JP2000508174A

JP2000508174A - タンパク質の相互作用を検出するための相互作用トラップシステム

Info

Publication number: JP2000508174A
Application number: JP9536441A
Authority: JP
Inventors: ロガーブレント; ジョンエム．マッコイ; ティムエイチ．イェセン; チャンクシングウィルソンゼウ
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1996-04-09
Filing date: 1997-04-09
Publication date: 2000-07-04
Also published as: EP0904402A4; EP0904402A1; EP1652918A2; US20030113749A1; EP1652918A3; WO1997038127A1; US6399296B1

Abstract

(57)【要約】本明細書において、第1のタンパク質が第2のタンパク質と物理的に相互作用することができるか否かを判定する方法であって、（a）（i）タンパク質結合部位に機能的に結合するレポーター遺伝子と、（ii）該タンパク質結合部位に特異的に結合することができる結合部分と共有結合する第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子と、（iii）遺伝子活性化部分と共有結合し立体配座的に制約された第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子とを有する宿主細胞を提供する段階と；（b）該第1のタンパク質と該第2のタンパク質との相互作用の指標としてレポーター遺伝子の発現を測定する段階とを含む方法について開示する。また、タンパク質の相互作用を解析する方法ならびにタンパク質の相互作用のアンタゴニストおよびアゴニストを同定する方法も開示する。これらの方法によって単離されるタンパク質も考察する。最後に、各細胞が、立体配座的に制約された細胞内ペプチドをコードする組換えDNA分子を有する、真核細胞の集団について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質の相互作用を検出するための相互作用トラップシステム関連出願の相互参照本出願は、1994年7月20日に出願された米国特許出願第08/278,082号の一部継続出願である、1995年7月20日に出願された米国特許出願第08/504,538号の一部継続出願である。発明の背景本発明は、タンパク質の相互作用を検出するための方法と新規タンパク質を単離するための方法とに関する。発明の概要概して、本発明は、タンパク質間の相互作用を検出するための方法を特徴とする。従って、一局面において、本発明は、第1のタンパク質が第2のタンパク質と物理的に相互作用することができるか否かを判定する方法を特徴とする。この方法には、（a）（i）DNA結合タンパク質認識部位に機能的に結合するレポーター遺伝子と、（ii）DNA結合タンパク質認識部位に特異的に結合することができる結合部分に共有結合した該第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子と、（iii）遺伝子活性化部分に共有結合し立体配座的に制約された該第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子とを有する宿主細胞を提供する段階、および（b）第1のタンパク質と第2のタンパク質との相互作用の指標としてレポーター遺伝子の発現を測定する段階が含まれる。好ましくは、第2のタンパク質は鎖長が少なくとも6アミノ酸の短いペプチドで、かつ鎖長が60個以下のアミノ酸であり、無作為に生じたペプチド配列または意図的に設計されたペプチド配列を含み、1つ以上のループを有し、立体配座的に制約されたタンパク質、例えばチオレドキシンまたはチオレドキシン様分子との共有結合の結果として立体配座的に制約されている。第2のタンパク質が立体配座的に制約されたタンパク質と共有結合している場合には、本発明は、共有結合している立体配座的に制約されたタンパク質内に第2のタンパク質が埋め込まれているポリペプチドを特徴とする。立体配座的に制約されたタンパク質がチオレドキシンである場合には、本発明はまた、第2のタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端のシステイン残基間のジスルフィド結合によって立体配座的に制約された第 2のタンパク質を含むさらなる方法を特徴とする。別の局面において、本発明はタンパク質集団から相互作用タンパク質を検出する方法であって、（a）（i）DNA結合タンパク質認識部位に機能的に結合するレポーター遺伝子と、（ii）DNA結合タンパク質認識部位に特異的に結合することができる結合部分と共有結合する被験タンパク質を含む融合タンパク質を発現する融合遺伝子とを含む宿主細胞を提供する段階、（b）遺伝子活性化部分と共有結合し立体配座的に制約されたタンパク質集団のうちの1つを含む第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子を宿主細胞中に導入する段階、および（c）レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む方法を特徴とする。好ましくは、タンパク質集団には、鎖長が１〜60アミノ酸の短いペプチドが含まれる。本発明はまた、タンパク質集団が無作為に生じた一連のペプチド配列もしくは意図的に設計された一連のペプチド配列である集団、または立体配座制約タンパク質と共有結合することによって立体配座的に制約された集団内で、相互作用タンパク質を検出する方法も特徴とする。好ましくは、タンパク質集団が立体配座制約タンパク質と共有結合することによって立体配座的に制約される場合には、タンパク質の集団は立体配座制約タンパク質内に埋め込まれる。本発明はさらに、立体配座制約タンパク質がチオレドキシンである集団内で相互作用するタンパク質を検出する方法を特徴する。好ましくは、細胞集団はチオレドキシンの活性部位ループ内に挿入される。本発明はさらに、タンパク質集団の各々が、該タンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端のシステイン残基間のジスルフィド結合によって立体配座的に制約される方法を特徴とする。種々の局面の好ましい態様において、宿主細胞は酵母であり、DNA結合領域はL exAであり、相互作用タンパク質が1つ以上のループを有し、および／またはレポーター遺伝子が呈色反応もしくは細胞生存率によって解析される。他の態様において、ベイト（bait）はCdk2であっても、Rasタンパク質配列であってもよい。別の関連する局面において、本発明は相互作用候補物質を同定するする方法を特徴とする。この方法は、（a）DNA結合タンパク質認識部位に機能的に結合するレポーター遺伝子を提供する段階、（b）該DNA結合タンパク質認識部位に特異的に結合することができる結合部分と共有結合する第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を提供する段階、（c）遺伝子活性部分と共有結合し、立体配座的に制約され、該第1のタンパク質と相互作用することができる第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を提供する段階、（d）該相互作用候補物質と該第1のタンパク質および／または該第2のタンパク質とを接触させる段階、および（e）該レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む。本発明は、相互作用候補物質を同定する方法であって、第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子を提供することによって第1の融合タンパク質を提供し、第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子を提供することによって第 2の融合タンパク質を提供する方法を特徴とする。別の方法として、レポーター遺伝子、第1の融合遺伝子、および第2の融合遺伝子が1本鎖のDNA片に含まれる。本発明はまた、相互作用候補物質を同定する方法であって、第1の融合タンパク質と第2の融合タンパク質とが該相互作用候補物質と接触する前に相互作用できるようにする方法、および第1の融合タンパク質と相互作用候補物質とが該第2 の融合タンパク質と接触する前に相互作用できるようにする関連の方法を特徴とする。好ましい態様において、相互作用候補物質は立体配座的に制約され、1つ以上のループを有してもよい。相互作用候補物質がアンタゴニストである場合、レポーター遺伝子の発現は低下する。相互作用候補物質がアゴニストである場合、レポーター遺伝子の発現は増加する。相互作用候補物質は、タンパク質、ポリヌクレオチドおよび小分子からなる群より選択される種である。また、相互作用候補物質はcDNAまたは合成DNAライブラリーの種によってコードされてもよい。さらに、相互作用候補物質は該第1の融合タンパク質または該第2の融合タンパク質の変異型であってもよい。上記の局面のいずれかの好ましい態様において、相互作用候補物質はインビトロにおいて単離され、インビボにおいて、すなわち立体配座的に制約された細胞内ペプチドとして機能することが示される。関連する局面において、本発明は、各細胞が立体配座的に制約された細胞内ペプチドをコードする組換えDNA分子を有し、集団中に少なくとも100種の異なる組換え分子が存在し、各分子が該集団の少なくとも1つの細胞中に存在する真核細胞の集団を特徴とする。好ましくは、細胞集団内の細胞内ペプチドは立体配座制約タンパク質と共有結合するため立体配座的に制約される。好ましい態様において、細胞内ペプチドは立体配座制約タンパク質、好ましくはチオレドキシン内に埋め込まれ、細胞内ペプチドは該第2のタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端のシステイン残基間のジスルフィド結合によって立体配座的に制約され、細胞内ペプチドは1つ以上のループを有し、真核細胞の集団は酵母細胞であり、組換えDNA分子はさらに、該細胞内ペプチドと共有結合する遺伝子活性化部分をコードし、および／または細胞内ペプチドは、該真核細胞内で第2の組換えタンパク質と物理的に相互作用する。別の局面において、本発明は第1のタンパク質と第2のタンパク質との相互作用を解析する方法を特徴とする。この方法は：（a）DNA結合タンパク質認識部位と機能的に結合するレポーター遺伝子を提供する段階、（b）DNA結合タンパク質認識部位と特異的に結合することができる結合部分と共有結合する第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を提供する段階、（c）立体配座的に制約され（および1つ以上のループを有し）、遺伝子活性化部分と共有結合する第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を提供する段階、（d）レポーター遺伝子と、第1 の融合タンパク質と、第2の融合タンパク質とを組み合わせる段階、および（e）レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む。好ましい態様において、本発明はさらに、2つのタンパク質間の相互作用を解析する方法であって、第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子を提供することによって、第1の融合タンパク質が提供され、第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子を提供することによって第2の融合タンパク質が提供される方法を特徴とする。別の好ましい態様において、相互作用はインビトロにおいて解析され、インビボにおいて、すなわち立体配座的に制約された細胞内ペプチドとして機能することが示される。さらに別の局面において、本発明は、好ましくは立体配座的に制約された配列 Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe-Arg-Ser- Leu-Phe（配列番号:1）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された；配列Met-Val-Val-Ala-Ala-Glu-Ala-Val-Arg-Thr-Val-Leu-Leu-Ala-Asp-Gl y-Gly-Asp-Val-Thr（配列番号:2）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Pro-Asn-Trp-Pro-His-Gln-Leu-Arg-Val-Gly-Arg-Val-Leu-Tr p-Glu-Arg-Leu-Ser-Phe-Glu（配列番号:3）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Ser-Val-Arg-Met-Arg-Tyr-Gly-Ile-Asp-Ala-Phe-Ph e-Asp-Leu-Gly-Gly-Leu-Leu-His-Gly（配列番号:9）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Glu-Leu-Arg-His-Arg-Leu-Gly-Arg-Ala-Le u-Ser-Glu-Asp-Met-Val-Arg-Gly-Leu-Ala-Trp-Gly-Pro-Thr-Ser-His-Cys-Ala-Th r-Val-Pro-Gly-Thr-Ser-Asp-Leu-Trp-Arg-Val-Ile-Arg-Phe-Leu（配列番号:10）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Tyr-Ser-Phe-Va l-His-His-Gly-Phe-Phe-Asn-Phe-Arg-Val-Ser-Trp-Arg-Glu-Met-Leu-Ala（配列番号:11）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Gln-V al-Trp-Ser-Leu-Trp-Ala-Leu-Gly-Trp-Arg-Trp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Trp-Asn-M et（配列番号:12）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Trp-Arg-Arg-Met-Glu-Leu-Asp-Ala-Glu-Ile-Arg-Trp-Val-Lys-Pro-Ile-Ser- Pro-Leu-Glu（配列番号:13）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Trp-Ala-Glu-Trp-Cys-Gly-Pro-Val-Cys-Ala-His-Gly-Ser-Arg-Ser- Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Lys-Tyr-His-Val-Ser-Phe-Leu-Gly-Pro-Cys-Lys-Met-Ile- Ala-Pro-Ile-Leu-Asp（配列番号:17）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly- Ala-Leu-Phe-Arg-Ser-Leu-Phe（配列番号:18）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Tyr-Arg-Trp-Gln-Gln-Gly-Val-Val-Pro-Ser-Asn- Trp-Ala-Ser-Cys-Ser-Phe-Arg-Cys-Gly（配列番号:19）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Ser-Ser-Phe-Ser-Leu-Trp-Leu-Leu-Met- Val-Lys-Ser-Ile-Lys-Arg-Ala-Ala-Trp-Glu-Leu-Gly-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Asn- Thr-Ser-Gly- Trp-Ala-Ser-Leu-Ala-Asp-Phe-Tyr（配列番号:20）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Arg-Val-Lys-Leu-Gly-Tyr-Ser-Phe-Trp-Ala- Gln-Ser-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Ser-Val-Gly（配列番号:21）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Gln-Leu-Tyr-Ala-Gly-Cys-Tyr-Leu- Gly-Val-Val-Ile-Ala-Ser-Ser-Leu-Ser-Ile-Arg-Val（配列番号:22）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Gln-Gln-Arg-Phe-Val-Phe- Ser-Pro-Ser-Trp-Phe-Thr-Cys-Ala-Gly-Thr-Ser-Asp-Phe-Trp-Gly-Pro-Glu-Pro- Leu-Phe-Asp-Trp-Thr-Arg-Asp（配列番号:23）を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Arg-Pro-Leu-Thr-Gly-Arg-Trp-Val-Val-Trp-Gly- Arg-Arg-His-Glu-Glu-Cys-Gly-Leu-Thr(配列番号:24)を有するタンパク質と；好ましくは立体配座的に制約された配列Pro-Val-Cys-Cys-Met-Met-Tyr-Gly-His-Ar g-Thr-Ala-Pro-His-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Asp（配列番号:25）を有するタンパク質と；配列Trp-Ser-Pro-Glu-Leu-Leu-Arg-Ala-Met-Val-Ala-Phe-Arg-Trp-Leu-Le u-Glu-Arg-Arg-Pro（配列番号:26）を有するタンパク質と；直前に記載したタンパク質をコードする実質的に純粋なDNAとを特徴とする。本発明はまた、前述の方法によって同定される新規タンパク質とその他の相互作用候補物質とを含む。これらのタンパク質および相互作用候補物質はレポーター遺伝子活性を増加させるものでも低下させるものでもよく、またこのような活性の変化は本明細書に記載するアッセイまたは当技術分野で公知のアッセイ法を使用して測定することができる。立体配座的に制約された相互作用タンパク質を使用するための方法も本発明に含まれる。例えば、立体配座的に制約されたタンパク質とこのタンパク質が特異的に結合する関心のあるタンパク質との複合体を形成し、次いで（例えば、複合体形成試薬として立体配座的に制約されたタンパク質を使用する免疫沈降法、ウェスタンブロット法またはアフィニティーカラム法によって）複合体を検出することに関係するタンパク質を検出するためのアッセイにおいて、本発明の立体配座的に制約されたタンパク質を試薬として使用してもよい。最後に、本発明は、第1のタンパク質と第2のタンパク質との相互作用を解析する方法であって、（a）第1のタンパク質を提供する段階、（b）立体配座的に制約された第2のタンパク質を含む融合タンパク質を提供する段階、（c）複合体の形成を可能にする条件下で第1のタンパク質と融合タンパク質とを接触させる段階、（d）相互作用の指標として複合体を検出する段階、および（e）第1のタンパク質が、細胞内で融合タンパク質と相互作用するか否かを判定する段階を含む方法を特徴とする。本明細書で用いられる「レポーター遺伝子」とは、その発現を解析することができる遺伝子を意味し、このような遺伝子には、lacZ、アミノ酸生合成遺伝子、例えば酵母LEU2遺伝子、HIS3遺伝子、LYS2遺伝子、TRP1遺伝子またはURA3遺伝子、核酸生合成遺伝子、哺乳類クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT ）遺伝子または特異的抗体が利用できる任意の表面抗原遺伝子が含まれるが、これに限定されない。レポーター遺伝子は、表現型マーカーとなる任意のタンパク質、例えば細胞の増殖に必要なタンパク質もしくは細胞死を生ずる毒性タンパク質をコードしていても、または呈色の有無を生ずる呈色アッセイによって検出され得るタンパク質（例えば、蛍光タンパク質およびその誘導体）をコードしていてもよい。または、レポーター遺伝子は、その発現によって解析が可能となるような表現型を生じるサプレッサーtRNAをコードしていてもよい。本発明に係るレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子機能に必要な要素（例えば、全てのプロモーター要素）を含む。「機能的に結合する」とは、適当な分子（例えば、転写活性化タンパク質または転写活性化領域を含むタンパク質）が調節配列に結合すると、遺伝子の発現を可能にするように遺伝子と調節配列とが連結することを意味する。「共有結合する」とは、2つの領域が共有結合によって直接または間接的に接続することを意味する。すなわち、「共有結合した」タンパク質またはタンパク質部分は、同一融合タンパク質内で1つ以上のアミノ酸の伸張によって速やかに接続または分離することができる。「提供する」とは、融合タンパク質を相互作用系に逐次的または同時に、および直接的（タンパク質として）または間接的に（これらのタンパク質をコードする遺伝子として）導入することを意昧する。「タンパク質」とは、天然に存在するポリペプチドもしくはペプチドの全てもしくは一部を構成する、または天然には存在しないポリペプチドもしくはペプチド（例えば、無作為に生じたペプチド配列もしくは意図的に設計されたペプチド配列集合体の1つ）を構成する任意の長さのアミノ酸の配列を意味する。「結合部分」とは、特定のDNA配列と特異的なポリペプチド結合をすることができる一連のアミノ酸を意味する（すなわち、「DNA結合タンパク質認識部位」）。「弱い遺伝子活性化部分」とは、調節領域に一連のアミノ酸が結合する遺伝子の発現を弱く誘導することができる一連のアミノ酸を意味する。本明細書において用いられる「弱く」とは、GAL4活性化領域IIによって影響される活性化の程度より小さいことを意味し（MaおよびPtashne、Cell 48:847，1987）、好ましくはマ（Ma）およびプタシュネ（Ptashne）（Cell 51:113，1987）のB112活性化領域によって影響される活性化のレベルと同じか、またはそれより小さい。活性化のレベルは任意の下流レポーター遺伝子系を使用して、平行アッセイにおいてGAL4 領域II-ポリペプチドが刺激する発現量と被験ポリペプチドが刺激する発現量とを比較することにより測定することができる。「レポーター遺伝子の発現を変更する」とは、使用するアッセイにおける変化を検出するために必要な程度まで、レポーター遺伝子の発現が増加または低下することを意味する。変化の程度は使用するレポーター遺伝子構築物またはレポーター遺伝子発現アッセイの種類に応じて変化することが期待される。「立体配座的に制約された」とは、アミノ末端およびカルボキシ末端が空間的に固定されるので、構造的な可撓性が低下したタンパク質を意味する。このような制約の結果として、タンパク質は「ループ」（すなわち、制約されたアミノ末端およびカルボキシ末端から離れて延在する任意の形状のアミノ酸領域）を形成することができる。好ましくは、立体配座的に制約されたタンパク質は構造的に強固な様式で示される。一方は関心のあるタンパク質のアミノ末端またはアミノ末端近傍に存在し、他方はカルボキシ末端またはカルボキシ末端近傍に存在する、天然または組換えにより導入されたシステイン残基対のジスルフィド結合力を利用することによって本発明による立体配座の制約を生じることができる。または、立体配座的に制約されたタンパク質内に関心のあるタンパク質を埋め込むことによって立体配座の制約を容易にすることができる。「立体配座制約タンパク質」とは、別のタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の可撓性を低下させることができる任意のペプチドまたはポリペプチドを意味する。好ましくは、このようなタンパク質は関心のあるタンパク質の強固な足場または台となる。また、このようなタンパク質は好ましくは、タンパク質分解による崩壊等に対する保護作用を提供することができ、および／または可溶性を増大させることができる。立体配座制約タンパク質の例には、チオレドキシンおよびその他のチオレドキシン様タンパク質、ヌクレアーゼ（例えば、RNase A）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ウシ膵臓トリプシン阻害剤）、抗体または構造的に強固なその断片、コノトキシンおよびプレクストリン相同領域が含まれる。立体配座制約ペプチドは適当な任意の長さであってもよく、1個のアミノ酸残基であってもよい。「チオレドキシン様タンパク質」とは、アミノ酸80個のアミノ酸配列長さの大腸菌（E．coli）チオレドキシンのアミノ酸配列と実質的に同様の、例えば少なくとも18％の相同性のアミノ酸配列と本明細書において規定する。または、チオレドキシン様DNA配列は、本明細書において、ヒトまたは大腸菌（E．coli）チオレドキシン、例えばグルタレドキシンと実質的に同様の3次元構造を有することによって特徴付けられ、また任意に活性部位ループを有することによって特徴づけられるタンパク質またはタンパク質断片をコードするDNA配列と規定する。グルタレドキシンのDNA配列は、3次元立体配座のこのような実質的な類似性を示し、Cys....Cys活性部位ループを有するタンパク質をコードするチオレドキシン様 DNA配列の一例である。大腸菌（E．coli）チオレドキシンのアミノ酸配列はエクルンド（Eklund）ら、EMBO J．3:1443-1449（1984）に記載されている。大腸菌（E．coli）チオレドキシンの3次元構造はホルムグレン（Holmgren）、J．Biol ．Chem．264:13963-13966（1989）の図2に記載されている。大腸菌（E．coli）チオレドキシンタンパク質をコードするDNA配列はリム(Lim)ら、J．Bacteriol． 163:311-316（1985）に記載されている。ヒトチオレドキシンの3次元構造はホルマン-ケイ（Forman-Kay）ら、Biochemistry 30:2685-98（1991）に記載されている。大腸菌（E．coli）チオレドキシンとグルタレドキシンの3次元構造の比較はキシア（Xia）、Protein Science I:310-321（1992）に報告されている。これら 4つの報告は、当業者に公知なチオレドキシン様タンパク質に関する情報を提供する目的のために参考文献として本明細書に組み入れられている。チオレドキシン様タンパク質の例は、本明細書に記載されている。「相互作用候補物質」とは、関心のあるタンパク質と物理的に相互作用するタンパク質（「相互作用候補タンパク質」）または化合物を意味し；この用語はまたアゴニストおよびアンタゴニストも包含する。相互作用アゴニストは、1対の相互作用タンパク質によって仲介されるレポーター遺伝子の発現を増加する能力を有する化合物またはタンパク質と同定される。相互作用アンタゴニストは、1 対の相互作用タンパク質によって仲介されるレポーター遺伝子の発現を低下させる能力を有する化合物またはタンパク質と同定される。相互作用候補物質はまた、標的タンパク質を特異的に認識し、抗体試薬と同様の様式で使用することができる、いわゆるペプチド「アプタマー」を含む；このようなアプタマーは1つ以上のループを有してもよい。「化合物」とは、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質等の、一般に1000MWより小さい小分子を含む。「被験タンパク質」とは1対の相互作用タンパク質の一方を意味し、対の他方の種は一般に「相互作用候補物質」と呼ばれる（前記）。「無作為に生じる」とは、所定の配列を有さない配列を意味する；これは、合成前に決定したDNAもしくはタンパク質配列またはモチーフを有する「意図的に設計された」配列とは対照的である。「変位型」とは部位特異的変位誘発法またはランダム突然変異誘発法のいずれかによって配列に変化を加えることを意味する。タンパク質の変位型は点突然変位、ならびに挿入、欠失または転位を含む。「細胞内」とは、ペプチドが細胞表面ではなく細胞内に局在化することを意味する。「活性型Ras」とは、対応する野生型のタンパク質によって示されるより長い期間、GTPに結合された状態を保つ任意の変異型のRasを意味する。「Ras」とはN -ras、K-rasおよびH-rasを含むが、これらに限定されない任意の型のRasタンパク質を意味する。本明細書に記載する相互作用トラップシステムにより、相互作用タンパク質または相互作用タンパク質をコードする遺伝子を単離するための従来の方法を上回る利点が提供される。例えば、本出願人らのシステムは、タンパク質が第2のポリペプチドと物理的に相互作用することに基づいて、多種多様の有用なタンパク質をコードする遺伝子を同定および精製するための非常に大きな有用性を有する迅速且つ高価でない方法を提供する。この大きな有用性は一部には、（例えば、タンパク質の相互作用に対する感受性が定量的に異なるレポーター遺伝子を使用することによって）多種多様の親和性を有するタンパク質の相互作用を検出しやすくするようにこのシステムの構成要素を容易に変更することができるという事実に由来する。その慢性的発現が宿主細胞に対して毒性であるようなタンパク質でさえも、タンパク質の短時間の突発的な発現を誘導し、その相互作用能力およびレポーター遺伝子の発現を刺激する能力について試験することにより簡単に単離できるため検出することができる相互作用タンパク質を発現させるのに用いられるプロモーターの誘導性によっても、相互作用候補物質の範囲が増大する。必要に応じて、相互作用タンパク質の検出は、弱い遺伝子活性化ドメイン標識を使用することによって行ってもよい。この方法は、（GAL4またはVP16などの）比較的強力な活性化ドメインと結合しうる利用可能な相互作用候補タンパク質のプールに対する制限を回避する。その機序は不明であるが、このような制限は明らかに、強力な活性化ドメインが仲介する軽度から中等度の宿主細胞毒性によって生じる。また、本発明の方法は立体配座的に制約されたタンパク質（すなわち、アミノ末端およびカルボキシ末端の制約により可撓性が低下したタンパク質）を使用する。立体配座の制約は、関心のあるタンパク質を立体配座制約タンパク質（すなわち、相互作用候補タンパク質を特定の3次元構造に固定することができる、適当な長さおよびアミノ酸組成のタンパク質）内に埋め込むことによって生じさせてもよい。立体配座制約タンパク質の例には、チオレドキシン（またはその他のチオレドキシン様タンパク質）、ヌクレアーゼ（例えば、RNase A）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ウシ膵臓トリプシン阻害剤）、抗体またはその構造的に強固な断片、コノトキシンおよびプレクストリン相同領域が含まれるが、これらに限定されない。または、立体配座制約は、一方は関心のあるタンパク質のアミノ末端に存在し、他方はそのカルボキシ末端に存在する、天然または組換えによって導入されたシステイン残基対のジスルフィド結合力を利用することによって得られるものでもよい。このようなジスルフィド結合はタンパク質を強固な、従って立体配座的に制約されたループ構造状態で固定する。例えば、大腸菌（E．coli.）trxB変異株の細胞質中でアミノ末端とカルボキシ末端のシステイン間にジスルフィド結合が形成される。いくつかの条件下では、ジスルフィド結合は、例えばサッカロミセスセレビシェ（S．cerevisiae）YTR4^-変異株（Furterら、Nucl Acids Res． 14:6357-6373，1986:ジェンバンク寄託番号P29509）のような同等の変異を有する高等生物の細胞質および核内で形成されうる。また、チオレドキシン活性部位ループ内に挿入されるペプチド塩基のシステインは、適当な条件下ではジスルフィド結合を形成するために互いに適当な距離をとっているので、本明細書において記載するチオレドキシン融合（trxA融合）は立体配座制約を導入するこのような別の手段を受け入れやすい。相互作用候補物質として立体配座的に制約されたタンパク質は3次元構造解析を実施しやすく、したがって薬理学的特性が改善された簡単な有機分子模擬物質の設計を容易にするので、それらは本発明において有用である。例えば、チオレドキシンは既知の構造を有するので、立体配座的に制約された領域間のタンパク質の構造は、NMRおよびX線による示差解析などの方法を使用して比較的容易に解決することができる。ある種の立体配座制約タンパク質はまた、埋込まれたタンパク質を細胞の崩壊から保護し、および／またはタンパク質の可溶性を増し、および／または相互作用候補物質が相互作用する能力を変化させる。相互作用タンパク質が単離されると、相互作用トラップシステムを使用して相互作用タンパク質を解析することができ、相互作用によって生じる信号はタンパク質の相互作用能力における任意の変化の指標となる。一つの特別な例において、相互作用タンパク質の一方または両方に（例えば、標準的なインビボまたはインビトロの部位特異的変異誘発法またはランダム変異誘発法によって）変更を加えて、この変更の影響をレポーター遺伝子の発現を測定することによってモニターする。この方法を使用して、相互作用能力が増加または低下した相互作用タンパク質が単離される。このようなタンパク質は、治療用分子（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）として、または上記のように簡単な有機分子模擬物質を設計するためのモデルとして有用である。アゴニストタンパク質およびアンタゴニストタンパク質は、種々の相互作用トラップシステムを使用して容易に同定および単離することができる。特に、タンパク質-タンパク質相互作用が一旦記録されると、アゴニストもしくはアンタゴニストの候補物質をコードする付加的DNA、または好ましくはアゴニストもしくはアンタゴニストと思われる物質をコードする配列のライブラリーの1つを宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を測定する。または、相互作用アゴニスト候補化合物またはアンタゴニスト候補化合物（すなわち、ポリペプチドおよび例えば、1本鎖ポリヌクレオチドのような非タンパク質性化合物を含む）を本発明によるインビボまたはインビトロの相互作用トラップシステムに組み入れ、レポーター遺伝子の発現に影響する能力を測定する。（候補配列または化合物を含まない対照と比較して）レポーター遺伝子発現の低下はアンタゴニストを示す。逆に、（対照と比較して）レポーター遺伝子発現の増加はアゴニストを示す。相互作用性のアゴニストおよびアンタゴニストは治療薬としてまたは簡単な模擬物質を設計するためのモデルとして有用である。必要に応じて、アゴニストタンパク質またはアンタゴニストタンパク質は立体配座的に制約されて本明細書に記載する利点を提供することができる。アンタゴニストまたはアゴニストを同定することができる相互作用タンパク質の特定の例には、IL-6受容体-リガンド対、TGF -β受容体-リガンド対、IL-1受容体-リガンド対、および他の受容体-リガンド相互作用、プロテインキナーゼ-基質対、転写因子の相互作用対、シグナル伝達経路の相互作用成分（例えば、ある種の受容体およびG-タンパク質の細胞質領域）、細胞周期調節に関与する相互作用タンパク質の対（例えば、p16およびCDK4）、ならびに神経伝達物質対が含まれるが、これらに限定されない。また、立休配座制約タンパク質をコードするライブラリーも本発明に含まれる。（天然および合成DNA配列集合体を含んでもよい）このようなライブラリーは、細胞内において、または任意には細胞を含まない系において発現され、相互作用タンパク質、アゴニストタンパク質もしくはアンタゴニストタンパク質、または細胞に識別可能な任意の特徴を付与するタンパク質、例えば細胞周期の進行を乱すタンパク質を同定するために、標準的な任意の遺伝的選抜もしくはスクリーニング、または多数の相互作用トラップ方式と組み合わせて使用することができる。従って、（無作為または設計された）ペプチド-コードライブラリーを、転写に基づいた、または転写に基づかない選抜またはスクリーニングに使用することができる。（好ましくは少なくとも100種の異なるペプチド-コード種を含み、より好ましくは1000または100,000以上の個々の種を含む）これらのライブラリーを任意の有用な原核細胞または真核細胞宿主中で形質転換することができ、酵母が好ましい宿主である。または、このようなペプチド-コードライブラリーを、細胞を含まない系で発現させてもよい。本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかになると思われる。図面の簡単な説明まず、図面を簡単に説明する。図1A〜1Cは、本発明による1つの相互作用トラップシステムを示す。図2は、ベクターpJM1ライブラリーの図である。図3Aは、ペプチドアプタマーと他のタンパク質との相互作用を示す写真である。図3Bは、Cdk2相互作用ペプチドの例の配列を示す。図4Aは、ペプチドアプタマーと他のタンパク質との相互作用を示す写真である。これらのペプチドアプタマーの命名は図3の命名とは異なり、図4Bに示す番号付けに対応している。これらの実験を実施するためには、酵母株EGY48を抗-Cdk2 アプタマーを発現するプラスミドまたは対照の20-merペプチドループを発現するプラスミドで形質転換し、次いでファインレー（Finley）ら（Proc．Natl．Acad ．Sci．U．S．A．91:12980-12984（1994））に記載されるように、株を異なるベイト（bait）株と融合する。図4Bは、図4Aで解析したCdk2と相互作用するペプチドアプタマーの例の配列を示す。図5は、ペプチド3および13のGst-Cdk2による共沈を示す。レーン1。Gstビーズ、抽出物はTrxAを含有する；レーン2。Gstビーズ、抽出物はTrxA-ペプチド3を含有する；レーン3。Gstビーズ、抽出物はTrxA-ペプチド13を含有する；レーン4。Gst-Cdk2ビーズ、抽出物はTrxAを含有する；レーン5。Gst-Cdk2ビーズ、抽出物はTrxA-ペプチド3を含有する；およびレーン6。Gst-Cdk2ビーズ、抽出物はTrxA-ペプチド13を含有する。図6は、図4Aおよび4Bのペプチドアプタマーの共沈を示す。図7は、エバネッセント波器を使用して生じる代表的な結合親和性のグラフを示す。図8は、図4Aおよび4Bのペプチドアプタマーの例がCdk2/cyclin EキナーゼによるヒストンH1のリン酸化を阻害する能力を示す。図9は、ベクターBRM116-H-Ras（G12V）を示す。図10は、ベクターpEG202-H-Ras（G12V）を示す。詳細な説明本出願人らは、関心のある第2のタンパク質と物理的に相互作用するか、またはこのような相互作用を阻害または増大する立体配座的に制約されたタンパク質を同定および解析するための新規相互作用トラップシステムを開発した。一態様において、この方法は、治療的または診断的に関心のあるタンパク質を、既知の DNA結合領域と共有結合する融合タンパク質として産生するように作成される真核細胞の宿主株（例えば、酵母株）に関係する；この方法の目的は有用であるが、まだ未知であるまたは特徴づけられていない相互作用ポリペプチドを「捕獲する」ことであるので（以下「プレイ（prey）」と呼ぶ）、このタンパク質は「ベイト（bait）」タンパク質と呼ばれる。真核細胞宿主株はまた1つ以上の「レポーター遺伝子」、すなわち転写がベイト-プレイ相互作用（bait-prey interacti on）に応答して検出される遺伝子を有する。ベイトタンパク質は、そのDNA結合領域を介してレポーター遺伝子の上流の特異的DNA認識部位に結合する；しかしながら、ベイトタンパク質は活性領域を有しないので、レポーターの転写は刺激されない。新規相互作用タンパク質をコードするDNA配列を単離するために、DNA発現ライブラリーの種（例えば、無作為または意図的に設計した、cDNAまたは合成DNAライブラリー）をレポーター遺伝子とベイトタンパク質を有する株に導入する；ライブラリーの各種に、非変異活性化領域標識と融合した相互作用候補タンパク質を合成させる。プロモーター結合ベイトタンパク質と物理的に相互作用する、これらのライブラリーがコードするタンパク質を「プレイ（prey）」タンパク質と呼ぶ。（活性化領域標識を介して）このように結合したプレイタンパク質は下流のレポーター遺伝子の発現を活性化して、検出可能とし、関心のある相互作用タンパク質をコードする特定のDNAクローンを同定するための容易なアッセイ法を提供する。本発明において、各プレイ候補タンパク質は、（例えば、立体配座制約タンパク質内にタンパク質を埋め込むことによって、またはタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端とを結合することによって）立体配座的に制約される。このようなタンパク質は固定された3次元構造の状態で維持され、模擬薬物の設計を促進する。本発明に従う1つの相互作用トラップシステムの一例を図1A〜Cに示す。図1Aは、2つのレポーター遺伝子、LexAop-LEU2およびLexAop-lacZと、構成的に発現されるベイトタンパク質遺伝子とを有するロイシン要求酵母株を示す。ベイトタンパク質（五角形で示す）をDNA結合領域（円で示す）と融合させる。DNA結合タンパク質は、レポーター遺伝子と機能的に結合した特異的なDNA結合タンパク質認識部位（塗りつぶした四角で示す）を認識し、結合する。図1Bおよび1Cにおいて、細胞はさらに、ベイト候補タンパク質（相互作用候補物質）（図1Bの白四角および図1Cの白六角形で示す）を有する；各ベイトタンパク質を立体配座制約タンパク質（2個の塗りつぶした半円で示す）に埋め込む。図1Bは、ベイト候補タンパク質が立体配座的に不活性なLexA-融合ベイトタンパク質と相互作用しない場合には、レポーター遺伝子は転写されない；細胞はleu^-培地では増殖してコロニーを形成せず、β-ガラクトシダーゼ活性を有しないので、Xgal培地では白色である。図1Cは、プレイ候補タンパク質がベイトと相互作用する場合には、両レポーター遺伝子は活性となる；細胞はleu^-培地でコロニーを形成し、コロニーがβ -ガラクトシダーゼ活性を有するので細胞はXgal培地上で青色となる。好ましくは、この方法において、ベイトタンパク質（すなわち、部位特異的DNA結合領域を有するタンパク質）は転写不活性で、（ベイトタンパク質が結合する）レポーター遺伝子は本質的に基礎転写をしない。この方法の各成分について本明細書においてさらに詳細に説明する。ベイトタンパク質図1A〜Cに示す選択宿主株は、細菌のLexAタンパク質から誘導したDNA結合部分をコードするDNAと融合するベイトタンパク質をコードするDNAとを有する。LexA 結合領域を使用することによりある種の利点が得られる。例えば、酵母において、LexA部分は活性化機能を有さず、酵母遺伝子の転写に対して既知の影響を与えない（BrentおよびPtashne、Nature 312:612-615、（1984）；BrentおよびPtash ne、Cell 43:729-736、（1985））。また、例えば、GAL4 DNA結合領域ではなく、LexAを使用することにより、ガラクトースの誘導に応答してベイトタンパク質の条件的発現が可能になる；これは、連続的に発現すると宿主細胞に毒性を示す可能性のあるベイトタンパク質の枯渇を促進する。最後に、LexAなどの十分に規定された系を使用することにより、LexAとLexA結合部位（すなわち、LexAオペレーター）との相互作用に関する情報を、オペレーター占有性を最適化する目的のため、および／または最大遺伝子活性に影響を与える結合ベイトタンパク質の結合構造を最適化する目的のために利用することができる。好ましくは、ベイトタンパク質はまたLexA二量体形成領域を有する；この任意の領域は効率的なLexA二量体形成を促進する。LexAは二量体としてDNA結合部位に結合するので、ベイトタンパク質中にこの領域が含まれることもオペレーター占有性効率を最適化している（GolemisおよびBrent、Mol．Cell Biol．12:3006- 3014（1992））。 LexAは本発明の好ましいDNA結合領域となる。しかしながら、他の任意の転写不活性DNA結合領域または本質的に転写不活性なDNA結合領域を相互作用トラップシステムに使用することができる；このようなDNA結合領域は周知で、タンパク質ACE1（CUP1）、λcI、lacリプレッサー、jun、fos、GCN4またはTetリプレッサーのDNA結合部分を有する。GAL4 DNA結合領域は、ベイトタンパク質にとってあまり好ましくないDNA結合部分となる。ベイトタンパク質は関心のある任意のタンパク質から選択することが可能であり、重要性が未知もしくは既知か、または診断的重要性、治療的重要性もしくは薬理学的重要性があることが疑われるタンパク質が含まれる。好ましいベイトタンパク質には、（myc、特にmycのC末端、ras、src、fosおよび特にfosのオリゴマー相互作用領域などの）発癌性タンパク質または（キナーゼ、ホスファターゼ、膜関連受容体の細胞質部分などの）細胞周期調節に関与する他の任意のタンパク質が含まれる。好ましいベイトタンパク質の特定の例には、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（例えば、Cdk2）もしくは受容体-リガンド対、または神経伝達物質対、または他のシグナル伝達タンパク質の対が含まれる。各場合において、関心のあるタンパク質を、一般には本明細書に記載するように既知の DNA結合領域と融合する。Cdk2とRasベイトを使用した例を以下に示す。レポーター図1Bに示すように、本発明に係る1つの好ましい宿主株は2つの異なるレポーター遺伝子、LEU2遺伝子およびlacZ遺伝子を有し、各々上流にベイトタンパク質の結合部位を有する。図1Bに示すレポーター遺伝子は各々、上流の結合部位として、本来の上流活性部位（Upstream Activation Sequences（UASs））の位置に1つ以上のLexAオペレーターを有する。このようなレポーター遺伝子は染色体に組込まれても、または自律複製プラスミド（例えば、酵母2μプラスミド）に保有されてもよい。多数の理由により、本発明のインビボでの態様においてはこのようなレポーターを2つ組み合わせることが好ましい。第1に、LexAop-LEU2構成によって、相互作用タンパク質を有する細胞は、ロイシンを含有しない培地上での増殖により選択することができるので、相互作用候補として可能性のあるタンパク質を含有する多数の細胞の調査を容易にする。第2に、LexAop-lacZレポーターによって、LE U⁺細胞は素早くスクリーニングされ、相互作用を確認することができる。また、第3に、他の技術面を考慮すると、LexAop-LEU2レポーターは極めて鋭敏な第1選択となるが、LexAop-lacZレポーターは、相互作用親和性が異なるタンパク質間の識別を可能にする。本明細書に記載するレポーター遺伝子は本発明の好ましい態様となるが、標準的な技術によって発現が検出または解析され得る他の同等の遺伝子を、LEU2およびlacZ遺伝子と併用して、または両者の代わりに使用することもできる。一般に、このようなレポーター遺伝子は、表現型マーカーとなる酵素、例えば細胞増殖に必要なタンパク質もしくは細胞死に至る毒性タンパク質をコードし、または発現が呈色の有無に至るので呈色アッセイにより検出可能なタンパク質をコードする。または、例えばサプレッサーtRNAは宿主細胞の致死的な突然変異を抑制するので、レポーター遺伝子は、発現を解析することができるサプレッサーtRNAをコードしてもよい。転写を検出することができる他の有用な遺伝子の特定の例には、（酵母HIS3、URA3、TRP1およびLYS2などの）アミノ酸および核酸生合成遺伝子 GAL1、大腸菌（E．coli）galK（酵母GAL1遺伝子を補足する）およびレポーター遺伝子CAT、GUS、蛍光タンパク質およびその誘導体ならびに抗体が利用できる細胞表面抗原（例えば、CD4）をコードする任意の遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子は、アゴニストまたはアンタゴニストとしての相互作用候補物質を識別する定性的手段または定量的手段によって解析され得る。プレイタンパク質本明細書に記載する選択では、一連の相互作用候補タンパク質をコードする別のDNA構成を使用する（すなわち、プレイタンパク質）；各々は、立体配座制約タンパク質中に埋め込まれる、またはプレイタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端が（例えば、ジスルフィド結合により）結合することにより、立体配座的に制約される。プレイタンパク質の例には、アミノ末端からカルボキシ末端までを保有する非変異型N末端部分、タンパク質発現のATG、任意の核局在性配列、弱い活性領域（例えば、MaおよびPtashne;Cell 51:113，1987のB112またはB42活性領域）、および融合タンパク質合成を免疫学的に迅速に検出するための任意のエピトープ標識が含まれる。ライブラリー配列、無作為または意図的に設計された合成DNA配列または立体配座的に制約されたタンパク質をコードする配列をこのN 末端断片の下流に挿入して、プレイタンパク質をコードする融合遺伝子を産生する。本明細書に記載したもの以外のプレイタンパク質も本発明に有用である。例えば、任意のmRNA集団からcDNAを構成して、等価な発現ベクターに挿入してもよい。このような優れたライブラリーは市販のキット（例えば、カリフォルニア州ラジョラのStratagene社製）を使用して、または十分に確立された調製手法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、ニューヨーク、John Wiley&Son s、1987）を使用してデノボ合成により構成することができる。または、多数のc DNA（多数の異なる生物由来）が報告されており、購入できる；ライブラリーの出典には、例えば、クローンテック（Clonetech）（カリフォルニア州パロアルト）およびストラタジーン（Stratagene）（カリフォルニア州ラジョラ）がある。プレイタンパク質が天然に存在する全長のポリペプチドである必要はないことも注目される。好ましい態様において、プレイタンパク質は合成DNA配列によってコードされ、無作為に生じるオープンリーディングフレームの産物であり、意図的な配列設計により合成されるオープンリーディングフレームであり、またはその断片である。好ましくは、このように無作為に生じる短い配列は、鎖長がアミノ酸1〜60個（好ましくは6個）のペプチドをコードする。特定の一例において、プレイタンパク質は相互作用領域のみを有する；このような領域はベイトタンパク質活性を調節する治療法として有用となる（すなわち、アンタゴニストまたはアゴニストとして）。特定の別の例において、プレイタンパク質は1つ以上のループを有する。このようなプレイタンパク質は、診断目的のため、または本明細書に記載する治療目的のいずれかのために免疫学的試薬として使用され得る；これに関しては、異なるループはベイトタンパク質の異なる部分を認識することができ、特異性を高めることができる。また、プレイタンパク質は、さらに最適化したプレイタンパク質を提供するために、オープンリーディングフレームに結合した複数の相互作用ペプチドを組み合わせたものであってもよい（必要に応じて、立体配座制約配列を変更する）。一例において、このような相互作用ペプチドの各々は最後の相互作用タンパク質の1つのループを構成する。同様に、活性領域の任意の数をプレイ分子の活性部分に使用してもよい；このような活性領域は好ましくは弱い活性領域であり、すなわち（例えば、lacZレポーター遺伝子を使用した平行β-ガラクトシダーゼアッセイにおいてGAL4活性領域IIまたはB112を比較することによって測定したとき）GAL4活性領域II部分より弱く、好ましくはB112より強くない；しかしながら、このような領域はB112より弱くてもよい。特に、LEU2選択案の驚くべき感受性によって、極めて弱い活性領域でさえも本発明に利用される。他の有用な弱い活性領域の例には、マ（Ma）およびプタシュネ（Ptashne）（Cell 51:113、1987）、ルーデン（Ruden）ら（Natur e 350:426-430、1991）およびギニガー（Giniger）およびプタシュネ（Ptashne ）（Nature330:670、1987）に記載されるB17、B42および両親媒性ヘリックス（A H）領域が含まれる。必要に応じて、プレイタンパク質は他の任意の核局在性配列（例えば、GAL4またはMATα2遺伝子から誘導される配列）または他の任意のエピトープ標識（例えば、Immunex社製のc-mycタンパク質または標識エピトープ部分）を含んでもよい。これらの配列はこの方法の効率を最適化するが、操作のために必要ではない。特に、核局在性配列は、プレイ分子が核局在性レポーター遺伝子構築物に到達する効率を最適化することにより、有効濃度を増加し、弱いタンパク質相互作用の検出を可能にする。エピトープ標識は融合タンパク質発現の単純な免疫解析法を容易にする。上記のレポーター遺伝子、DNA結合領域および遺伝子活性領域成分は、酵母、哺乳類細胞および原核細胞ゲノムまたはcDNAならびに人工的な配列を含む任意の適当な真核細胞起源であっても、原核細胞起源であってもよいことも当業者は認識している。さらに、（増殖、遺伝子操作および大規模スクリーニングが容易であるという理由のために）酵母は相互作用トラップシステムの好ましい宿主生物であるが、哺乳類細胞などの他の宿主生物も利用することができる。哺乳類系を選択する場合には、好ましいレポーター遺伝子は感受性があり、容易に解析することができるCAT遺伝子である；有用なDNA結合領域および遺伝子活性領域を上記のものから選択することができる（例えば、LexADNA結合領域およびB42またはB1 12活性化領域）。立体配座制約タンパク質本発明の一態様によると、プレイタンパク質をコードするDNA配列は立体配座制約タンパク質（すなわち、プレイタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端の可撓性を低下するタンパク質）をコードするDNA配列中に埋め込まれる。（例えば、適当に配置されるシステイン残基のジスルフィド結合によって）タンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端とを直接結合する方法は上記してある。この方法の別法として、立体配座制約タンパク質を利用することができる。一般に、立体配座制約タンパク質は足場または台として作用し、関心のあるペプチドまたはタンパク質が自由にとる3次元構造の数を制限する。立体配座制約タンパク質の好ましい例はチオレドキシンまたは他のチオレドキシン様配列であるが、多数の他のタンパク質もこの目的に有用である。好ましくは、立体配座制約タンパク質はサイズが小さく（一般にアミノ酸200個以下）、構造が強固で、既知の3次元構造をとり、構造が不当に破壊することなく、関心のあるタンパク質を挿入させることができる。このようなタンパク質の主要な特徴は、溶媒接触面の、ペプチド挿入を可能にする位置の利用性である（例えば、チオレドキシン活性部位ループ）。立体配座制約タンパク質産生遺伝子が種々の原核細胞および真核細胞宿主において高度に発現されること、およびタンパク質が可溶性で、プロテアーゼにより分解されないことも好ましい。本発明に有用な立体配座制約タンパク質の例には、ヌクレアーゼ（例えば、RNAase A）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ウシ膵臓トリプシン阻害剤）、抗体またはその強固な断片、コノトキシンおよびプレクストリン相同領域が含まれる。しかしながら、ここに列挙したものに限定されない。上記に同定されていない配列またはおそらく同定も報告もされていない配列を有する他の立体配座制約タンパク質も、その構造的な安定性および強固さに基づいて有用であることが期待される。上記のように、本発明に係る1つの好ましい立体配座制約タンパク質はチオレドキシンまたは他のチオレドキシン様タンパク質である。本発明に有用なチオレドキシン様タンパク質の一例として、大腸菌（E．coli）チオレドキシンは以下の特徴を有する。大腸菌（E．coli）チオレドキシンはわずか11.7kDの小さいタンパク質で、高いレベルで産生され得る。タンパク質のサイズが小さいことおよび合成能力が高レベルであることにより、細胞内濃度は高い。大腸菌（E．coli ）チオレドキシンの特徴はさらに、非常に安定で、強固な3次元構造を有するので、タンパク質の精製が容易になることである。大腸菌（E．coli）チオレドキシンの3次元構造は周知で、タンパク質本体から突出する、Cys₃₃残基とCys₃₆残基間の特徴的なCys....Cys活性部位ループを含む、いくつかの表面ループを有する。このCys....Cys活性部位ループは同定可能で接近可能な表面ループ領域で、全体的な構造安定性に寄与するタンパク質の残りとの相互作用には関与しない。従って、それはプレイタンパク質挿入部位としてすぐれた候補である。ヒトチオレドキシン、グルタレドキシンおよび他のチオレドキシン様分子もこのCys....Cys活性部位ループを有する。大腸菌（E．coli）チオレドキシンのアミノ末端およびカルボキシ末端は共にこのタンパク質の表面に存在し、融合物構成のために容易に接近することもできる。大腸菌（E．coli ）チオレドキシンはまたプロテアーゼに安定であり、80℃までの加熱に安定であり、低pHに安定である。本発明に有用なチオレドキシン様DNA配列がコードする他のチオレドキシン様タンパク質は相同アミノ酸配列ならびに同様の物理的および構造的特徴を共有する。従って、他のチオレドキシン様タンパク質をコードするDNA配列を本発明による大腸菌（E．coli）チオレドキシンの代わりに使用することができる。例えば、他の種のチオレドキシン、例えばヒトチオレドキシンをコードするDNA配列が好適である。ヒトチオレドキシンは、両分子のNMR構造を比較することによって測定すると、大腸菌（E．coli）の3次元構造に実質的に重なる3次元構造を有する。フォーマン-キー（Forman-Kay）ら、バイオケミストリー（Biochem.）20: 2685（1991）。ヒトチオレドキシンはまた、大腸菌（E．coli）のタンパク質に見られるCys....Cys活性部位ループと構造的および機能的に同等な活性部位ループも有する。本発明の方法によってタンパク質および小ペプチドを産生する際に、大腸菌（E．coli）チオレドキシンの代わりに、または大腸菌（E．coli）チオレドキシンに加えてヒトチオレドキシンを使用することができる。ヒトチオレドキシン活性部位ループ内およびアミノ末端への挿入は、大腸菌（E．coli）チオレドキシンと同様に認容性が良好である。本発明に使用することができる他のチオレドキシン様配列は、タンパク質グルタレドキシンおよび種々の種のその相同物の全てまたは部分を含む（Holmgren、上記）。大腸菌（E．coil）グルタレドキシンと大腸菌（E．coil)チオレドキシンはアミノ酸の相同性は20%より低いが、この2つのタンパク質は立体配座的および機能的類似性を有し（Eklundら、EMBO J.3:1443-1449（1984））、グルタレドキシンは、大腸菌（E．coli）チオレドキシンのCys....Cys活性部位ループと構造的および機能的に同等な活性部位ループを有する。従って、グルタレドキシンは本明細書において規定するチオレドキシン様分子である。また、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）の反復領域は大腸菌（E．coli ）チオレドキシンと＞30%の相同性を有し、反復領域は大腸菌（E．coli）チオレドキシンのCys....Cys活性部位ループと構造的かつ機能的に同等な活性部位ループを有するので、タンパク質PDIまたはチオレドキシン様領域および様々な種のその相同物を有する部分をコードするDNA配列（Edmanら、Nature 317:267-2 70（1985））もチオレドキシン様DNA配列として使用することができる。当業者に公知で入手可能なグルタレドキシンおよびPDIに関する情報を提供する目的のために、後者の2つの報告を参考として本明細書に組み入れる。同様に、大腸菌（E．coli）チオレドキシンと相同なアミノ酸配列に基づいて、または大腸菌（E．coli）チオレドキシンのCys....Cys活性部位ループと構造的かつ機能的に同等な活性部位ループの3次元的な立体配座の類似性および存在に基づいて、ホスホイノシチド-特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）、その断片および種々の種のその相同物をコードするDNA配列（Bennettら、Nature、334:268- 270（1988））も本発明に使用することができる。小胞体タンパク質、ERp72または種々の種のその相同物をコードするDNA配列の全てまたは一部も、アミノ酸配列の相同性に基づいて、または大腸菌（E．coli）チオレドキシンのCys....Cys 活性部位ループと構造的かつ機能的に同等な活性部位ループの3次元的な立体配座の類似性および存在に基づいて、本発明の目的のためにチオレドキシン様DNA 配列として含める。別のチオレドキシン様配列は、成人T細胞白血病誘導因子（A DF）または他の種のその相同物の全てまたは一部をコードするDNA配列である（W akasugiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、87:8282-8286（1990））。ADFは現在ではヒトチオレドキシンであると考えられる。同様に、大腸菌（E．coli）の周辺細胞におけるジスルフィド結合形成の促進を担うタンパク質、dsbA遺伝子産物（Bardwellら、Cell 67:581-89，1991）もチオレドキシン様配列であると考えられる。後者の3つの報告は、当業者に公知であり、入手可能なPI-PLC、ERp72、AD FおよびdsbAに関する情報を提供する目的のために参考として本明細書に組み入れられる。上記で使用したチオレドキシン様配列の定義から、上記では特に同定されていない他の配列、またはおそらくまだ同定もされていないし、報告もされていない他の配列が、大腸菌（E．coli）チオレドキシンと相同のアミノ酸配列に基づいて、または大腸菌（E．coli）もしくはヒトチオレドキシンと実質的に同様の3次元構造を有することおよび大腸菌（E．coli）チオレドキシンのCys....Cys活性部位ループと構造的かつ機能的に同等な活性部位ループを有することに基づいて、チオレドキシン様配列として有用であることが期待される。当業者は、例えば、x線結晶構造解析または2次元NMR分光分析と大腸菌（E．coli）チオレドキシンの報告された3次元構造とにより解析して、3次元構造を比較することにより、分子が後者の2つの特徴を有するか否かを判定することができ、また分子のアミノ酸配列を解析することにより、分子が、大腸菌（E．coli）チオレドキシンのCys ....Cys活性部位ループと構造的かつ機能的に同等である活性部位ループを有するか否かを判定することができる。また、一次配列のコンピュータ支援解析によってチオレドキシン様タンパク質の同定を可能にする予測アルゴリズムが記載されている（Ellisら、Biochemistry 31:4882-91（1992））。上記の記載に基づいて、当業者は、過度の実験を行うことなく、本発明に使用するためのチオレドキシン様配列を選択し、同定し、必要に応じてこれを変更することができる。例えば、本来のチオレドキシンまたは本来のチオレドキシン様配列の一部に実施する、得られる分子の構造には影響しない簡単な点突然変異は、本来のチオレドキシンまたは本体のチオレドキシン様配列の対立遺伝子変位型であるような、別のチオレドキシン様配列となる。ストリンジェントなまたは非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での大腸菌（E．coli）チオレドキシンまたはその構造相同物の配列にハイブリダイズするDNA配列も、本発明に使用するためのチオレドキシン様タンパク質をコードする。このようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、65℃で4X SSCでハイブリダイゼーション、次いで65℃で0.1X SSCで１時間洗浄である。または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド中、42℃で4X SSCである。非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、50℃で4X SSCで、または42℃で30-40%ホルムアミドでのハイブリダイゼーションである。このようなチオレドキシン様配列全ての使用は、本発明に含まれると考えられる。プレイタンパク質が、チオレドキシンまたはチオレドキシン様分子の活性部位ループ内に融合されることが、種々の理由のために好ましいことがある。活性部位ループ周囲のチオレドキシンの面は、非特異的タンパク質ジスルフィドオキシド-還元酵素としてのこのタンパク質の主要な機能を保つ際に、多種多様なタンパク質面と相互作用できるように進化してきた。活性部位領域は、強固な二次構造の分節の間に見られ、活性部位ループ領域はプレイタンパク質をつなぎ止める強固な台となる。チオレドキシン様タンパク質の活性部位ループ内に挿入される小さいプレイタンパク質は、三次構造を維持する際に関与しないタンパク質領域に存在する。従って、このような融合タンパク質の構造は安定である。実際、大腸菌（E．coli ）チオレドキシンは、活性部位ループに近い位置で2つの断片に切断することができるが、タンパク質を安定させる3次元相互作用は残る。大腸菌（E．coli）チオレドキシンの活性部位は配列NH₂....Cys₃₃-Gly-Pro-Cy s₃₆....COOHを有する。タンパク質の活性ループ部において、選択したプレイタンパク質をチオレドキシン様タンパク質で融合すると、両端においてプレイを抑制し、プレイタンパク質の立体配座的な自由の程度を減少し、結果としてプレイがとる別の構造の数を減少する。挿入されたプレイタンパク質は各端にシステイン残基が結合し、本来のチオレドキシン内で生じ、さらに挿入されたプレイの立体配座的な自由を制限するように、互いにジスルフィド結合を形成する。また、プレイタンパク質は活性部位ループ内に位置づけされることにより、チオレドキシン様タンパク質の表面に配置される。これは、生物活性タンパク質の立体配座のスクリーニングおよび他のアッセイに使用される利点である。一般に、チオレドキシンまたは他のチオレドキシン様タンパク質の利用性は、マッコイ（McCoy）ら米国特許第5,270,181号およびラバリエ（LaVallie）ら、バイオ/テクノロジー（Bio/Technology）11:187-193（1993）に記載されている。これら2 つの参考文献は参考として本明細書に組み入れられる。以下に、本発明に係るチオレドキシン相互作用トラップシステムを記載する。これらの実施例は例示目的のためであり、本発明を限定するものではない。チオレドキシン相互作用トラップシステム立体配座的に制約されたタンパク質を利用する相互作用トラップシステムが、タンパク質の相互作用を検出するために、該相互作用に関与するタンパク質を同定および単離するために、該相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを同定および単離するために、また抗体型試薬と同様の方法でタンパク質検出アッセイに使用することができる相互作用ペプチドアプタマーを同定および単離するために開発された。本明細書の方法の例を記載する。 1.Cdk2 ベイトとチオレドキシンの相互作用の検知細胞周期による真核細胞の進行は、Cdk2と相互作用し、その活性を調節する多数の調節タンパク質の共同作用を必要とする（Sherr、Cell 79:551-555（1994））。このような調節タンパク質には、Cdk活性を正に調節するサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（Ckis）ならびに多数のプロテインキナーゼおよびホスファターゼが含まれる。多数のプロテインキナーゼおよびホスファターゼのなかには、CAKおよびCdc25などのようにキナーゼ活性を正に調製するものあれば、Weelなどのようにキナーゼ活性を阻害するものもあれば、Cdi1などのように（Gyurisら、Cell 75:791-803 （1993））これまでは未知の影響を有するものもある（Morgan)、ature 374:131 -134（1995）を参照）。Cdk2は、高度な真核細胞がG1期からS期に進行するために必要であると考えられる（Fang&Newpot、J．Cell Biol．66:731-742（1991）；Paganoら、J．Cell Biol．121:101-111（1993）；van den Hauvel&Harlow、Sc ience 262:2050-2054（1993））。Cdk2キナーゼ活性はサイクリンEおよびサイクリンAによって正に調節され（Koffら、Science 257:1689-1694（1992）；Dulic ら、Science 257:1958-1961（1992）；Tsaiら、Nature 353:174-7（1991））、p 21、p27およびp57によって負に調節される（Harperら、Cell 75:805-816（1993 ）；Polyakら、Genes Dev．8:9-22（1994）；Toyoshima&Hunter、Cell 78:67-74 （1994）；Matsuokaら、Genes Dev.9:660-662（1995）；Leeら、Genes Dev.9:63 9-649（1995））；また、Cdk2はG1からSへの遷移期にCdi1と複合体を形成する（ Gyurisら、前記）。本明細書において、本発明者らは、組み合わせからCdk2を認識する分子を選択するための、酵母2-ハイブリッド系の使用について記載する。大腸菌（E．coli）チオレドキシン遺伝子（trxA）を含むプレイベクターを構築する。pJG4-4（Gyurisら、前記）をベクター骨格として使用し、EcoRIおよびX hoIで切断する。B112転写活性領域をコードするDNA断片を、プラスミドLexA-B11 2のPCR増幅によって獲得し（Doug Ruden、博士論文、ハーバード大学、1992年）、MunIおよびNdeIで切断する。大腸菌（E．coli）trxA遺伝子を、NdeIおよびSal 1で消化することによってベクターpALTRXA-781（米国特許第5,292,646号；In Vi trogen Corp.カリフォルニア州サンジエゴ）から切り出す。trxAおよびB112断片を標準的な技法によって、EcoRI/XhoI-cut pJG4-4骨格に連結し、pYEAeTRXを形成する。このベクターは、SV40核局在性領域、B112転写活性領域、赤血球凝集素エピトープ標識および大腸菌（E．coli）チオレドキシンを含む融合タンパク質をコードする（図2）。ペプチドライブラリーを以下のように構築する：DNAオリゴマー5’GACTGACTGG TCCG(NNK)₂₀GGTCCTCAGTCAGTCAG3’(N=A,C,G,TおよびK=G,T)（配列番号：4）を合成し、第1のオリゴマーの3'端に2本鎖DNAを形成するために、第2のオリゴマー（ 5’CTGACTGACTGAGGACC3'）（配列番号：5）にアニーリングする。第2の鎖は、第 2のオリゴマーとの合成を開始するクレノウ酵素を使用して酵素の作用により完了する。産物をAvaIIで切断し、RsrIIで切断したpYENAeTRXに挿入する。連結後、この構築物を使用して、標準的な方法により大腸菌（E．coli）を形質転換する（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、（Greene and Wily -interscience、New York、1987-1994））。このライブラリーは2.9×10⁹種を含み、このうち10⁹種より多くがペプチドを合成した。多数の異なるパターンの形状に折りたたまれて帯電するほど十分に長く、コードするオリゴヌクレオチドの多くが停止コドンを含まない程度に短かったので、20種を好ましいペプチドとして選択した。コードするオリゴヌクレオチドには思いがけないことに制限部位を有するものがあり、またライブラリーメンバーには2本鎖の挿入物を有するものがあったので、制約されたペプチドのうち約1/4は単位長さより長かったり、短かったりした。相互作用ペプチドすなわち「アプタマー」をスクリーニングするために、100 μgのライブラリーを使用して酵母株EGY48を形質転換した（Matα his3 leu2::2 L exop-LEU2 ura3 trp1 LYS2;Gyurisら、前記）。この株はまた、酵母2μ複製起点を有するpLR1Δ1誘導物である、レポータープラスミドpSH18-34、URA3遺伝子およびGAL1の上流調節要素が4 colE1 LexAオペレーターと置換したGAL1-lacZレポーター遺伝子（Westら、Mol．Cell Biol．4:2467，1984;Ebinaら、J．Biol．Che m．258:13258，1983;HanesおよびBrent，Cell 57:1275，1989）、ならびにベイトベクターpLexA202-Cdk2（Cdk2は、細胞周期の必須酵素であるヒトサイクリン依存性キナーゼ2をコードする）（Gyurisら、前記;Tsaiら、oncogene 8:1593、1 993）を有した。約2.5×10⁶個の形質転換体が得られ、プールした。第1の選択段階として、2%ガラクトース/1%ラフィノースによる誘導後に、ロイシン欠乏培地で増殖させ（Gyurisら、前記;GuthrieおよびFink、Guide to Yeast Genetics an d Molecular Biology 、194巻、1991年）、酵母のライブラリーを8倍に重複させ（20×10⁶cfu）、30℃で5日間の増殖後に約900コロニーを得た。最も大きい300 個のコロニーを線状接種して培養して精製し、LEU遺伝子産物およびβ-ガラクトシダーゼ（pSH 18-34がコードする）のガラクトース-依存性発現について試験した。後者は培地にXga1が存在する場合に酵母のコロニーが青色になる（Ausubal ら、前記）。33個のコロニーがこれらの要件を満たし、配列決定後は14個の異なるコロニーが残り、これらは全てLexA-Cdk2ベイトと特異的に結合したが、LexA またはLexA-Cdk3ベイトとは特異的に結合しなかった（Finleyら、Proc．Natl．A cad．Sci．USA 91:12980-12984（1994））。結合強度は、各々異なる相互作用物質を含む酵母のコロニーが形成する青色の呈色の強さによって判定した。この手段によって、並列接合相互作用アッセイにおいてCdk2の天然に存在するパートナータンパク質によって生じる青色の強さを基準にして、各相互作用物質を強い結合物質、中程度の結合物質または弱い結合物質と分類した。各分類の代表的なペプチド配列の例を本明細書に示す：強い結合物質：ペプチド3（配列番号：6） -Gly₃₄-Pro₃₅-Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu -Phe-Arg-Ser-Leu-Phe-Gly₃₄-Pro₃₅- 中程度の結合物質：ペプチド2（配列番号：7） -Gly₃₄-Pro₃₅-Met-Val-Val-Ala-Ala-Glu-Ala-Val-Arg-Thr-Val-Leu-Leu-Ala-Asp -Gly-Gly-Asp-Val-Thr-Gly₃₄-Pro₃₅- 弱い結合物質：ペプチド6（配列番号：8） -Gly₃₄-Pro₃₅-Pro-Asn-Trp-Pro-His-Gln-Leu-Arg-Val-Gly-Arg-Val-Leu-Trp-Glu -Arg-Leu-Ser-Phe-Glu-Gly₃₄-Pro₃₅- 検出可能なほどには結合しない弱いペプチドはc4である：Arg-Arg-Ala-Ser-Val- Cys-Gly-Pro-Leu-Leu-Ser-Lys-Arg-Gly-Tyr-Gly Pro-Pro-Phe-Tyr-Leu-Ala-Gly- Met-Thr-Ala-Pro-Glu-Gly-Pro-Cys（配列番号：14）およびc:Arg-Arg-Ala-Ser-V al-Cys-Gly-Pro-Leu-His-Tyr-Trp-Gly-Leu-Gly-Gly-Phe-Val-Asp-Leu-Trp-Gln-G lu-Thr-Thr-Gly-Val-Gly-Pro-Cys（配列番号：15）。図3は、ペプチドアプタマーのうち5個がLexA-Cdk2ベイトと強力に反応したが、大多数の関連のないタンパク質とは反応しなかったことを示す。Cdk2アプタマーはどれも、共にCdk2と65%同一であるCDC28またはCdc2と相互作用しなかった。しかしながら、5個のCdk2相互作用物質のうちの2個はヒトCdk3とも相互作用し、 5個のうちの1個はショウジョウバエ（Drodophila）Cdc2cとも相互作用した。これは、これらのペプチドはこれらのタンパク質と共通する決定部を認識することを示唆している。理論的に考慮し、λリプレッサーのC末端を用いた較正実験を実施することにより、pSH18-34レポーターのEGY48への転写は、10^-6M程度の弱さのKdsとのタンパク質相互作用によって活性化され得ることが示された。ペプチド3および13がこのLexAop-lacZレポーターの強力な転写を促したということは、それらがかなり強力に相互作用することができるという考えと一致した。これらのペプチドの配列を図3Bに示す。関連実験において、6個の別のアプタマー（すなわち、ペプチド6（配列番号： 21）、ペプチド7（配列番号：22）、ペプチド9（配列番号：23）、ペプチド12（配列番号：24）、ペプチド13（配列番号：25）およびペプチド14（配列番号：26 ）は、LexA-Cdk2ベイトと相互作用するが、MaxもしくはRbなどの関連のないタンパク質、またはCdk2と47%配列が同一である、Cdk4などのある種のCdkファミリーのメンバーとは相互作用しないことが示された（図4A）。しかしながら、一部のアプタマーはCdkファミリーの他のメンバーと相互作用した。異なるペプチドアプタマーが、異なるCdkと別個のパターンの交差反応を示したということは、これらのアプタマーが種々のCdkに保存されている異なるエピトープを認識したことを示した。ペプチドループの塩基配列を図4Bに示す。全体としてのライブラリーには、Cdk2と相互作用するアプタマーには単位長さのペプチドは同じ頻度では生じなかった。20-merペプチドが実際に新規の認識構造物を形成した場合に予測されたように、アプタマーは既知のタンパク質と配列類似性をあまり示さなかった。ペプチドは全て帯電しており、そのCdk2との相互作用の一部はイオン性である可能性を示唆している。 Cdk2相互作用の特異性を確認するために、Gst-Cdk2融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズに固定し、これらのビーズを使用して、細菌が発現したペプチドアプタマーを特異的に沈降させた。一連の結果を図5に示し、別の結果を図6に示す。図5の結果について、Gst-Cdk2は大腸菌（E．coli）で発現させ、過去に記載されているように、グルタチオンセファロースで精製した（Leeら、Nature 374:91 -94（1995））。以下のようにペプチドを作成した：ペプチド3およびペプチド13 の合成を行う断片を、対応するライブラリープラスミドがコードする挿入物のPC R増幅によって作成し、pAL-TrxAに導入した（LaVallieら、前記）。融合タンパク質を発現させ、過去に記載されるようにフレンチプレス処理した細胞中で溶菌した（LaVallieら、前記）。リー（Lee）ら（前記）に記載されるように、Gst- セファロースビーズを使用して共沈を実施し、試料を15%SDSポリアクリルアミドゲル上で泳動し、ナイロン膜に移した。TrxA-を含有する融合タンパク質は、抗T rxA抗体で膜を探査し、次いで製造業者の指示に従って、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG抗体ECL試薬による固定抗体処理によって可視化した（Amersham社、イリノイ州アーリントンハイツ）。図6の結果について、GstおよびGst-Cdk2を記載されるように精製した（Leeら、Nature 374:91-94（1995））。オリゴヌクレオチド5’TAATGAGCGATAAACACCACC ACCACCACCACGACGACGACGACAAAGG3’(配列番号：27)および5’TACCTTTGTCGCTGTCGT CGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTATCGCTCATTA3’(配列番号：28)をアニーリングし、Ndel で切断したpALTRX-781に連結することによってpALHISTRXを構築した（LaVallie ら、前記）。次いで、ペプチドループをコードするAvaII断片をRsrIIで切断した pALHISTRXのライブラリープラスミドからクローニングした。His6-TrxAおよびHi s6-アプタマーを過去に記載されるようにGI724中で発現し（Ausubelら、前記）、タンパク質を製造業者（Qiagen社、カリフォルニア州チャッツウォース）の指示に従ってNi²⁺-NTA-アガロースで精製し、次いで10mM Hepes pH7.4/50mM NaCl で透析した。His6-TrxAまたはHis6-アプタマーの1μgを記載されるようにGstまたはGst-Cdk2セファロースビーズで沈殿させ（Leeら、前記）、抗TrxAウサギ抗血清とECL試薬（Amersham社、イリノイ州アーリントン）を用いたウエスタンブロット分析によって産物を検出した。図5および図6に示す結果は、Cdk2とペプチドアプタマーとの相互作用はインビトロで観察され、酵母に固有の任意の架橋タンパク質には依存しないことを明らかにしている。これらのアプタマーのCdk2に対する結合親和性を測定するために、以下の実験を実施した。相互作用検知較正実験（Estojakら、Mol．Cell．Biol．15:5820-58 29（1995））からの内挿に基づいて、図4Aおよび4Bのアプタマーの一部がpSH18- 34レポーターに促した強力な転写は、相互作用の平衡解離定数（Kds）は＜10^-6M であることを示唆している。アプタマーとCdk2との結合親和性を正確に測定するために、本発明者らはエバネッセント波発生器（BIAcore、Pharmacia社、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）を使用した。精製したHis6-Cdk2をCM-デキストランチップに結合し、ペプチドアプタマーを移動緩衝液中に添加してチップに流した。結合後、チップをアプタマーを含有しない移動緩衝液ですすいだ。このような実験では特に、HIS6-Cdk2を、アミン結合キット（Pharmacia社、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）を用いて、10mM MES pH6.1/50mM NaCl中で CM5チップと交差結合させた。次いで、精製したアプタマーを移動緩衝液（Hepes 10mM pH7.4/50mM NaCl）中に添加して、5μl/分の流速でチップに流し、His6-C dk2-アプタマー複合物の会合と解離を時間経過による共鳴角の変化として記録した。会合相はアプタマー注入時に始まり、解離は移動緩衝液の注入時に始まった。次いで会合および解離曲線の一部を適合させ、屈折率が僅かに異なった、（「緩衝液の流動」）移動緩衝液とアプタマー含有移動緩衝液との移行によって生じる共鳴角の急激な変化を除いた。各アプタマーについて少なくとも2回の試験（一般には４回の試験）の会合および解離相を、データ解析プログラムIGOR（Wavemetrics，Inc.、オレゴン州レイクオスウェゴ）およびオシャネシ（O'Shannessy）ら（Anal．Biochem．212:45 7-468（1993））に記載されるように非線形最小二乗アルゴリズムを使用して、指数関数に適合することによって、会合および解離速度定数を測定した。解離速度定数を会合速度定数で除することによってKdsを算出した。図7に代表的な波発生試験を示し、表1は上記の条件下で、全てのアプタマーは30〜120nMのKdsを示したことを示す。指定した細胞内ベイトと特異的に相互作用するTrxA-ペプチドを選択する能力によって、別の分類の細胞内試薬を作成できる。例えば、(上記のように)適当に誘導体化したTrxA-ペプチド融合物によってアンタゴニストまたはアゴニストを作成することができる。または、ペプチド融合物は、特定のタンパク質対の相互作用を促す、ホモ二量体またはヘテロ二量体「マッチメーカー」を作成させる。 1つの特定の例において、相互作用候補ペプチドを含有する立体配座制約タンパク質に結合されたロイシンジッパー配列を使用することによって2つのタンパク質を一緒にさせる。このタンパク質は関心のあるタンパク質対の両方のメンバーと結合することができ、両者の相互作用を促す。または、「マッチメーカー」は 2つの異なる配列を有してもよく、1つは第1のポリペプチドに親和性を有し、もう1つは第2のポリペプチドに親和性を有する。また、結果は第1と第2のポリペプチドの相互作用に向けられる。本明細書に記載するペプチド融合物の別の実例は、宿主のプロテアーゼによって破壊されるための結合タンパク質を標的とする「デストロイヤー」の作成である。デストロイヤーの適用例では、プロテアーゼは相互作用対の一方の成分と相互作用させられ、その成分が破壊される標的（例えば、プロテアーゼ基質）と相互作用させられる。この方法によって、プロテアーゼは所望の作用部位に搬送され、その例えば分解力は効果的に増大した。本明細書に記載する融合タンパク質のさらに別の用途は、「立体配座安定剤」としてであり、標的タンパク質が特定の立体配座を取りやすいように、またはその立体配座を安定するように誘導する。特定の1例において、rasタンパク質は、細胞に分裂するようにシグナルを与える立体配座と、細胞に分裂しないようにシグナルを与える立体配座とをとる。望ましい立体配座を安定するペプチドまたはタンパク質を選択することによって、細胞が分裂するか否かに影響を与えることができる。活性を増加または減少させる立体配座の変化を受ける他のタンパク質はまた、適当な「立体配座安定剤」に結合して、望ましいタンパク質の特性に影響を与えることができる。2 ．Cdk2の機能的阻害 Cdk2と相互作用するペプチドがインビボにおいてCdk2機能を阻害するか否かを測定するために、本発明者らはヒトCdk2がCdc28の温度感受性対立遺伝子を補足することができるという事実を利用した（ElledgeおよびSpottswood、EMBO 10:2 653-2659、1991;Ninomiyaら、PNAS 88:9006-9010、1991;Meyersonら、EMBO 11:2 909-2917、1992）。ペプチド13はCdk2依存性酵母の平板効率を阻害する。温度感受性cdc28-1N変異体を保有する株は、Cdk2を発現するプラスミドを保有すると、高温でコロニーを形成することができる。制限温度では、対照のペプチドを発現する酵母の平板効率と比較すると、ペプチド13の発現はこの株の平板効率を10倍低下する。ペプチド3および13は、cdc28-13ts対立遺伝子を保有するCdk2（+）株の37℃における平板効率に同様の影響を与える。ペプチド13の発現はCdk2（+）、cdc28ts-1N株の倍加時間を50％遅延する。このペプチドを発現する株の顕微鏡調査は、これらの細胞の多数の集団は制限温度においてcdc28-1N細胞の特徴である細長い形態であったが、対照のペプチドを発現する細胞はさらに正常の形態であった。ペプチド13は、欠損が野生型Cdc28産物を発現するプラスミドによって補足されるとき、高温ではcdc28-1N株の増殖に影響を与えず、許容温度では酵母に影響を与えない。任意の特定の理諭に結びつけたくはないが、このペプチドは、Cdk2 分子の一部の面に結合して、その機能を阻害することによって、サイクリン、他のパートナーまたは基質と相互作用する能力を妨害することにより、酵母細胞周期の進行を阻止すると思われる。図4Bのアプタマーを用いた後者の実験において、これらのペプチドによるCdk2 活性の阻害（例えば、分子の面に結合して、パートナータンパク質または基質の一方との相互作用を阻止することによって）を調査した。特に、アプタマーがCd k2/サイクリンEキナーゼによるヒストンH1のリン酸化を阻害する能力を試験した。これらの実験を実施するために、記載されるように、2×10⁷Sf9細胞を、赤血球凝集素-標識Cdk2およびHis6-サイクリンEを発現する組換えバキュロウィルスで共感染した（Katoら、Genes&Dev．7:331-342（1993）；Desaiら、Mol．Biol． Cell 3:571-582（1992））。1×キナーゼ緩衝液500μl中での感染後細胞を40時間溶菌し（Katoら、前記）、100倍に希釈した抽出液の5μlを30μlの反応に使用した。2.5μCiの［γ³²P］ATP（3000Ci/mmol）、25μM ATP、100ngのヒストンH1 （シグマ社、ミズーリ州セントルイス）および種々の量のHis6-TrxAまたはHis6- アプタマーを添加することにより、反応を25℃で20分間実施した。試料を15%SDS -PAGEゲル上で泳動し、オートラジオグラフィーで露光した。これらの実験の結果を図8に示す。試験したアプタマーは全てCdk2/サイクリン EキナーゼによるヒストンH1のリン酸化を阻害することができた。標準的な条件下（pH7.5、0mM NaCl）（Katoら、前記）では、見かけの半分阻害濃度は1.5〜10 nMの範囲であった。わずかな量の細菌の汚染が阻害反応を生じる可能性を排除するために、本発明者らはウサギポリクローナル抗チオレドキシン抗血清を用いた Pep2調製物からHis6-ペプチドアプタマーを除去した；この免疫枯渇調製物はCdk 2キナーゼ活性を阻害しなかった。アプタマーの半分阻害濃度はエバネッセント波実験で測定されたKdsより低く、各相互作用のエネルギーの一部はイオン性であり、エバネッセント波流動緩衝液中の塩によって低下されるという考えと一致する。共沈実験（Reymondら、Oncogene 11:1173-1178（1995））において、精製されたPep2は、インビトロで翻訳されたCdk2との結合に関して、インビトロで翻訳されたサイクリンEと競合しなかった。しかしながら、Pep2による阻害は10倍過剰なヒストンH1の添加によって回復された。これは、少なくともPep2は、そのH1基質と競合することによってキナーゼ活性を阻害することを示唆している。過去の研究は、制約されていないペプチドのライブラリーは、インビトロにおいて（Devlinら、Science 249:404-406（1990）；Cwirlaら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 87:6378-6382（1990）；Lamら、Nature 354:82-84（1991）；Songya ngら、Current Biology 4:973-982（1994）；Scottら、Current Bioloqy 5:40-4 8（1994））および酵母において（Yangら、Nucl．Acids．Res．23:1152-1156（1 995））標的を認識することができる配列を含むことを確立している。このような単離ペプチド配列は天然の相互作用物質と類似性を有することが多い。対照的に、制約されたペプチドライブラリーは立体配座的に差が小さく（McConnellら、Gene151:115-118（1994））、結合が1つの立体配座をとるループを生じる場合には、立体配座に差がないことはエントロピーの消費を減らすはずである（Spol arら、Science 263:777-784（1994））；エントロピー消費のこのような低下は、制約されていないペプチドで一般に観察されるよりも大きい親和性を有する標的を、本発明者らのCdk2ペプチドアプタマーは認識するということを説明する（ Yangら、前記；Oldenburgら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5393-5397（1992 ）；McLaffertyら、Gene 128:29-36（1993））。このような高い親相性は、最も単純な場合では、標的分子の特異的な面に結合し、特異的なパートナーまたはエフェクターとの相互作用を妨害することによって、ペプチドアプタマーがインビボにおいてタンパク質の機能を阻害することを示唆している。特異的なタンパク質に結合する物質の強力な選択法となる相互作用トラップとともに考慮すると、組み合わせライブラリーから大多数のアプタマーを形成する能力は、種々の細胞内標的に対するペプチドアプタマーの選択を容易にする。タンパク質の接触を阻害するアプタマーを使用して、高等な真核細胞の分裂を支配するタンパク質相互作用のネットワークの切断を助力することができ、また特異的なミスセンス対立遺伝子の単離が実行不可能な後生生物の遺伝子解析に使用することもできる。本発明のアプタマーと抗体との類似性は、ペプチドアプタマーを、ELISA、免疫蛍光実験およびセンサーなどの、免疫学的試薬を使用する他の用途に使用することができることを示している。望ましい場合には、例えばその価数を増加することにより、またより強固に結合する変異体を選択するために現行の相互作用技術を使用することによって、これらのアプタマーの親和性を増大させることができる。この第1世代のペプチドアプタマーは、細胞内で巨大分子を破壊、変更および集合させる助力となる細胞内ナノテクノロジーの認識法の作成を容易にする。3 ．Onco Rasベイトとチオレドキシンの相互作用の検知 rasタンパク質は多数のシグナル伝達経路に必須であり、細胞増殖を含む数多くの生理的機能を調節する。ras遺伝子は最初にハービー（Harvey）およびカーステン（Kirsten）肉腫ウィルスのケノムから同定された。３種の哺乳類ras遺伝子（N、K-rasおよびH-ras）は高度に保存された膜結合型グアニンヌクレオチド結合タンパク質をコードし、分子量は21kDaであり、活性（GTP-結合）型と不活性（GDP-結合）型とを循環する。正常細胞では、その固有のGTPase活性が結合GTPをGDPに速やかに変換するので、Rasの活性化タンパク質は短命である。GTPase活性は、GTPase-活性化タンパク質（GAPs）によって10⁵倍刺激される。GTP-結合RasはGAP、c-Raf、1型神経繊維腫症（NF-1）およびRalグアニンヌクレオチド解離刺激因子（RalGDS）と相互作用する。突然変異により活性化されるRASタンパク質はヒト腫瘍細胞の約30％で見つけられ、GAPによって刺激されないGTPase活性を大幅に低下させる。これまで研究された突然変異の大多数は、RasのGly-12残基またはGln-61残基のどちらかの点突然変異によるものである。このようなRas突然変異は活性型を維持し、下流のエフェクターと相互作用して腫瘍を発生させる。野生型のGTP-結合型と発癌性Ra sタンパク質との間には大きな立体配座の差があることが報告されている。このような立体配座の差は、発癌性rasタンパク質が誘導する悪性変化の原因となりうる。突然変異によって活性化されるGTP-結合H-ras突然変異体の立体配座のこのような変化は、立体配座的に制約されたランダムペプチドライブラリーのメンバーの標的となる。本発明の実施例において、ライブラリーは、上記のように、立体配座的に制約されたチオレドキシンペプチドライブラリーである。発癌性Rasと相互作用するライブラリーのメンバーは、上記の種々の相互作用検知技術を使用して同定されている。発癌性Rasと既知のエフェクターとの相互作用を妨害し、細胞の形質転換を阻害する能力について、単離された発癌性Rasペプチドアプタマーを解析することができる。本発明者らは、ペプチドアプタマーを単離して特徴づけるために、十分に特徴付けられている発癌性H-ras（G12V）を使用している。本明細書に提供されるプロトコールを適応させ、他の発癌性遺伝子のためのペプチドアプタマーを単離することができる。ベイト構築 BTM116-H-Ras（G12V）（図9）をBamHIおよびSalIで消化することによって、Le xA-Ras（G12V）/pEG202:H-Ras（G12V）DNAの構築を行った。H-Ras（G12V）DNAを、BamHIおよびSalIで消化したpEG202骨格に連結した。得られたプラスミドをpEG 202:H-Ras（G12V）（またはV6）と称する（図10）。 H-Ras（G12V）ペプチドアプタマーのスクリーニング標準的な酵母形質転換プロトコールにより、pEG202:H-Ras（G12V）（V6）をEG Y48株で形質転換した；特に、ジモリザーチ（Zymo Research）社（カリフォルニア州オレンジカントリー）によって提供されたプロトコールを本明細書において使用した。EGY48をYPD培地で、OD₆₀₀=0.2-0.7まで増殖した。500×g、4分間で細胞をペレット状にし、EZ1溶液（Zymo Research社）10mlに再懸濁させた。次いで、細胞を遠心分離し、EZ2（Zymo Research社）1mlに再懸濁させた。コンピテント細胞の一部（50μl）を-70℃の冷凍庫に保存した。コンピテント細胞の一部をLexA-H-Ras（G12V）/pEG202の0.1μgおよびEZ3溶液（Zymo Research社）の500μlと混合した。混合物を30℃で、30分間インキュベーションし、ヒスチジンとウラシルを含まない酵母培地で平板培養した。1つのコロニーを取り、OD₆₀₀測定値が0.96になるまで、振盪させながら（150rpm）30 ℃でグルコースUra^-His^-培地100ml中でインキュベーションした。培養物を2000g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを滅菌したLioAc/TE 5mlに再懸濁させた。細胞を再度上記のように遠心分離し、滅菌したLiOAc/TE 0.5mlに再懸濁させた。次いで、細胞の一部（50μl）を、チオレドキシンペプチドライブラリーDNAの 1μl、サケ精子DNAの70μg、および滅菌した40%PEGのLiOAc/TE溶液300μlと共に 30℃で、30分間インキュベーションした。混合物を42℃で、15分間熱ショックを加えた。各部分をグルコースUra^-His^-Trp^-培地を含む24cm×24cm平板上で平板培養した。形質転換効率は、一般にライブラリーDNAのμgあたり50,000〜100,000 コロニー形成単位の範囲であった。合計150万個の形質転換体を獲得し、ガラクトース/ラフィノースLeu^-Ura^-His^- Trp^-の選択培地上で平板培養した。形成された338個のコロニーのうちから、50 個を無作為に取り、酵母プラスミドDNAを調製するために、グルコースLeu^-Ura^-H is^-Trp^-培地の5mlに接種した。各酵母培養液のうち0.5mlを等容量の酸で洗浄した砂とフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（24:24:1）と混合し、ボルテックス混合器で2分間混合した。次いで、混合物を15分間遠心分離し、上清をエタノールで沈殿させた。DNAペレットをTE 50μlに再懸濁させた。各試料の1μlを使用して、エレクトロポレーション法によって大腸菌（E．col i）KC8を形質転換した。細菌の形質転換体をウラシル、ロイシン、ヒスチジンおよびアンピシリンを添加した最小培地で選択した。各種の形質転換体から、チオレドキシン-ペプチド融合タンパク質をコードするDNA断片を保有する、ロイシンマーカーが付いたプラスミドを最後に単離した。プライマー5'-GACGGGGCGATCCTCGTCG-3’(配列番号：16)を使用したfmolDNA（登録商標）配列決定システム（Promega社、ウィスコンシン州マディソン）の指示によって、50個の単離物の塩基配列決定を実施した。50個の単離物のうち9個（#4、#18、#39、#41、#22、#24、#30、#31、#46と呼ぶ）は、dT/ddT停止反応物を電気泳動で測定すると、独特のペプチドコード配列を有していた。それらのうち、#39の予測ペプチドアプタマー配列は以下のようであった：Trp-Ala-Glu-Trp -Cys-Gly-Pro-Val-Cys-Ala-His-Gly-Ser-Arg-Ser-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Lys-Tyr -His-Val-Ser-Phe-Leu-Gly-Pro-Cys-Lys-Met-Ile-Ala-Pro-Ile-Leu-Asp（配列番号：17）。本発明者らの結果から、約60個の特有のH-Ras（G12V）ペプチドアプタマー（338×9/50）が第1回のスクリーニングにおいて単離されたと考えられる。その他の態様上記のように、本発明は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出し、解析するための方法を特徴とする。一般に、上記の実験では、ベイトタンパク質をDNA 結合領域に融合し、（立体配座制約タンパク質と関連する）プレイタンパク質を遺伝子活性領域に融合する。しかしながら、本発明は容易に他の形式に適合される。例えば、本発明は、ベイトタンパク質を遺伝子活性領域に融合し、（立体配座制約タンパク質と関連する）プレイタンパク質をDNA結合領域に融合する「逆の」相互作用トラップ法も含む。また、ベイトタンパク質とプレイタンパク質との相互作用により、レポーター遺伝子の発現が活性化される。しかしながら、このような「逆の」相互作用トラップ方法は、下流の遺伝子の発現を活性化しないプレイタンパク質の使用に依存する。本明細書に記載するタンパク質相互作用アッセイは細胞を含有しないインビトロの系で実施してもよい。このような系は、DNA結合タンパク質認識部位（例えば、LexA結合部位）と機能的に結合するレポーター遺伝子を含むDNA構築物により開始する。このDNAにベイトタンパク質（例えば、LexADNA結合領域に結合する、本明細書に記載するベイトタンパク質のいずれか）およびプレイタンパク質（例えば、遺伝子活性領域に結合する、立体配座的に制約された相互作用候補プレイタンパク質のライブラリーの1つ）を添加する。RNA産物として、もしくはインビトロで翻訳したタンパク質産物としてレポーター遺伝子産物を測定することにより、または翻訳したレポーター遺伝子産物の一部の酵素活性により、ベイトタンパク質とプレイタンパク質との相互作用を解析する。または、例えば（カラムまたは他の固体支持体への第1のタンパク質の固定および立体配座的に制約されたタンパク質との接触などの）タンパク質相互作用を同定するための任意の標準的な物理的または生化学的手法によって直接的なインビトロ手法により、立体配座的に制約されたタンパク質に関係する相互作用を実施してもよい。これらの直接的なインビトロによる方法は、好ましくは立体配座的に制約されたタンパク質をコードするDNAを、例えば大腸菌（E．coli）の鞭毛上のファージの呈示またはタンパク質の呈示に関係する手法を使用して、容易に単離する方法で、容易に実施される。これらのインビトロの系を使用して、（上記の系において）既知の相互作用タンパク質対に、相互作用アゴニスト候補物質または相互作用アンタゴニスト候補物質を添加し、候補化合物またはタンパク質を含有しない対照反応と比較して、レポーター遺伝子発現の（それぞれ）増加または減少を解析することによってアゴニストまたはアンタゴニストを同定することもできる。大規模スクリーニングを容易にするために、例えば、10ないし20個の候補化合物またはタンパク質の貯留物中において、プレイ候補タンパク質またはアゴニスト候補物質もしくはアンタゴニスト候補物質を最初に試験することができる。陽性の結果を示す貯留物から、貯留物の成分を個別に解析することによって、特定の相互作用タンパク質またはアゴニストもしくはアンタゴニストを同定する。このようなインビトロの系をロボットによる自動化またはキット製造に改良する。本明細書に記載する相互作用トラップ方法のいずれかの成分を含むキットも本発明に含まれる。 1つの特定の態様において、インビトロで同定される相互作用タンパク質を、インビボで相互作用する能力について試験する。このようなインビボで相互作用するタンパク質を任意の診断目的または治療目的のために使用することができる。例えば、インビボで相互作用することが示されているタンパク質を細胞内相互作用を妨害、促進または安定化するために使用してもよいし、または細胞内抗体様試薬として使用してもよい。本発明のインビボ系またはインビトロ系のいずれかの成分（例えば、種々の融合タンパク質またはそのDNA）を、望ましい実験計画に応じて逐次または同時に提供することができる。他の実施態様は以下の請求の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 1/68 (72)発明者マッコイジョンエム. アメリカ合衆国マサチューセッツ州リーディングパインリッジロード 63 (72)発明者イェセンティムエイチ. ドイツ国バッドソデンウィーゼンウェグ３ (72)発明者ゼウチャンクシングウィルソンアメリカ合衆国マサチューセッツ州ボストンホーソンプレイス９アパートメント９ピー

Claims

【特許請求の範囲】 1．第1のタンパク質が第2のタンパク質と物理的に相互作用できるか否かを判定する方法であって：（a）（i）DNA結合タンパク質認識部位と機能的に結合するレポーター遺伝子と、（ii）該DNA結合タンパク質認識部位と特異的に結合することができる結合部分に共有結合された該第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子と、（iii）遺伝子活性化部分と共有結合し、立体配座的に制約された該第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子とを有する宿主細胞を提供する段階、および（b）該第1のタンパク質と該第2のタンパク質との相互作用の指標として該レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む方法。 2．第2のタンパク質が少なくとも6アミノ酸のペプチドである、請求項1記載の方法。 3．第2のタンパク質が、鎖長60以下のアミノ酸のペプチドである、請求項1記載の方法。 4．第2のタンパク質が、無作為に生じたペプチド配列または意図的に設計されたペプチド配列を含む、請求項1記載の方法。 5．第2のタンパク質が、立体配座制約タンパク質と共有結合されているために立体配座的に制約されている、請求項1記載の方法。 6．第2のタンパク質が1つ以上のループを含む、請求項1記載の方法。 7．第1のタンパク質がCdk2である、請求項1記載の方法。 8．第1のタンパク質がRasまたは活性型Rasである、請求項1記載の方法。 9．第2のタンパク質が立体配座制約タンパク質内に埋め込まれている、請求項5 記載の方法。 10．立体配座制約タンパク質がチオレドキシンである、請求項5記載の方法。 11．立体配座制約タンパク質がチオレドキシン様分子である、請求項5記載の方法。 12．第2のタンパク質が、チオレドキシンタンパク質の活性部位ループ内に挿入されている、請求項10記載の方法。 13．第2のタンパク質が、該第2のタンパク質のアミノ末端のシステイン残基とカルボキシ末端のシステイン残基とのジスルフィド結合によって立体配座的に制約されている、請求項1記載の方法。 14．宿主細胞が酵母である請求項1記載の方法。 15．DNA結合ドメインがLexAである請求項1記載の方法。 16．レポーター遺伝子が呈色反応によって解析される、請求項1記載の方法。 17．レポーター遺伝子が細胞の生存率によって解析される、請求項1記載の方法。 18．タンパク質集団から相互作用タンパク質を検出する方法であって：（a）（i）DNA結合タンパク質認識部位と機能的に結合するレポーター遺伝子と、（ii）該DNA結合タンパク質認識部位に特異的に結合することができる結合部分と共有結合する被験タンパク質を含む融合タンパク質を発現する融合遺伝子とを含む宿主細胞を提供する段階、（b）遺伝子活性化部分に共有結合し立体配座的に制約された、該タンパク質集団のうちの1つを含む第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子を該宿主細胞中に導入する段階、および（c）該レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む方法。 19．タンパク質集団が、鎖長1〜60アミノ酸の短いペプチドを含む、請求項18記載の方法。 20．タンパク質集団が、一連の無作為に生じたペプチド配列または意図的に設計されたペプチド配列である、請求項18記載の方法。 21．タンパク質集団が、立体配座制約タンパク質と共有結合することによって立体配座的に制約されている、請求項18記載の方法。 22．タンパク質集団が各々1つ以上のループを有する、請求項18記載の方法。 23．タンパク質集団の各々が立体配座制約タンパク質内に埋め込まれている、請求項21記載の方法。 24．立体配座制約タンパク質がチオレドキシンである、請求項21記載の方法。 25．タンパク質集団の各々が、チオレドキシンの活性部位ループ内に挿入されている、請求項24記載の方法。 26．タンパク質集団の各々が、該タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端のシステイン残基間のジスルフィド結合によって立体配座的に制約されている、請求項18記載の方法。 27．第1のタンパク質がCdk2である請求項18記載の方法。 28．第1のタンパク質がRasまたは活性型Rasである請求項18記載の方法。 29．宿主細胞が酵母である請求項18記載の方法。 30．DNA結合ドメインがLexAである請求項18記載の方法。 31．レポーター遺伝子が呈色反応によって解析される、請求項18記載の方法。 32．レポーター遺伝子が、細胞の生存率によって解析される、請求項18記載の方法。 33．相互作用候補物質を同定する方法であって、（a）DNA結合タンパク質認識部位に機能的に結合するレポーター遺伝子を提供する段階、（b）該DNA結合タンパク質認識部位に特異的に結合することができる結合部分と共有結合する第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を提供する段階、（c）遺伝子活性部分に共有結合し、立体配座的に制約され、該第1のタンパク質と相互作用することができる第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を提供する段階、（d）該相互作用候補物質と該第1のタンパク質および／または該第2のタンパク質とを接触させる段階、および（e）該レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む方法。 34．第1の融合タンパク質を提供する段階が、該第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子を提供する段階を含み、第2の融合タンパク質を提供する段階が、該第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子を提供する段階を含む、請求項33記載の方法。 35．第1の融合タンパク質と第2の融合タンパク質とが、相互作用候補物質と接触する前に相互作用することを可能にされる、請求項33記載の方法。 36．第1の融合タンパク質と相互作用候補物質とが、第2の融合タンパク質と接触する前に相互作用することを可能にされる、請求項33記載の方法。 37．相互作用候補物質が立体配座的に制約されている、請求項33記載の方法。 38．相互作用候補物質が1つ以上のループを有する、請求項33記載の方法。 39．相互作用候補物質がアンタゴニストであり、レポーター遺伝子発現を低下させるものである、請求項33記載の方法。 40．相互作用候補物質がアゴニストであり、レポーター遺伝子発現を増加させるものである、請求項33記載の方法。 41．相互作用候補物質が、タンパク質、ポリヌクレオチドおよび小分子からなる群より選択される種である、請求項33記載の方法。 42．相互作用候補物質がcDNAまたは合成DNAライブラリーの１つの種によってコードされている、請求項33記載の方法。 43．相互作用候補物質が、第1の融合タンパク質または第2の融合タンパク質の変異型である、請求項33記載の方法。 44．レポーター遺伝子、第1の融合遺伝子および第2の融合遺伝子が1本鎖のDNA片に含まれている、請求項34記載の方法。 45．（f）第2のタンパク質が、細胞内で第1のタンパク質と相互作用するか否かを判定する段階をさらに含む、請求項33記載の方法。 46．第1のタンパク質がCdk2である請求項33記載の方法。 47．第1のタンパク質がRasまたは活性型Rasである請求項33記載の方法。 48．真核細胞の集団であって、各細胞が、立体配座的に制約された細胞内ペプチドをコードする組換えDNA分子を有し、該集団中に少なくとも100種の異なる組換え分子が存在し、各分子が該集団の少なくとも1つの細胞中に存在する、真核細胞の集団。 49．細胞内ペプチドが、立体配座的制約タンパク質と共有結合されているため、立体配座的に制約されている、請求項48記載の真核細胞集団。 50．細胞内ペプチドが立体配座的制約タンパク質内に埋め込まれている、請求項 49記載の集団。 51．細胞内ペプチドが1つ以上のループを有する、請求項49記載の集団。 52．立体配座制約タンパク質がチオレドキシンである請求項49記載の真核細胞集団。 53．細胞内ペプチドが、第2のタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端のシステイン残基間のジスルフィド結合によって立体配座的に制約されている、請求項48記載の真核細胞集団。 54．細胞が酵母細胞である請求項48記載の真核細胞の集団。 55．組換えDNA分子がさらに、細胞内ペプチドと共有結合する遺伝子活性化部分をコードしている、請求項48記載の真核細胞集団。 56．細胞内ペプチドが真核細胞内で第2の組換えタンパク質と物理的に相互作用する、請求項48記載の真核細胞集団。 57．第1のタンパク質と第2のタンパク質との相互作用を解析する方法であって、（a）DNA結合タンパク質認識部位と機能的に結合するレポーター遺伝子を提供する段階、（b）該DNA結合タンパク質認識部位と特異的に結合することができる結合部分と共有結合する第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を提供する段階、（c）遺伝子活性化部分と共有結合し、立体配座的に制約されている第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を提供する段階、（d）該レポーター遺伝子と、該第1の融合タンパク質と、該第2の融合タンパク質とを組み合わせる段階、および（e）該レポーター遺伝子の発現を測定する段階を含む方法。 58．第1の融合タンパク質を提供する段階が、該第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子を提供する段階を含み、第2の融合タンパク質を提供する段階が、該第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子を提供する段階を含む、請求項57記載の方法。 59．第2の融合タンパク質が1つ以上のループを含む、請求項57記載の方法。 60．（f）第2のタンパク質が細胞内で第1のタンパク質と相互作用するか否かを決定する段階をさらに含む請求項57記載の方法。 61．配列Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe- Arg-Ser-Leu-Phe（配列番号:1）を有するタンパク質。 62．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項61記載のタンパク質。 63．配列Met-Val-Val-Ala-Ala-Glu-Ala-Val-Arg-Thr-Val-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly- Gly-Asp-Val-Thr（配列番号:2）を有するタンパク質。 64．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項63記載のタンパク質。 65．配列Pro-Asn-Trp-Pro-His-Gln-Leu-Arg-Val-Gly-Arg-Val-Leu-Trp-Glu-Arg- Leu-Ser-Phe-Glu（配列番号:3）を有するタンパク質。 66．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項65記載のタンパク質。 67．配列Ser-Val-Arg-Met-Arg-Tyr-Gly-Ile-Asp-Ala-Phe-Phe-Asp-Leu-Gly-Gly- Leu-Leu-His-Gly（配列番号:9）を有するタンパク質。 68．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項67記載のタンパク質。 69．配列Glu-Leu-Arg-His-Arg-Leu-Gly-Arg-Ala-Leu-Ser-Glu-Asp-Met-Val-Arg- Gly-Leu-Ala-Trp-Gly-Pro-Thr-Ser-His-Cys-Ala-Thr-Val-Pro-Gly-Thr-Ser-Asp- Leu-Trp-Arg-Val-Ile-Arg-Phe-Leu（配列番号:10）を有するタンパク質。 70．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項69記載のタンパク質。 71．配列Tyr-Ser-Phe-Val-His-His-Gly-Phe-Phe-Asn-Phe-Arg-Val-Ser-Trp-Arg- Glu-Met-Leu-Ala（配列番号:11）を有するタンパク質。 72．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項71記載のタンパク質。 73．配列Gln-Val-Trp-Ser-Leu-Trp-Ala-Leu-Gly-Trp-Arg-Trp-Leu-Arg-Arg-Tyr- Gly-Trp-Asn-Met（配列番号:12）を有するタンパク質。 74．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項73記載のタンパク質。 75．配列Trp-Arg-Arg-Met-Glu-Leu-Asp-Ala-Glu-Ile-Arg-Trp-Val-Lys-Pro-Ile- Ser-Pro-Leu-Glu（配列番号:13）を有するタンパク質。 76．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項75記載のタンパク質。 77．配列Trp-Ala-Glu-Trp-Cys-Gly-Pro-Val-Cys-Ala-His-Gly-Ser-Arg-Ser-Leu- Thr-Leu-Leu-Thr-Lys-Tyr-His-Val-Ser-Phe-Leu-Gly-Pro-Cys-Lys-Met-Ile-Ala- Pro-Ile-Leu-Asp（配列番号:17）を有するタンパク質。 78．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項77記載のタンパク質。 79．配列Leu-Val-Cys-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Asp-Trp-Glu-Ala-Gly-Ala-Leu-Phe- Arg-Ser-Leu-Phe（配列番号:18）を有するタンパク質。 80．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項79記載のタンパク質。 81．配列Tyr-Arg-Trp-Gln-Gln-Gly-Val-Val-Pro-Ser-Asn-Trp-Ala-Ser-Cys-Ser- Phe-Arg-Cys-Gly（配列番号:19）を有するタンパク質。 82．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項81記載のタンパク質。 83．配列Ser-Ser-Phe-Ser-Leu-Trp-Leu-Leu-Met-Val-Lys-Ser-Ile-Lys-Arg-Ala- Ala-Trp-Glu-Leu-Gly-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Asn-Thr-Ser-Gly-Trp-Ala-Ser-Leu- Ala-Asp-Phe-Tyr（配列番号:20）を有するタンパク質。 84．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項83記載のタンパク質。 85．配列Arg-Val-Lys-Leu-Gly-Tyr-Ser-Phe-Trp-Ala-Gln-Ser-Leu-Leu-Arg-Cys- Ile-Ser-Val-Gly（配列番号:21）を有するタンパク質。 86．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項85記載のタンパク質。 87．配列Gln-Leu-Tyr-Ala-Gly-Cys-Tyr-Leu-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Ser-Ser-Leu- Ser-Ile-Arg-Val（配列番号:22）を有するタンパク質。 88．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項87記載のタンパク質。 89．配列Gln-Gln-Arg-Phe-Val-Phe-Ser-Pro-Ser-Trp-Phe-Thr-Cys-Ala-Gly-Thr- Ser-Asp-Phe-Trp-Gly-Pro-Glu-Pro-Leu-Phe-Asp-Trp-Thr-Arg-Asp（配列番号:23 ）を有するタンパク質。 90．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項89記載の方法。 91．配列Arg-Pro-Leu-Thr-Gly-Arg-Trp-Val-Val-Trp-Gly-Arg-Arg-His-Glu-Glu- Cys-Gly-Leu-Thr(配列番号:24)を有するタンパク質。 92．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項91記載のタンパク質。 93．配列Pro-Val-Cys-Cys-Met-Met-Tyr-Gly-His-Arg-Thr-Ala-Pro-His-Ser-Val- Phe-Asn-Val-Asp（配列番号:25）を有するタンパク質。 94．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項93記載のタンパク質。 95．配列Trp-Ser-Pro-Glu-Leu-Leu-Arg-Ala-Met-Val-Ala-Phe-Arg-Trp-Leu-Leu- Glu-Arg-Arg-Pro（配列番号:26）を有するタンパク質。 96．タンパク質が立体配座的に制約されている、請求項95記載のタンパク質。 97．請求項61記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 98．請求項63記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 99．請求項65記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 100．請求項67記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 101．請求項69記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 102．請求項71記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 103．請求項73記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 104．請求項75記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 105．請求項77記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 106．請求項79記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 107．請求項81記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 108．請求項83記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 109．請求項85記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 110．請求項87記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 111．請求項89記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 112．請求項91記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 113．請求項93記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 114．請求項95記載のタンパク質をコードする実質的に純粋なDNA。 115．（a）（i）DNA結合タンパク質認識部位と機能的に結合するレポーター遺伝子と（ii）該DNA結合タンパク質認識部位と特異的に結合することができる結合部分と共有結合する被験タンパク質を含む融合タンパク質を発現する融合遺伝子とを有する宿主細胞を提供する段階、（b）遺伝子活性化部分と共有結合する該タンパク質の集団の1つを含み、立体配座的に制約されている第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子を該宿主細胞に導入する段階、（c）該レポーター遺伝子の発現を測定する段階、および（d）該第2の融合タンパク質中に存在するとき、該レポーター遺伝子の発現を変更する能力に基づいてタンパク質を単離する段階を含む方法によって単離されるタンパク質。 116．（a）DNA結合タンパク質認識部位と機能的に結合するレポーター遺伝子を提供する段階、（b）該DNA結合タンパク質認識部位と特異的に結合することができる結合部分と共有結合する第1のタンパク質を含む第1の融合タンパク質を提供する段階、（c）遺伝子活性化部分と共有結合し、立体配座的に制約され、該第1のタンパク質と相互作用することができる第2のタンパク質を含む第2の融合タンパク質を提供する段階、（d）相互作用候補タンパク質と該第1のタンパク質または該第2のタンパク質とを接触させる段階、（e）該レポーター遺伝子の発現を測定する段階、および（f）該第1のタンパク質または該第2のタンパク質とともに存在するとき、該レポーター遺伝子の発現を変更する能力に基づいて相互作用タンパク質を単離する段階を含む方法によって単離される相互作用タンパク質。 117．試料中のタンパク質を検出するための方法であって、（a）該試料と、該タンパク質に特異的に結合することができる立体配座的に制約されたタンパク質とを接触させて、複合体を形成する段階、および（b）該複合体を検出する段階を含む方法。 118．検出段階が、複合体-形成試薬として立体配座的に制約されたタンパク質を使用する免疫沈降法、ウエスタンブロット法またはアフィニティーカラム法によって実施される、請求項117記載の方法。 119．第1のタンパク質と第2のタンパク質との相互作用を解析する方法であって、（a）第1のタンパク質を提供する段階、（b）立体配座的に制約された第2のタンパク質を含む融合タンパク質を提供する段階、（c）複合体の形成を可能にする条件下で第1のタンパク質と該融合タンパク質とを接触させる段階、（d）相互作用の指標として該複合体を検出する段階、および（e）該第1のタンパク質が、細胞内で該融合タンパク質と相互作用するか否かを決定する段階を含む方法。