を含 む。
【００３１】 二つの好ましい阻害剤はB1-グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q及びB1-グ ルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-Qである。
【００３２】 他のAEP阻害剤はB1-アスパラギン酸(Asp)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(A
sn)-Q；B1-アスパラギン(Asn)-グリシン(Gly)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-フェニ
ルアラニン(Phe)-プロリン(Pro)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-バリン(Val)-プロリ
ン(Pro)-アスパラギン(Asn)-Q；及びB1-ヒスチジン(His)-ヒスチジン(His)-アス
パラギン(Asn)-Qを含む。これら阻害剤は番号217,219,238,244及び252それぞれ がつけられるp41のアスパラギン残基に関する。
【００３３】 関与しないタンパク質及びペプチドの他の切断部位は図８に示されている。こ
れらが上述したような適切な阻害剤を設計するのに用いられてもよい。
【００３４】 典型的には、ペプチドアルデヒド阻害剤はこの構造を有する； アセチル(または他の遮断基)-Xn-アスパラギン (Acetyl(or other blocking gro
up)-Xn-Asparaginal)) Xはアミノ酸残基であり、nは１から１００の間、好ましくは１から５０の間、よ
り好ましくは１から１０の間及び典型的には２〜６である。
【００３５】 好ましいペプチドアルデヒドはアセチル-アラニン-グルタミン-アスパラギン(
acetyl-alanyl-glutamyl-asparaginal)を含む。
【００３６】 エラスタチナル(Elastatinal)はAEP活性を遮断する；しかしながらC末端アミ ノ酸残基がアスパラギンで置換されたさらなる特異的変異体(a more specific v
ariant)も有効であるかもしれない。
【００３７】 図４はいくつかの有用な阻害剤の構造を示す。
【００３８】 典型的には、ペプチドクロロメチルケトン阻害剤はこの構造を有する。
【００３９】 アセチル(または他の遮断基)-Xn-アスパラギン(Asparaginyl)-クロロメチルケ
トン、X及びnは上述した通りである。
【００４０】 好ましいペプチドはアセチル-アラニン-グルタミン-アスパラギン-クロロメチ
ルケトン(acetyl-alanyl-glutamyl-asparaginyl-chloromethylketone)及びアセ チル-チロシン-バリン-アラニン-アスパラギン-クロロメチルケトン(acetyl-tyr
osyl-valyl-alanyl-asparaginyl-chloromethylketone)(ICEプロテアーゼ阻害剤Y
VAD-cmkに類似する)；さらなる詳細は図４を参照されたい。
【００４１】 典型的には、ペプチドフルオロメチルケトン阻害剤はクロロ基のフルオロ基へ
の置換を除いたペプチドクロロメチルケトン阻害剤に類似した構造を有する。
【００４２】 典型的には、ペプチドジアゾメタン阻害剤は構造 B1-(X)n-アスパラギン-ジアゾメタン (B1-(X)n-asparaginyl-diazomethane) を有し、B1はアセチルまたはベンジルオキシカルボニルを含む好ましい遮断基で
あり、X及びnは上述したとおりである。ペプチドのC末端のジアゾメタンは一般 構造R-C(O)CHN2を有し、Rはペプチドを示す。
【００４３】 好ましいペプチドはB1-アラニン-アスパラギン-ジアゾメタン(B1-alanyl-aspa
raginyl-diazomethane)またはB1-アラニン-グルタミン-アスパラギン-ジアゾメ タン(B1-alanyl-glutamyl-asparaginyl-diazomethane)を含む。
【００４４】 典型的には、ペプチドビニルスルホン阻害剤は構造 B1-(X)n-アスパラギン-ビニルスルホン-R (B1-(X)n-asparaginyl-vinyl sulphon
e-R) を有し、B1はアセチルまたはベンジルオキシカルボニルのようなN-末端遮断基で
あり、X及びnは上述したとおりであり、Rは好ましいアルキルまたはアリル終結(
terminating)基であり、かつC1〜C10アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル 等を含む。
【００４５】 好ましいペプチドはモルホリヌレア(morpholinurea)-ロイシン-アスパラギン-
ビニルスルホン-フェニル(morpholinurea-leucyl-asparaginyl-vinylsulphone-p
henyl)またはモルホリヌレア-アラニン-グルタミン-アスパラギン-ビニルスルホ
ン-フェニル(morpholinurea-alanyl-glutamyl-asparaginyl-vinylsulphone-phen
yl)を含む。
【００４６】 他の好ましいペプチドはペプチジル(アシルオキシ)メタン及びペプチジルN,O-
ジアシルヒドロキサム酸を含む。
【００４７】 例えば存在するアミノ酸残基の適所の適切な位置にアスパラギンを導入するこ
とにより、E-64(１-トランス-エポキシスクシニル-ロイシルアミド(４-グアニド
)-ブタン)(1-trans-epoxysuccinyl-leucylamide(4-guanido)-butane)、ロイペプ
チン(Leupeptin)(アセチル-ロイシン-ロイシン-アルギニン)(acetyl-leucyl-leu
cyl-arginal)、アンチペイン(antipain)([(S)-１-カルボキシ-２-フェニル]-カ ルバモイル-アルギニン-バリン(Val)-アルギニン)([(S)-1-carboxy-2-phenyl]-c
arbamoyl-Arg-Val-arginal)、エラスチナル(Elastinal)(N-[(S)-１-カルボキシ-
イソペンチル]-カルバモイル-α-(２-イミノヘキサヒドロ-４(S)-ピリミジル］-
L-グリシン-L-グルタミン-L-アラニン)(N-[(S)-1-carboxy-isopentyl]-carbamoy
l-α-(2-iminohexahydro-4(S)-pyrimidyl]-L-glycyl-L-glutaminyl-L-alaninal)
、TLCK(トシルリジルクロロメチルケトン)(tosyllysylchloromethylketone)及び
TPCK(トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン)(tosylphenylalanylchlorome
thylketone)のような他のシステインプロテアーゼ阻害剤に基づいてAEP阻害剤が
設計されてもよいことは前記した内容から認識されるだろう。
【００４８】 システインプロテアーゼのビニルスルホン阻害剤はパルマー(Palmer) 等 (199
5) J. Med. Chem. 38, 3193-3196に記載されている。システインプロテアーゼの
ペプチドアルデヒド阻害剤はトムソン(Thomson) Methods Enzymol. 46, 220-及 びビニツキー(Vinitsky) 等 (1994) J. Biol. Chem. 269, 29860-29866 639-648
に記載されている。システインプロテアーゼの阻害剤のようなペプチドジアゾメ
タンはショー(Shaw) (1994) Methods Enzymol. 244, 649-656及びショー及びグ リーン(Shaw & Green) (1981) Methods Enzymol. 80, 820-826に記載されている
。システインプロテアーゼの阻害剤のようなペプチド(アリルオキシ)メタンはク
ランツ(Krantz) (1994) Methods Enzymol. 244, 656-671に記載されている。シ ステインプロテアーゼの阻害剤のようなペプチドN,O-ジアリルヒドロキサム酸は
ブローメ及びデムス(Bromme & Demuth) (1994) Methods Enzymol. 244, 671-685
に記載されている。システインプロテアーゼの阻害剤のようなペプチドクロロメ
チルケトンはウイリアム及びマン(Williams & Mann) (1993) Methods Enzymol.
222, 503-513に記載されている。このように、適切な阻害剤を合成する方法は当
業者によく知られている。
【００４９】 前記阻害剤がクロロメチルケトン阻害剤またはフルオロメチルケトン阻害剤で
あるなら好ましい。前記阻害剤がビニルスルホン阻害剤ならばそれよりやや劣る
。チェン(Chen) 等 (1998) FEBS Letters 441, 361-365には、レグマイン(AEP) はプロテアーゼカスペイス(caspases)、クロストリペイン(clostripain)及びギ ンギペイン(gingipain)と同様な活性部位を有していることが示されている。ク ロストリペイン及びギンギペインがアルギニン(arginyl)及びリジン(Lysinyl)プ
ロテアーゼであるにもかかわらず、カスペイスはアスパラギン酸(Aspartate)特 異プロテアーゼである。AEP阻害剤は、アスパラギン酸(Aspartate)をアスパラギ
ンに置換することによるカスペイス阻害剤を修飾することで作製されてもよいし
、クロストリペインまたはギンギペイン阻害剤においてそれらはアルギニンまた
はリジンをアスパラギンに置換することで作製されてもよい。
【００５０】 他のシステインプロテアーゼに関する相似性により、例えば哺乳類細胞にみら
れるペプチド阻害剤または微生物にみられる阻害剤など天然のAEPの阻害剤が存 在する可能性はある。本発明の用途に関する阻害剤はこれら阻害剤を含んでいる
。
【００５１】 前記AEP阻害剤はAEPに対して選択的であることが好ましい。「選択的」とは、
アスパラギンエンドペプチダーゼ(asparaginyl endopeptidase)活性を有さない 別のシステインプロテアーゼよりAEPに対して前記阻害剤は少なくとも１０倍の 効力(potent)をもっていることを我々は意味している。
【００５２】 さらに好ましいことには、別のシステインプロテアーゼよりAEPに対して前記A
EP阻害剤は少なくとも１００倍、より好ましくは１０００倍、最も好ましくは１
００００倍の効力を有している。特に、前記阻害剤がカテプシンS及びLをほとん
ど阻害しない阻害剤なら好ましい。P2位置を占有する残基についてカテプシンS 及びLは特別であり、P2位置(すなわちアスパラギンの残基N末端)にアスパラギン
酸及びグルタミン酸残基を含む阻害剤はAEP阻害剤を産生するのに適しているが 、カテプシンL,S及びBの阻害剤には不都合である。カテプシンS及びLはP2位置に
チャージされない(uncharged)アミノ酸残基の優先物(preference)を有している 。(リソソームシステインプロテアーゼ, キルケ, バレット 及び ローリングス,
第二版, 1998, オックスフォード大学出版, オックスフォード(Lysosomal Cyst
ein Proteases,Kirschke,Barrett & Rawlings, Second Edition, 1998, Oxford
University Press, Oxford)を参照されたい)好ましいAEPの阻害剤はアラニン(Al
a)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)Qを含む阻害剤であり、Qは上述したよ
うに定義される。特に好ましい阻害剤はアラニン(Ala)-グルタミン酸(Glu)-アス
パラギン(Asn)-クロロメチルケトンまたはアラニン(Ala)-グルタミン酸(Glu)-ア
スパラギン(Asn)-フルオロメチルケトンを含む阻害剤である。
【００５３】 さらなる好ましい実施例において、AEPの阻害剤はAEP-選択的アンチセンス試 薬(antisense agent)であってもよい。
【００５４】 アンチセンス試薬は、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖核酸であり、相補的核酸配列に特異
的に結合できる。適切な標的配列に結合することにより、RNA-RNA、DNA-DNA、RN
A-DNA二重らせんが形成される。それらは遺伝子のセンスまたはコーディング鎖 に相補的であるので、これらの核酸はしばしば「アンチセンス(antisense)」と 名称づけられる。
【００５６】 最近、前記オリゴヌクレオチドがDNA二重らせんに結合する可能性があること から三重らせんの形成が証明されている。オリゴヌクレオチドはDNA二重らせん の主溝における配列を認識できることがわかった。三重らせんはそれによって形
成された。このことから、主溝水素結合部位(major groove hydrogen binding s
ites)の認識によって、特異的に二本鎖DNAに結合する配列特異性(sequence-spec
ific)分子を合成することができるということが推測される。
【００５７】 標的核酸への結合により、上述したオリゴヌクレオチドは標的核酸の機能を阻
害する。これは例えば転写、プロセシング、ポリ(A)付加、複製、翻訳を遮断す ること、またはRNA分解を促進することのような細胞の阻害メカニズムを促進す ることの結果である。
【００５８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは実験室で調整され、それから例えば、マイ
クロインジェクション(microinjection)または細胞培養培地から細胞へのアップ
テイク(uptake)により細胞に導入される。アンチセンス遺伝子を運搬するプラス
ミドまたはレトロウイルスまたは他のベクターでのトランスフェクション後、そ
れらは細胞にて発現する。ラウス肉腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ｉ型単
純ヘルペスウイルス、サルのウイルス及びインフルエンザウイルスの細胞培養に
おいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドはウイルス性(viral)複製または発現 を阻害することが最初に発見された。それ以来、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドによるｍRNA翻訳の阻害が、ウサギ網状赤血球溶菌液及びコムギ胚芽抽出物を 含む無細胞系において過度に研究されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド
によるウイルス性機能の阻害がAIDS HIVレトロウイルスRNAに相補的なオリゴヌ クレオチドを用いてインビトロに説明されている(グッドチャイルド, J.(Goodch
ild, J.) 1988 “アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるヒト免疫不全
ウイルス複製の阻害(Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Replicatio
n by Antisense Oligodeoxynucleotides)”, Proc. Natl. Acad. Sci.(米国) 85
(15), 5507-11)。グッドチャイルドの研究から、最も効率的なオリゴヌクレオチ
ドはポリ(A)シグナルに相補的だった；プライマー結合部位に近接したRNAの5'末
端、特にキャップ及び5'非翻訳領域及びプライマー結合部位を標的にしたオリゴ
ヌクレオチドもまた有効だったということが示された。キャップ、5'非翻訳領域
、及びポリ(A)シグナルはレトロウイルスRNA(R領域)の末端に繰り返される配列 に存在し、これらに相補的なオリゴヌクレオチドは前記RNAに２回(twice)結合す
るかもしれない。
【００５９】 オリゴヌクレオチドは細胞内因性(cellular endogenous)のヌクレアーゼによ り分解または不活性化されやすい。この問題を回避するため、修飾されたヌクレ
アーゼ、例えばインターヌクレオチド(internucleotide)連鎖(linkages)を変え ることを採用することができ、天然に起こるホスホジエステル連鎖は別の連鎖に
置き換えられる。例えば、アグラワル(Agrawal) 等 (1998) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 7079-7083はオリゴヌクレオチドホスホアミデート(phosphoramida
tes)及びホスホロチオエート(phosphorothioates)を用いるHIV-1の組織培養にお
いて阻害が増大することを示した。サリン(Sarin) 等 (1998) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 85, 7448-7451はオリゴヌクレオチドメチルリン酸を用いるHIV-1の 阻害が増大することを説明した。アグラワル(Agrawal) 等 (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86, 7790-7794はヌクレオチド配列特異性オリゴヌクレオチドホ
スホロチオエートを用いる初期感染及び慢性的に感染された細胞培養の両方にお
けるHIV-1複製の阻害を示した。リーザー(Leither) 等 (1990) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 87, 3430-3434はオリゴヌクレオチドホスホロチオエートによるイ ンフルエンザウイルスの組織培養における阻害を報告している。
【００６０】 人工連鎖(artificial linkages)を有するオリゴヌクレオチドはインビボの分 解に抵抗性があることが示されている。例えば、ショー(Shaw) 等 (1991) Nucle
ic Acids Res. 19, 747-750は任意のキャッピング(capping)構造により3'末端で
遮断される場合、他の非修飾オリゴヌクレオチドはインビボのヌクレアーゼによ
り抵抗的になり、キャップされない(uncapped)オリゴヌクレオチドホスホロチオ
エートはインビボで分解されないということを報告している。
【００６１】 Ｈ-ホスホネート(H-phosphonate)からオリゴヌクレオシドホスホロチオエート
合成への詳細な記載はアグラワル及びタング(Agrawal and Tang) (1990) Tetrah
edron Letters 31, 7541-7544に与えられており、これらに教えられていること は本明細書中に組み込まれる。オリゴヌクレオシドメチルホスホネート、ホスホ
ロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、架橋された(bri
dged)ホスホルアミデート及び架橋(bridge)ホスホロチオエートの合成は当技術 分野において知られている。例えば、アグラワル及びグッドチャイルド(Agrawal
and Goodchild) (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539; ニールセン(Nielsen)
等 (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; ジャガー(Jager) 等 (1988) Bioch
emistry 27, 7237; ユナンスキー(Uznanski) 等 (1987) Tetrahedron Letters 2
8, 3401; バンワース(Bannwarth) (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517; クロス
ティック及びバイル(Crosstick and Vyle) (1989) Tetrahedron Letters 30, 46
93; アグラワル(Agrawal) 等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-14
05を参照されたい。その教示は参考として本明細書中に組み込まれている。他の
合成または生成の方法もまた可能である。好ましい実施例において、リボ核酸(R
NA)配列が合成及び適用されるかもしれないが、前記オリゴヌクレオチドはデオ キシリボ核酸(DNA)である。
【００６２】 本発明において有用なオリゴヌクレオチドは好ましくは内因性のヌクレオリテ
ィック(nucleolytic)酵素による分解に抵抗するように設計される。オリゴヌク レオチドのインビボの分解は長さの減少したオリゴヌクレオチドブレイクダウン
(breakdown)産物を産生する。そのようなブレイクダウン産物は非特異的なハイ ブリダイゼーションにおいてより起こりやすく、全長(full-length)相当物に比 較してより有効的でない。従って、ボディー(body)に分解に対する抵抗性があり
、標的細胞に到達できるオリゴヌクレオチドを用いるのが望ましい。
【００６３】 本発明のオリゴヌクレオチドは、ネイティブ(native)ホスホジエステル連鎖に
関して一つまたはそれ以上の内部(internal)人工的インターヌクレオチド(inter
nucleotide)連鎖を置換する、例えば、連鎖中でリン酸(phosphate)をイオウに代
えることによりインビボの分解に対してより抵抗的にすることができる。用いら
れる連鎖の例は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフ
ェート、ケチル、ホスホロジチオエート、種々のホスホルアミデート、ホスフェ
ートエステル、架橋されたホスホロチオエート及び架橋されたホスホルアミデー
トを含む。他のインターヌクレオチド連鎖がこの技術において知られているので
あるから、そのような例は限定的であるというよりむしろ実例として考えられる
べきである。例えば、コーヘン(Cohen), (1990) Trends in Biotechnologyを参 照されたい。ホスホジエステルインターヌクレオチド連鎖に置換されたこれらの
連鎖の一つまたはそれ以上を有するオリゴヌクレオチドの合成は当技術において
よく知られ、インターヌクレオチド連鎖を混合するオリゴヌクレオチドを生成す
る合成経路を含んでいる。
【００６４】 オリゴヌクレオチドは、内因性の酵素による“キャッピング”または5'または
3'末端ヌクレオチドの類似基(similar groups)を取り込むことでエクステンショ
ン(extension)に対して抵抗性になりうる。キャッピングの試薬は商業的にAmino
-Link II(商標)としてApplied BioSystems Inc, Foster City, CAから入手可能 である。キャッピングの方法は、例えば、ショー(Shaw) 等 (1991) Nucleic Aci
ds Res.19,747-750及びアグラワル(Agrawal) 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
8(17), 7595-7599に記載され、これらの教示は本明細書中に組み込まれる。
【００６５】 参照として本明細書中に組み込まれるタング(Tang) 等 (1993) Nucl. Acids R
es. 21, 2729-2735に記載されているように、ヌクレアーゼの攻撃(attack)に抵 抗性のオリゴヌクレオチドを作製するさらなる方法はそれらにおいて“自己安定
化(self-stabilized)”することである。自己安定化されたオリゴヌクレオチド は3'末端にヘアピンループ構造を有し、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、DNAポリ メラーゼＩ及び胎児のウシの血清による分解に対して抵抗性を増大させることを
明らかにする。オリゴヌクレオチドの自己安定化された領域は相補的核酸へのハ
イブリダイゼーションを妨げず、マウスにおける薬物動態学及び安定性の研究か
ら、自己安定化されたオリゴヌクレオチドはインビボでの永続性をそれらの一次
相当物(linear counterparts)に関して増大させることがわかっている。
【００６６】 本発明によれば、アンチセンス化合物の有用性をインビボでの意図する遺伝子
座に限定し、少量が使用され、そして全身性効果(systemic effects)を最小化さ
せることにより、塩基対の特性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドの本来備
えている結合特異性が高まる。従って、望ましい効果を達成するようにオリゴヌ
クレオチドが局所的に適用される。このオリゴヌクレオチドが全身に投与された
場合より、望まれた遺伝子座でのオリゴヌクレオチドの濃度が高い。さらに、使
用総量をかなり低くすることによって治療効果(the therapeutic effect)を得る
ことができる。局所的に高濃度なオリゴヌクレオチドは標的細胞の浸透力を高め
、標的核酸配列の翻訳を有効に遮断する。
【００６７】 局所化されたドラッグの投与に対して適切ななんらかの手段により前記オリゴ
ヌクレオチドは遺伝子座に運搬される。例えば、前記オリゴヌクレオチドの溶液
は直接前記部位へ注入される、または注入ポンプを用いて浸剤により運搬される
。前記オリゴヌクレオチドはまた、所望の部位に置かれた場合にオリゴヌクレオ
チドがこれを取り囲んでいる遺伝子座に解放されるのを許容する移植可能な物質
(device)に組み込まれる。
【００６８】 前記オリゴヌクレオチドはヒドロゲル物質によって投与されてもよい。前記ヒ
ドロゲルは非炎症性及び生物分解性である。現在多くのそのような物質が知られ
ており、天然及び合成ポリマーからなる物質を含んでいる。好ましい実施例にお
いて、前記方法は、体温より低い状態では液体であって、体温付近では形状を保
持している(shape-retaining)半固体ヒドロゲルを形成するようにゲル化するヒ ドロゲルを開発する(exploits)。好ましいヒドロゲルはエチレンオキシドプロピ
レンオキシド反復単位のポリマーである。前記ポリマーの特性はポリマー自身の
分子量、及びポリマー中のポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシドの
相関割合に依存する。好ましいヒドロゲルは重量が約１０〜約８０％のエチレン
オキシドを含み、重量が約２０〜約９０％のプロピレンオキシドを含有する。特
に好ましいヒドロゲルは約７０％ポリエチレンオキシド及び３０％ポリプロピレ
ンオキシドを含有する。使用されうるヒドロゲルは例えば商標名プルロニック(P
luronicR)であって、BASF Corp., Parsippany, NJから入手可能である。
【００６９】 本実施例において、前記ヒドロゲルは液体状態で冷却され、前記オリゴヌクレ
オチドはヒドロゲル１ｇに対して約１ｍｇオリゴヌクレオチドの濃度の液体に混
合される。結果として起こる混合物はその後、例えば外科手術中のスプレーまた
はペインティング、またはカテーテルまたは内視鏡処置をすることにより処理さ
れる表面へ適用される。前記ポリマーが温まるに従い、ポリマーはゲルを形成す
るように凝固し、ゲルの正確な組成により定義される時間を過ぎると前記オリゴ
ヌクレオチドはゲルから周囲の細胞に拡散する。
【００７０】 リポソーム、ミクロカプセル及び移植可能な物質を含み商業的に入手可能であ
り、または科学文献に記載されている他の移植の手段により前記オリゴヌクレオ
チドは投与される。例えば、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル(polyortho
esters)、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれの共ポリマー(copolymers)、 コラーゲン、及びプロテインポリマーのような生物分解性の物質、またはエチレ
ンビニルアセテート(EVAc)、ポリビニルアセテート、エチレンビニルアルコール
、及びそれの派生物のような非生物分解性の物質により、局所的に前記オリゴヌ
クレオチドを運搬するための移植が行われる。溶融物または溶媒蒸発技術を使っ
て、または機械的に物質を混合して、重合化または凝固化されるような物質に前
記オリゴヌクレオチドを組み込むことができる。一つの実施例において、シリカ
ビーズ(silica beads)、ステント(stents)、またはカテーテル被覆されたデキス
トランのような移植可能な物質のコーティングに前記オリゴヌクレオチドは混合
または適用される。
【００７１】 オリゴヌクレオチドの用量はそのオリゴヌクレオチドのサイズ及び投与される
目的に依存する。一般に、用量範囲は取り扱われる組織の表面積に基づいて算出
される。有効なオリゴヌクレオチド用量はそのオリゴヌクレオチドの長さ及び化
学的組成にやや依存するが、一般的に組織表面積の平方センチメートル当たり約
３０〜３０００μｇの範囲である。
【００７２】 前記オリゴヌクレオチドは治療及び予防の両方を目的として患者に全身的に投
与されてもよい。前記オリゴヌクレオチドはいずれかの有効な方法、例えば非経
口的に(例えば静脈的、皮下的、筋肉内的に)または経口的、鼻腔的または前記オ
リゴヌクレオチドが患者の血流に進入し循環するのを許容する別の手段により投
与されてもよい。全身に投与されるオリゴヌクレオチドはなるべく局所的に投与
されたオリゴヌクレオチドに加えて与えられるが、局所的投与でない場合にも有
用性がある。目的を果たすためには、成人への投与に対して約０．１〜約１０グ
ラムの範囲の用量が一般に効果的だろう。
【００７３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなAEP選択性アンチセンス試薬は、例 えば本明細書に組み込まれているチェン(Chen) 等 (1997) J. Biol. Chem. 272,
8090-8098に記載されているAEPをコードするcDNAを参考にすることで当業者に より設計及び作製される。一つ以上のAEP遺伝子が存在し、またはAEP遺伝子によ
り一つ以上のAEP転写物が生成されることが認識されるだろう。典型的には、前 記アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１０塩基、より好ましくは、少
なくとも１５塩基を有する。典型的には、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド
は１８〜２０塩基ぐらいである。AEP遺伝子またはmRNA転写物のいずれかの領域 に相補的であるオリゴヌクレオチドが設計及び作製されてもよいが、好ましい実
施例において、前記オリゴヌクレオチドは翻訳開始シグナルを含む、またはAEP ポリペプチドのN-末端をコードするmRNAの領域に対応するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドである。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的にされ
るAEP mRNAにおける部位が、mRNAの二次構造が予期されない及びタンパク質が結
合するか予期されないような部位であるなら好ましい。
【００７４】 有効になるためにAEP-阻害アンチセンス試薬がAEP遺伝子またはmRNAに完全に 相補的である必要はない。むしろ、アンチセンスオリゴヌクレオチドが充分な長
さなら、ミスマッチ(mismatches)はいくらか受け入れられる。生理的状況下でAE
P転写物に選択的にハイブリダイズするために、このオリゴヌクレオチドは充分 な長さと相補性を有するべきである。好ましくは、ミスマッチは無いまたは最小
限である。
【００７５】 AEP阻害剤は、患者への投与後、患者の適切な部位で適切にAEPに接触し阻害す
ることができる。AEP阻害剤は細胞パーミアント(permeant)であることが望まし いが、エンドサイトーシス(endocytosis)により適切な細胞に取り込まれるかも しれないので、ノンパーミアント(non-permeant)AEP阻害剤が有用であるかもし れないと信じられる。
【００７６】 AEP阻害剤の「有効量」は、患者において臨床的に有用な範囲で免疫応答を調 整するのに有効な量である。
【００７７】 クラスII MHC分子に蓄積されかつそれによって提示されるように運命づけられ
るタンパク質抗原のプロセシングにAEPは関与すると信じられている。本発明の 好ましい実施例において、扱われる患者はMHCクラスII分子に関係する病気をも つ、またはそれにかかる危険がある。本発明に関係する理論により制限はしない
が、AEPはアスパラギン残基でのグリコシル化により正常に隠される部位を認識 及び切断するので、AEPは自己免疫病に重要な役割を果たすかもしれないと我々 は信じている。アスパラギン残基でのグリコシル化は哺乳類タンパク質において
普通であり、グリコシル化されたアスパラギン残基はAEPにより切断されない。 自己タンパク質(self Protein)のアスパラギングリコシル化における異常還元(r
eduction)は潜在性(cryptic)部位でのAEP切断に対する感受性を誘発し、それゆ え、異常にグリコシル化されたタンパク質から合成されるペプチドはクラスII M
HC分子による免疫系への蓄積及び提示に対して感受性になる。破傷風毒素のよう
な細菌タンパク質は典型的にはアスパラギンがグリコシル化されないので、もし
適切なアスパラギン残基を含むなら、AEPによる分解およびクラスII MHC分子に 関する提示いずれの場合に対して感受性である。
【００７８】 不変鎖に結合したままのクラスII MHC分子は他のペプチドに結合できない。そ
れゆえに、AEPの阻害は抗原ペプチドを結合するクラスII MHC分子の応答能を減 少させ(reduce)、クラスII MHC分子による抗原ペプチドの提示を減少させる(red
uces)。
【００７９】 好ましくは、前記病気は自己免疫病であり、扱われる患者が慢性関節リウマチ
、インスリン依存性真性糖尿病、多発硬化、橋本甲状腺炎、小児脂肪便症、重症
筋無力症、尋常性天疱瘡、全身性エリテマトーデス及びグレーブス病のような自
己免疫病を有するまたはこれにかかる危険があるなら特に好ましい。
【００８０】 本発明のさらなる好ましい実施例において、AEPの阻害剤が投与される患者は アレルギー性反応を有するまたはこれにかかる危険があり、または移植片拒絶が
起こるかもしれない器官(organ)または組織(tissue)または細胞(cell)移植組織(
transplant)を受けているまたは受けることになっている患者である。
【００８１】 いくつかのアレルギー及び過敏性反応は、吸い込まれる、摂取されるまたは接
触される無害な環境抗原(environmental antigens)に対して望ましくない応答を
伴う。いくつかの場合において、関連する抗原が知られている。そしてCD4 T細 胞がクラスII MHC／ペプチド複合体により活性化されるのと同じ程度に、AEP阻 害剤によるこれら抗原のプロセシングを阻害することはアレルギー性または過敏
性反応を引き起こすT細胞に対するこれら抗原の提示を遮断するまたは減少させ ると信じられている。
【００８２】 典型的アレルギーは以下のものを含んでいる：
【００８３】 草及び樹木花粉、ごみ-ダニ排泄物、猫／犬の毛などにより引き起こされるア レルギー性鼻炎(枯草菌)及びアレルギー性喘息；金属(ニッケル、コバルト、銅 、パラジウム)、ペンタデカカテコール(毒ツタ)またはミツバチの毒液により引 き起こされる接触過敏性反応；貝、牛乳、卵、小麦に対する食物アレルギー；及
び例えばペニシリン、アスピリンに対するドラッグアレルギー。
【００８４】 従って本発明のAEP阻害剤はアレルギー、及び、アレルギー性及び過敏性反応 の処置に有用である。上述したこれらアレルギー及び過敏性反応に加えて、本明
細書に記載されているAEP阻害剤は次のいずれかに関与するアレルギー性または 過敏性状況の処置に有用である。：ネコの皮膚及び飼いネコのフェリスドメステ
ィカス(Felis domesticus)の唾液腺アレルゲン(アミノ酸配列はWO 91/06571に開
示されている)、ハウスダストマイトダーマトファゴイデス(the house dust mit
e dermatophagoides)からの主タンパク質アレルゲン(WO 94/24281に開示されて いるアミノ酸配列)及び次のいずれかに存在するアレルゲン：草、樹木及び雑草(
ブタクサを含む)花粉；菌及びカビ；食物、例えば魚、貝、カニ、ロブスター、 ピーナッツ、ナッツ、卵及び牛乳；針を刺す昆虫、例えばミツバチ、スズメバチ
及びクマンバチ及びキロノミダエ(chironomidae)(刺さない蚊)；クモ及びダニ；
イヌ、ウマ、ラット、ギニアブタ、マウス及びガービル(gerbil)；ラテックス；
生物学的デタージェント添加剤；ドラッグ、例えばペニシリン及び他の抗生物質
及びアネスティック試薬(anaesthetic agents)。
【００８５】 昆虫タンパク質に対するアレルギーはハウスフライ(house fly)、フルーツフ ライ(fruit fly)、シープブローフライ(sheep blow fly)、スクリューワームフ ライ(screw worm fly)、穀物のゾウムシ、蚕、ミツバチ、針を刺さない蚊の幼虫
、ミツバチ ガ 幼虫、ミールワーム(meal worm)、ゴキブリ及びテニブリオモ リタービートル(Tenibrio molitor beetle)の幼虫由来のタンパク質から発生す る。これら昆虫アレルギーの全部が作業場から生じるアレルギー性問題に特に関
連性がある。
【００８６】 AEP阻害剤はそれ自身で用いられてもよいし、またはこの技術分野で知られて いるアレルギー性または過敏性状況の処置の他の形態とともに投与されてもよい
ということが認識されるであろう。
【００８７】 同種異系移植(個々は異なるが、同種由来)または異種移植(異種)は、供与者(t
he donor)と受容者(the recipient)との間のMHC遺伝子の遺伝子座の違いからよ く拒絶される。免疫抑制剤が養生する(regimes)ように、MHCマッチング(matchin
g)は移植体を受容する機会を与える。本明細書に記載されているAEPの阻害剤を 用いるクラスII MHC分子のペプチド提示における遮断及び還元(reduction)は、 免疫抑制に有用であり、またシクロスポリン(cyclosporin)及びFK506のようなT 細胞活性のサプレッサーの代わりに、またはこれと一緒に行われてもよい。
【００８８】 付随する免疫抑制方法から有益になるであろう組織及び器官移植体は腎臓、肺
、心臓、角膜及び骨髄を含んでいる。器官及び宿主両方の先の処置は有益になる
かもしれない。
【００８９】 AEP阻害剤はそれ自身で用いられてもよいし、あるいは上述したような阻害剤 、またはAEP阻害剤の混合物、または例えば後述するようなカテプシンSの阻害剤
とAEP阻害剤の混合物のような免疫抑制の他の形態とともに投与されてもよいと いうことが認識されるだろう。
【００９０】 本発明及びそれの調整に用いる前述した阻害剤は経口、非経口(例えば、皮下 のまたは筋肉内の)局所的の注入等を含む便利な方法により投与されてもよい。 その処置(The treatment)は一回で投与されてもよいし、またある期間に複数回 投与されてもよい。
【００９１】 本発明の用途に関する阻害剤が単独で投与されることは可能であるが、一つま
たはそれ以上の受入可能なキャリア(carriers)と一緒に薬学製剤として存在する
ことが好ましい。本発明の化合物に適合し、それの移植宿主に対して有害でない
という意味において、キャリアは「受入可能(acceptable)」でなければならない
。典型的には、キャリアは無菌かつ発熱物質がない(pyrogen free)水または塩類
溶液だろう。
【００９２】 製剤は好都合なことにユニット投薬形態で存在してもよいし、薬学的手法にお
いてよく知られるなんらかの方法により行われてもよい。そのような方法は、活
性成分(AEPの阻害剤)の一つまたはそれ以上の補助的成分を構成するキャリアへ の関連性を導き出す工程を含んでいる。一般に、一様及び精密に活性成分を液体
キャリアまたは細かく分割された固体キャリアまたはその両方に会合させ(bring
ing into association)、その後もし必要ならば生成物を形成することによって 製剤が調整される。
【００９３】 経口投与に適する本発明に従う製剤は、それぞれが予定された活性成分量を含
有するカプセル、カシェ剤またはタブレットのような別々のユニットとして；パ
ウダーまたは顆粒として；水の液体または水でない液体における溶液または懸濁
液として；またはオイル-イン-水(oil-in-water)乳濁液または水-イン-オイル(w
ater-in-oil)液体乳濁液として提示されてもよい。活性成分は巨丸、舐剤または
ペーストとして提示されてもよい。
【００９４】 タブレットは任意に一つまたはそれ以上の補助的な成分とともに、圧縮または
成形されて作製されてもよい。圧縮されたタブレットは適する機械で圧縮されて
、バインダー(binder)(例えばポビドン(povidon)、ゲラチン(gelatin)、ヒドロ キシプロピルメチルセルロース(hydroxypropylmethyl cellulose))、滑剤、非活
性希釈剤、防腐薬、分解性(例えばスターチグリコール酸塩(sodium starch glyc
olate)、架橋された(cross-linked)ポピドン、架橋されたカルボキシセルロース
塩(sodium carboxymethyl cellulose))、表面活性または分解性試薬に任意に混 合されたパウダー及び顆粒のようなフリーフロイング(free-flowing)形態の活性
成分を圧縮することにより調製されてもよい。成形されたタブレットは適する機
械で非活性希釈剤で湿らせたパウダー化された化合物の混合物を成形することに
より作製されてもよい。このタブレットは任意に被覆またはスコア(scored)され
てもよいし、例えば、所望の放出プロフィールを提供する様々な特性を有するヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースを用い、そこにある活性成分の遅いまたは制
御された放出を提供するように調合されてもよい。
【００９５】 局所的な経口投与に適する製剤は、フレーバー(flavoured)基剤、普通スクロ ース及びアカシア(acacia)またはトラガカントにおける活性成分を含むロゼンジ
；ゼラチン及びグリシン、またはスクロース及びアカシアのような非活性基剤に
おける活性成分を含むサブロー錠剤；及び適切な液体キャリアにおける活性成分
を含む口内洗浄液を含んでいる。
【００９６】 非経口投与に適する製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び製剤等張性(formu
lation isotonic)を意図した供与者血液に与える溶質(solutes)を含有する水系 及び非水系無菌注入溶液；及び沈殿防止剤及びシックニング(thickening)試薬を
含有する水系及び非水系無菌懸濁液を含んでいる。この製剤は、ユニット-用量(
unit-dose)及びマルチ-用量(multi-dose)容器、例えばシールされた(sealed)ア ンプル及びバイアルに存在し、無菌の液体キャリア、例えば使用直前の注入用の
水の付加のみが必要とされる凍結-乾燥された(凍結乾燥された)状態に保存され る。即時注入溶液及び懸濁液は、無菌のパウダー、顆粒及び前述した種類のタブ
レットから調合されてもよい。
【００９７】 好ましいユニット投薬製剤は、活性成分の日用量またはユニット、日副用量ま
たはそれの適切なフラクション(fraction)を含む製剤である。
【００９８】 特に前述した前記成分に加えて、本発明の製剤は当の製剤型に関する技術にお
ける従来の他の試薬を含んでもよく、例えば経口投与に適する試薬にフレーバー
試薬を含んでもよいということが理解されるべきである。
【００９９】 本発明の薬学的組成はさらに、免疫応答の調整を必要とする患者に有用に投与
される試薬をさらに含むということが認識されるだろう。例えば、その組成は自
己免疫病またはアレルギー性または過敏性反応の治療または予防または改善のた
めの試薬をさらに含んでいる。さらなる例として、前記組成はシクロスポリンま
たはFK506のような免疫抑制剤を含んでいる。
【０１００】 もしAEP阻害剤が病気の部位または部位付近に投与されるなら特に好ましい。 例えば、慢性関節リウマチの治療においてAEP阻害剤が関与する関節またはその 付近に投与されるのが望ましい。この場合、AEP阻害剤は局所施用(topical appl
ication)により投与されてもよい。
【０１０１】 本発明のさらなる側面によれば、免疫応答の調整を必要とする患者において免
疫応答を調整するための薬剤の製造においてアスパラギンエンドペプチダーゼ阻
害剤の用途を提供する。
【０１０２】 本発明のまたさらなる側面によれば、免疫応答の調整を必要とする患者におい
て免疫応答を調整するためのアスパラギンエンドペプチダーゼ阻害剤の用途を提
供する。
【０１０３】 本発明のまたさらなる側面によれば、AEPの阻害剤及び薬学的に受入可能なキ ャリアを有する薬剤及び薬学的組成の用途に関するアスパラギンエンドペプチダ
ーゼ阻害剤を提供する。
【０１０４】 (本明細書の最初に記載されているような)AEPに加えて、他の二種類のプロテ アーゼがクラスII MHC経路に関与している。これらはシステインプロテアーゼの
パパイン属(カテプシンS，L，B及びH)及びアスパラギン酸属(カテプシンD及びE)
である。
【０１０５】 カテプシンL，D及びBノックアウトマウスの最近の結果から、少なくとも抗原 提示細胞周辺において、それらは主要な効果を有していないということがすいそ
くされる。これにより好ましい重複性がある、またはこれら酵素は本当は重要な
タンパク質でないということのどちらかであることが推測される。本明細書に記
載されている結果から、AEPはクラスII MHC抗原プロセシングにおいて重要な酵 素であることがわかり、単独で用いられる場合のAEP阻害剤は有用になることが 意図される。しかしながら、いくつかの状況において、患者に投与する、または
薬学製剤または治療システム(パーツキット(kit of parts))においてAEP阻害剤 とクラスII MHC経路に関与する他の酵素の一つまたはそれ以上の阻害剤とを組み
合わせる (combine)ことが望ましい。特に、カテプシンSは不変鎖プロセシング において重要な酵素になるので(例えば、WO 97/40066を参照されたい)、カテプ シンS阻害剤とAEP阻害剤との組み合わせ(combination)は特に有用になると信じ られている。
【０１０６】 従って、本明細書に開示されているAEP阻害剤とカテプシンDまたはカテプシン
Eとの組み合わせが意図される。カテプシンD及びカテプシンEのようなアスパラ ギン酸酵素の既知の阻害剤は、例えば、ペプスタチン(pepstatin)及びCGP 53437
を含んでいる(Ciba-Geigy; アルテリ(Alteri) 等 (1993) Antimic. Ag. Chemoth
erapy 37, 2087-を参照されたい)。
【０１０７】 同様に、AEP阻害剤とリソソーム(Lysosomal)システインプロテアーゼ阻害剤( すなわちカテプシンS，L，B及びHの阻害剤)との組み合わせが意図される。広範 囲の特異性を有するこれら酵素の阻害剤はロイペプチン(leupeptin)及びエポキ シド化合物E64またはE64Dを含んでいる。しかしながら、カテプシンS阻害剤(特 に、カテプシンS-選択性または特異性阻害剤)は特に有利にAEP阻害剤と組み合わ
せられることが意図される。カテプシンS阻害剤はWO 97/40066に詳細に記載され
ており、参照として本明細書に全て組み込まれている。特に、次に示すカテプシ
ンS阻害剤はAEP阻害剤との組み合わせに有用であると信じられている：モルホリ
ノ-ロイシン-ホモフェニルアラニン-ビニルスルホン(morpholino-Leu-homopheny
lalanine-vinyl sulphone)；種々のN-末端遮断基を有するロイシン-ロイシン-ロ
イシン-ビニルスルホン(Leu-Leu-Leu-vinyl sulphone)；カテプシンSにより切断
される不変鎖切断部位に基づくビニルスルホン(vinyl sulphone)。
【０１０８】 AEP及びカテプシンS両方を標的にした不変鎖に基づく(invariant chain-based
)阻害剤の組み合わせが用いられるなら好ましい。本明細書に開示されているAEP
阻害剤に関する参考文献及びWO 97/40066に記載されている不変鎖に基づくカテ プシンS阻害剤に関する参考文献により当業者はそのような阻害剤の組み合わせ を容易に実施することができる。そのような組み合わせの実施例はB1-グルタミ ン酸-アスパラギン-ロイシン-ビニルスルホン(B1-Glu-Asn-Leu-vinyl sulphone)
及び／またはB1-ロイシン-アルギニン-メチオニン-ビニルスルホン(B1-Leu-Arg-
Met-vinyl sulphone) (カテプシンSを遮断する)加えてB1-セリン-グルタミン-ア
スパラギン(B1-Ser-Gln-Asn)；B1-ロイシン-グルタミン酸-アスパラギン(B1-Leu
-Glu-Asn)；B1-ロイシン-グルタミン-アスパラギン(B1-Leu-Gln-Asn)；B1-プロ リン-グルタミン酸-アスパラギン(B1-Pro-Glu-Asn)；及びB1-ロイシン-リジン- アスパラギン(B1-Leu-Lys-Asn)、(アスパラギン残基を経由して付着される)ビニ
ルスルホンのような全てのもののうちの一つまたはそれ以上を含んでいるが、こ
れに限定されるものではない。
【０１０９】 反応基としてのビニルスルホンに代わるものとしては、上述した(“Q”)反応 基のいずれが阻害剤に用いられてもよい。
【０１１０】 他の好ましい組み合わせは、競争阻害剤(本明細書に開示されているようなAEP
及びWO 97/40066に記載されているようなカテプシンSの)に基づく不変鎖配列； 及びいずれのカテプシンS阻害剤との組み合わせにおいて不変鎖に基づかないAEP
阻害剤として本明細書に開示されている化合物を含んでいる。
【０１１１】 本発明はまた、細胞のMHCクラスII分子によるタンパク質抗原のプロセシング を減少させる(reducing)方法であって、細胞がアスパラギンエンドペプチダーゼ
の阻害剤に接触する(contacting)ことを含む方法を提供する。
【０１１２】 本発明の一つの実施例において、樹枝状細胞またはマクロファージまたはBリ ンパ球のような適切な抗原提示細胞(APC)はcDNAsのプール(pool)にトランスフェ
クションされる(またはcDNAsのプールから発現されるタンパク質に接触される) 。cDNAsのプールはT細胞を活性化し、かつ自己免疫病に関連するタンパク質をコ
ードするcDNAを含むと信じられている。T細胞を活性化するタンパク質をコード するcDNAが選択され、推定の自己免疫タンパク質をコードする。病気にAEPプロ セシングが関与するかを決定するため、また自己-抗原免疫応答において重要に なる潜在性(cryptic)アスパラギングリコシル化部位を決定するために、AEP阻害
が存在及び不在の状態でアッセイが行われる。従って、T細胞は推定の自己抗原 のcDNAが発現され提示されるかどうか、及びAEP阻害剤がこれになんらかの影響 を及ぼすかどうかを“読み出す(read out)”のに用いられる。
【０１１３】 本発明のさらなる側面は、クラスII MHC抗原プロセシングを調整する化合物を
同定する方法であって、アスパラギンエンドペプチダーゼに関する試験化合物に
接触すること及びその活性を減少させる(reduces)化合物を選択することを含む 方法を提供する。
【０１１４】 本発明のこの方法(またはスクリーニングアッセイ)は多くの試験化合物が９６
-ウエルプレート形式(a 96-well plate format)のように同時に選抜される(scre
ened)のを許容する形式(format)で適切に実施される。AEPの活性はなんらかの適
する基質を用い従来通りに測定されるが、基質はAEPによる切断に関して、容易 に検出可能な産物を生ずるものであれば好ましい。例えば、産物は有色されたり
、または蛍光を発したりまたはいくつか他の方法で検出可能である。産物は蛍光
を発するなら特に好ましい。；好ましい基質はZ-アラニン-アラニン-アスパラギ
ン-７-(４-メチル)クマリルアミド(Z-Ala-Ala-Asn-7-(4-methyl)coumarylamide)
である。
【０１１５】 この試験化合物は好ましくは試験化合物のライブラリー由来の化合物である。
この化合物は合成化学方法(組み合わせ化学方法(combinatorial chemistry meth
ods)のような)によって作製されるものでもよいし、自然に発生する化合物であ ってもよい。普通に選抜されうる(いかなる適切な化合物をも含む)化合物型に対
する偏見が無ければ、多くのAEP阻害剤はペプチドまたはペプチド様(peptide-li
ke)構造を有するだろうと信じられている。従って、試験化合物がペプチドまた はペプチド様構造を有するなら好ましい。
【０１１６】 前記方法またはスクリーニングアッセイはまた、非特異性阻害剤化合物を削除
したり、またはAEPは阻害するがAEP活性を有さない他のシステインプロテアーゼ
は実質的に阻害しないこれら阻害剤を積極的に選択する工程を含んでいることが
認識されるだろう。
【０１１７】 本発明の好ましい実施例において、AEPの活性を減少させることができると同 定されるいかなる試験化合物は、適する細胞におけるクラスII MHC分子の蓄積及
び提示に影響を与える能力の評価を含む第二のスクリーニング工程のために選択
される。
【０１１８】 従って、好ましくは、この第二の工程は前記化合物に適するクラスII MHC分子
を含有する細胞のペプチドの蓄積及び提示を阻害する能力が本質的にあるかどう
かを決定するものである。これを決定する便利な方法は、化合物に適するクラス
II MHC分子を含有する細胞によるT細胞活性を本質的に阻害する能力があるかど うかを評価することである。これは実施例に記載されているように実施される。
【０１１９】 本発明のさらなる側面は、アスパラギンエンドペプチダーゼをコードする遺伝
子が形成される非ヒト(non-human)トランスジェニック(transgenic)動物を含み 、かつ前記動物は前記遺伝子から本質的にはアスパラギンエンドペプチダーゼを
発現しない。
【０１２０】 「トランスジェニック」動物には、遺伝子の全部または一部が“ノックアウト
(knocked out)”され、またはさもなければ本質的にはアスパラギンエンドペプ チダーゼを発現する能力がない動物が明確に含まれる。適するマウスは、例えば
、当技術においてよく知られているような胚ステム(embryonic stem)(ES)細胞の
遺伝子操作に関与する標準的方法を用いて作製されうる。AEPをコードするcDNA はチェン(Chen) 等 (1997) J. Biol. Chem. 272, 8090-8096に記載され、この情
報が本発明のトランスジェニック動物の設計及び作製に用いられてもよい。
【０１２１】 非ヒト動物がマウスなら特に好ましいが、ラット、ラビット等を含むいずれの
適切な非ヒト動物であってもよい。
【０１２２】 本発明の好ましい実施例において、AEP遺伝子から実質的にAEPを発現しない非
ヒトトランスジェニック動物は、自発的またはタンパク質抗原の投与のいずれか
により動物が自己免疫病にかかりやすくなる遺伝的バックグラウンド(backgroun
d)を含んでいる。適切な遺伝的バックグラウンドを有する動物、特にマウスは、
例えば糖尿病のモデルとなるNODマウス、アレルギー性脳脊髄炎のモデルになるE
AE(実験的自己免疫脳脊髄炎)マウス及びコラーゲン誘導性関節炎のモデルとなる
CIAマウスがよく知られている。モデル病気EAEに使用されるマウスは、MHCハプ ロタイプ(haplotypes)H-2uまたはH-2k(例えばPL/JまたはB10.PL株)である。モデ
ル病気CIAに使用されるマウスは、MHCハプロタイプH-2q(例えばDBA/1J株)である
。そのようなマウスはカントルナ(Cantorna) 等 (1998) J. Nutr. 128, 68-72;
キアオ及びリンク(Xiao & Link) (1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 85, 11
9-128; 及びクーマー(Kumar) 等 (1997) J. Exp. Med. 185, 1725-1733に記載、
または参照されたい。
【０１２３】 代わりになるべきものとして、前記動物はヒトを自己免疫病にかかりやすくす
るヒトクラスII MHC分子に関してトランスジェニックだろう。
【０１２４】 好ましいさらなる実施例において、実質的にはAEP遺伝子からAEPを発現しない
非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトクラスII MHC分子に対してさらにトラン
スジェニックであり、CD4に対してもさらに任意にトランスジェニックである。 これらのさらなる特性をもつマウスはアルトマン(Altmann) 等 (1995) J. Exp.
Med. 181, 867-875;ヤマモト(Yamamoto)等(1994) J. Ex. Med. 180, 165-171; 及びウッズ(Woods) 等 (1994) J. Exp. Med. 180, 173-181に記載されている。
【０１２５】 特性の組み合わせた非ヒト動物は、適した動物を交差する(crossing)ことによ
り作製されうることが認識されるだろう。従って、本発明の好ましい実施例の動
物は適した動物を交差することにより作製されてもよい。
【０１２６】 前述した内容から新しいAEP阻害剤が開示されることが認識されるだろう。
【０１２７】 本発明のさらなる側面は、構造B1-(Xa-Xn)-アスパラギン(Asn)-Qを有するアス
パラギンエンドペプチダーゼを提供し、B1はいずれかの適したN末端遮断基であ り；Xa-XnはクラスII MHC分子の不変鎖におけるアスパラギン切断部位に近接す るN末端のnアミノ酸残基であり；アスパアラギン(Asn)はアスパラギン残基であ り；及びQはアスパラギンエンドペプチダーゼの活性部位に反応可能な基である 。
【０１２８】 適した遮断基、アミノ酸、及びAEPの活性部位に反応可能な基は本明細書の前 半に開示したものと同様である。AEPの活性部位に反応可能な基が活性部位シス テイン残基に反応できるなら好ましい。
【０１２９】 不変鎖の配列及び前半に記載したようなアスパラギン残基番号を参照すること
により、アスパラギン切断部位に対するnアミノ酸残基N末端は容易に決定できる
。典型的にはアミノ酸残基番号は１から２５の間である；好ましくは２から１０
の間；より好ましくは２から５の間である。
【０１３０】 好ましい阻害剤は、Qは先に定義したような反応基であり、B1は先に定義した ようなN末端遮断基であるB1-セリン(Ser)-グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-
Q；B1-ロイシン(Leu)-グルタミン酸Glu)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-ロイシン(Le
u)-グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-プロリン(Pro)-グルタミン酸(Gl
u)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-ロイシン(Leu)-リジン(Lys)-アスパラギン(Asn) -
Q；B1-グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-グルタミン酸(Glu)-アスパラ
ギン(Asn)-Q；B1-アスパラギン酸(Asp)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-
Q；B1-アスパラギン(Asn)-グリシン(Gly)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-フェニルア
ラニン(Phe)-プロリン(Pro)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-バリン(Val)-プロリン(P
ro)-アスパラギン(Asn)-Q；及びB1-ヒスチジン(His)-ヒスチジン(His)-アスパラ
ギン(Asn)-Qを含んでいる。
【０１３１】 本発明のさらなる側面によれば、構造(Xb-Xc)アスパラギン(Asn)(Xd-Xe)を有 し、(Xb-Xc)はクラスII MHC分子の不変鎖におけるアスパラギン(切断部位に近接
するN末端のrアミノ酸残基であり、かつ(Xd-Xe)はクラスII MHC分子の不変鎖に おけるアスパラギン(Asn)切断部位に近接するC末端のsアミノ酸残基であり；ア スパラギン(Asn)はアスパラギン残基であり；r及びsはそれぞれ２から２５の間 であるアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤を提供する。
【０１３２】 好ましくは、r及びsはそれぞれ２から１０の間である；より好ましくはr及びs
はそれぞれ２から５の間である。
【０１３３】
【発明の実施の形態】
本発明は以下の実施例及び図面を参照することによって説明される
【０１３４】 実施例１：アスパラギンエンドペプチダーゼはプロセシング及び微生物抗原の クラスII MHC提示に関与する
【０１３５】 概要 外来抗原(foreign antigen)はクラスII MHC分子の表面へのペプチドの蓄積を許 容するように加水分解的にプロセスされなければならない。どのプロテアーゼが
関与するかを調べるために、我々は微生物抗原、破傷風毒素(TTCF)のドメインを
、ヒトB細胞系(cell line)から精製した分裂したリソソームにさらした。驚くこ
とに、生理的優位プロセシング活性(the dominant processing activity)は既知
のリソソームカテプシンの一つにはなかったが、むしろ我々がAEPと呼んでいる アスパラギン特異性システインエンドペプチダーゼ(asparagine specific cyste
ine endopeptidase)にあった。レグマイン1の哺乳類の同類物(homologue)、起源
的に植物及び寄生虫2,3に発見されたアスパラギンエンドペプチダーゼと同一で ないなら、この酵素は同様に現れる。我々はアスパラギンエンドペプチダーゼ活
性を特異的に遮断し、インビトロでのTTCFのプロセシング及びインビボでのT細 胞へのそれの提示を阻害するAEPの競争ペプチド阻害剤を設計した。N-グリコシ ル化によりアスパラギンはAEPによる切断に対して抵抗するので、この酵素は微 生物非自己(microbial non-self)に焦点をしぼる(to focus its attention)先天
性免疫系(innate immune system)のさらなる能力例を表すだろうと我々は暗示す
る。
【０１３６】 酵素が必要とされるということについての先の推測をせずに外来抗原のプロセ
シングを解析するため、我々は破傷風毒素抗原(TTCF)の47 kDドメインをヒトB細
胞系EDRから精製した分裂した(disrupted)リソソームにさらした。図１ａに示す
ように、抗原は断片化されpH4.5で個々の産物を産生したが、pH7.0及び極小的に
はpH6.0では産生せず、リソソーム起源(origin)のプロテアーゼが関与している ことがわかった(図１)。驚くことに、ロイペプチン、E64(トランス-エポキシス クシニル-L-ロイシルアミド-(４-グアニジノ)ブタン)、リソソームシステインプ
ロテアーゼの広域(broad spectrum)阻害剤またはペプスタチン、アスパラギン酸
カテプシンE及びDの阻害剤でTTCFのリソソーム消化をわれわれは阻害できなかっ
た(図１ａ)。LHVS、より特異的なカテプシンS4の阻害剤もまた効果がなかった( 示さない)。我々はリソソームTTCF消化パタ-ン(pattern)を再産生することも、 精製されたカテプシンL，S，B，DまたはEを用いてこれら断片のいずれも実際に 生成できなかったが、カテプシンL，S，B，DまたはE全てがクラスII MHC抗原プ ロセシング経路に関係している(参考文献５及び６に論評される)。しかしながら
さらなる阻害剤の研究から、その活性はヨードアセタミド(iodoacetamide)(図１
ａ)、N-エチルマレイミド(N-ethyl maleimide)、及び高濃度ジアゾメタン(diazo
methane)に対して感受性であり、Z-フェニルアラニン(Phe)-フェニルアラニン(P
he)-CHN2(図示省略)から一つまたはそれ以上のシステインプロテアーゼがそれに
も関わらず関与することがわかった。
【０１３７】 このプロセシング活性に関するさらなる情報を得るために、我々はそれぞれの
メジャーTTCF消化産物をシークエンスした(seaquenced)。TTCFタンパク質におい
て全ての可視断片は三つの切断から生じ、それぞれはアスパラギン残基の後に起
こっていた(図１ｂ)。アスパラギン1184及びグルタミン酸1185のアラニンへの変
異(mutation)は、この部位での切断を完全に廃し(図１ｃ)、一つ(おそらくはア スパラギン)またはこれら残基の全てがプロセシングに重要であることを示す。
【０１３８】 これらの結果から、B細胞リソソームはアスパラギンに対して好ましい特異性 を有する一つまたはそれ以上の新しいシステインエンドペプチダーゼを含有して
いることが推測された。以前から抗原提示細胞の記載はないけれども、レグマイ
ンと呼ばれる同様の特性を有する酵素は、マメ科植物(legumimous plants)2,3の
種子、マンソン住血吸虫3及び最近では腎臓及び胎盤1のようないくつかの哺乳類
組織に発見されている。TTCFプロセシング活性がアスパラギンエンドペプチダー
ゼにあるかどうか証明するため、我々は次に粗(crude)B細胞リソソームフラクシ
ョンからTTCFプロセシング活性を部分的に精製した。図２ｂに示すように、TTCF
プロセシング活性のピークは0.4M NaClでカチオン(cation)-交換樹脂から溶出し
た(eluted)。この活性は、基質Z-アラニン(Ala)-アラニン(Ala)-アスパラギン(A
sn)-７-(４-メチル)クマリルアミド基質を切断できる活性を明確に有して共-溶 出した(co-eluted)(図２ａ)。基質Z-フェニルアラニン(Phe)-アルギニン(Arg)-N
HMecを切断できる他のプロテアーゼ活性、おそらくはカテプシンL及び／またはB
がアスパラギンエンドペプチダーゼ活性と部分的に重複した(図２ａ)。しかしな
がら、この活性はE64により完全に阻害された(図２ａ)が、一方TTCF及びZ-アラ ニン(Ala)-アラニン(Ala)-アスパラギン(Asn)-NHMecの両方のプロセシング活性 は影響がなく(図２ｂ)、新しいシステインエンドペプチダーゼが関与したことが
わかる。最近記載されたレグマインの哺乳類の形態に対するこの活性を比較する
ため、哺乳類プレプロレグマイン(preprolegumain)配列のいくつかの領域に対す
るアンチ-ペプチド(anti-peptide)抗血清を生成した。残基125-140(方法を参照)
に対する抗血清に関するそれぞれのフラクションのブロッティング(Blotting)か
ら、TTCF及びペプチド基質プロセシング活性とともに共溶出した(co-eluted)精 製されたブタ腎臓レグマインと同様な移動度(mobility)(35kD)を有するタンパク
質の存在が明らかになった(図２ｃ)。最終的に、粗リソソームフラクション、部
分的に精製されたTTCFプロセシング活性及び精製されたブタ腎臓レグマインによ
り同様のプロセシング部位が正確に認識された(図１ｂ及び２ｂ、参考文献１及 びデータは示さない)。このように哺乳類レグマインまたは密接に関与した酵素 は、ヒトBリンパ球に存在し、インビトロではプロセシング抗原に応答可能な主 要酵素になる。植物酵素由来のものと区別するため、この酵素にAEP(Asparaginy
l endopeptidase)と命名することを提案する。
【０１３９】 我々は高濃度アスパラギン含有ペプチドが競争阻害剤として作用できるか試験
することに決めた。図３に示すように、N及びC-末端的に遮断されたテトラペプ チド アラニン(Ala)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-リジン(Lys)-NH(AE
NK)はAEPによりTTCFのプロセシングを実質的に阻害した(図３ａ)。リジン(Lys)-
アスパラギン(Asn)-アスパラギン(Asn)-グルタミン酸(Glu)-NH(KNNE)もまた阻害
したが、あまり有効ではなかった。重要なことには、同濃度グルタミン類似物AE
QK及びKQQEはAEPの特異的競争阻害を説明するTTCFrプロセシングを阻害しなかっ
た(図３ａ)。AEPの阻害が特異的であったことを説明するため、我々は、これら テトラペプチドの存在及び不在下での異なる合成ペプチド基質の加水分解を測定
した。図３ｂに示すように、AENKはB細胞リソソームフラクションによるZ-バリ ン(Val)-アラニン(Ala)-アスパラギン(Asn)-NHMecの切断を完全に遮断したが、 カテプシンL/B基質、Z-フェニルアラニン(Phe)-アルギニン(Arg)-NHMecの加水分
解またはカテプシンS基質Z-バリン(Val)-バリン(Val)-アルギニン(Arg)-HNMecに
影響を与えなかった。
【０１４０】 AEPが抗原提示細胞のTTCFプロセシングに重要な役割を果たすなら、効果的高 レベルの競争AENKペプチドはTTCFエピトープの標準的クラスII MHC蓄積を阻害す
ると推測されるかもしれない。テトラペプチドが存在または不在下での１５分の
インキュベートに続いて、ペプチドが連続して存在または不在の状態にて新鮮に
単離された末梢血単核細胞(PBMC)がTTCF抗原とともにインキュベートされた。異
なる時間に、細胞は洗浄(washed)、固定され(fixed)、そして種々のペプチド／M
HC複合体の発現を評価するため、異なるオートロガスT細胞クローンとともに共 培養された(co-cultured)。競争ペプチド不在下では、抗原にパルスを当てた６ ０分後にほとんどのクローンに対する提示を検出できたが、AENK存在下では、い
くつかのクローンに対する提示は検出不可(AK 20及びAK 90；図３ｂ)またはほと
んど阻害(例えばAK 6)のいずれかだった。後に、競争阻害剤に推測されるように
これらエピトープの提示の回復があった。いくつかの操作によりAENK競争剤の阻
害剤効果は単に非特異的毒性(non-specific toxicity)に原因があるという可能 性が否定された。第一に、TTCFの他の領域を認識する他のクローンに対する提示
はAENK競争剤により影響を受けなかった(例えばAK 111,71及び33：図３ｃ)。第 二に、AENK対AEQKに対して明らかに異なる感受性があり(図３ｃ)、AEPの特異的 阻害がゆっくりとした提示速度(kinetics of presentation)に応答可能であった
ということが強く推測される。第三に、AEPによりインビトロで前消化(pre-dige
sted)されたTTCFを用いることにより、AENKの阻害剤効果は無視できた。言い換 えると、インビボでのAEP要求性、及びこれゆえのAENKの阻害効果はインビトロ でのAEP切断により回避された(データは示さない)。我々の結果から考慮すると 、クラスII MHC経路における新しく高度に特異的なプロセシンング活性としての
AEPが明らかになる。先の研究は、AEPは種々の他の抗原提示細胞型(antigen pre
senting cell types)に存在することを示す。
【０１４１】 我々は抗原タンパク質アッセイを用いてこのプロセシング活性を説くことはし
ないけれども、それは不変鎖プロセシングにおいても同様に重要な役割を果たす
ということは可能である。全ての知られているシステインプロテアーゼ活性がま
たロイペプチン7に抑制されたとしても、カテプシンD遺伝子標的マウス(catheps
in D targeted mice)由来の脾細胞(Splenocytes)は不変鎖プロセシング産物を産
生し続けた。他の非システイン(non-cysteine)プロテアーゼ(カテプシンDと比べ
ると)はIi(不変鎖)切断を開始するに違いないとビラダンゴス(Villadangos)等は
推測した。システインプロテアーゼであるが、ロイペプチンに対して完全に抵抗
性がある(図１ａ)ので、カテプシンEが一つの候補になるがAEPもそうである。無
傷のp31 Iiはインビトロで容易にAEPにより切断されるので、現在我々はAENKも またIiプロセシングを阻害できると評価している。しかしながら、T細胞クロー ンのAENK阻害剤の種々の効果、及びAEPによる抗原の前消化はAENK阻害剤の阻害 剤効果を廃したという事実から、我々の研究における先の阻害剤効果はTTCFプロ
セシングに関するということが議論される。
【０１４２】 抗原提示細胞においてアスパラギンエンドペプチダーゼが存在することが特別
な重要性をもつものだと考えられるだろうか?特に感受性アスパラギン残基のN- グリコシル化により、宿主タンパク質はAEP攻撃(attack)に抵抗できるので、宿 主タンパク質より微生物タンパク質のほうが一般に好ましい基質になるという可
能性がある。TTCFはAEPに対してとても好ましい基質であるが、切断は４７のア スパラギン残基のうちの３つでのみ起こるということがとても目立つ。このこと
から、同定すべきAEP詳細の付加的な決定要素があり、策略的N-グリコシル化は 実質上の保護を与えるということが推測される。従って、非自己分子「パターン
(patterns)」を認識して微生物抗原を結合できる先天性免疫系(innate immune s
ystems)も同様に、微生物抗原プロセシングに対する「先天性(innate)」先入観(
bias)を利用するかもしれない。加えて、我々のデータからN-グリコシル化を妨 害することは病理学的に重要になりうる「潜在性(cryptic)」エピトープの提示 を誘導するAEPにより自己タンパク質のプロセシングに変化をもたらすかもしれ ないという可能性が生じる。
【０１４３】 方法 TTCFプロセシング活性。ヒトB細胞系EDR由来のリソソームフラクションは、125I
-標識されたトランスフェリン(transferrin)(３７℃で３０分間インターナライ ズされた(internalised))を用いて先に記載8したような27％ペルコール(Percoll
)密度勾配及びエンドソーム／形質(plasma)膜とリソソームフラクションとのそ れぞれを同定するためのβ-ヘキサミニダーゼ(hexosaminidase)に基づき調製さ れた。リソソームのピークは40,000gで１時間の遠心分離により回収され、下に あるペルコールペレットから除去され、１時間の50,000gで再度回収され、そし て冷凍保存された。ロイペプチン-非感受性システインプロテアーゼ活性の分離 のため、7.5×109の細胞がボール-ベアリング(ball-bearing)ホモジナイザー(ho
mogenizer)でホモジナイズされ(homogenised)、核及び未壊(unbroken)細胞が１ ０分間の2,000gで遠心分離により除去された。膜ペレット(A membrane pellet) は40,000gで回収され、0.1％ CHAPS(３-(［コールアミドプロピル)ジメチルアン
モニオ］-１-プロパン-スルホン酸)(3-(［cholamidopropyl)dimethylammonio］-
1-propane-sulphonate)を含むpH 5.5、50 mMクエン酸バッファーに可溶化させた
。抽出物は２０分間の2,000gで遠心分離され、それからモノ-S(Mono-S)カラム(P
harmacia)にアプライされた。フラクションはNaClの勾配で溶出され、TTCFプロ セシング活性が監視された。
【０１４４】 タンパク質及びペプチド。破傷風毒素のC末端のヒスチジン標識された誘導体 が調製され9,10、記載されたように精製された10。このタンパク質は完全な毒素
(1-1315)のうちの残基872-1315を有し、配列MGHGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHIが先行す
る。XbaI/BamHI断片をpSL1180に挿入するように(ファルマシア(Pharmacia))、ヒ
スチジン(His)-TTCF(参考文献１０)をクローニングすることにより得られるテン
プレートEH106を用いて残基1184/5の変異誘発(Mutagenesis)が行われた。残基11
84/85の部位特異的変異誘発は、変異誘発プライマー CGC TAC ACT CCG AAC GCG
GCG ATC GAT TCT TTC GTT及びフランキング(flanking)プライマー M13 rev(AGCG
GATAACAATTTCACACAGGA)及びM13 seq(GTAAAACGACGGCCAGT)を用いて、ミカエリン(
Mikaelian)及びサージェント(Sergent)の方法に従って行われた。変異誘発を確 認するシークエンスを行った後、発現のためのpET16Bに戻してリクローンされた
。テトラペプチドはC末端をアミド化(amidated)しN-末端をフモック(Fmoc)基の まま保持させるフモック化学(Fmoc chemistry)を用いて合成された。LHVSはハイ
ド プロー，マサチューセッツ工科大学(Hidde Ploegh, MIT)からの親切な寄贈品
だった。
【０１４５】 抗原提示。末梢血単核細胞はフィコール/パーク(Ficoll/Paque)遠心分離によ り調製され、新鮮に使用された。TTCFに特異的なT細胞クローンは供与者A.K.か ら12に従って樹立された(established)。エピトープマップ(Epitope mapping)は
長さ拡張(length spanning)TTCF配列(キロンミモトープ(Chiron Mimotope))にお
ける88ペプチド、17残基のセットを用いて行われた。クローンAK 6,90,及び71は
ペプチド1235-1245，1145-1156及び950-961それぞれを認識する。クローン111及
び33は領域1225-1276及び1104-1153内のエピトープを認識する。クローン20によ
り認識されたエピトープはマップされなかった。ペプチドAENKまたはAEQKを水に
溶解させ、NaClで等張させ(made isotonic)、そしてRPMI増殖培地に希釈した。T
細胞増殖アッセイが記載12,13されたように必然的に行われた。簡単に言えば、 テトラペプチド(1 mg/ml)が存在または不在下での抗原パルス(antigen pulsing)
(30μg/ml TTCF)に続いてPBMCはPBSで洗浄され、0.05％グルタルアルデヒドに４
５秒間固定した。グリシンが最終濃度0.1 Mになるように加えられ、丸底の９６-
ウェルマイクロタイタープレート(round-bottom 96-well microtitre plates)で
T細胞クローンとともに共培養する前に、細胞は１％ FCSを含むRPMI 1640培地で
５回洗浄された。４８時間後、培養液は3Ｈ-チミジン１μCiでパルスされ(were
pulsed)、１６時間経った後回収された。
【０１４６】 さらなる実験からAEPはインビボでのTTCFプロセシングに重要な役割を果たす ことが示された。新鮮に単離された末梢血単核細胞(PBMC)はAENKまたはコントロ
ールペプチドAEQKとともに簡単にプレインキュベートされ、それから一つまたは
他のペプチドを存在させ続けた状態でTTCF抗原にパルスした。種々の時間で、細
胞は洗浄、固定され、それから種々のペプチド／MHC複合体の発現を評価するた め種々のオートロガスT細胞クローンとともに共培養された。コントロールペプ チド存在下では抗原パルスの３０から６０分の間に、提示は検出可能になったが
(図９ａ)、AENK存在下ではほとんどのクローン(例えばAK5,90及び6)に対する提 示は初期段階で検出不可だった。我々はまた供与者AK由来のEBV-B細胞系を生成 し、同じT細胞クローンに対するB細胞抗原提示に関するテトラペプチドの効果を
試験した。図９ｂに示されたように、AENKペプチドがEBV-B細胞による抗原提示 を効率よく遮断した。コントロールペプチドAEQKは抗原提示の速度(the kinetic
s)に関して目に見えるような効果はなかった(図９ｂ)。このようにAENKは、二つ
の異なるAPC集団(populations)による抗原提示を特異的に阻害した。長時間の抗
原パルス(pulsing)の後、全てのクローンに対する抗原提示は種々の範囲に回復 した。この回復は、AENKが競争基質として作用することにより阻害し、それ自身
がアスパラギンエンドペプチダーゼにより加水分解された(データは示さない)と
いうことから説明されると我々は推測している。この状況下において、TTCFプロ
セシングを完全に遮断することは不可能である。我々はまた、いくつかのクロー
ン、例えばクローン33はAEPの遮断に対してほとんど感受性がなかった(図４ａ及
びｂ)ということに気付いた。AEPプロセシングに関する種々の必要条件、T細胞 エピトープの位置(location)または個々のクローンの抗原用量／応答(antigen d
ose/response)またはこれら要因の組み合わせに依存することのいずれかにより 、そのようなクローンバリエーションは説明されるかもしれない。最初のシナリ
オと一致して、同じペプチド領域に特異的なクローンはAEP遮断に対して同様な 感受性を示すということに我々は気付いている。例えば、クローン5及び90及び 第三のクローン(AK 20)全てが1145-1156ペプチドを認識し、AENKに対して同様な
感受性を示している(図９及びデータは示さない)。しかしながら、推測したよう
に、我々が試験したクローンの抗原用量／応答においてもまたバリエーションが
あった。半-最大トリガーリング(half-maximal triggering)のそれらに必要な高
レベル抗原は、ゆっくりとした提示速度及びAEP遮断に対する強い感受性を一般 に示した。種々のクローンにより示されたAEPプロセシングのための明確な種々 の必要条件は、エピトープの位置、クローン「親和性(affinity)」及び可能な他
の因子の組み合わせによるものだと我々は推測している。にもかかわらず、今ま
で試験されたほとんどの破傷風毒素細胞エピトープに対する提示はAEP遮断によ り影響を受けるということは明らかである。このことはAEPによる最初のプロセ シングは、さらなるプロセシングのための天然の(native)タンパク質の「錠をあ
ける(unlocks)」「鍵(key)」になるかもしれないという考えに一致している。抗
原提示を促進させるかもしれないという理由から、この仮定のさらなる試験とし
て、インビトロでAEPとともに前消化されたTTCFの提示速度をアッセイした。図 ９ｃに示されるように、これは事実だった。プロセスされないTTCFが提示前に６
０-１２０分を必要としたにもかかわらず、たった１５-３０分後にT細胞エピト ープを提示したAEPでプレプロセスされた(pre-processed)TTCFとともにインキュ
ベートされた細胞が検出された。重要なことには、これらの時間でAENKはプレプ
ロセスされた抗原の迅速な提示を遮断せず(図９ｄ)、この阻害剤はインビボでの
抗原基質に関するAEP作用を特異的に遮断するということがわかった。固定され たPBMCにより提示されなかったので(図９ｃ及びｄ)、AEPでプレプロセスされたT
TCFはなおいっそうさらなる細胞のプロセシングを必要とした。これらの結果か ら考慮すると、AEPはTTCF加水分解を開始するが、MHC結合のための適するペプチ
ドの生成はさらなる細胞内(intracellular)プロセシングを必要とする作業モデ ル(working model)を支持する。天然のTTCFはカテプシンE，D，L，S及びBには不
十分な基質であるが(データは示さない)、例えばカテプシンE及びDに対する多く
のプロセシング部位は次の抗原のアンフォールディング(unfolding)を明らかに した。
【０１４７】 我々はまた、ヒト血清トランスフェリンから単離された天然の21-残基のトリ プシンの(tryptic)グリコペプチド(残基622-642)を解析した(表１参照)。このペ
プチドは２つのアスパラギン残基を含み、そのうちの一つ(N630)は二分岐(biate
nnary)のオリゴ糖を輸送する(ルー, J. 及び バンホールビンク, H.(Lu,J. & va
nhalbeek, H.) (1996) “ヒト血清トランスフェリンから調製される21-アミノ酸
グリコペプチドの完全な1Ｈ及び13C共鳴帰属(Complete 1H and 13C resonance a
ssighments of a 21-amino acid glycopeptide prepared from human serum tra
nsferrin)” Carbohydr. Res. 296, 1-21)。アスパラギンを修飾せずに同じペプ
チドが合成され、平行して消化された。［溶解性(solubility)を増加させるため
、３つのリジン残基が加えられた］。
【０１４８】 質量分析(mass spectrometric)解析及び産物のN-末端配列の両方から、アスパ
ラギン630と637両方の加水分解はグリコシル化されない(non-glycosylated)ペプ
チドで起こったことがわかった(表１)。しかしながら、我々はグリコペプチド中
のN637の加水分解からの産物だけを検出した。３つのアスパラギン残基を含む第
二のトランスフェリン-誘導性(derived)トリプシンのグリコペプチド(残基421-4
52)はまたAEPで消化された。再度、我々はグリコシル化されないアスパラギン43
0及び436での加水分解からの断片だけを検出した(示さない)。
【０１４９】 表１：N-グリコシル化は天然グリコペプチドのアスパラギンエンドペプチダー
ゼ作用(action)を遮断する
【０１５０】
【表１】
【０１５１】 予想された断片質量(masses)は、EXPASYサーバーでのペプチド質量(PeptideMa
ss)を用いて算出されるヒト血清トランスフェリン配列(取得番号(accession num
ber): P02787)から得られた。トランスフェリン二分岐のオリゴ糖(2 シアル酸(S
ialic acid)＋4 GlcNAc＋5 ヘキソース(hexose)はペプチドに結合した2204の質 量を有する(ルー,J. 及び バンホールビンク(Lu, J. & van Halbeek, H.) (1996
) “ヒト血清トランスフェリンから調製される21-アミノ酸グリコペプチドの完 全な1Ｈ及び13C共鳴帰属(Complete 1H and 13C resonance assighments of a 21
-amino acid glycopeptide prepared from human serum transferrin)” Carboh
ydr. Res. 296, 1-21)。示さないが観測された変異型(variants)もまたグリコペ
プチドのモノシアル酸化型(monosialylated forms)であり、かつN末端ペプチド はN末端グルタミンピログルタミン酸化(N-terminal glutamine pyroglutamisati
on)に対応する17質量ユニットの低下(17 mass units lower)を形成する。このペ
プチドにおける二つのシステイン残基の*環化が観測された質量2の欠損をおそら
く説明する。
【０１５２】 実施例２：アスパラギンエンドペプチダーゼはクラスII MHC不変鎖をプロセス できる
【０１５３】 ペプチド／クラスII MHC複合体生成(generation)の鍵となるステップはクラス
II MHCαβダイマーから不変鎖と呼ばれるペプチドを完全に除去することである
。これはいかなるペプチドも蓄積されないうちに加水分解によって除去されなけ
ればならないクラスII MHCにささげられたシャペロンである(クレスウエル(Cres
swell) (1996) Cell 84, 505-)。標準的に、それらの除去は、第一に、クラスII
ペプチド結合部位を遮断する小断片(〜約3 kDのCLIPとして知られている)を産生
するタンパク質分解、及び第二に、このペプチドを除去するDMと呼ばれるタンパ
ク質の作用(action)を必要とする。遮断不変鎖除去(Blocking invariant chain
removal)は有効に他の全てのペプチドの蓄積を遮断する。不変鎖には普通p31及 びp41として知られる二つのどちらかのスプライスされた型が存在する。p41は不
変鎖のほぼ４０％を説明する樹状細胞を除くほとんどの細胞においてマイナー(m
inor)である。
【０１５４】 インビトロで、カテプシンSはDM作用に適する小断片(CLIP)を産生する(リース
(Riese) 等 (1996) Immunity 4, 357-)が、他の酵素は生きた細胞(living cell)
の不変鎖プロセシングに関与する。例えば、カテプシンSの阻害剤はCLIPよりず っと大きい(〜10 kD)不変鎖断片の蓄積(accumlation)を引き起こす。このことよ
り、カテプシンSは不変鎖プロセシングの後の段階(stage)に本当に不可欠となり
、他の酵素が10 kD断片を産生するということがわかる。AEPはインビトロで不変
鎖を分解するということが現在分かっている。従って、不変鎖のAEPプロセシン グは、いくつかのまたは全ての細胞においてその分解を開始するかもしれない( いくつかの細胞、例えば胸腺の皮質上皮細胞(thymic cortical epithelial cell
s)はカテプシンSを発現しないように思われる)。
【０１５５】 ヒトEBV-形質転換(transformed)系(lines) PALAまたはAL-EBVは0.5 mCi/ml 35 S-トランスラベル(Translabel)(ICN)で３７℃、１５分放射線標識、洗浄されプ ロテアーゼ阻害剤を加えて１％トリトンX-100を含むトリスバッファー塩類溶液(
Tris-buffered saline)で溶菌された(デビットソン 及び ワッツ(Davidson & Wa
tts) (1989) J. Cell. Biol. 109, 85)。溶菌液は遠心分離によりクリアされ(cl
eared)、プロテインGセファロースでプレクリアされた(pre-cleared)。不変鎖／
クラスII MHC複合体はVIC-Y1抗体(W ナップ(W Knapp)からの寄贈品)で沈殿した 。複合体はプロテインGセファロースに回収され、トリスバッファー塩類溶液、 １％トリトンX-100で３回洗浄され、0.05 ％ CHAPS(Calbiochem)存在または不在
下で50mMクエン酸バッファー、１ mM EDTA、5 mM ジチオトレイトール(dithioth
reitol)で再懸濁した。精製されたアスパラギンエンドペプチダーゼは20μl反応
につき5 mU加えられた。消化は３７℃、３０分間行われ、トリス-トリシン(Tris
-tricine)SDS-PAGE(12％)により解析された。不変鎖のp41及びp31の両方の型は3
-4の個々の断片を産生するように完全に消化されたが(図６)、一方クラスII MHC
のα及びβ鎖の両方はAEPプロセシングに抵抗性があるということに注目された い。デタージェントCHAPSの存在は消化に影響しない。
【０１５６】 カテプシンS，L，B及びD以外の酵素は生きた細胞の不変鎖を分解できるという
ことが状況証拠から前もって分かっている。このことは、(カテプシンS，L及びB
を阻害する)ロイペプチンで処理されたカテプシンDノックアウトマウス由来の脾
臓細胞において、不変鎖プロセシングの初期段階がさらに始まるという見解から
生じるものである(ビラダンゴス(Villadangos) 等 (1997) J. Exp. Med. 186, 5
49-)。ここに示された結果から、AEPはこの残余(residual)不変鎖プロセシング 活性に対して応答可能であるということが推測される。
【０１５７】 不変鎖プロセシングを説明するためさらなる実験が行われた。結果は図７に示
す。
【０１５８】 ヒトEBV-形質転換系Palaは35S-メチオニン／システイン(トランスラベル(Tran
slabel)，ICN)で３０分間放射線標識され、その細胞は免疫沈降のために溶菌さ れた。クリアされた(cleared)溶菌液は、mAb DA6.231(クラスII MHC β鎖特異性
)またはVIC-γ１(不変鎖特異性)のどちらかとともにインキュベートされた。回 収された(Recovered)免疫沈降はそれから5 mU精製されたブタ腎臓レグマインで ６０分間消化された。消化物はそれから１２％トリス-トリシンSDSゲルにランさ
れ(run)、PVDF膜に移され、図７のパネル(ａ)に番号付けされた断片は、N-末端 エドマン分解を受けたAEPプロセシングから生じる。それぞれの切断サイクルか ら得られる溶出液を乾燥させ、シンチレーションカクテルに再懸濁され、βカウ
ンターで計数した。同様の消化パターンがDA6.231沈殿から得られた(図示しない
)。エドマン分解の特異的サイクルで放出される35S cpmから、切断されたアスパ
ラギン残基を同定されることが認められた。配列バンド５から得られる生の実例
となる実施例は図７(ｂ)に示されている。図７(ｃ)ヒト li p31配列は三つのAEP
プロセシング部位を示している。AEPは下線のCLIP領域の両サイドを切断できる 。配列バンド１から得られる最初の部位は細胞質尾部(cytoplasmic tail)にあり
、生きた細胞のプロセシングに利用できないだろうということに注目したい。
【０１５９】 実施例１に関する参考文献 １． チェン, J.M.(Chen, J.M.,)等(1997) J. Biol. Chem. 272, 8090-8. ２． ケンハビ, A.A.,バトル, D.J., ナイト, C.G.及びバレット, A.J.(Kemb havi, A.A., Buttle, D.J., Knight, C.G. & Barrett, A.J.)(1993) Ar ch. Biochem. Biophys. 303, 208-13. ３． ダルトン, J.P., ホーラヤムリスカ, L.及びブリンドリー, P.j.(Dalto n, J.P., Hola Jamriska, L. & Brindley, P.j.)(1995) Parasitology 111, 575-80. ４． リース, R.J.(Riese, R.J.,)等(1996) Immunity 4, 357-66. ５． ワッツ, C.(Watts, C.)(1997) Annu Rev Immunol 15, 821-50. ６． フィネンスキー, B.及びミラー, J.(Fineschi, B. & Miller, J.)(1997 ) Trends Biochem Sci 22, 377-382. ７． ビラダンゴス, J.A., リース, R.J., ピーター, C., チャップマン, H. A., プロー, H.L. (Villadangos, J.A., Riese, R.J., Peters, C., Ch apman, H.A. & Ploegh, H.L.)(1997) J. EXp. Med. 186, 549-60. ８． ダビッドソン, W., ウエスト, M.A.及びワッツ, C.(Davidson, W., Wes t, M.A. & Watts, C.)(1990)J Immunol 144, 4101-9. ９． マコフ, A.J., バレンタイン, S.P., スモールウッド, A.E.及びファイ アフェザー, N.F.(Makoff, A.J., Ballantine, S.P., Smallwood, A.E. & Fairweather, N.F.)(1989) Bio/Technology 7, 1043-1046. １０． ヒューイット, E.W.(Hewitt, E.W.,)等(1997) J. Immunol. 159, 4693- 9. １１． ミケライン, I.及びサージェント, A.(Mikelain, I. & Sergent, A.)(1 992) Nucleic Acids Res. 20, 376. １２． ランザベッキア, A.(Lanzavecchia, A.)(1985) Nature 314, 537-539. １３． ポンド, L.及びワッツ, C.(Pond, L. & Watts, C.)(1997) J. Immunol. 159, 543-53.
【０１６０】 図４に記載された合成方法に関する参考文献 １． トムソン, R.C.(Thomson, R.C.) Meth. Enzymol. 46, 220- ２． ビニスキー, A., カルドザ, C., セップ-ロレンチーノ, L, ミカウド, C. 及び オーロスキー, M.(Vinitsky, A., Cardozo, C., Sepp-Lorenzi no, L, Michaud, C. & Orlowski, M.)基質が関与するペプチジルアルデ ヒドによる多触媒プロテナーゼのタンパク質分解活性の阻害(Inibition of the Proteolytic activity of the multicatalytic Proteinase co mplex by Substrate-related peptidyl aldehydes.) J. Biol. Chem. 2 69, 29860-29866 (1994). ３． ショー, E. 及び グリーン, G.D.J.(Shaw, E. & Green, G.D.J.)ペプチ ジルジアゾメチルケトンに関するチオールプロテアーゼの不活性(Inact ivation of thiol Proteases with peptidyl diazomethyl ketones.) M eth. Enzymol. 80, 820-826 (1981). ４． ショー, E.(Shaw, E.)システイン及びセリンプロテアーゼの阻害剤とし てのペプチジルジアゾメタン(Peptidyl diazomethanes as inibitors o f cystein and Serine Proteases.) Meth. Enzymol. 244, 649-656 (19 94). ５． ウイリアム, E.B. 及び マン, K.G.(Williams, E.B. & Mann, K.G.)標 識試薬としてのペプチドクロロメチルケトン(Peptide chloromethyl ke tones as labelling reagents.) Meth. Enzymol. 222, 503-513 (1993) . ６． パルマー, J.T., ラスニック, D., クラウス, J.L. 及び ブローメ, D. (Palmer, J.T., Rasnick, D., Klaus, J.L. & Bromme, D.)メカニズム に基づくシステインプロテアーゼ阻害剤としてのビニルスルホン(Vinyl sulphones as mechanism-based cystein Protease inibitors.) J. Me d. Chem. 38, 3193-96 (1995). ７． クランツ, A.(Krantz, A.)システインプロテアーゼのための静止アフィ ニティーラベルとしてのペプチジル(アシルオキシ)メタン(Peptidyl(ac yloxy)methanes as quiescent affinity labels for cystein Protease s.) Meth. Enzymol. 244, 656-671 (1994). ８． ブローメ, D. 及び メムス, H-U.(Bromme, D. & Memuth, H-U.)システ インプロテアーゼの選択性及び不可逆性阻害剤としてのN,O-ジアシル ヒドロキサム酸(N,O-diacyl hydroxamates as selective and irrevers ible inibitors of cystein Proteases.) Meth. Enzymol. 244, 671-68 5.
【図面の簡単な説明】
【図１】 ロイペプチン-非感受性(insensitive)システインエンドペプチダーゼ活性によ
るTTCFのプロセシングを示す。(ａ)ヨードアセタミド(1mM)、ロイペプチン、E64
またはペプスタチン(それぞれ0.1mg/ml)が存在または不在下で、TTCFは分裂され
た(disrupted)リソソーム(1-2μg)存在下のインビトロで消化された。消化はpH4
.5の0.1M NH4酢酸(acetate)、またはpH6.0または7.0、Na2HPO4で行われた。３７
℃で４時間後、反応はトリス-トリシン(Tris-tricine)SDS-PAGEにより分離され クーマシーブルー(Coomassie Blue)で染色された。(ｂ)切断部位：TTCF消化産物
はSDS PAGEにより分離され、電気泳動的に(electrophoretically)ニトロセルロ ース膜(nitrocellulose membrane)に移された。１-６に番号付けされた個々のフ
ラグメントはエドマン分解の５サイクルにさらした(subjected)。得られたN-末 端配列はTTCF(破傷風毒素ナンバリング(tetanus toxin numbering))由来の上流(
upstream)残基に続く太字で示される。ヒスチジン(His)-標識された(tagged)TTC
FのN末端配列はフラグメント１及び３から得られた。(ｃ)TTCFの残基アスパラギ
ン(Asn) 1184及びグルタミン酸(Glu) 1184はアラニンに変異され(方法を参照)、
消化は前述したように行われた。変異体(The mutation)は変異された部位では切
断されないが、最初の部位で切断される(対の一方は47kD(doublet at 47kD))。 この実験において、３番目(the third)の部位の切断が最小(minimal)だった。
【図２】 アスパラギンエンドペプチダーゼによりTTCFはプロセスされることを示す。( ａ)モノ-S(mono-S)樹脂のTTCFプロセシング活性のクロマトグラフィー。NaCl勾 配により溶出されたフラクションは、E64(トランス-エポキシスクシニル-L-ロイ
シルアミド-(４-グアニジノ)ブタン)(trans-epoxysuccinyl-L-Leucylamido-(4-g
uanidino)butane)が存在または不在下で基質Z-アラニン(Ala)-アラニン(Ala)-ア
スパラギン(Asn)-NHMecまたはZ-フェニルアラニン(Phe)-アルギニン(Arg)-NHMec
とともにインキュベートされた。E64はZ-アラニン(Ala)-アラニン(Ala)-アスパ ラギン(Asn)-NHMec(図示しない)の切断に関して阻害効果を有さなかった。(ｂ)S
DS-PAGE解析を行う前に、上述したTTCFはE64の存在または不在下で10μｇTTCFと
ともに３７℃で４時間インキュベートされた。(ｃ)それぞれのフラクションがSD
S-PAGE及びウエスタンブロッティングにより解析された。電気泳動的に移された
物質は、ヒトレグマイン(human legmain)1のペプチドKGIGSGKVLKSGPQCに対して 起こされるアフィニティー(affinity)精製された抗血清でプローブされた。
【図３】 AEPのペプチド阻害剤は、インビトロ及びインビボでのアスパラギンエンドペ プチダーゼ活性及びTTCFプロセシングを遮断することを示す。(ａ)示されたペプ
チド0.2mg/ml存在または不在下で、TTCFは精製されたAEP(ブタ腎臓由来レグマイ
ン)で消化された。フモック(Fmoc)及びアミド基のそれぞれを取り除かないこと により、ペプチドはN及びC-末端的に遮断された。(ｂ)精製されたAEPまたは粗(c
rude)リソソームプロテアーゼ混合物は、Z-アラニン(Ala)-アラニン(Ala)-アス パラギン(Asn)-NHMec、Z-フェニルアラニン(Phe)-アルギニン(Arg)-NHMec(カテ プシン L及びB)またはZ-バリン(Val)-バリン(Val)-アラニン(Ala)-NHMec(カテプ
シン S)とともにAENKまたはAEQK濃度を増加させる状態でインキュベートされた 。７-アミノ-４-メチルクマリン(7-amino-4-metyl coumarin)の放出(Release)が
１０、２０または３０分後に測定された。(ｃ)抹消血単核細胞は供与者(donor)A
.K.から単離され、TTCF抗原を加える前に1mg/ml AENK(■)またはAEQK(○)の存在
または存在下で１５分間プレインキュベート(preincubated)された。異なる時間
でこの細胞は洗浄され、0.05％グルタルアルデヒドに固定され(fixed)、そして オートロガス(autologous)TTCF特異的T細胞クローンとともに共培養された。(ｄ
)ヒトB細胞AEPはTTCFを消化し、AENKにより阻害されたがAEQKでは阻害されなか った。
【図４】 種々のAEP阻害剤の構造を示す。
【図５】 本明細書に記載されているようなAEP阻害剤に転換されうる種々のプロテアー ゼ阻害剤の構造を示す。
【図６】 AEPがクラスII MHC変異鎖(p31及びp41イソ型の両方)を切断できることを示す 。
【図７】 変異鎖のAEPプロセシングのさらなる詳細を示す。
【図８】 種々のタンパク質におけるAEP／レグマインのプロセシング部位を示す。文献 に記載されている、または注文により作製したペプチドのように商業源から入手
されるタンパク質は、１mM DTT存在下のpH5.5で精製されたブタ腎臓レグマイン により消化された。消化産物は電気泳動及び電気泳動的PVDF膜への移動後、MALD
I-TOF質量分析計及び／またはN-末端エドマン分解により解析された。
【図９】 TTCFプロセシング及び提示がインビボでAEPを必要とすることを示す。ａ及び ｂ，アスパラギンエンドペプチダーゼのペプチド阻害剤はインビボでの抗原提示
を遅らせる。ａ，末梢血単核細胞またはｂ，EBV-形質転換された(transformed)
B細胞，供与者A.K.由来の両方の細胞はTTCFを加える前にAENK(■)，AEQK()ま たはペプチド無(▲)存在下で１５分間プレインキュベートされた。抗原パルス(a
ntigen pulsing)の間、存在するペプチドは１mg/ml(ａ)または２mg/ml(ｂ)に保 持された。いろいろな時間で、細胞は洗浄され、0.05％グルタルアルデヒドに固
定され、異なるオートロガスTTCF特異性T細胞クローンの増殖(proliferation)を
利用することによって抗原提示が測定された。ｃ，TTCFのAEPプレプロセシング は抗原提示を促進する。TTCF()あるいは、生きた(live)(, ▲)または固定さ れた(fixed)(△)オートロガスPBMCのどちらかを用いたAEPで前消化されたTTCF( ▲,△)のどちらかを用いて抗原提示はａで測定された。ｄ，AEPプレプロセシン グされた抗原の提示はもはやAENKによって阻害されない。EBV B細胞を用いて、 抗原パルスの６０分後に提示が測定された。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２３日（２０００．３．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 5/103 43/00 １１１ 5/11 Ｃ０７Ｋ 5/103 14/705 5/11 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 14/705 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/64 33/50 37/02 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CA18 CA19 CB01 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 FB02 FB05 FB09 FB12 4B024 AA01 BA14 CA06 DA02 GA11 4C084 AA02 DC32 DC50 ZA962 ZB012 ZB132 ZC202 4H045 AA10 BA12 CA40 DA56 EA22 HA02 【要約の続き】

Claims (56)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫応答の調整を必要とする患者において免疫応答を調整す
    る方法であって、有効な量のアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤を前記患
    者に投与することを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記患者はMHCクラスII分子に関与する病気を有しているま たはそれにかかる危険がある請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記病気は自己免疫病である請求項１または２に記載の方法
    。
  4. 【請求項４】 前記病気は慢性関節リウマチである請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記患者はアレルギー性または過敏性反応を有しているまた
    はそれにかかる危険がある請求項１または２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記患者は移植組織を受けているまたは受けることになって
    いる請求項１または２に記載の方法。
  7. 【請求項７】 移植された、または移植されるべき物質は有効な量のアスパ
    ラギンエンドペプチダーゼの阻害剤に接触している請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記阻害剤は競争阻害剤である先行する請求項のいずれか一
    つに記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記競争阻害剤はアスパラギン含有ペプチドを含むペプチド
    である請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ペプチドはN及びC末端が遮断されたペプチド アラニ ン(Ala)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-リジン(Lys)-NH(AENK)またはリ
    ジン(Lys)-アスパラギン(Asn)-アスパラギン(Asn)-グルタミン酸(Glu)-NH(KNNE)
    である請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記阻害剤は非競争または不可逆性阻害剤である請求項１
    〜６のいずれか一つに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記阻害剤は構造B1-(X)n-アスパラギン(Asn)-Qを有し、B
    1は適切なN末端遮断基であり；Xはアミノ酸残基であり；nは１から１００の間で
    あり、アスパラギン(Asn)はアスパラギン残基であり、Qはアスパラギンエンドペ
    プチダーゼの活性部位システインに反応できる基である請求項１１に記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】 自己免疫病またはアレルギー性または過敏性反応の治療ま
    たは予防または回復のための有効な量の薬剤を前記患者に投与することをさらに
    含む先行する請求項のいずれか一つに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 有効な量の免疫抑制剤を前記患者に投与することをさらに
    含む請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 細胞のMHCクラスII分子によりタンパク質抗原のプロセシ ングを減少させる方法であって、前記細胞がアスパラギンエンドペプチダーゼに
    接触することを含む方法。
  16. 【請求項１６】 前記阻害剤は競争阻害剤である請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記競争阻害剤はアスパラギン含有ペプチドを含むペプチ
    ドである請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ペプチドはN及びC末端が遮断されたペプチド アラニ ン(Ala)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-リジン(Lys)-NH(AENK)またはリ
    ジン(Lys)-アスパラギン(Asn)-アスパラギン(Asn)-グルタミン酸(Glu)-NH(KNNE)
    である請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記阻害剤は非競争または不可逆性阻害剤である請求項１
    ５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記阻害剤は構造B1-(X)n-アスパラギン(Asn)-Qを有し、B
    1は適切なN末端遮断基であり；Xはアミノ酸残基であり；nは１から１００の間で
    あり、アスパラギン(Asn)はアスパラギン残基であり、Qはアスパラギンエンドペ
    プチダーゼの活性部位システインに反応できる基である請求項１９に記載の方法
    。
  21. 【請求項２１】 前記細胞は患者への移植のためのものであり、または組織
    または器官に含まれる請求項１５〜２０のいずれか一つに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 免疫応答の調整を必要とする患者における免疫応答を調整
    する製剤におけるアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤の用途。
  23. 【請求項２３】 前記患者はMHCクラスII分子に関与する病気を有している またはそれにかかる危険がある請求項２２に記載の用途。
  24. 【請求項２４】 前記病気は自己免疫病である請求項２２または２３に記載
    の用途。
  25. 【請求項２５】 前記病気は慢性関節リウマチである請求項２４に記載の用
    途。
  26. 【請求項２６】 前記患者はアレルギー性または過敏性反応を有しているま
    たはそれにかかる危険がある請求項２２または２３に記載の用途。
  27. 【請求項２７】 前記患者は移植組織を受けているまたは受けることになっ
    ている請求項２２または２３に記載の用途。
  28. 【請求項２８】 前記阻害剤は競争阻害剤である請求項２２〜２７のいずれ
    か一つに記載の用途。
  29. 【請求項２９】 前記競争阻害剤はアスパラギン含有ペプチドを含むペプチ
    ドである請求項２８に記載の用途。
  30. 【請求項３０】 前記ペプチドはN及びC末端が遮断されたペプチド アラニ ン(Ala)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-Lys-NH(AENK)またはリジン(Lys
    )-アスパラギン(Asn)-アスパラギン(Asn)-グルタミン酸(Glu)-NH(KNNE)である請
    求項２９に記載の用途。
  31. 【請求項３１】 前記阻害剤は非競争または不可逆性阻害剤である請求項２
    ２〜２７のいずれか一つに記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記阻害剤は構造B1-(X)n-アスパラギン(Asn)-Qを有し、B
    1は適切なN末端遮断基であり；Xはアミノ酸残基であり；nは１から１００の間で
    あり、アスパラギン(Asn)はアスパラギン残基であり、Qはアスパラギンエンドペ
    プチダーゼの活性部位システインに反応できる基である請求項１１に記載の用途
    。
  33. 【請求項３３】 前記患者は自己免疫病またはアレルギー性または過敏性反
    応の治療または予防または回復のための有効な量の薬剤が投与される請求項２２
    〜３２のいずれか一つに記載の用途。
  34. 【請求項３４】 前記患者は有効な量の免疫抑制剤が投与される請求項２２
    〜３２のいずれか一つに記載の用途。
  35. 【請求項３５】 免疫応答の調整を必要とする患者において免疫応答を調整
    するためのアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤の用途。
  36. 【請求項３６】 細胞のMHCクラスII分子によりタンパク質抗原のプロセシ ングを減少させるためのアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤の用途。
  37. 【請求項３７】 医療用のアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤。
  38. 【請求項３８】 アスパラギンエンドペプチダーゼ及び薬学的に受入可能な
    キャリア(carrier)の阻害剤を含む薬学的化合物。
  39. 【請求項３９】 免疫応答の調整を必要とする患者に有用に投与される薬剤
    をさらに含む請求項３８に記載の薬学的化合物。
  40. 【請求項４０】 自己免疫病またはアレルギー性または過敏性反応の治療ま
    たは予防または回復のための薬剤をさらに含む請求項３８に記載の薬学的化合物
    。
  41. 【請求項４１】 免疫抑制剤をさらに含む請求項３８に記載の薬学的化合物
    。
  42. 【請求項４２】 アスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤、カテプシンS 及び薬学的に受入可能なキャリアの阻害剤を含む薬学的化合物。
  43. 【請求項４３】 クラスII MHC抗原プロセシングを調整するための化合物を
    同定する方法であって、試験化合物をアスパラギンエンドペプチダーゼに接触さ
    せること及びその活性を失わせる化合物を選択することを含む方法。
  44. 【請求項４４】 アスパラギンエンドペプチダーゼの活性は前記エンドペプ
    チダーゼにより切断される基質を用いて測定され、検出可能な産物を容易に産生
    する請求項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記基質はZ-アラニン(Ala)-アラニン(Ala)-アスパラギン
    (Asn)-７-(４-メチル)クマリルアミドであり、かつ前記産物は蛍光を発する(flu
    orescent)請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 選択された化合物は適するクラスII MHC分子含有細胞にペ
    プチドの蓄積(loading)及び提示(presentation)を実質的に阻害する能力がある かどうかを決定する工程をさらに含む請求項４３〜４５のいずれか一つに記載の
    方法。
  47. 【請求項４７】 適するクラスII MHC分子含有細胞によりT細胞活性を実質 的に阻害する能力が前記選択された化合物にあるかどうかが決定される請求項４
    ６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 アスパラギンエンドペプチダーゼをコードする遺伝子が修
    飾され前記遺伝子からアスパラギンエンドペプチダーゼは実質的には発現されな
    い非ヒト(A non-human)トランスジェニック動物。
  49. 【請求項４９】 請求項４８に記載の非ヒトトランスジェニック動物であっ
    て、前記非ヒトトランスジェニック動物はマウスである非ヒトトランスジェニッ
    ク動物。
  50. 【請求項５０】 自発的またはタンパク質抗原の投与のどちらかによる自己
    免疫病の傾向がある遺伝的背景をさらに含む請求項４８または４９に記載の非ヒ
    トトランスジェニック動物。
  51. 【請求項５１】 ヒトクラスII MHC分子に関してさらにトランスジェニック
    でかつ、任意に、ヒトCD4に関してさらにトランスジェニックな請求項４８また は４９に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  52. 【請求項５２】 構造B1-(Xa-Xn)-アスパラギン(Asn)-Qを有し、B1は適切な
    N末端遮断基であり；Xa-XnはクラスII MHC分子の不変鎖におけるアスパラギン(A
    sn)切断部位に近接するN末端のnアミノ酸残基であり；アスパラギン(Asn)はアス
    パラギン残基であり；Qはアスパラギンエンドペプチダーゼの活性部位に反応で きる基であるアスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤。
  53. 【請求項５３】 (Xa-Xn)のアミノ酸残基数は１から２５の間、好ましくは ２から１０の間である請求項５２に記載の阻害剤。
  54. 【請求項５４】 B1-セリン(Ser)-グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q；
    B1-ロイシン(Leu)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-ロイシン(Leu)
    -グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-プロリン(Pro)-グルタミン酸(Glu)
    -アスパラギン(Asn)-Q；B1-ロイシン(Leu)-リジン(Lys)-アスパラギン(Asn)-Q；
    B1-グルタミン(Gln)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-グルタミン酸(Glu)-アスパラギ ン(Asn)-Q；B1-アスパラギン酸(Asp)-グルタミン酸(Glu)-アスパラギン(Asn)-Q ；B1-アスパラギン(Asn)-グリシン(Gly)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-フェニルア ラニン(Phe)-プロリン(Pro)-アスパラギン(Asn)-Q；B1-バリン(Val)-プロリン(P
    ro)-アスパラギン(Asn)-Q；及びB1-ヒスチジン(His)-ヒスチジン(His)-アスパラ
    ギン(Asn)-Qのいずれかである請求項５３に記載の阻害剤。
  55. 【請求項５５】 構造(Xb-Xc)アスパラギン(Asn)(Xd-Xe)を有し、(Xb-Xc)は
    クラスII MHC分子の不変鎖におけるアスパラギン(Asn)切断部位に近接するN末端
    のrアミノ酸残基であり、かつ(Xd-Xe)はクラスII MHC分子の不変鎖におけるアス
    パラギン(Asn)切断部位に近接するC末端のsアミノ酸残基であり；アスパラギン(
    Asn)はアスパラギン残基であり；r及びsはそれぞれ２から２５の間であるアスパ
    ラギンエンドペプチダーゼの阻害剤。
  56. 【請求項５６】 アスパラギンエンドペプチダーゼの阻害剤及びカテプシン
    Sの阻害剤を含む化合物。
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