JP2000508175A

JP2000508175A - 組み換え酵母用培地を改良する方法

Info

Publication number: JP2000508175A
Application number: JP9536445A
Authority: JP
Inventors: チヤン，チンユー; グリースハム，ランドルフ・エル
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-04-10
Filing date: 1997-04-07
Publication date: 2000-07-04
Also published as: CA2251014A1; EP0896628A1; AU2446997A; WO1997038122A1

Abstract

(57)【要約】培地中に用いるべき酵母抽出物の不良ロットを同定し、酵母抽出物の前記ロットにアデニン、トレハロース及び／またはラクテートの適当な組み合わせを補充することによって酵母組み換え体発現系の収量を改善する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称組み換え酵母用培地を改良する方法発明の背景医薬に有用な化合物を組み換え酵母の培養によって製造することは、科学及び商業の分野で広く行なわれている。精製組み換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）はＢ型肝炎ウイルス性疾患のワクチンとして用いられ、医薬に有用な組み換えタンパク質の良く知られた一例である。組み換えＨＢｓＡｇは、複合培地または化学的に規定した（合成）培地中で酵母細胞を培養することにより製造する。通常、複合培地は酵母抽出物及びペプトンなどの粗な窒素源を含有する。このような複合培地においては、細胞及び粗なＨＢｓＡｇの収量は増えるが総性能がしばしば変動し、時に許容干能なほど不安定となる。発酵性能の不安定性は後段の精製ステップに悪影響を及ぼし、精製製品のコストを上昇させる場合も有る。組み換えタンパク質の製造には通常、調節発現系を用いる。或る種の調節系では異種タンパク質産生の厳密な栄養制御を行なう。この種の系は、バイオマスの生産及び製品の安定性を最大限に実現する一方、異種タンパク質の発現が宿主細胞に及ぼす悪影響を最小限に留める。例えばＺａｂｒｉｓｋｉｅ等，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌ．８，ｐｐ．７０６ −７１７，１９８９を参照されたい。ｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．の商標）製造用の組み換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を用い、この株は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターに連結したＨＢｓＡｇコーディング配列、並びに酵母２μプラスミド由来の複製開始点、及び酵母細胞における選択用のＬＥＵ２遺伝子が組み込まれたプラスミドを保持する。この株はアデニン要求株（ａｄｅｎｉｎｅａｕｘｏｔｒｏｐｈ）であり、即ち増殖にアデニンを必要とする。酵母の他のアデニン要求株、例えばＡＤＥ１またはＡＤＥ２座において突然変異した株は、典型的には異種タンパク質発現のための組み換え宿主として用いられる。例えばＰ．Ｋｎｉｓｋｅｒｎ等が“ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓｆｏｒＰｒｏｃｅｓｓｅｓｆｏｒＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＰｒｏｄｕｃｔｓ，”Ｈａｔｃｈ等編，ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓＮ．４４７（ｃｈ．６），ｐｐ．６５−７５，１９９１に述べていること、及びＬ．Ｓｃｈｕｌｔｚ等，Ｇｅｎｅ６１，ｐ．１２３，１９８７を参照されたい。複合培地の、発酵性能、特に収量に影響する（１種以上の）成分を同定することが望ましいと考えられる。前記成分を発見すれば、発酵過程の再現性を高めることができ、また精製をより確実に実施し得るなどの利点が得られる。酵母抽出物は通常酵母発酵用培地中で、栄養素のビタミン、微量元素及び窒素の供給源として用いる。多くの発酵過程において、発酵の間に制限的（ｌｉｍｉｔｉｎｇ）となる栄養素源は炭素源である。販売元の製造方法の変動に起因して酵母抽出物がロット毎に変化することは、組み換え酵母発酵、例えばＲｎｃ．の商標）産生酵母発酵の生産性及び安定性に甚だしく影響する。この問題は過去に、新しい酵母抽出物ロットの「強制的（ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ）」発酵スクリーニング（「使用試験」）によって一部解決された。その結果、付加的な人手及び手段が必要となり、また判断の遅れが原因で「優良」ロットを確保できなかったり、「劣悪」ロットを購入し、廃棄しなければならなかったりする場合が生じた。このような短所は、まに影響する様々な重要成分を同定すること、及び前記成分について迅速にアッセイする方法を確立することにより克服できる。十分に典型的なデータベースを構成すれば、分析結果を用いて酵母発酵に望ましいものであるかどうかを評価し得る。本発明は、酵母抽出物ロットがＨＢｓＡｇ（Ｒｅｃｏｍｂｉ用として「優良」であるかどうかを、アデニン、トレハロース及び乳酸などの様々な重要成分の含量を測定することによって迅速に決定する方法に係わる。本発明の単純で、迅速に行なえるスクリーニング操作により、非最適（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）レベルの上記成分を含有するロットを排除して、ほとんど（約８０％のロット）の場合に高く、かつ安定した発酵生産性を達成することができる。本発明の方法は、「劣悪」な酵母抽出物ロットに発酵収量を改善する成分を適宜補充することによる発酵収量改善も可能にする。本発明者はアデニン及び２種の代謝性炭素源（トレハロース及びラクテート）を酵母抽出物の、発酵を不安定にする重要成分として同定した。アデニンは増殖に必要であり、一方緩慢に代謝されるトレハロースは増殖期後に発現産物の合成において、組み換え遺伝子発現のためのエネルギーを供給する。急速に利用されるラクテートは、産生物合成のための炭素源としてより多量のエタノールを節約することによって間接的に正の作用を及ぼす。増殖及び産生に対するこれらの作用は相互依存性である。炭素源（トレハロース＋ラクテート）レベルが比較的高く（＞４ｇ／４２ｇ）、かつアデニンレベルが中庸である（０．０６〜０．１ｇ／４２ｇ）ことが、酵母の培養及び組なＨＢｓＡｇの製造用として優良な酵母抽出物ロットの必須の特性である。発明の概要本発明は、組み換え酵母の培養及び組み換えタンパク質の製造に有用な培地を改良する方法を提供する。本発明の方法によって得られる培地は、ＨＢｓＡｇを産生する組み換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の培養に特に有用である。発明の詳細な説明本発明は、酵母細胞に組み換えタンパク質を産生させる一般的な発酵方法に係わる。本発明の方法を、ＨＢｓＡｇ遺伝子を含むプラスミドで形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のバッチ発酵によるＨＢｓＡｇ製造によって明示する。当業者には理解されようが、本発明の方法は他のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の培養及び他の組み換え産物の製造にも広く適用でき、ＨＢｓＡｇに限定されない。通常、複合培地中での酵母バッチ発酵の過程は用いるＹＥ（酵母抽出物）ロットのアデニン及びトレハロース／ラクテート含量に応じて増殖制限型または炭素源制限型となる。ＹＥの上記重要成分の濃度は、販売元の製造方法の変動に起因して甚だしく変動する恐れが有る。このような不安定さは発酵性能、例えばＨＢｓＡｇ産生量のばらつきの一因となる。ＹＥ中のアデニン、トレハロース及びラクテートに関する分析手段は開発されている。アデニン含量がバイオマス生産を決定付ける一方で、炭素源（トレハロース＋ラクテート）含量は抗原（ＨＢｓＡｇ）産物合成に影響し、これら二つの作用は互いに関連する。中庸レベル（０．０６〜０．１ｇ／４２ｇＹＥ）のアデニン及び高レベル（＞４ｇ／４２ｇＹＥ）のトレハロース＋ラクテートが優良ロットの必要条件であり、ただしその際ラクテートの濃度は約４．０ｇ／４２ｇＹＥを越えない。約４．０ｇ／４２ｇＹＥを越えるラクテート濃度は発酵ｐＨプロフィールを甚だしく変化させる。アデニン、トレハロースもしくはラクテート、またはこれらの組み合わせを適宜補充することによって多くの劣悪ロットを改良できる。本発明は、組み換え酵母原栄養株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) トレハロース及びラクテートの濃度を測定するステップ、 c) トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以上に調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法を提供する。本発明の一具体例は、組み換え酵母原栄養株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) トレハロース及びラクテートの濃度を測定するステップ、 c) トレハロース＋ラタテートの儂度を酵母抽出物４２ｇ当たり約５．０〜約８．０ｇに調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法を提供する。本発明は、組み換え酵母原栄養株のための制限的炭素源を含有する発酵用酵母抽出物の不良ロットを同定する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) トレハロース及びラクテートの濃度を測定するステップ、及び c) 非最適濃度のトレハロースまたはラクテートを含有するロットを不良ロットとして同定するステップを含む方法も提供する。本発明の別の具体例は、組み換え酵母アデニン要求株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、 c) アデニンの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約０．０６〜約０．１０ｇに調節し、トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以上に調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法を提供する。本発明の別の具体例は、組み換え酵母アデニン要求株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、 c) アデニンの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約０．０６〜約０．１０ｇに調節し、トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約５．０〜約８．０ｇに調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法を提供する。本発明の別の具体例は、制限的炭素源を含有する組み換え酵母アデニン要求株発酵用酵母抽出物の不良ロットを同定する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、及び c) 非最適濃度のアデニン、トレハロースもしくはラクテート、またはこれらの組み合わせを含有するロットを不良ロットとして同定するステップを含む方法を提供する。本発明の別の具体例は、組み換えＢ型肝炎表面抗原の合成に用いられる組み換え酵母アデニン要求株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、 c) アデニンの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約０．０６〜約０．１ｇに調節し、トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以上に調節し、ただしその際ラタテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法を提供する。本発明の別の具体例は、組み換えＢ型肝炎表面抗原の合成に用いられる組み換え酵母アデニン要求株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、 c) アデニンの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約０．０６〜約０．１ｇに調節し、トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約５．０〜約８．０ｇに調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法を提供する。本発明の別の具体例は、組み換えＢ型肝炎表面抗原の合成において制限的炭素源を含有する組み換え酵母アデニン要求株発酵用酵母抽出物の不良ロットを同定する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを所定の量で用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートの濃度を測定するステップ、及びｃ）非最適濃度のアデニン、トレハロースもしくはラクテート、またはこれらの組み合わせを含有するロットを不良ロットとして同定するステップを含む方法を提供する。酵母アデニン要求株は、不良ロッドを同定し、また酵母抽出物に適宜成分を補充する技術を具体的に説明するべく提示されたと理解される。他の酵母栄養要求株、並びに酵母原栄養株も、組み換えタンパク質合成のための酵母抽出物分析スクリーニング及び成分補充に適したソースを提供する。本発明において、トレハロース＋ラクテート合計含量の好ましい一例はＹＥ４２ｇ当たり約４．０ｇ以上であり、ただしその際ラクテートの濃度はＹＥ４２ｇ当たり約４．０ｇを越えない。ラクテート濃度の前記上限により、高い発酵ｐＨに起因して収量が最適でなくなる事態が回避される。トレハロース濃度には原則として制限は無いが、トレハロースはそのレベルが約８．０ｇ／４２ｇＹＥを上回ると、典型的には代謝されなくなる。より高い濃度では、トレハロースの有毒作用は観察されていない。少なくともトレハロースとラクテートとの両方を培地中に存在させることが好ましく、なぜならこれらは異なる発酵段階に付加的炭素源を提供するからである。酵母抽出物（ＹＥ）は培地１ｌにつき４２ｇ用いる。「少量増殖」ロットの発酵性能の改善通常、増殖が少量であると体積測定ＨＢｓＡｇ（即ち抗原）収量も僅かとなるが、増殖が多量であっても抗原が順調に産生されない場合もしばしば有ることが観察された。０．２ｇ／ｌ以上のアデニンの添加によって増殖が、「超多量増殖、少収量」ロットで実現する増殖の域まで促進されたので、大量のバイオマス生産により、抗原合成に関連し、また該合成に必要な他の栄養素／因子が枯渇した恐れが有った。従って、予測どおりの小さい抗原力価をもたらす「少量増殖」ロットを用いてアデニン滴定試験を行なった。得られた結果から、アデニン濃度が（０．２ｇ／ｌまで）上昇するにつれて次第に増殖が増加する一方で、抗原収量に関しては明らかに最適のアデニンレベルが存在することが判明した。この試験の場合、０．１ｇ／ｌの添加によって力価が６０％増大した。別の酵母抽出物ロット中で増殖させた培養物のオンライン呼吸プロフィールにより、元の培地がアデニンを制限されたこと、及び０．０４ｇ／ｌのアデニンの添加によって増殖が著しく促進されたことが明らかに証明された。対照バッチに比較してバイオマスは４０％増加し、抗原力価は２０％増大した。〜３２時間経過時点でのＯＵＲ（酸素取り込み率）の急激な低下は、高いアデニン濃度がもたらす多量の増殖により、抗原合成のためのエネルギー源の既知の提供体であるエタノール（培養物によるグルコース発酵から蓄積）が急速に枯渇し、その結果抗原力価の増大がバイオマスの増加を下回ったことを示唆している。ＹＥ中のアデニンに関する酵素アッセイＮａｈｅｒ（ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ４，ｐ．１９０９，１９７４）に基づく方法を開発した。この方法では、アデニンを亜硝酸で脱アミノ化してヒポキサンチンとし、これをキサンチンオキシダーゼで急速かつ定量的に酸化してキサンチンとし、更には２９３ｎｍで測定可能な尿酸とする（実施例参照）。このアッセイで行なったアデニンの尿酸への変換は完全で、かつ定量的であった。最後に、キサンチンオキシダーゼを除外したところ、尿酸の生成を観察しなかった。ＹＥロットについて測定したアデニン含量は加熱滅菌条件に感受性でないことが判明したが、このことは２１容振盪フラスコ規模で確認したアデニンと増殖との関係が大きい規模にも該当し得ることを示している。ＹＥアデニン含量と発酵性能との関係２１規模におけるロットのバイオマス及び抗原生産をアデニン含量との関連において測定した。増殖とアデニンとの間には高度の相関関係が認められ、即ちバイオマスは測定アデニン含量が酵母抽出物（ＹＥ）４２ｇ当たり約０．１２ｇとなるまでアデニンと共に増加し、その後はアデニンレベルはもはや増殖の制限要因ではなくなった。しかし、アデニンと抗原収量との間には、ほとんどの「多収量」ロット（ＨＢｓＡｇ≧３８ｍｇ／ｌ）が中庸レベル（０．０６〜０．１０ｇ／４２ｇＹＥ）のアデニンを含有したこと以外直接の関係は存在せず、前記アデニンレベル範囲は幾つかの「少収量」ロットにも該当した。即ち、中位のアデニン含量は、最適抗原（ＨＢｓＡｇ）産生の条件として望ましくはあるが十分ではない。ＹＥ中の代謝性炭素源としてのトレハロース及びラクテートの同定幾つかのＹＥロットへのアデニンの補充は増殖の促進を招いたが、ＨＢｓＡｇの特異的産生を減少させ、高いアデニン含量に起因して「超多量増殖性」となった幾つかのロットはきわめて僅かな抗原収量しかもたらさなかった。このことは、多量の増殖によって抗原合成に必要なエタノールなどのエネルギー源が枯渇したためと説明し得る。他方、（いずれの発酵物中にも常に存在する）グルコースから同様量のエタノールが生成するはずであるが、多くの場合増殖、またはＹＥアデニン含量のみから発酵の抗原収量を予測することは不可能であり、きわめて類似したアデニンまたはバイオマスレベルを有するロットに関し甚だしく相違する前記収量が得られた。炭水化物ＨＰＬＣ分析を発酵速度論的分析と関連付けて用いてＹＥ成分を調べた。実質的にいずれのＹＥロット中にも、大きい二糖ピークとより小さい「ラクテート」ピークとによって示される２種の代謝性成分が存在し、これらの成分のレベルはロット毎に変動することが判明した。上記二つのピークは発酵後に縮小または消滅したので、対応する化合物は炭素／エネルギー源として機能することにより発酵に寄与したはずである。二糖ピークはマルトースの異性体であるトレハロースを示すと理解したが、なぜならＹＥ試料を特異的トレハラーゼで処理すると該ピークが縮小し、グルコースピークが生じるからである。「ラクテート」成分に関しては、ＹＥ試料をＬ− ラクテート２−モノオキシゲナーゼと共にインキュベートするとピークが縮小し、アセテートピークが生じた。上記２成分の構造を確認するべく、これらの成分をＹＥから、熱エタノール抽出とこれに続く分析カラム上での分取ＨＰＬＣとによって精製した。精製した化合物をＮＭＲ試験により、トレハロース及びラクテートとして同定した。トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシルα−Ｄ−グルコピラノシド）は、パン酵母が環境ストレスに応じて合成する貯蔵物質である。トレハロース含量は乾燥細胞重量に基づき２０％に達する。販売元の培養過程、及びより後段の過程が絶対に不変であることはあり得ないので、様々なＹＥロットのトレハロース含量がＹＥ４２ｇ当たり１ｇ未満から７ｇを上回るものまできわめて様々となることがＨＰＬＣにより判明した。ラクテート成分の場合は、パン酵母がこの代謝物を蓄積しないので、パン酵母工業では通常の現象である販売元の装造過程の間の乳酸桿菌汚染に起因してしばしば少量（大抵の場合＜３ｇ／４２ｇＹＥ）しか検出されない。２３ｌ規模の酵母発酵の間、ＹＥに由来するトレハロース及びラクテートの利用を監視した。ラクテートはグルコース利用後に増殖のための炭素源として急速に代謝され、それによって抗原産生のための既知のエネルギー源である蓄積エタノールの枯渇が遅延されることが判明した。ブイヨンｐＨはラクテート利用の間に増大し、その後減小して元に戻った。グリセロールが蓄積されたが、膜不透過性であるため再利用されなかった。トレハロースは蓄積エタノールの酸化の間及び後にゆっくり異化され、即ち組み換え産物の抗原（ＨＢｓＡｇ）が合成される発酵後期の間炭素／エネルギー源として機能した。エネルギー源という機能の外に、トレハロースは細胞膜構造を環境ストレスに対して安定化するという別の妥当な機能も有する。トレハロース＋ラクテートのレベルと発酵性能との関係２１酵母発酵において評価した様々なロットを、そのトレハロース及びラクテート含量について分析した。炭素源（トレハロース＋ラクテート）含量とバイオマスとの関係には、ほとんどの発酵がアデニンによって制限されるような、増殖とＹＥ炭素源含量とを関係付ける明らかな相関関係は認められなかった。しかし、６ｇ／４２ｇＹＥまでは炭素源含量が高いほど大きい抗原力価が得られるという、きわめて明らかな傾向は存在する。「優良」ロット（ＨＢｓＡｇ収量が３８ｍｇ／ｌを上回る）の大部分は４ｇ／４２ｇＹＥより多い炭素源を含有し、前記レベルより低レベルの炭素源しか含有しないロットは実質的に総て「劣悪」であった。しかし、かなりの炭素源含量を有するロットの総てが「優良」であった訳ではない。「優良」ロットの約８０％は中庸レベル（０．０６〜０．１ｇ／４２ｇＹＥ）のアデニンを含有する。ラクテート補充が発酵性能に及ぼす影響高レベル（０．１３ｇ／ｌ）のアデニン及び低レベル（トレハロース２．７ｇ／ｌ；ラクテート０．６ｇ／ｌ）の炭素源を含有するＹＥロットに２３ｌ規模でラクテートを補充したところ、正の効果が得られた。ラクテート代謝がｐＨを増大させることが判明したので、ｐＨを手動制御して対照と整合させた。明らかに、４．５ｇ／ｌ以上のラクテートを存在させると炭素源は増殖に利用され、即ちエタノールが節約される。その結果、（ＣＯ₂発生速度即ちＣＥＲに現われる）エタノールの枯渇が遅延され、それによって抗原合成に用いられ得るエネルギー源が増加し、従ってより大きいＨＢｓＡｇ力価が得られる。トレハロースの作用の新規な機序、及び適当な成分補充による劣悪ロットの改良トレハロースの既知の機能の一つに微生物膜の一体性を環境ストレスから保護することが有り、この機能は、リン脂質のホスホジエステル結合と結合するというトレハロースの独得の特性によってもたらされる。しかし、酵母発酵では、トレハロースの正の作用はしばしばトレハロースが無傷でない場合、即ちグルコースに分解し、かつ異化された場合に観察された。トレハロースは増殖及び産生物合成のためのグルコースをゆっくり供給することによって酵母発酵に影響すると考えられた。後者の作用は主として、２４〜３６時間（ロット次第）経過時点でエタノールが枯渇し、その結果指数増殖が停止した後、グルコースから製造されたグリセロールは再利用され得ず、またＹＥ及びＨｙ−Ｓｏｙによってもたらされたラクテートはより早い時期に枯渇してしまっているのでトレハロースが抗原合成に用いられ得る唯一の炭素／エネルギー源となることであった。このような新規な機序に基づき、劣悪なＹＥロット（アデニン含量が高く、トレハロース＋ラクテート含量が低い）をトレハロースの追加によって改良する。一例では、対照から、トレハロースを追加しないと抗原合成はエタノールが枯渇した（ＯＵＲによって判断）時実質的に停止し、また元来存在したトレハロースのほとんどは〜３０時間経過時点で費消されることが知見された。１時間も経過しない時点でグルコースを追加すると、増殖に用いられるエタノール（及び使用不能のグリセロール）がより多く蓄積されたが、それによってエタノールの枯渇は僅かしか遅延されず、即ち抗原力価は僅かしか増大し得なかった。トレハロースを約８ｇ／４２ｇＹＥのレベルまで補充したところ、類似の異化プロフィールが観察され、合成期の間トレハロースの利用によって炭素／エネルギーが提供され、その結果細胞はより活性となり（ＯＵＲプロフィールに反映）、抗原収量は有意に増加した。上記より多量のトレハロースを用いても、グルコースを追加した場合同様エタノールの枯渇は遅延されなかったことは注目に値し、この事実は異なる機序の存在、並びに抗原合成にエネルギーが用いられることを確実にした、ゆっくり放出される炭素／エネルギー源の重要性を示している。２３ｌ容発酵槽規模における、低レベルから中庸レベルのトレハロースを含有する様々なロットへのトレハロース補充の影響によって、前記ロットのうちのほとんどが主に特異的産生の拡大を介して改良され、一方バイオマスは抗原力価の増大に比較して僅かしか増加しないことが示された。ほとんどの場合、オンラインＯＵＲプロフィールは合成期の呼吸活性が個々の対照に比較して著しく高いことを示した。実施例１培養種菌発育及び生産発酵いずれの実験用の培養ソースも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２１５０−２−３（ｐＨＢＳ５６−ＧＡＰ３４７／３３）の凍結バイアルに由来する凍結保存種菌とした。いずれの種菌段階用の培地も、デキストロース９０ｇ／ｌ含有の５×Ｌｅｕ^- とした。生産発酵培地は、４２ｇ／ｌの酵母抽出物（ＹＥ）、３５ｇ／ｌのＨｙ −Ｓｏｙペプトン及び１７ｇ／ｌのデキストロース（個別に滅菌）を含有する、滅菌前ｐＨを５．０に調節されたＥｎｈａｎｃｅｄＹＥＨＤとした。消泡剤としてポリアルキレングリコールを、振盪フラスコ発酵では０．５ｍｌ／ｌ、攪拌槽発酵では１ｍｌ／ｌの量で添加した。アデニン、ラクテートまたはトレハロースは滅菌前に、特定した濃度で添加した。凍結細胞懸濁液（１．５ｍｌ）を室温で解凍し、５０ｍｌの培地を収容した２５０ｍｌ容Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに接種した。回転振盪機（２２０ｒｐｍ；２８℃）上で２４時間インキュベーション後、２０ｍｌの培養物を、５００ｍｌの培地を収容した２ｌ容Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、回転振盪機上で１８０ｒｐｍ及び２８℃で２４時間培養した。培養物を、２ｌ容振盪フラスコ内及び２３ｌ容槽内での発酵試験のための種菌として用いた。別の２３ｌ規模発酵用として、１５ｌの培地を収容した２３ｌ容槽内で２８℃で２４時間、６００ｒｐｍでの攪拌及び６ｌ／分での通気下に発育させた第三の種菌段階培養物を用いた。振盪フラスコ規模で行なった発酵試験では、２００ｍｌのＥｎｈａｎｃｅｄＹＥＨＤ培地を収容した２ｌ容の邪魔板付き（ｂａｆｆｌｅｄ）フラスコを用いた。フラスコに４％（ｖ／ｖ）の種菌培養物を接種し、これを回転振盪機上で２８℃及び１８０ｒｐｍで２日間インキュベートした。２３ｌ容攪拌槽発酵では種菌として、振盪フラスコ用種菌を５％の量で、または第三の種菌段階培養物を８％の量で用いた。槽は、６００ｒｐｍでの攪拌、１２ｌ／分での通気、及び０．６ｂａｒの背圧下に２８℃で機能させた。呼吸活性（酸素取り込み率即ちＯＵＲ、及びＣＯ₂発生率即ちＣＥＲ）、溶存酸素及びｐＨをオンラインで監視し、一方炭水化物をＨＰＬＣによりオフラインで監視した。実施例２分析増殖を分光光度計で６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）によって、または乾燥細胞重量（ＤＣＷ）によって測定した。これら二つの方法から、実質的に同じ結論が得られた。グルコース、トレハロース、ラクテート及びエタノールなどの炭素源化合物をＨＰＬＣシステムによって分析した。抗原産生を跡付けるべく、様々な時点に採取した発酵ブイヨン試料から５０ＯＤ単位の細胞ペレットを調製し、これをＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、破壊に至るまで−７０℃で貯蔵した。細胞をガラスビーズと共に攪拌することによって溶解物を調製した。細胞溶解物のタンパク質含量をビシンコニン酸法（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄｍｅｔｈｏｄ）で分析し、ＨＢｓＡｇ濃度を、市販のアッセイキットを用いるエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）によって測定した。総ての結果を逆算し、発酵力両（ｍｇ／ｌ）として表わした。複数の実験及び個々の対照に関して同一条件下に同時に実施し、それによってアッセイキット、標準、及びアッセイ条件に起因する変動を最小限に留めたアッセイからデータを得た。同様に、比較は総て同じ実験に基づいて行ない、それによって培養条件に起因する差異を排除した。測定を２回以上行なった場合、平均の結果を用いた。実施例３酵母抽出物のアデニン含量の測定様々なＹＥロットのアデニン含量を、亜硝酸によるアデニンの脱アミノ化及びキサンチンオキシダーゼによる酸化により２９３ｎｍで測定可能な尿酸を得る、Ｎａｈｅｒ（ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ４，ｐ．１９０９，１９７４）に基づき開発した酵素アッセイによって測定した。操作は次のとおりである。 1．１．０５ｇのＹＥ粉末に２４．５ｍｌの水及び０．２ｍｌの２ＮＨＣｌを添加し、これを完全に混合して透明な溶液を得ることにより４２ｇ／ｌのＹＥ試料を調製する（濁った溶液を与えるロットは望ましくない）。また、ｐＨ２の１．０ｇ／ｌストック溶液（４℃で何カ月にもわたり安定）を水で稀釈することによってアデニン標準溶液（０、０．０２５、０．０５、０．１０、０．２０、０．４０ｇ／ｌ）も調製する。 2．蓋をしない５０ｍｌ容管内で２．０ｍｌのＹＥ試料またはアデニン標準溶液を０．９ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）硝酸ナトリウム及び０．１ｍｌの非稀薄硝酸と共に攪拌し、完全に混合する。得られた混合物を直ちに３７℃の水浴に入れて６０分間インキュベートし、その際蓋をしていない管をペーパータオルで覆う。 3．管を浴から取り出した後、水酸化ナトリウムの２０％（ｗ／ｖ）溶液１．０ｍｌを添加して十分混合し、反応を停止させる。この混合物は以下のステップにおいてアッセイ溶液として有用であり、４℃において少なくとも１カ月安定であることが判明した。 4．トリス緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ８．０）に空気を吹き付ける（ｓｐａｒｇｅ）ことによって該緩衝液に酸素を飽和させる。この緩衝液３．０ｍｌと、３０μ ｌのアッセイ溶液とを５ｍｌ容のキュベットに入れる。キュベットをパラフィルムで封止し、かつ逆さにして中味を混合し、その後直ちに、アデニン含量０ｇ／ｌの標準溶液でリセット（ｂｌａｎｋ）した分光光度計上で２９３ｎｍにおける消衰（Ｅ１）を読み取る。読み取りは各測定毎に２回行なうべきであり、その際読み取った値は０．００２より大きく相違するべきでない。 5．上記キュベットに１０μｌの１：１０稀釈キサンチンオキシダーゼ懸濁液（１５．６１Ｕ／ｍｌ；３．２Ｍ硫酸アンモニウムで稀釈）を添加し、このキュベットをパラフィルムで封止する。キュベットを逆さにして中味を混合し、その後直ちに、及び一定／最大値（Ｅ２）に到達するまで（通常３０分未満の間）５分置きに同じ分光光度計上で上記と同様にして２９２ｎｍにおける消衰を読み取る。 6．真正アデニン試料（０、０．０２５、０．０５、０．１０、０．２０、０．４０ｇ／ｌ；ＹＥ試料と同時に同一操作で処理）から得られた標準曲線に基づき、ＹＥロットのアデニン濃度（ｇ／４２ｇＹＥ）を当該ロットのＥ値から推定する。Ｅ値は次式に従って計算する（「ｂｌａｎｋ」は０ｇ／ｌのアデニン含有）。Ｅ＝（Ｅ２−Ｅ１）_sample−（Ｅ２−Ｅ１）_blank 実施例４トレハロース及びラクテートの測定様々な酵母抽出物（ＹＥ）ロットのトレハロース及びラクテート含量を、イオン交換カラムを用いるＨＰＬＣ法によって測定した。操作は次のとおりである。 1．アデニン分析の場合と同様にして４２ｇ／ｌのＹＥ試料を調製する。試料を０．００５Ｍ硫酸（移動相）で稀釈し（１：５）、その後０．４５μｍ膜で濾過する。トレハロース（二水和物）標準溶液（０〜２．０ｇ／ｌ）及びＮａ−ラクテート標準溶液（０〜１．０ｇ／ｌ）も移動相を用いて調製する。 2．ＨＰＬＣシステム上でトレハロース及びラクテートに関する標準曲線を得、その後ＹＥ試料を分析する。装置は、溶媒給送ポンプ、自動試料注入器及び検出器を具備したものを使用する。ポリスチレンジビニルベンゼンカチオン交換樹脂（有機酸及びアルコール用）を入れ、６０℃に維持したカラムに２０μｌ試料を注入する。試料を、０．７ｍｌ／分で給送する０．００５Ｍ硫酸でアイソクラチック溶離し、屈折率（ＲＩ）変化について監視する。試料ピークを真正化合物のピークとの比較によって同定し、当該化合物を定量する。上記条件下に、トレハロースは〜７．３分経過時点で、またラクテートは〜１２．６分経過時点で溶出した。実施例５トレハロース及びラクテートの精製その構造をＮＭＲによって確認するべくトレハロース及びラクテートをＹＥから、熱エタノール抽出と、続く分析カラム上での分取ＨＰＬＣとによって精製した。５０ｇのＹＥに２００ｍｌのエタノールを添加し、得られた混合物を８５〜９０℃の水浴中で３０分間攪拌した。濾液を室温に冷却し、生じた沈澱物を回収した。沈澱物を、冷エタノールで洗浄し、かつ風乾してから２ｍｌの水に溶解させた。トレハロースに関し重量純度３０％以上と推定される調製物を、更に精製するため上記分析用ＨＰＬＣシステムにおいて繰り返し注入及び溶離した（分取カラムは使用可能でなかった）。プールしたトレハロース及びラクテート画分を凍結乾燥し、その後ＮＭＲで構造を確認した。本明細書には本発明の原理を教示し、その際説明のために実施例を提示したが、本発明の実施には以下の請求の範囲各項の記載とその均等物を逸脱しない通常の変更、適合化または変形が総て含まれると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者グリースハム，ランドルフ・エルアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．組み換え酵母原栄養株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを用意するステップ、 b) トレハロース及びラタテートの濃度を測定するステップ、 c) トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以上に調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法。２．ステップc)のトレハロース＋ラクテートの濃度の調節を酵母抽出物４２ｇ当たり約５．０〜約８．０ｇとし、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．組み換え酵母原栄養株のための制限的炭素源を含有する発酵用酵母抽出物の不良ロットを同定する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを用意するステップ、 b) トレハロース及びラクテートの濃度を測定するステップ、及び c) 非最適濃度のトレハロースまたはラクテートを含有するロットを不良ロットとして同定するステップを含む方法。４．組み換え酵母アデニン要求株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、 c) アデニンの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約０．０６〜約０．１０ｇに調節し、トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以上に調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法。５．ステップc)のトレハロース＋ラクテートの濃度の調節を酵母抽出物４２ｇ当たり約５．０〜約８．０ｇとし、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とすることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．制限的炭素源を含有する組み換え酵母アデニン要求株発酵用酵母抽出物の不良ロットを同定する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、及び c) 非最適濃度のアデニン、トレハロースもしくはラクテート、またはこれらの組み合わせを含有するロットを不良ロットとして同定するステップを含む方法。７．組み換えＢ型肝炎表面抗原の合成に用いられる組み換え酵母アデニン要求株のための制限的炭素源を含有する培地を改良する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートのうちの１種以上の濃度を測定するステップ、 c) アデニンの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約０．０６〜約０．１ｇに調節し、トレハロース＋ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以上に調節し、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とするステップを含む方法。８．ステップc)のトレハロース＋ラクテートの濃度の調節を酵母抽出物４２ｇ当たり約５．０〜約８．０ｇとし、ただしその際ラクテートの濃度を酵母抽出物４２ｇ当たり約４．０ｇ以下とすることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．組み換えＢ型肝炎表面抗原の合成において制限的炭素源を含有する組み換え酵母アデニン要求株発酵用酵母抽出物の不良ロットを同定する方法であって、 a) 試験するべき所与の酵母抽出物ロットを用意するステップ、 b) アデニン、トレハロース及びラクテートの濃度を測定するステップ、及び c) 非最適濃度のアデニン、トレハロースもしくはラクテート、またはこれらの組み合わせを含有するロットを不良ロットとして同定するステップを含む方法。