JP2003199459A - リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物 - Google Patents
リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リンパ球特異的にその運動性を制御する分子
を同定し、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片
拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明する上
で、あるいは新しい治療法を開発する上で有用なモデル
動物を提供すること。 【解決手段】 ＤＯＣＫ２遺伝子を染色体上で欠損さ
せ、リンパ球遊走制御機能が欠失又は抑制されているモ
デル動物、例えばＤＯＣＫ２ノックアウトマウスを作製
する。このＤＯＣＫ２ノックアウトマウスでは、Ｒａｃ
を活性化してアクチン細胞骨格の再構築を促す機能や、
ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリ
ンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の
２次リンパ組織へのホーミング機能や、ＥＬＣケモカイ
ン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中への移出機能
が障害されており、その結果免疫応答が抑制される。
を同定し、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片
拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明する上
で、あるいは新しい治療法を開発する上で有用なモデル
動物を提供すること。 【解決手段】 ＤＯＣＫ２遺伝子を染色体上で欠損さ
せ、リンパ球遊走制御機能が欠失又は抑制されているモ
デル動物、例えばＤＯＣＫ２ノックアウトマウスを作製
する。このＤＯＣＫ２ノックアウトマウスでは、Ｒａｃ
を活性化してアクチン細胞骨格の再構築を促す機能や、
ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリ
ンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の
２次リンパ組織へのホーミング機能や、ＥＬＣケモカイ
ン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中への移出機能
が障害されており、その結果免疫応答が抑制される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、造血細胞特異的Ｃ
ＤＭファミリータンパク質であるＤＯＣＫ２遺伝子を染
色体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能
が欠失又は抑制されているリンパ球遊走制御機能欠失モ
デル非ヒト動物や、かかるモデル非ヒト動物を利用する
リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリ
ーニング方法や、Ｒａｃを活性化して細胞骨格の再構築
を促進するリンパ球遊走制御タンパク質や、かかるリン
パ球遊走制御タンパク質をコードするＤＮＡ等に関す
る。
ＤＭファミリータンパク質であるＤＯＣＫ２遺伝子を染
色体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能
が欠失又は抑制されているリンパ球遊走制御機能欠失モ
デル非ヒト動物や、かかるモデル非ヒト動物を利用する
リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリ
ーニング方法や、Ｒａｃを活性化して細胞骨格の再構築
を促進するリンパ球遊走制御タンパク質や、かかるリン
パ球遊走制御タンパク質をコードするＤＮＡ等に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】免疫応答は、生体にとって感染に対する
必須の防御機構であり、免疫細胞は、種々の感染源に迅
速に対処すべく生体内を常にパトロールしている。この
ように構成細胞が絶えず動き回るという特徴は、他の生
命複雑系においては認められず、免疫系独自に進化した
ものである。免疫細胞のうち、好中球、マクロファージ
といった細胞は感染の初期防御において機能する一方、
Ｔリンパ球及びＢリンパ球はその抗原受容体を介して外
来異物を認識することで抗原特異的な免疫応答を引き起
こすことが知られている。上記Ｔ及びＢリンパ球は、胸
腺、骨髄といった１次リンパ組織で分化し、脾臓、リン
パ節、パイエル板（小腸のリンパ組織）といった２次リ
ンパ組織の特定のコンパートメントへ移動した後、ここ
で、種々の組織から集められた抗原を、かかる抗原受容
体を介して認識することにより特異的な免疫応答を惹起
する。この際、リンパ球が２次リンパ組織の特定の部位
に移動することは、免疫応答の成立において極めて重要
である。これまで、リンパ球の移動が、種々のケモカイ
ンと総称されるタンパク質によって導かれることは知ら
れているが、リンパ球の運動性そのものを制御する分子
機構に関しては不明であった。
必須の防御機構であり、免疫細胞は、種々の感染源に迅
速に対処すべく生体内を常にパトロールしている。この
ように構成細胞が絶えず動き回るという特徴は、他の生
命複雑系においては認められず、免疫系独自に進化した
ものである。免疫細胞のうち、好中球、マクロファージ
といった細胞は感染の初期防御において機能する一方、
Ｔリンパ球及びＢリンパ球はその抗原受容体を介して外
来異物を認識することで抗原特異的な免疫応答を引き起
こすことが知られている。上記Ｔ及びＢリンパ球は、胸
腺、骨髄といった１次リンパ組織で分化し、脾臓、リン
パ節、パイエル板（小腸のリンパ組織）といった２次リ
ンパ組織の特定のコンパートメントへ移動した後、ここ
で、種々の組織から集められた抗原を、かかる抗原受容
体を介して認識することにより特異的な免疫応答を惹起
する。この際、リンパ球が２次リンパ組織の特定の部位
に移動することは、免疫応答の成立において極めて重要
である。これまで、リンパ球の移動が、種々のケモカイ
ンと総称されるタンパク質によって導かれることは知ら
れているが、リンパ球の運動性そのものを制御する分子
機構に関しては不明であった。
【０００３】細胞運動には、細胞極性の変化と細胞骨格
の再構築が必須であり（Cell 84, 359-369, 1996）、こ
れらはいずれもＲｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２といった低
分子量Ｇ蛋白質によって制御されていることが知られて
いる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5027-5031, 19
95、Science 279, 509-514, 1998、J. Cell Biol. 141,
1147-1157, 1998、Science 287, 1037-1040, 2000）。
この中でもとりわけＲａｃは、葉状突起と呼ばれるアク
チンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動
力を提供している（Science 279, 509-514, 1998、Cell
103, 227-238,2000）。他方、線虫（Caenorhabditis e
legans）、ヒト及びショウジョウバエ（Drosophila mel
anogaster）において、ＣＥＤ５、ＤＯＣＫ１８０、Myo
blastcity（ＭＢＣ）という構造上相同性を示す分子が
同定され、これらの分子はその頭文字をとってＣＤＭフ
ァミリー分子と呼ばれており、いずれもＲａｃの上流で
機能することで細胞骨格の再構築に関与すると考えられ
ている（Mol. Cell Biol. 16, 1770-1776, 1996、J. Ce
ll Biol. 138, 589-603, 1997、Nature 392, 501-504,
1998、Genes Dev. 12, 3331-3336, 1998、Genes Dev. 1
2, 3337-3342, 1998、Nature Cell Biol. 2, 131-136,
2000）。上記ＣＥＤ−５及びMyoblast Cityが特定タイ
プの細胞の運動に重要であることが突然変異体を用いた
遺伝学的解析から明らかになっているが（J. Cell Bio
l. 138, 589-603, 1997、Nature 392, 501-504, 1998、
Nature Cell Biol. 2, 131-136, 2000）、ＣＤＭファミ
リータンパク質が、哺乳類において生理的にどのように
機能するかは未だ不明であった。
の再構築が必須であり（Cell 84, 359-369, 1996）、こ
れらはいずれもＲｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２といった低
分子量Ｇ蛋白質によって制御されていることが知られて
いる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5027-5031, 19
95、Science 279, 509-514, 1998、J. Cell Biol. 141,
1147-1157, 1998、Science 287, 1037-1040, 2000）。
この中でもとりわけＲａｃは、葉状突起と呼ばれるアク
チンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動
力を提供している（Science 279, 509-514, 1998、Cell
103, 227-238,2000）。他方、線虫（Caenorhabditis e
legans）、ヒト及びショウジョウバエ（Drosophila mel
anogaster）において、ＣＥＤ５、ＤＯＣＫ１８０、Myo
blastcity（ＭＢＣ）という構造上相同性を示す分子が
同定され、これらの分子はその頭文字をとってＣＤＭフ
ァミリー分子と呼ばれており、いずれもＲａｃの上流で
機能することで細胞骨格の再構築に関与すると考えられ
ている（Mol. Cell Biol. 16, 1770-1776, 1996、J. Ce
ll Biol. 138, 589-603, 1997、Nature 392, 501-504,
1998、Genes Dev. 12, 3331-3336, 1998、Genes Dev. 1
2, 3337-3342, 1998、Nature Cell Biol. 2, 131-136,
2000）。上記ＣＥＤ−５及びMyoblast Cityが特定タイ
プの細胞の運動に重要であることが突然変異体を用いた
遺伝学的解析から明らかになっているが（J. Cell Bio
l. 138, 589-603, 1997、Nature 392, 501-504, 1998、
Nature Cell Biol. 2, 131-136, 2000）、ＣＤＭファミ
リータンパク質が、哺乳類において生理的にどのように
機能するかは未だ不明であった。
【０００４】ＤＯＣＫ２（ＫＩＡＡ０２０９；DNA Res.
3, 321-329）は、ヒト造血細胞で特異的に発現するＣ
ＤＭファミリータンパク質の他のメンバーをコードし、
上記ＤＯＣＫ２が２９３Ｔ腎細胞においてＲａｃに結合
し、Ｒａｃを活性化することが知られている（Biochem.
Biophys. Acta 1452, 179-187, 1999）。一方、本発明
者らは、マウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーよりＣＤＭフ
ァミリーに属する新規遺伝子Ｈｃｈを単離し、かかる遺
伝子産物が１８２８のアミノ酸から成り、そのＮ末端に
はＳＨ３ドメインがコードされていることを見い出した
（Nature, Vol412, 23 August, 826-831, 2001）。ま
た、マウス組織を用いたノザンブロット解析において、
ＤＯＣＫ１８０がさまざまな臓器に発現しているのに対
して、Ｈｃｈの発現は胸腺及び脾臓に限局していること
や、細胞株を用いた解析より２種類の変異Ｔ細胞株を除
いて、Ｈｃｈの発現がＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ
のいずれにおいても認められることを確認した。またＨ
ｃｈの発現を欠く変異Ｔ細胞株にＨｃｈを導入すること
で細胞形態の著明な変化と接着性の亢進が観察されるこ
とを明らかにしている。Ｈｃｈのコードする１８２８ア
ミノ酸のうち１６７７アミノ酸はヒトＤＯＣＫ２と同一
であり、ＨｃｈはマウスＤＯＣＫ２ホモログと考えられ
たが、上記ＤＯＣＫ２の生理的機能は不明であった。
3, 321-329）は、ヒト造血細胞で特異的に発現するＣ
ＤＭファミリータンパク質の他のメンバーをコードし、
上記ＤＯＣＫ２が２９３Ｔ腎細胞においてＲａｃに結合
し、Ｒａｃを活性化することが知られている（Biochem.
Biophys. Acta 1452, 179-187, 1999）。一方、本発明
者らは、マウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーよりＣＤＭフ
ァミリーに属する新規遺伝子Ｈｃｈを単離し、かかる遺
伝子産物が１８２８のアミノ酸から成り、そのＮ末端に
はＳＨ３ドメインがコードされていることを見い出した
（Nature, Vol412, 23 August, 826-831, 2001）。ま
た、マウス組織を用いたノザンブロット解析において、
ＤＯＣＫ１８０がさまざまな臓器に発現しているのに対
して、Ｈｃｈの発現は胸腺及び脾臓に限局していること
や、細胞株を用いた解析より２種類の変異Ｔ細胞株を除
いて、Ｈｃｈの発現がＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ
のいずれにおいても認められることを確認した。またＨ
ｃｈの発現を欠く変異Ｔ細胞株にＨｃｈを導入すること
で細胞形態の著明な変化と接着性の亢進が観察されるこ
とを明らかにしている。Ｈｃｈのコードする１８２８ア
ミノ酸のうち１６７７アミノ酸はヒトＤＯＣＫ２と同一
であり、ＨｃｈはマウスＤＯＣＫ２ホモログと考えられ
たが、上記ＤＯＣＫ２の生理的機能は不明であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】免疫応答は、生体にと
って必須の防御機構であるが、免疫応答したための疾患
あるいは病態、例えば自己免疫疾患、移植に伴う拒絶や
ＧｖＨ病などは現代医学がその解決を迫られている問題
としてクローズアップされている。これら疾患や病態を
分子レベルで解明する上で、あるいはこれら疾患や病態
に対する新しい治療法を開発する上で、リンパ球特異的
にその運動性を制御する分子の同定が希求されていた。
本発明の課題は、リンパ球特異的にその運動性を制御す
る分子を同定し、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、
移植片拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明
する上で、あるいはこれら疾患や病態に対する新しい治
療法を開発する上で有用なモデル動物を提供することに
ある。
って必須の防御機構であるが、免疫応答したための疾患
あるいは病態、例えば自己免疫疾患、移植に伴う拒絶や
ＧｖＨ病などは現代医学がその解決を迫られている問題
としてクローズアップされている。これら疾患や病態を
分子レベルで解明する上で、あるいはこれら疾患や病態
に対する新しい治療法を開発する上で、リンパ球特異的
にその運動性を制御する分子の同定が希求されていた。
本発明の課題は、リンパ球特異的にその運動性を制御す
る分子を同定し、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、
移植片拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明
する上で、あるいはこれら疾患や病態に対する新しい治
療法を開発する上で有用なモデル動物を提供することに
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らはマウス胸腺
ｃＤＮＡライブラリーより、免疫系特異的に発現するＣ
ＤＭファミリー遺伝子ＤＯＣＫ２（Ｈｃｈ）を単離し、
その生体内での機能を明らかにする目的で、ノックアウ
トマウスを作製した。ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスは
メンデルの法則に従って出生し、外見上の異常は認めら
れなかった。しかしながら、野生型マウスと比較して脾
臓、リンパ節といった２次リンパ組織におけるＴ及びＢ
リンパ球の数が著減していた。リンパ球を蛍光組織でラ
ベルして、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスに静注し、リ
ンパ節へのホーミングを検討したところ、かかるノック
アウトマウスのＴ及びＢリンパ球のホーミング活性は野
生型マウスのそれと比較して約１／１０に減少してい
た。一方、野生型マウスのリンパ球はノックアウトマウ
スのリンパ節へ効率よくホーミングしていた。このこと
から、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスでは、リンパ球自
身の異常により、２次リンパ組織へのホーミングが障害
されていると考えられた。
ｃＤＮＡライブラリーより、免疫系特異的に発現するＣ
ＤＭファミリー遺伝子ＤＯＣＫ２（Ｈｃｈ）を単離し、
その生体内での機能を明らかにする目的で、ノックアウ
トマウスを作製した。ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスは
メンデルの法則に従って出生し、外見上の異常は認めら
れなかった。しかしながら、野生型マウスと比較して脾
臓、リンパ節といった２次リンパ組織におけるＴ及びＢ
リンパ球の数が著減していた。リンパ球を蛍光組織でラ
ベルして、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスに静注し、リ
ンパ節へのホーミングを検討したところ、かかるノック
アウトマウスのＴ及びＢリンパ球のホーミング活性は野
生型マウスのそれと比較して約１／１０に減少してい
た。一方、野生型マウスのリンパ球はノックアウトマウ
スのリンパ節へ効率よくホーミングしていた。このこと
から、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスでは、リンパ球自
身の異常により、２次リンパ組織へのホーミングが障害
されていると考えられた。
【０００７】そこで、リンパ球運動におけるＤＯＣＫ２
分子の関与を直接検討する目的で、種々のケモカインに
対する遊走活性をノックアウトマウスと野生型マウスで
比較した。ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１といったケモカイン
に対するマクロファージの遊走活性はノックアウトマウ
スと野生型マウス間で差を認めなかった。しかしなが
ら、野生型マウスのＴ及びＢリンパ球が、ＳＬＣ、ＳＤ
Ｆ−１、ＢＬＣといったケモカイン刺激より活発に遊走
するのに対して、ノックアウトマウスのそれは顕著に障
害されていた。野生型マウスのリンパ球をケモカインで
刺激すると１５秒をピークとしてＲａｃの活性化及びア
クチン重合が観察されたが、ノックアウトマウスのリン
パ球においてはこれらの反応が消失していた。一方、Ｐ
ＫＢ、ＥＲＫの活性化やカルシウムの流入は両者の間で
差を認めなかった。すなわち、ＤＯＣＫ２は、Ｒａｃを
活性化し、細胞骨格の再構築を促すことでリンパ球特異
的にその運動性を制御していることが明らかとなった。
分子の関与を直接検討する目的で、種々のケモカインに
対する遊走活性をノックアウトマウスと野生型マウスで
比較した。ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１といったケモカイン
に対するマクロファージの遊走活性はノックアウトマウ
スと野生型マウス間で差を認めなかった。しかしなが
ら、野生型マウスのＴ及びＢリンパ球が、ＳＬＣ、ＳＤ
Ｆ−１、ＢＬＣといったケモカイン刺激より活発に遊走
するのに対して、ノックアウトマウスのそれは顕著に障
害されていた。野生型マウスのリンパ球をケモカインで
刺激すると１５秒をピークとしてＲａｃの活性化及びア
クチン重合が観察されたが、ノックアウトマウスのリン
パ球においてはこれらの反応が消失していた。一方、Ｐ
ＫＢ、ＥＲＫの活性化やカルシウムの流入は両者の間で
差を認めなかった。すなわち、ＤＯＣＫ２は、Ｒａｃを
活性化し、細胞骨格の再構築を促すことでリンパ球特異
的にその運動性を制御していることが明らかとなった。
【０００８】ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスの１次リン
パ組織におけるＴ及びＢリンパ球の分化に関して、大き
な異常は認められなかった。しかしながら、ノックアウ
トマウスの末梢血中のＴリンパ球は野生型マウスと比較
して著減していた。ところで、ケモカインＥＬＣが成熟
胸腺Ｔ細胞の胸腺からの移出に関与することが知られて
いることから、胸腺器官培養を用いてＥＬＣに対する成
熟胸腺Ｔ細胞の移出を検討したところ、その効率がノッ
クアウトマウスでは野生型マウスに比べ約１／２０に減
少していた。このことから、成熟胸腺Ｔ細胞の移出障害
が、ノックアウトマウス末梢血におけるＴリンパ球減少
の原因であることが示唆された。
パ組織におけるＴ及びＢリンパ球の分化に関して、大き
な異常は認められなかった。しかしながら、ノックアウ
トマウスの末梢血中のＴリンパ球は野生型マウスと比較
して著減していた。ところで、ケモカインＥＬＣが成熟
胸腺Ｔ細胞の胸腺からの移出に関与することが知られて
いることから、胸腺器官培養を用いてＥＬＣに対する成
熟胸腺Ｔ細胞の移出を検討したところ、その効率がノッ
クアウトマウスでは野生型マウスに比べ約１／２０に減
少していた。このことから、成熟胸腺Ｔ細胞の移出障害
が、ノックアウトマウス末梢血におけるＴリンパ球減少
の原因であることが示唆された。
【０００９】ＳＬＣ、ＥＬＣ、ＢＬＣといったケモカイ
ンは、「免疫ケモカイン」と称され、２次リンパ組織の
構築に重要な役割を演じることが知られている。ＤＯＣ
Ｋ２ノックアウトマウスの脾臓の免疫組織学的解析にお
いて、リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけるリンパ
球の迷入及び辺緑帯Ｂ細胞の消失が観察された。リンパ
濾胞の萎縮はリンパ節、パイエル板といった他の２次リ
ンパ系組織においても同様に認められた。さらに、ノッ
クアウトマウスの胸腺において成熟胸腺Ｔ細胞の分布に
顕著な異常を認めた。すなわち、ＤＯＣＫ２ノックアウ
トマウスのリンパ球は種々のケモカイン刺激に遊走活性
を示さず、その結果免疫系の構築異常が生じることが示
された。
ンは、「免疫ケモカイン」と称され、２次リンパ組織の
構築に重要な役割を演じることが知られている。ＤＯＣ
Ｋ２ノックアウトマウスの脾臓の免疫組織学的解析にお
いて、リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけるリンパ
球の迷入及び辺緑帯Ｂ細胞の消失が観察された。リンパ
濾胞の萎縮はリンパ節、パイエル板といった他の２次リ
ンパ系組織においても同様に認められた。さらに、ノッ
クアウトマウスの胸腺において成熟胸腺Ｔ細胞の分布に
顕著な異常を認めた。すなわち、ＤＯＣＫ２ノックアウ
トマウスのリンパ球は種々のケモカイン刺激に遊走活性
を示さず、その結果免疫系の構築異常が生じることが示
された。
【００１０】ＤＯＣＫ２欠損が免疫応答に及ぼす影響を
検討するため、ＭＨＣクラスII Ｉ−Ａbに結合すること
が知られているＥ由来のペプチドを免疫し、抗原特異的
T細胞応答を解析したところ、野生型マウスでは抗原濃
度依存的にＴ細胞増殖反応が観察されるのに対して、Ｄ
ＯＣＫ２ノックアウトマウスではこのようなＴ細胞応答
は認められなかった。また、ＤＮＰ−ＫＬＨを免疫して
ＫＬＨ特異的抗体産生を解析したが、免疫後７日では、
ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスにおける抗体産生は顕著
に障害されていた。すなわち、ＤＯＣＫ２ノックアウト
マウスでは１次免疫応答が抑制されていることが明らか
となった。
検討するため、ＭＨＣクラスII Ｉ−Ａbに結合すること
が知られているＥ由来のペプチドを免疫し、抗原特異的
T細胞応答を解析したところ、野生型マウスでは抗原濃
度依存的にＴ細胞増殖反応が観察されるのに対して、Ｄ
ＯＣＫ２ノックアウトマウスではこのようなＴ細胞応答
は認められなかった。また、ＤＮＰ−ＫＬＨを免疫して
ＫＬＨ特異的抗体産生を解析したが、免疫後７日では、
ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスにおける抗体産生は顕著
に障害されていた。すなわち、ＤＯＣＫ２ノックアウト
マウスでは１次免疫応答が抑制されていることが明らか
となった。
【００１１】以上のことより、ＤＯＣＫ２はＲａｃを活
性化し、細胞骨格の再構築を促すことでリンパ球の運動
性を制御する重要な分子であり、その欠損が免疫系の構
築並びに免疫応答に多大な影響を与えることが初めて明
らかにされた。かかる知見より、ＤＯＣＫ２を標的とし
てリンパ球の運動性を人為的に制御することでアレルギ
ー、自己免疫疾患、移植片拒絶といった免疫関連疾患に
対する新しい治療法の開発につながることが期待され、
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったもの
である。
性化し、細胞骨格の再構築を促すことでリンパ球の運動
性を制御する重要な分子であり、その欠損が免疫系の構
築並びに免疫応答に多大な影響を与えることが初めて明
らかにされた。かかる知見より、ＤＯＣＫ２を標的とし
てリンパ球の運動性を人為的に制御することでアレルギ
ー、自己免疫疾患、移植片拒絶といった免疫関連疾患に
対する新しい治療法の開発につながることが期待され、
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったもの
である。
【００１２】すなわち本発明は、ＤＯＣＫ２遺伝子を染
色体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能
が欠失又は抑制されていることを特徴とするリンパ球遊
走制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項１）や、リン
パ球遊走制御機能が、Ｒａｃを活性化し、細胞骨格の再
構築を促す機能であることを特徴とする請求項１記載の
リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項
２）や、リンパ球遊走制御機能が、ＳＬＣ、ＳＤＦ−
１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激によるリンパ球の遊走機
能であることを特徴とする請求項１記載のリンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項３）や、リンパ
球遊走制御機能が、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２
次リンパ組織へのホーミング機能であることを特徴とす
る請求項１記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒ
ト動物（請求項４）や、リンパ球遊走制御機能が、ＥＬ
Ｃケモカイン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中へ
の移出機能、又はＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣ
Ｄ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の胸腺内遊走機能であること
を特徴とする請求項１記載のリンパ球遊走制御機能欠失
モデル非ヒト動物（請求項５）や、リンパ球において、
ケモカイン刺激によるアクチンの重合が殆ど全て消失し
ていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の
リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項
６）や、リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけるリン
パ球の迷入及び辺緑帯Ｂ細胞の消失が観察されることを
特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のリンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項７）や、非ヒト
動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜７のい
ずれか記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動
物（請求項８）に関する。
色体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能
が欠失又は抑制されていることを特徴とするリンパ球遊
走制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項１）や、リン
パ球遊走制御機能が、Ｒａｃを活性化し、細胞骨格の再
構築を促す機能であることを特徴とする請求項１記載の
リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項
２）や、リンパ球遊走制御機能が、ＳＬＣ、ＳＤＦ−
１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激によるリンパ球の遊走機
能であることを特徴とする請求項１記載のリンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項３）や、リンパ
球遊走制御機能が、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２
次リンパ組織へのホーミング機能であることを特徴とす
る請求項１記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒ
ト動物（請求項４）や、リンパ球遊走制御機能が、ＥＬ
Ｃケモカイン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中へ
の移出機能、又はＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣ
Ｄ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の胸腺内遊走機能であること
を特徴とする請求項１記載のリンパ球遊走制御機能欠失
モデル非ヒト動物（請求項５）や、リンパ球において、
ケモカイン刺激によるアクチンの重合が殆ど全て消失し
ていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の
リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項
６）や、リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけるリン
パ球の迷入及び辺緑帯Ｂ細胞の消失が観察されることを
特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のリンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物（請求項７）や、非ヒト
動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜７のい
ずれか記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動
物（請求項８）に関する。
【００１３】また本発明は、請求項１〜８のいずれか記
載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検
物質を投与し、又は該モデル非動物及び野生型動物由来
の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させ、リ
ンパ球遊走制御機能の変化を測定・評価することを特徴
とするリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質の
スクリーニング方法（請求項９）や、リンパ球遊走制御
機能の変化が、ＧＴＰ結合型活性化Ｒａｃの変化である
ことを特徴とする請求項９記載のリンパ球遊走制御機能
の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項
１０）や、リンパ球遊走制御機能の変化が、ＳＬＣ、Ｓ
ＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊
走活性の変化であることを特徴とする請求項９記載のリ
ンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリー
ニング方法（請求項１１）や、リンパ球遊走制御機能の
変化が、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２次リンパ組
織へのホーミング活性の変化であることを特徴とする請
求項９記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、リンパ球
遊走制御機能の変化が、ＥＬＣケモカイン刺激に対する
末梢血中の成熟Ｔ細胞の数の変化、又はＳＤＦ−１ケモ
カイン刺激に対するＣＤ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の胸腺
内遊走活性の変化であることを特徴とする請求項９記載
のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスク
リーニング方法（請求項１３）や、リンパ球遊走制御機
能の変化が、ケモカイン刺激に対するリンパ球における
アクチンの重合の程度の変化であることを特徴とする請
求項９記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、リンパ球
遊走制御機能の変化が、リンパ濾胞の萎縮、赤脾髄にお
けるリンパ球の迷入及び辺緑帯Ｂ細胞の消失の程度の変
化であることを特徴とする請求項９記載のリンパ球遊走
制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法
（請求項１５）や、ＤＯＣＫ２に結合する分子を被検物
質とすることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記
載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のス
クリーニング方法（請求項１６）や、ＤＯＣＫ２遺伝子
を染色体上で欠損させた非ヒト動物におけるリンパ球遊
走制御機能の変化の程度と野生型非ヒト動物におけるリ
ンパ球遊走制御機能の変化の程度とを比較・評価するこ
とを特徴とする請求項９〜１６のいずれか記載のリンパ
球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニン
グ方法（請求項１７）や、非ヒト動物がマウスであるこ
とを特徴とする請求項９〜１７のいずれか記載のリンパ
球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニン
グ方法（請求項１８）や、請求項９〜１８のいずれか記
載のスクリーニング方法により得られることを特徴とす
るリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質（請求
項１９）や、抑制物質が、抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯＣＫ
２結合分子又はＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖であ
ることを特徴とする請求項１９記載のリンパ球遊走制御
機能の抑制物質（請求項２０）や、請求項９〜１８のい
ずれか記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とする
アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免
疫関連疾患に対する治療薬のスクリーニング方法（請求
項２１）や、請求項２１記載のスクリーニング方法によ
り得られることを特徴とするアレルギー、自己免疫疾
患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療
薬（請求項２２）や、抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯＣＫ２結
合分子又はＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖であるこ
とを特徴とする請求項２２記載の免疫関連疾患に対する
治療薬（請求項２３）に関する。
載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検
物質を投与し、又は該モデル非動物及び野生型動物由来
の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させ、リ
ンパ球遊走制御機能の変化を測定・評価することを特徴
とするリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質の
スクリーニング方法（請求項９）や、リンパ球遊走制御
機能の変化が、ＧＴＰ結合型活性化Ｒａｃの変化である
ことを特徴とする請求項９記載のリンパ球遊走制御機能
の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項
１０）や、リンパ球遊走制御機能の変化が、ＳＬＣ、Ｓ
ＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊
走活性の変化であることを特徴とする請求項９記載のリ
ンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリー
ニング方法（請求項１１）や、リンパ球遊走制御機能の
変化が、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２次リンパ組
織へのホーミング活性の変化であることを特徴とする請
求項９記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、リンパ球
遊走制御機能の変化が、ＥＬＣケモカイン刺激に対する
末梢血中の成熟Ｔ細胞の数の変化、又はＳＤＦ−１ケモ
カイン刺激に対するＣＤ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の胸腺
内遊走活性の変化であることを特徴とする請求項９記載
のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスク
リーニング方法（請求項１３）や、リンパ球遊走制御機
能の変化が、ケモカイン刺激に対するリンパ球における
アクチンの重合の程度の変化であることを特徴とする請
求項９記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、リンパ球
遊走制御機能の変化が、リンパ濾胞の萎縮、赤脾髄にお
けるリンパ球の迷入及び辺緑帯Ｂ細胞の消失の程度の変
化であることを特徴とする請求項９記載のリンパ球遊走
制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法
（請求項１５）や、ＤＯＣＫ２に結合する分子を被検物
質とすることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記
載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のス
クリーニング方法（請求項１６）や、ＤＯＣＫ２遺伝子
を染色体上で欠損させた非ヒト動物におけるリンパ球遊
走制御機能の変化の程度と野生型非ヒト動物におけるリ
ンパ球遊走制御機能の変化の程度とを比較・評価するこ
とを特徴とする請求項９〜１６のいずれか記載のリンパ
球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニン
グ方法（請求項１７）や、非ヒト動物がマウスであるこ
とを特徴とする請求項９〜１７のいずれか記載のリンパ
球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニン
グ方法（請求項１８）や、請求項９〜１８のいずれか記
載のスクリーニング方法により得られることを特徴とす
るリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質（請求
項１９）や、抑制物質が、抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯＣＫ
２結合分子又はＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖であ
ることを特徴とする請求項１９記載のリンパ球遊走制御
機能の抑制物質（請求項２０）や、請求項９〜１８のい
ずれか記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とする
アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免
疫関連疾患に対する治療薬のスクリーニング方法（請求
項２１）や、請求項２１記載のスクリーニング方法によ
り得られることを特徴とするアレルギー、自己免疫疾
患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療
薬（請求項２２）や、抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯＣＫ２結
合分子又はＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖であるこ
とを特徴とする請求項２２記載の免疫関連疾患に対する
治療薬（請求項２３）に関する。
【００１４】さらに本発明は、Ｒａｃを活性化して細胞
骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質
（請求項２４）や、ＤＯＣＫ２及び変異ＤＯＣＫ２であ
ることを特徴とする請求項２４記載のリンパ球遊走制御
用タンパク質（請求項２５）や、ＤＯＣＫ２が、Ｈｃｈ
遺伝子（GenBank：アクセッションナンバーAYO27438）
の発現産物であることを特徴とする請求項２５記載のリ
ンパ球遊走制御用タンパク質（請求項２６）や、請求項
２４〜２６のいずれか記載のタンパク質をリンパ球遊走
制御用として使用する方法（請求項２７）や、Ｒａｃを
活性化して細胞骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制
御用タンパク質をコードするＤＮＡ（請求項２８）や、
ＤＯＣＫ２遺伝子及び変異ＤＯＣＫ２遺伝子であること
を特徴とする請求項２８記載のリンパ球遊走制御用タン
パク質をコードするＤＮＡ（請求項２９）や、ＤＯＣＫ
２遺伝子が、Ｈｃｈ遺伝子（GenBank：アクセッション
ナンバーAYO27438）であることを特徴とする請求項２９
記載のリンパ球遊走制御用タンパク質をコードするＤＮ
Ａ（請求項３０）や、請求項２８〜３０のいずれか記載
のＤＮＡをリンパ球遊走制御用タンパク質を発現させる
ために使用する方法（請求項３１）に関する。
骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質
（請求項２４）や、ＤＯＣＫ２及び変異ＤＯＣＫ２であ
ることを特徴とする請求項２４記載のリンパ球遊走制御
用タンパク質（請求項２５）や、ＤＯＣＫ２が、Ｈｃｈ
遺伝子（GenBank：アクセッションナンバーAYO27438）
の発現産物であることを特徴とする請求項２５記載のリ
ンパ球遊走制御用タンパク質（請求項２６）や、請求項
２４〜２６のいずれか記載のタンパク質をリンパ球遊走
制御用として使用する方法（請求項２７）や、Ｒａｃを
活性化して細胞骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制
御用タンパク質をコードするＤＮＡ（請求項２８）や、
ＤＯＣＫ２遺伝子及び変異ＤＯＣＫ２遺伝子であること
を特徴とする請求項２８記載のリンパ球遊走制御用タン
パク質をコードするＤＮＡ（請求項２９）や、ＤＯＣＫ
２遺伝子が、Ｈｃｈ遺伝子（GenBank：アクセッション
ナンバーAYO27438）であることを特徴とする請求項２９
記載のリンパ球遊走制御用タンパク質をコードするＤＮ
Ａ（請求項３０）や、請求項２８〜３０のいずれか記載
のＤＮＡをリンパ球遊走制御用タンパク質を発現させる
ために使用する方法（請求項３１）に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明のリンパ球遊走制御機能欠
失モデル非ヒト動物としては、ＤＯＣＫ２遺伝子を染色
体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能が
欠失又は抑制されているモデル動物であれば特に制限さ
れるものではなく、例えば、ＤＯＣＫ２をコードする非
ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・
置換等の遺伝子変異により、その機能を不活性化させる
ことにより、ＤＯＣＫ２遺伝子機能を染色体上で欠損さ
せることができる。本発明における非ヒト動物として
は、マウス、ラット等の齧歯目動物の他、ウサギ、イ
ヌ、ブタ、ヒツジ、サル等を具体的に挙げることができ
るが、これらに限定されるものではなく、中でも、取扱
い易さ等からマウスが好ましい。また、上記ＤＯＣＫ２
遺伝子としては、Ｈｃｈ（マウスＤＯＣＫ２）遺伝子
（GenBankアクセッションナンバーAYO27438；Nature, V
ol412, 23 August, 826-831, 2001）、ヒトＤＯＣＫ２
遺伝子（ＫＩＡＡ０２０９；DNA Res. 3, 321-329）を
具体的に挙げることができるが、ＤＯＣＫ２遺伝子の由
来はマウス及びヒト等に限られるものではない。
失モデル非ヒト動物としては、ＤＯＣＫ２遺伝子を染色
体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能が
欠失又は抑制されているモデル動物であれば特に制限さ
れるものではなく、例えば、ＤＯＣＫ２をコードする非
ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・
置換等の遺伝子変異により、その機能を不活性化させる
ことにより、ＤＯＣＫ２遺伝子機能を染色体上で欠損さ
せることができる。本発明における非ヒト動物として
は、マウス、ラット等の齧歯目動物の他、ウサギ、イ
ヌ、ブタ、ヒツジ、サル等を具体的に挙げることができ
るが、これらに限定されるものではなく、中でも、取扱
い易さ等からマウスが好ましい。また、上記ＤＯＣＫ２
遺伝子としては、Ｈｃｈ（マウスＤＯＣＫ２）遺伝子
（GenBankアクセッションナンバーAYO27438；Nature, V
ol412, 23 August, 826-831, 2001）、ヒトＤＯＣＫ２
遺伝子（ＫＩＡＡ０２０９；DNA Res. 3, 321-329）を
具体的に挙げることができるが、ＤＯＣＫ２遺伝子の由
来はマウス及びヒト等に限られるものではない。
【００１６】本発明のリンパ球遊走制御機能欠失モデル
非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機能としては、Ｄ
ＯＣＫ２遺伝子の発現に依拠するリンパ球の運動性を制
御する機能であれば特に制限されるものではないが、Ｒ
ａｃを活性化してＲａｃ−ＧＴＰ結合体とし、細胞骨格
の再構築、特にリンパ球におけるアクチン重合を促進す
る機能や、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン
刺激よるリンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイ
エル板等の２次リンパ組織へのホーミング機能や、ＥＬ
Ｃケモカイン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中へ
の移出機能や、ＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣＤ
４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の遊走機能等を具体的に例示す
ることができる。かかるリンパ球遊走制御機能が欠失又
は抑制されている本発明のリンパ球遊走制御機能欠失モ
デル非ヒト動物は、ケモカイン刺激に対してリンパ球に
おけるアクチン重合が殆ど全て消失しており、また、リ
ンパ濾胞の著明な萎縮や、赤脾髄におけるリンパ球の迷
入や、辺緑帯Ｂ細胞の消失が観察されるモデル動物、好
ましくはＤＯＣＫ２ノックアウトマウスである。以下、
非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機能としては、Ｄ
ＯＣＫ２遺伝子の発現に依拠するリンパ球の運動性を制
御する機能であれば特に制限されるものではないが、Ｒ
ａｃを活性化してＲａｃ−ＧＴＰ結合体とし、細胞骨格
の再構築、特にリンパ球におけるアクチン重合を促進す
る機能や、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン
刺激よるリンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイ
エル板等の２次リンパ組織へのホーミング機能や、ＥＬ
Ｃケモカイン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中へ
の移出機能や、ＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣＤ
４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の遊走機能等を具体的に例示す
ることができる。かかるリンパ球遊走制御機能が欠失又
は抑制されている本発明のリンパ球遊走制御機能欠失モ
デル非ヒト動物は、ケモカイン刺激に対してリンパ球に
おけるアクチン重合が殆ど全て消失しており、また、リ
ンパ濾胞の著明な萎縮や、赤脾髄におけるリンパ球の迷
入や、辺緑帯Ｂ細胞の消失が観察されるモデル動物、好
ましくはＤＯＣＫ２ノックアウトマウスである。以下、
非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１７】ＤＯＣＫ２遺伝子が染色体上で欠損したマ
ウス、すなわちＤＯＣＫ２ノックアウトマウス（ＤＯＣ
Ｋ２-/-）の作製方法は特に制限されるものではない
が、例えば、文献（Cell 76, 519-529, 1994）に記載す
る方法等によって作製することができる。具体的には、
マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得
られた遺伝子断片を用いて、ＤＯＣＫ２遺伝子をスクリ
ーニングし、スクリーニングされたＤＯＣＫ２遺伝子を
組換えＤＮＡ技術により、ＤＯＣＫ２遺伝子の全部又は
一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺
伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラ
グメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスの
チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を
導入してターゲティングベクターを作製し、この作製さ
れたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロ
ポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入
し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中か
ら、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物
質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択された
ＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロッ
ト法等により確認することが好ましい。
ウス、すなわちＤＯＣＫ２ノックアウトマウス（ＤＯＣ
Ｋ２-/-）の作製方法は特に制限されるものではない
が、例えば、文献（Cell 76, 519-529, 1994）に記載す
る方法等によって作製することができる。具体的には、
マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得
られた遺伝子断片を用いて、ＤＯＣＫ２遺伝子をスクリ
ーニングし、スクリーニングされたＤＯＣＫ２遺伝子を
組換えＤＮＡ技術により、ＤＯＣＫ２遺伝子の全部又は
一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺
伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラ
グメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスの
チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を
導入してターゲティングベクターを作製し、この作製さ
れたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロ
ポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入
し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中か
ら、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物
質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択された
ＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロッ
ト法等により確認することが好ましい。
【００１８】上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中に
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウ
スを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを
交配させることによって、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウ
スを得ることができる。そして、かかるＤＯＣＫ２ノッ
クアウトマウスにおけるＤＯＣＫ２遺伝子が染色体上で
欠損していることを確認する方法としては、例えば、上
記の方法により得られたマウスの尾からＤＮＡを単離し
てサザンブロット法等により調べる方法や、このマウス
のリンパ球細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロ
ット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウ
スを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを
交配させることによって、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウ
スを得ることができる。そして、かかるＤＯＣＫ２ノッ
クアウトマウスにおけるＤＯＣＫ２遺伝子が染色体上で
欠損していることを確認する方法としては、例えば、上
記の方法により得られたマウスの尾からＤＮＡを単離し
てサザンブロット法等により調べる方法や、このマウス
のリンパ球細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロ
ット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
【００１９】本発明のリンパ球遊走制御機能欠失モデル
非ヒト動物は、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移
植片拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明す
るためのモデル動物として、あるいはこれら疾患や病態
に対する新しい治療法を開発するためのモデル動物とし
てきわめて有用であり、かかるリンパ球遊走制御機能欠
失モデル非ヒト動物を利用して野生型マウスと比較する
ことで、ＤＯＣＫ２を標的としたリンパ球遊走制御機能
の促進物質又は抑制物質のスクリーニングや、アレルギ
ー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾
患に対する治療薬のスクリーニングが可能となる。
非ヒト動物は、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移
植片拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明す
るためのモデル動物として、あるいはこれら疾患や病態
に対する新しい治療法を開発するためのモデル動物とし
てきわめて有用であり、かかるリンパ球遊走制御機能欠
失モデル非ヒト動物を利用して野生型マウスと比較する
ことで、ＤＯＣＫ２を標的としたリンパ球遊走制御機能
の促進物質又は抑制物質のスクリーニングや、アレルギ
ー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾
患に対する治療薬のスクリーニングが可能となる。
【００２０】本発明のリンパ球遊走制御機能の促進物質
又は抑制物質のスクリーニング方法としては、前記本発
明のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検
物質を投与する方法や、リンパ球遊走制御機能欠失モデ
ル非ヒト動物に由来する組織、器官又は細胞を被検物質
と接触させる方法を挙げることができる。リンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物、例えば前記ＤＯＣＫ２
ノックアウトマウス及び野生型動物に由来する組織、器
官又は細胞を被検物質と接触させる方法としては、これ
ら動物由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触さ
せ、リンパ球遊走制御機能の変化、例えば、ＧＴＰと結
合した活性化Ｒａｃの変化、核の偏在等の細胞極性の変
化、アクチン重合の変化、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ
等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊走活性の変化など
を測定・評価する方法を具体的に例示することができ
る。また、リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動
物、例えば前記ＤＯＣＫ２ノックアウトマウス及び野生
型動物に被検物質を投与する方法としては、該マウスの
組織、器官又は細胞におけるリンパ球遊走制御機能の変
化、例えば、リンパ球等の細胞におけるＧＴＰと結合し
た活性化Ｒａｃの変化、核の偏在等細胞極性の変化の変
化、アクチン重合の変化や、該マウスにおけるＳＬＣ、
ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリンパ球の
遊走活性の変化や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２
次リンパ組織へのホーミング活性の変化や、ＥＬＣケモ
カイン刺激に対する末梢血中の成熟Ｔ細胞の数の変化
や、ＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対する末梢血中のＣＤ
４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の遊走活性の変化や、リンパ濾
胞の萎縮、赤脾髄におけるリンパ球の迷入及び辺緑帯Ｂ
細胞の消失の程度の変化を測定・評価する方法などを具
体的に挙げることができるが、これらに制限されるもの
ではない。
又は抑制物質のスクリーニング方法としては、前記本発
明のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検
物質を投与する方法や、リンパ球遊走制御機能欠失モデ
ル非ヒト動物に由来する組織、器官又は細胞を被検物質
と接触させる方法を挙げることができる。リンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物、例えば前記ＤＯＣＫ２
ノックアウトマウス及び野生型動物に由来する組織、器
官又は細胞を被検物質と接触させる方法としては、これ
ら動物由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触さ
せ、リンパ球遊走制御機能の変化、例えば、ＧＴＰと結
合した活性化Ｒａｃの変化、核の偏在等の細胞極性の変
化、アクチン重合の変化、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ
等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊走活性の変化など
を測定・評価する方法を具体的に例示することができ
る。また、リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動
物、例えば前記ＤＯＣＫ２ノックアウトマウス及び野生
型動物に被検物質を投与する方法としては、該マウスの
組織、器官又は細胞におけるリンパ球遊走制御機能の変
化、例えば、リンパ球等の細胞におけるＧＴＰと結合し
た活性化Ｒａｃの変化、核の偏在等細胞極性の変化の変
化、アクチン重合の変化や、該マウスにおけるＳＬＣ、
ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリンパ球の
遊走活性の変化や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の２
次リンパ組織へのホーミング活性の変化や、ＥＬＣケモ
カイン刺激に対する末梢血中の成熟Ｔ細胞の数の変化
や、ＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対する末梢血中のＣＤ
４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の遊走活性の変化や、リンパ濾
胞の萎縮、赤脾髄におけるリンパ球の迷入及び辺緑帯Ｂ
細胞の消失の程度の変化を測定・評価する方法などを具
体的に挙げることができるが、これらに制限されるもの
ではない。
【００２１】上記スクリーニングに際して、インビトロ
等でＤＯＣＫ２に結合する分子、好ましくはＤＯＣＫ２
に特異的に結合する分子を被検物質とすることにより、
リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質、特に抑
制物質を効率よくスクリーニングすることができる。イ
ンビトロ等でＤＯＣＫ２に結合する分子を探索する方法
としては、酵母のtwo hybrid system、大腸菌発現系を
用いたfar western法、免疫沈降法、アフィニティクロ
マトグラフィーを利用する方法等の公知の相互作用する
タンパク質の探索法を好適に例示することができる。ま
た、上記スクリーニングに際して、ＤＯＣＫ２遺伝子を
染色体上で欠損させた非ヒト動物におけるリンパ球遊走
制御機能の変化の程度と、野生型非ヒト動物、好ましく
は同腹の野生型非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機
能の変化の程度とを比較・評価することが好ましい。
等でＤＯＣＫ２に結合する分子、好ましくはＤＯＣＫ２
に特異的に結合する分子を被検物質とすることにより、
リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質、特に抑
制物質を効率よくスクリーニングすることができる。イ
ンビトロ等でＤＯＣＫ２に結合する分子を探索する方法
としては、酵母のtwo hybrid system、大腸菌発現系を
用いたfar western法、免疫沈降法、アフィニティクロ
マトグラフィーを利用する方法等の公知の相互作用する
タンパク質の探索法を好適に例示することができる。ま
た、上記スクリーニングに際して、ＤＯＣＫ２遺伝子を
染色体上で欠損させた非ヒト動物におけるリンパ球遊走
制御機能の変化の程度と、野生型非ヒト動物、好ましく
は同腹の野生型非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機
能の変化の程度とを比較・評価することが好ましい。
【００２２】上記のリンパ球遊走制御機能の促進物質又
は抑制物質のスクリーニング方法を利用すると、ＤＯＣ
Ｋ２を標的としたアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、
移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬のスクリー
ニングが可能となる。例えば、リンパ球遊走制御機能の
促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法により得ら
れる抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯＣＫ２結合分子、ＤＯＣＫ
２遺伝子のアンチセンス鎖等のリンパ球遊走制御機能の
抑制物質は、リンパ球の運動性を人為的に抑制しうるこ
とが期待されることから、アレルギー、自己免疫疾患、
ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬と
なりうる可能性がきわめて大きく、かかる治療薬を医薬
品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担
体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、
崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤
用配合成分を添加することができ、通常用いられる投与
形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸
濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるい
は、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注
射の型で非経口投与することができる。
は抑制物質のスクリーニング方法を利用すると、ＤＯＣ
Ｋ２を標的としたアレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、
移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬のスクリー
ニングが可能となる。例えば、リンパ球遊走制御機能の
促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法により得ら
れる抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯＣＫ２結合分子、ＤＯＣＫ
２遺伝子のアンチセンス鎖等のリンパ球遊走制御機能の
抑制物質は、リンパ球の運動性を人為的に抑制しうるこ
とが期待されることから、アレルギー、自己免疫疾患、
ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬と
なりうる可能性がきわめて大きく、かかる治療薬を医薬
品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担
体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、
崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤
用配合成分を添加することができ、通常用いられる投与
形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸
濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるい
は、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注
射の型で非経口投与することができる。
【００２３】本発明は、Ｒａｃを活性化して細胞骨格の
再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質やかか
るリンパ球遊走制御用タンパク質をコードするＤＮＡを
対象としている。また本発明は、Ｒａｃを活性化して細
胞骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク
質をリンパ球遊走制御用として使用する方法や、リンパ
球遊走制御用タンパク質をコードするＤＮＡを、リンパ
球遊走制御用タンパク質を発現させるために使用する方
法を対象としている。上記タンパク質やＤＮＡとして
は、Ｈｃｈ等のＤＯＣＫ２や、Ｈｃｈ遺伝子（GenBan
k：アクセッションナンバーAYO27438）等のＤＯＣＫ２
遺伝子を具体的に挙げることができ、前述のように、Ｒ
ａｃを活性化して細胞骨格の再構築を促進するリンパ球
遊走制御タンパク質やかかるリンパ球遊走制御タンパク
質をコードするＤＮＡの機能は、本発明においてはじめ
て明らかにされたものである。
再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質やかか
るリンパ球遊走制御用タンパク質をコードするＤＮＡを
対象としている。また本発明は、Ｒａｃを活性化して細
胞骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク
質をリンパ球遊走制御用として使用する方法や、リンパ
球遊走制御用タンパク質をコードするＤＮＡを、リンパ
球遊走制御用タンパク質を発現させるために使用する方
法を対象としている。上記タンパク質やＤＮＡとして
は、Ｈｃｈ等のＤＯＣＫ２や、Ｈｃｈ遺伝子（GenBan
k：アクセッションナンバーAYO27438）等のＤＯＣＫ２
遺伝子を具体的に挙げることができ、前述のように、Ｒ
ａｃを活性化して細胞骨格の再構築を促進するリンパ球
遊走制御タンパク質やかかるリンパ球遊走制御タンパク
質をコードするＤＮＡの機能は、本発明においてはじめ
て明らかにされたものである。
【００２４】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例１（Ｔ細胞株においてＤＯＣＫ２が引き起こすア
クチン細胞骨格の再構築） ＤＯＣＫ２遺伝子（ＫＩＡＡ０２０９；DNA Res. 3, 32
1-329）は、ヒト造血細胞で特異的に発現するＣＤＭフ
ァミリータンパク質をコードし、上記ＤＯＣＫ２が２９
３Ｔ腎細胞におけるＲａｃに結合し、Ｒａｃを活性化す
ることが知られている（Biochem. Biophys. Acta 1452,
179-187, 1999）が、その生理機能は不明であった。
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例１（Ｔ細胞株においてＤＯＣＫ２が引き起こすア
クチン細胞骨格の再構築） ＤＯＣＫ２遺伝子（ＫＩＡＡ０２０９；DNA Res. 3, 32
1-329）は、ヒト造血細胞で特異的に発現するＣＤＭフ
ァミリータンパク質をコードし、上記ＤＯＣＫ２が２９
３Ｔ腎細胞におけるＲａｃに結合し、Ｒａｃを活性化す
ることが知られている（Biochem. Biophys. Acta 1452,
179-187, 1999）が、その生理機能は不明であった。
【００２５】そこで、本発明者らは、マウス胸腺で発現
する遺伝子をみつけるべく、アミノ末端のＳＨ（Src-ho
mology）−３ドメインを含む１８２８個のアミノ酸をコ
ードすると推定される相補ＤＮＡを単離してＨｃｈ遺伝
子（GenBank：アクセッションナンバーAYO27438）と命
名した。Ｈｃｈは、ＣＥＤ−５、ＭＢＣ、及びＤＯＣＫ
１８０と相同であり、さらにＨｃｈの１８２８アミノ酸
のうち、１６７７個がヒトＤＯＣＫ２と一致しているこ
とを見い出した。ＤＯＣＫ１８０遺伝子は、種々の組織
で発現するのに対し、Ｈｃｈ遺伝子の発現は、胸腺、脾
臓、及びリンパ節に限定され、Ｈｃｈ遺伝子が造血細胞
で特異的に発現することが示唆されていた。実験した全
てのＴ細胞株、Ｂ細胞株、及び単球細胞株でＨｃｈ遺伝
子の発現が観察されたが、二種類のＴ細胞株、ＢＷ５１
４７α-β-及びその誘導体ＢＥα１６−３（以下「１６
−３」という。）においては発現が認められなかった。
以上の結果からＨｃｈ遺伝子が、ヒトＤＯＣＫ２遺伝子
のマウスの相同体であると結論づけた。
する遺伝子をみつけるべく、アミノ末端のＳＨ（Src-ho
mology）−３ドメインを含む１８２８個のアミノ酸をコ
ードすると推定される相補ＤＮＡを単離してＨｃｈ遺伝
子（GenBank：アクセッションナンバーAYO27438）と命
名した。Ｈｃｈは、ＣＥＤ−５、ＭＢＣ、及びＤＯＣＫ
１８０と相同であり、さらにＨｃｈの１８２８アミノ酸
のうち、１６７７個がヒトＤＯＣＫ２と一致しているこ
とを見い出した。ＤＯＣＫ１８０遺伝子は、種々の組織
で発現するのに対し、Ｈｃｈ遺伝子の発現は、胸腺、脾
臓、及びリンパ節に限定され、Ｈｃｈ遺伝子が造血細胞
で特異的に発現することが示唆されていた。実験した全
てのＴ細胞株、Ｂ細胞株、及び単球細胞株でＨｃｈ遺伝
子の発現が観察されたが、二種類のＴ細胞株、ＢＷ５１
４７α-β-及びその誘導体ＢＥα１６−３（以下「１６
−３」という。）においては発現が認められなかった。
以上の結果からＨｃｈ遺伝子が、ヒトＤＯＣＫ２遺伝子
のマウスの相同体であると結論づけた。
【００２６】ＤＯＣＫ２遺伝子を欠失したＴ細胞株１６
−３にマウスＤＯＣＫ２遺伝子を導入して、ＤＯＣＫ２
遺伝子の発現がアクチン細胞骨格に影響するかどうかを
調べた。ウエスタンブロット分析の結果、導入遺伝子を
安定的に発現する細胞２種（１７−１１及び２５−７）
において、ＤＯＣＫ２が野生型細胞株であるＮ３−５と
比べ、やや強く（１７−１１）あるいは弱く（２５−
７）発現することが明らかになった（図１ａ；参考写真
１参照）。１７−１１及びＮ３−５では、ＰＡＫ１と相
互作用するＧＴＰ結合型活性化Ｒａｃ（Nature 367, 40
-46, 1994）が検出されたが、１６−３からは検出され
なかった（図１ｂ；参考写真１参照）。細胞株１７−１
１及び２５−７が、形態的にいくつかの点で１６−３と
異なり、Ｎ３−５と類似していることを見い出した。す
なわち、１６−３は円形細胞だが、１７−１１、２５−
７及びＮ３−５は、核が偏在し、比較的平坦で極性をも
つ細胞形態を示す（図１ｃ；参考写真１参照）。細胞を
ファロイジンで染色すると、Ｆアクチンの集合が１７−
１１、２５−７及びＮ３−５では観察されたが、１６−
３では観察されなかった（図１ｃ；参考写真１参照）。
共焦点レーザー顕微鏡の観察の結果、導入されたＤＯＣ
Ｋ２は葉状突起の根元で、上記Ｆアクチン集合体と共局
在するのでなく、かかる集合体に隣接して局在すること
が明らかとなった（図１ｄ；参考写真１参照）。これら
のことから、他のＣＤＭファミリータンパク質同様、Ｄ
ＯＣＫ２がＲａｃを活性化し、Ｔ細胞においてアクチン
細胞骨格の再構築を促すことが明らかになった。
−３にマウスＤＯＣＫ２遺伝子を導入して、ＤＯＣＫ２
遺伝子の発現がアクチン細胞骨格に影響するかどうかを
調べた。ウエスタンブロット分析の結果、導入遺伝子を
安定的に発現する細胞２種（１７−１１及び２５−７）
において、ＤＯＣＫ２が野生型細胞株であるＮ３−５と
比べ、やや強く（１７−１１）あるいは弱く（２５−
７）発現することが明らかになった（図１ａ；参考写真
１参照）。１７−１１及びＮ３−５では、ＰＡＫ１と相
互作用するＧＴＰ結合型活性化Ｒａｃ（Nature 367, 40
-46, 1994）が検出されたが、１６−３からは検出され
なかった（図１ｂ；参考写真１参照）。細胞株１７−１
１及び２５−７が、形態的にいくつかの点で１６−３と
異なり、Ｎ３−５と類似していることを見い出した。す
なわち、１６−３は円形細胞だが、１７−１１、２５−
７及びＮ３−５は、核が偏在し、比較的平坦で極性をも
つ細胞形態を示す（図１ｃ；参考写真１参照）。細胞を
ファロイジンで染色すると、Ｆアクチンの集合が１７−
１１、２５−７及びＮ３−５では観察されたが、１６−
３では観察されなかった（図１ｃ；参考写真１参照）。
共焦点レーザー顕微鏡の観察の結果、導入されたＤＯＣ
Ｋ２は葉状突起の根元で、上記Ｆアクチン集合体と共局
在するのでなく、かかる集合体に隣接して局在すること
が明らかとなった（図１ｄ；参考写真１参照）。これら
のことから、他のＣＤＭファミリータンパク質同様、Ｄ
ＯＣＫ２がＲａｃを活性化し、Ｔ細胞においてアクチン
細胞骨格の再構築を促すことが明らかになった。
【００２７】実施例２（ＤＯＣＫ２-/-マウスの作製）
１２９／Ｓｖゲノムライブラリーから、ＤＯＣＫ２遺伝
子を有するゲノムクローンを単離した。エクソン３のKp
n I部位からエクソン５と６の間にあるBamH I部位まで
の３．１ｋｂ断片を、ネオマイシン耐性カセット（ｎｅ
ｏ）に置換してターゲッティングベクターを構築した。
このベクターを線状化し、エレクトロポレーションする
ことによってＥＳ細胞に導入し相同的組換え体を作製し
た。かかる相同的組換え体からＥＳクローンを単離し、
Ｇ４１８を用いてネオマイシン耐性ＥＳクローンをスク
リーニングし、サザンブロット法によって相同的組換え
体を確認した。かかる相同的組換え体からゲノムＤＮＡ
を単離して、Sph I及びEcoRIでダイジェストし、ｎｅｏ
カセットを含むターゲッティングアレルに置換されてい
ることを確認した。確認後、標的としたＥＳクローンを
Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞にマイクロインジェクションし、
得られた雄キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交
配させた。変異アレルをもつヘテロ接合体（ＤＯＣＫ２
+/-）マウス同士を交配させてＤＯＣＫ２-/-マウスを得
た。なお、変異マウス（ＤＯＣＫ２+/-マウス）につい
ては、野生型ＤＯＣＫ２アレルが特異的に破壊されてい
るか否かをサザンブロット分析により確認した。ＲＴ−
ＰＣＲ（polymerase chainreaction with reverse tran
scription）法により、ｎｅｏカセットの挿入によって
ＤＯＣＫ２のＮ末端部分において終止コドンが出現し、
４２アミノ酸残基しか残らないことが明らかとなった。
また、ウエスタンブロット法を行ったところ、変異マウ
スの脾臓及び胸腺からＤＯＣＫ２の発現を確認できなか
った。同腹子のＤＯＣＫ２+/-マウス及びＤＯＣＫ２-/-
マウスを用いて、以下の実験を行った。
子を有するゲノムクローンを単離した。エクソン３のKp
n I部位からエクソン５と６の間にあるBamH I部位まで
の３．１ｋｂ断片を、ネオマイシン耐性カセット（ｎｅ
ｏ）に置換してターゲッティングベクターを構築した。
このベクターを線状化し、エレクトロポレーションする
ことによってＥＳ細胞に導入し相同的組換え体を作製し
た。かかる相同的組換え体からＥＳクローンを単離し、
Ｇ４１８を用いてネオマイシン耐性ＥＳクローンをスク
リーニングし、サザンブロット法によって相同的組換え
体を確認した。かかる相同的組換え体からゲノムＤＮＡ
を単離して、Sph I及びEcoRIでダイジェストし、ｎｅｏ
カセットを含むターゲッティングアレルに置換されてい
ることを確認した。確認後、標的としたＥＳクローンを
Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞にマイクロインジェクションし、
得られた雄キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交
配させた。変異アレルをもつヘテロ接合体（ＤＯＣＫ２
+/-）マウス同士を交配させてＤＯＣＫ２-/-マウスを得
た。なお、変異マウス（ＤＯＣＫ２+/-マウス）につい
ては、野生型ＤＯＣＫ２アレルが特異的に破壊されてい
るか否かをサザンブロット分析により確認した。ＲＴ−
ＰＣＲ（polymerase chainreaction with reverse tran
scription）法により、ｎｅｏカセットの挿入によって
ＤＯＣＫ２のＮ末端部分において終止コドンが出現し、
４２アミノ酸残基しか残らないことが明らかとなった。
また、ウエスタンブロット法を行ったところ、変異マウ
スの脾臓及び胸腺からＤＯＣＫ２の発現を確認できなか
った。同腹子のＤＯＣＫ２+/-マウス及びＤＯＣＫ２-/-
マウスを用いて、以下の実験を行った。
【００２８】実施例３（二次リンパ組織へのＤＯＣＫ２
-/-マウス由来のリンパ球のホーミングの欠損） 本発明者らは、ＤＯＣＫ２の生理機能を解明するため
に、胚幹（ＥＳ）細胞を用いた相同組換えによりＤＯＣ
Ｋ２欠損マウスを作製した。ＤＯＣＫ２-/-マウスはメ
ンデルの法則に従って出生し、外見上の異常は認められ
なかった。しかし、ＤＯＣＫ２-/-マウスの脾細胞の総
数は、ＤＯＣＫ２+/-マウスのものと比べ５０％まで減
少していることが明らかとなった（図２ａ）。また、脾
細胞において、ＤＯＣＫ２-/-マウスにおけるＣＤ４+及
びＣＤ８+Ｔ細胞並びにＢ細胞の比率はＤＯＣＫ２+/-マ
ウスのものとそれ程変化はみられなかったが、Ｍａｃ１
+単球の比率は著しく上昇しているのが確認できた。同
様の傾向は、腸間膜リンパ節細胞及び鼡径リンパ節細胞
でも観察されたが、ＣＤ４+Ｔ細胞の比率だけは異なっ
た傾向がみられた（図２ｂ、ｃ）。すなわち、ＤＯＣＫ
２+/-マウス由来のリンパ節細胞にＣＤ４+Ｔ細胞が占め
る割合は約４０％であったが、ＤＯＣＫ２-/-マウスに
おける同細胞の割合は２５％未満まで減少していた。以
上のことから、ＤＯＣＫ２-/-マウスの脾臓及びリンパ
節におけるＴ細胞及びＢ細胞の総数は顕著に減少する
が、単球は減少しないことがわかった。
-/-マウス由来のリンパ球のホーミングの欠損） 本発明者らは、ＤＯＣＫ２の生理機能を解明するため
に、胚幹（ＥＳ）細胞を用いた相同組換えによりＤＯＣ
Ｋ２欠損マウスを作製した。ＤＯＣＫ２-/-マウスはメ
ンデルの法則に従って出生し、外見上の異常は認められ
なかった。しかし、ＤＯＣＫ２-/-マウスの脾細胞の総
数は、ＤＯＣＫ２+/-マウスのものと比べ５０％まで減
少していることが明らかとなった（図２ａ）。また、脾
細胞において、ＤＯＣＫ２-/-マウスにおけるＣＤ４+及
びＣＤ８+Ｔ細胞並びにＢ細胞の比率はＤＯＣＫ２+/-マ
ウスのものとそれ程変化はみられなかったが、Ｍａｃ１
+単球の比率は著しく上昇しているのが確認できた。同
様の傾向は、腸間膜リンパ節細胞及び鼡径リンパ節細胞
でも観察されたが、ＣＤ４+Ｔ細胞の比率だけは異なっ
た傾向がみられた（図２ｂ、ｃ）。すなわち、ＤＯＣＫ
２+/-マウス由来のリンパ節細胞にＣＤ４+Ｔ細胞が占め
る割合は約４０％であったが、ＤＯＣＫ２-/-マウスに
おける同細胞の割合は２５％未満まで減少していた。以
上のことから、ＤＯＣＫ２-/-マウスの脾臓及びリンパ
節におけるＴ細胞及びＢ細胞の総数は顕著に減少する
が、単球は減少しないことがわかった。
【００２９】これらの知見により、ＤＯＣＫ２-/-マウ
スにおいて、二次リンパ組織へのリンパ球のホーミング
が障害されている可能性があると考え、かかる可能性を
調べるために、蛍光標識したＣＤ４+Ｔ細胞又はＢ細胞
の末梢リンパ節又は脾臓への走化性を比較検討した。Ｄ
ＯＣＫ２+/-マウスから調製した細胞を、野生型マウス
（Ｃ５７ＢＬ／６）の静脈に注射すると、投与したＣＤ
４+Ｔ細胞又はＢ細胞のうち、それぞれ平均して０．３
４及び０．０５％が鼡径リンパ節に遊走することがわか
った（図２ｄ、左）。しかし、ＤＯＣＫ２-/-マウスか
ら調製した細胞を野生型マウスに投与した場合、遊走し
たＣＤ４+Ｔ細胞又はＢ細胞は、ＤＯＣＫ２+/-マウス由
来の細胞を投与したものと比べ１０％程度まで減少して
いた。また、野生型マウスの脾臓への遊走を分析した結
果においても同様の差異が認められた（図２ｄ、右）。
一方、ＤＯＣＫ２+/-マウスから調製したＣＤ４+Ｔ細胞
及びＢ細胞は、ＤＯＣＫ２-/-マウスの鼡径リンパ節及
び脾臓に効率よく遊走することが確認できた（図２
ｄ）。かかる結果から、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、リ
ンパ球自身の異常により、リンパ球のホーミングが障害
されていることが示された。また、野生型マウスの末梢
血に導入したＴ細胞の発現の頻度においては有意な差は
認められなかったが、導入したＤＯＣＫ２-/-マウスの
Ｂ細胞の割合は、ＤＯＣＫ２+/-マウス由来のＢ細胞の
ものと比較して２．７倍増加していることがわかった
（図２ｅ）。
スにおいて、二次リンパ組織へのリンパ球のホーミング
が障害されている可能性があると考え、かかる可能性を
調べるために、蛍光標識したＣＤ４+Ｔ細胞又はＢ細胞
の末梢リンパ節又は脾臓への走化性を比較検討した。Ｄ
ＯＣＫ２+/-マウスから調製した細胞を、野生型マウス
（Ｃ５７ＢＬ／６）の静脈に注射すると、投与したＣＤ
４+Ｔ細胞又はＢ細胞のうち、それぞれ平均して０．３
４及び０．０５％が鼡径リンパ節に遊走することがわか
った（図２ｄ、左）。しかし、ＤＯＣＫ２-/-マウスか
ら調製した細胞を野生型マウスに投与した場合、遊走し
たＣＤ４+Ｔ細胞又はＢ細胞は、ＤＯＣＫ２+/-マウス由
来の細胞を投与したものと比べ１０％程度まで減少して
いた。また、野生型マウスの脾臓への遊走を分析した結
果においても同様の差異が認められた（図２ｄ、右）。
一方、ＤＯＣＫ２+/-マウスから調製したＣＤ４+Ｔ細胞
及びＢ細胞は、ＤＯＣＫ２-/-マウスの鼡径リンパ節及
び脾臓に効率よく遊走することが確認できた（図２
ｄ）。かかる結果から、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、リ
ンパ球自身の異常により、リンパ球のホーミングが障害
されていることが示された。また、野生型マウスの末梢
血に導入したＴ細胞の発現の頻度においては有意な差は
認められなかったが、導入したＤＯＣＫ２-/-マウスの
Ｂ細胞の割合は、ＤＯＣＫ２+/-マウス由来のＢ細胞の
ものと比較して２．７倍増加していることがわかった
（図２ｅ）。
【００３０】実施例４（ＤＯＣＫ２-/-マウス由来のリ
ンパ球における遊走活性の欠如） 次に、二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）、Ｂリンパ
球ケモアトラクタント（ＢＬＣ）、ストローマ由来因子
（ＳＤＦ）−１及び単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）―
１等のケモカイン数種を用いて刺激したときの脾臓Ｔ細
胞及びＢ細胞の走化性を検討した。ＤＯＣＫ２+/-マウ
スのＴ細胞及びＢ細胞は、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１及びＢＬ
Ｃに反応して効率よく遊走したが、ＤＯＣＫ２-/-マウ
ス由来のＴ細胞及びＢ細胞は、上記ケモカインによる刺
激に対し、何ら反応を示さなかった（図３ａ、左及び中
央；参考写真２参照）。これに対して、ＤＯＣＫ２-/-
マウス由来の単球は、ＭＣＰ−１及びＳＤＦ−１による
刺激に対して走化性反応を示し、ＤＯＣＫ２+/-マウス
のものにおいても同様の走化性反応がみられた（図３
ａ、右；参考写真２参照）。また、ＳＬＣ及びＳＤＦ−
１の走化性が、それぞれの受容体であるＣＣＲ７又はＣ
ＸＣＲ４との相互作用によって惹起されることが報告さ
れていることから（Nature 382, 829-833, 1996、Natur
e 382, 833-835, 1996、J. Biol. Chem. 273, 7118-712
2, 1998）、脾臓Ｂ細胞表面及び脾臓Ｔ細胞におけるＣ
ＸＣＲ４又はＣＣＲ７の発現を調べてみたところ、ＤＯ
ＣＫ２-/ -及びＤＯＣＫ２+/-マウス由来の脾臓Ｂ細胞表
面におけるＣＸＣＲ４の発現は同レベルであったが、脾
臓Ｔ細胞では、ＤＯＣＫ２+/-マウスよりむしろＤＯＣ
Ｋ２-/-マウスの方が、高頻度にＣＸＣＲ４及びＣＣＲ
７を発現しているのが確認できた（図３ｂ；参考写真２
参照）。このことから、受容体の発現が極度に低レベル
若しくは無であることが、ＤＯＣＫ２-/-マウス由来の
リンパ球の走化性反応を障害する原因ではないことが明
らかとなった。以上のことから、ＤＯＣＫ２は単球遊走
には関与しないが、ＤＯＣＫ２分子はケモカイン受容体
の下流で機能することにより、リンパ球遊走には不可欠
であることが示された。
ンパ球における遊走活性の欠如） 次に、二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）、Ｂリンパ
球ケモアトラクタント（ＢＬＣ）、ストローマ由来因子
（ＳＤＦ）−１及び単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）―
１等のケモカイン数種を用いて刺激したときの脾臓Ｔ細
胞及びＢ細胞の走化性を検討した。ＤＯＣＫ２+/-マウ
スのＴ細胞及びＢ細胞は、ＳＬＣ、ＳＤＦ−１及びＢＬ
Ｃに反応して効率よく遊走したが、ＤＯＣＫ２-/-マウ
ス由来のＴ細胞及びＢ細胞は、上記ケモカインによる刺
激に対し、何ら反応を示さなかった（図３ａ、左及び中
央；参考写真２参照）。これに対して、ＤＯＣＫ２-/-
マウス由来の単球は、ＭＣＰ−１及びＳＤＦ−１による
刺激に対して走化性反応を示し、ＤＯＣＫ２+/-マウス
のものにおいても同様の走化性反応がみられた（図３
ａ、右；参考写真２参照）。また、ＳＬＣ及びＳＤＦ−
１の走化性が、それぞれの受容体であるＣＣＲ７又はＣ
ＸＣＲ４との相互作用によって惹起されることが報告さ
れていることから（Nature 382, 829-833, 1996、Natur
e 382, 833-835, 1996、J. Biol. Chem. 273, 7118-712
2, 1998）、脾臓Ｂ細胞表面及び脾臓Ｔ細胞におけるＣ
ＸＣＲ４又はＣＣＲ７の発現を調べてみたところ、ＤＯ
ＣＫ２-/ -及びＤＯＣＫ２+/-マウス由来の脾臓Ｂ細胞表
面におけるＣＸＣＲ４の発現は同レベルであったが、脾
臓Ｔ細胞では、ＤＯＣＫ２+/-マウスよりむしろＤＯＣ
Ｋ２-/-マウスの方が、高頻度にＣＸＣＲ４及びＣＣＲ
７を発現しているのが確認できた（図３ｂ；参考写真２
参照）。このことから、受容体の発現が極度に低レベル
若しくは無であることが、ＤＯＣＫ２-/-マウス由来の
リンパ球の走化性反応を障害する原因ではないことが明
らかとなった。以上のことから、ＤＯＣＫ２は単球遊走
には関与しないが、ＤＯＣＫ２分子はケモカイン受容体
の下流で機能することにより、リンパ球遊走には不可欠
であることが示された。
【００３１】ケモカイン受容体は種々のシグナル経路を
活性化するヘテロ二量体Ｇiタンパク質に結合してお
り、その下流にあるホスファチジルイノシトール−３−
ＯＨキナーゼ（ＰＩ(３)Ｋ）は、Ｒａｃ、プロテインキ
ナーゼＢ（ＰＫＢ）及び細胞外シグナル調節キナーゼ類
（ＥＲＫｓ）の活性化に関与する重要なシグナル分子で
ある（Immunol. Rev. 177, 217-235, 2000、Nature Imm
unol. 2, 129-134, 2001）。ＳＤＦ−１を用いてＤＯＣ
Ｋ２+/-マウス由来のＴ細胞及びＢ細胞を刺激すると、
活性化Ｒａｃが検出されたが、ＤＯＣＫ２-/-マウス由
来のリンパ球ではかかる活性化Ｒａｃは完全に消失して
いた（図３ｃ；参考写真２参照）。また、この結果と同
様に、ＳＤＦ−１により誘導されるアクチン重合は、Ｄ
ＯＣＫ２+/ -マウス由来のリンパ球で認められるのに対
し、ＤＯＣＫ２-/-マウス由来のリンパ球では殆ど認め
られないことがわかった（図３ｄ；参考写真２参照）。
一方、ＳＤＦ−１により誘導されるＰＫＢ、ＥＲＫ１及
びＥＲＫ２のリン酸化は、ＤＯＣＫ２+/-及びＤＯＣＫ
２-/-マウス由来のＢ細胞の双方で同等に認められた
（図３ｅ；参考写真２参照）。また、ケモカインはホス
ホリパーゼＣを活性化し、細胞内のＣａ2+濃度[Ｃａ2+]
iを上昇させることが知られていることから（NatureImm
unol. 2, 129-134, 2001）、ＳＤＦ−１が誘導するＣａ
2+の流入について調べてみたところ、ＤＯＣＫ２+/-及
びＤＯＣＫ２-/-マウス由来のＢ細胞で同程度であるこ
とが明らかとなった（図３ｆ；参考写真２参照）。これ
らの結果から、ケモカイン受容体を介するシグナル伝達
経路においては、ＤＯＣＫ２が主ににＲａｃの活性化に
関与していることが示された（図３ｇ；参考写真２参
照）。
活性化するヘテロ二量体Ｇiタンパク質に結合してお
り、その下流にあるホスファチジルイノシトール−３−
ＯＨキナーゼ（ＰＩ(３)Ｋ）は、Ｒａｃ、プロテインキ
ナーゼＢ（ＰＫＢ）及び細胞外シグナル調節キナーゼ類
（ＥＲＫｓ）の活性化に関与する重要なシグナル分子で
ある（Immunol. Rev. 177, 217-235, 2000、Nature Imm
unol. 2, 129-134, 2001）。ＳＤＦ−１を用いてＤＯＣ
Ｋ２+/-マウス由来のＴ細胞及びＢ細胞を刺激すると、
活性化Ｒａｃが検出されたが、ＤＯＣＫ２-/-マウス由
来のリンパ球ではかかる活性化Ｒａｃは完全に消失して
いた（図３ｃ；参考写真２参照）。また、この結果と同
様に、ＳＤＦ−１により誘導されるアクチン重合は、Ｄ
ＯＣＫ２+/ -マウス由来のリンパ球で認められるのに対
し、ＤＯＣＫ２-/-マウス由来のリンパ球では殆ど認め
られないことがわかった（図３ｄ；参考写真２参照）。
一方、ＳＤＦ−１により誘導されるＰＫＢ、ＥＲＫ１及
びＥＲＫ２のリン酸化は、ＤＯＣＫ２+/-及びＤＯＣＫ
２-/-マウス由来のＢ細胞の双方で同等に認められた
（図３ｅ；参考写真２参照）。また、ケモカインはホス
ホリパーゼＣを活性化し、細胞内のＣａ2+濃度[Ｃａ2+]
iを上昇させることが知られていることから（NatureImm
unol. 2, 129-134, 2001）、ＳＤＦ−１が誘導するＣａ
2+の流入について調べてみたところ、ＤＯＣＫ２+/-及
びＤＯＣＫ２-/-マウス由来のＢ細胞で同程度であるこ
とが明らかとなった（図３ｆ；参考写真２参照）。これ
らの結果から、ケモカイン受容体を介するシグナル伝達
経路においては、ＤＯＣＫ２が主ににＲａｃの活性化に
関与していることが示された（図３ｇ；参考写真２参
照）。
【００３２】実施例５（ＤＯＣＫ２-/-マウスの免疫系
における構築異常） ＳＬＣ、ＢＬＣといった免疫ケモカインは、２次リンパ
組織のサブコンパートメントへのリンパ球の移動に重要
な役割を担っていることが知られている（Cell87, 1037
-1047, 1996、Blood 91, 2886-2895, 1998、Cell 99, 2
3-33, 1999、J. Exp. Med. 189, 451-460, 1999）。こ
れらのケモカインに対し、ＤＯＣＫ２-/ -マウス由来の
リンパ球は、インビトロにおいて、走化性を消失してい
たので、脾臓、リンパ節及びパイエル板についても調べ
てみた。ＤＯＣＫ２+/-マウスの脾臓では、Ｔ細胞帯域
及びその周囲のＢ細胞領域からなるリンパ濾胞が明確に
存在したが（図４ａ、左；参考写真３参照）、ＤＯＣＫ
２-/-マウスの脾臓では、かかるリンパ濾胞は著明に萎
縮しており、赤脾髄におけるリンパ球（Ｔ細胞及びＢ細
胞）の迷入が見られた（図４ａ、右；参考写真３参
照）。また、脾臓組織切片の免疫蛍光解析を行ったとこ
ろ、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、通常、metallophilic m
acrophageの周囲に分布している辺縁帯Ｂ細胞が顕著に
減少していることが明らかになった（図４ｂ；参考写真
３参照）。かかる辺縁帯Ｂ細胞は、ＣＤ２１／３５high
ＣＤ２３neg-lowＢ細胞として特徴づけることができる
（Eur. J. Immunol. 27, 2366-2374, 1997）。ＤＯＣＫ
２+/-マウスでは、Ｂ２２０+ＣＤ２３-脾臓Ｂ細胞の約
２５〜３０％がＣＤ２１／ＣＤ３５を発現していたが、
ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、このようなＢ細胞群は殆ど
みられなかった。このことから、ＤＯＣＫ２-/-系統で
は辺縁帯Ｂ細胞が欠損していることが確認できた（図４
ｃ；参考写真３参照）。ＤＯＣＫ２-/-マウス由来のリ
ンパ節でもリンパ濾胞が萎縮し、異常なＴ細胞分布を示
した（図４ｄ；参考写真３参照）。また、ＤＯＣＫ２
-/-マウスではパイエル板が、大きさと細胞密度の点で
発達不良であることも明らかとなった（図４ｅ；参考写
真３参照）。
における構築異常） ＳＬＣ、ＢＬＣといった免疫ケモカインは、２次リンパ
組織のサブコンパートメントへのリンパ球の移動に重要
な役割を担っていることが知られている（Cell87, 1037
-1047, 1996、Blood 91, 2886-2895, 1998、Cell 99, 2
3-33, 1999、J. Exp. Med. 189, 451-460, 1999）。こ
れらのケモカインに対し、ＤＯＣＫ２-/ -マウス由来の
リンパ球は、インビトロにおいて、走化性を消失してい
たので、脾臓、リンパ節及びパイエル板についても調べ
てみた。ＤＯＣＫ２+/-マウスの脾臓では、Ｔ細胞帯域
及びその周囲のＢ細胞領域からなるリンパ濾胞が明確に
存在したが（図４ａ、左；参考写真３参照）、ＤＯＣＫ
２-/-マウスの脾臓では、かかるリンパ濾胞は著明に萎
縮しており、赤脾髄におけるリンパ球（Ｔ細胞及びＢ細
胞）の迷入が見られた（図４ａ、右；参考写真３参
照）。また、脾臓組織切片の免疫蛍光解析を行ったとこ
ろ、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、通常、metallophilic m
acrophageの周囲に分布している辺縁帯Ｂ細胞が顕著に
減少していることが明らかになった（図４ｂ；参考写真
３参照）。かかる辺縁帯Ｂ細胞は、ＣＤ２１／３５high
ＣＤ２３neg-lowＢ細胞として特徴づけることができる
（Eur. J. Immunol. 27, 2366-2374, 1997）。ＤＯＣＫ
２+/-マウスでは、Ｂ２２０+ＣＤ２３-脾臓Ｂ細胞の約
２５〜３０％がＣＤ２１／ＣＤ３５を発現していたが、
ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、このようなＢ細胞群は殆ど
みられなかった。このことから、ＤＯＣＫ２-/-系統で
は辺縁帯Ｂ細胞が欠損していることが確認できた（図４
ｃ；参考写真３参照）。ＤＯＣＫ２-/-マウス由来のリ
ンパ節でもリンパ濾胞が萎縮し、異常なＴ細胞分布を示
した（図４ｄ；参考写真３参照）。また、ＤＯＣＫ２
-/-マウスではパイエル板が、大きさと細胞密度の点で
発達不良であることも明らかとなった（図４ｅ；参考写
真３参照）。
【００３３】ＳＤＦ−１は、未成熟リンパ球の走化性因
子として機能している。ＳＤＦ−１（２５０ｎｇ／ｍ
ｌ）刺激に対するＤＯＣＫ２-/-プロ及びプレＢ細胞の
走化性反応は、ＤＯＣＫ２+/-マウスと比し著減してい
た（それぞれ、プロＢ細胞では３．４％VS１８．５％；
プレＢ細胞では０．５％VS５．６％）。しかし、骨髄に
含まれるプロＢ細胞、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞及び骨
髄系細胞の量は、ＤＯＣＫ２+/-とＤＯＣＫ２-/-マウス
の間で変わらなかった。このことから、ＤＯＣＫ２欠損
は、Ｂリンパ球生成及び骨髄系細胞の生成のいずれにも
影響を及ぼさないことがわかった。ＤＯＣＫ２+/-マウ
スと比べるとＤＯＣＫ２-/-マウスにおける胸腺細胞の
総数は減少し、また、ＣＤ４-ＣＤ８-胸腺細胞の割合は
増加していたが、これらの系統では成熟胸腺細胞の割合
は同程度であった。しかしながら、末梢血中のＣＤ４+
及びＣＤ８+Ｔ細胞の総数は、ＤＯＣＫ２-/-マウスにお
いて著しく減少していることがわかった（図４ｆ；参考
写真３参照）。次に、成熟胸腺細胞の走化性因子として
機能することが知られているＥＢＩ１−リガンドケモカ
イン（ＥＬＣ）（Blood 91, 4434-4443, 1998）で刺激
したときの各マウスの胸腺細胞の遊走を比較してみた。
ＣＤ４+ＣＤ８-及びＣＤ４-ＣＤ８+成熟胸腺細胞は、Ｄ
ＯＣＫ２+/-マウスの胸腺由来のものでは効率よく移出
するものの、ＤＯＣＫ２-/-マウスの場合は、成熟胸腺
細胞は殆ど検出されなかった（図４ｇ、左；参考写真３
参照）。ＤＯＣＫ２-/-マウスの胸腺由来の成熟胸腺細
胞の移出効率は、野生型マウスのものと比べ５％未満ま
で低下していた（図４ｇ、右；参考写真３参照）。これ
らのことから、成熟胸腺細胞から末梢血流への移出障害
が、ＤＯＣＫ２-/-マウスにみられるＴリンパ球減少の
原因となっていることが示唆される。また、ＤＯＣＫ２
-/-マウスの胸腺では、ＣＤ４+ＣＤ８-又はＣＤ４-ＣＤ
８+成熟胸腺細胞が、胸腺中にわたって小さな斑点状で
不規則に分布していることが確認できた（図４ｈ；参考
写真３参照）。この詳細な機構は現時点では不明である
が、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは胸腺における胸腺細胞の
運動性もまた損なわれている可能性が考えられる。この
ことは、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、ＳＤＦ−１刺激に
対するＣＤ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の走化性が著しく損
なわれていたことからも裏付けることができる（図４
ｉ；参考写真３参照）。
子として機能している。ＳＤＦ−１（２５０ｎｇ／ｍ
ｌ）刺激に対するＤＯＣＫ２-/-プロ及びプレＢ細胞の
走化性反応は、ＤＯＣＫ２+/-マウスと比し著減してい
た（それぞれ、プロＢ細胞では３．４％VS１８．５％；
プレＢ細胞では０．５％VS５．６％）。しかし、骨髄に
含まれるプロＢ細胞、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞及び骨
髄系細胞の量は、ＤＯＣＫ２+/-とＤＯＣＫ２-/-マウス
の間で変わらなかった。このことから、ＤＯＣＫ２欠損
は、Ｂリンパ球生成及び骨髄系細胞の生成のいずれにも
影響を及ぼさないことがわかった。ＤＯＣＫ２+/-マウ
スと比べるとＤＯＣＫ２-/-マウスにおける胸腺細胞の
総数は減少し、また、ＣＤ４-ＣＤ８-胸腺細胞の割合は
増加していたが、これらの系統では成熟胸腺細胞の割合
は同程度であった。しかしながら、末梢血中のＣＤ４+
及びＣＤ８+Ｔ細胞の総数は、ＤＯＣＫ２-/-マウスにお
いて著しく減少していることがわかった（図４ｆ；参考
写真３参照）。次に、成熟胸腺細胞の走化性因子として
機能することが知られているＥＢＩ１−リガンドケモカ
イン（ＥＬＣ）（Blood 91, 4434-4443, 1998）で刺激
したときの各マウスの胸腺細胞の遊走を比較してみた。
ＣＤ４+ＣＤ８-及びＣＤ４-ＣＤ８+成熟胸腺細胞は、Ｄ
ＯＣＫ２+/-マウスの胸腺由来のものでは効率よく移出
するものの、ＤＯＣＫ２-/-マウスの場合は、成熟胸腺
細胞は殆ど検出されなかった（図４ｇ、左；参考写真３
参照）。ＤＯＣＫ２-/-マウスの胸腺由来の成熟胸腺細
胞の移出効率は、野生型マウスのものと比べ５％未満ま
で低下していた（図４ｇ、右；参考写真３参照）。これ
らのことから、成熟胸腺細胞から末梢血流への移出障害
が、ＤＯＣＫ２-/-マウスにみられるＴリンパ球減少の
原因となっていることが示唆される。また、ＤＯＣＫ２
-/-マウスの胸腺では、ＣＤ４+ＣＤ８-又はＣＤ４-ＣＤ
８+成熟胸腺細胞が、胸腺中にわたって小さな斑点状で
不規則に分布していることが確認できた（図４ｈ；参考
写真３参照）。この詳細な機構は現時点では不明である
が、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは胸腺における胸腺細胞の
運動性もまた損なわれている可能性が考えられる。この
ことは、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、ＳＤＦ−１刺激に
対するＣＤ４+ＣＤ８+未熟胸腺細胞の走化性が著しく損
なわれていたことからも裏付けることができる（図４
ｉ；参考写真３参照）。
【００３４】実施例６（ＤＯＣＫ２-/-マウスの免疫応
答障害） ＤＯＣＫ２欠損が免疫応答に及ぼす影響を検討するた
め、ＭＨＣクラスII Ｉ−Ａbに結合することが知られて
いるＥα由来のペプチド５０ｇをＤＯＣＫ２-/-マウス
及びＤＯＣＫ２+/-マウスの尾底部にアジュバントと共
に免疫し、１０日後所属リンパ節よりＣＤ４+Ｔ細胞を
単離してインビトロでＥα由来のペプチドと培養するこ
とで抗原特異的T細胞応答を解析した。野生型マウスで
はペプチド濃度依存的にＴ細胞増殖反応が観察されるの
に対して、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスではこのよう
なＴ細胞応答は認められなかった。また、ＤＮＰ−ＫＬ
Ｈを同様に免疫してＫＬＨ特異的抗体産生を解析した
が、免疫後７日では、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスに
おける抗体産生は顕著に障害されていた。すなわち、Ｄ
ＯＣＫ２ノックアウトマウスでは１次免疫応答が障害さ
れていることが明らかとなった。
答障害） ＤＯＣＫ２欠損が免疫応答に及ぼす影響を検討するた
め、ＭＨＣクラスII Ｉ−Ａbに結合することが知られて
いるＥα由来のペプチド５０ｇをＤＯＣＫ２-/-マウス
及びＤＯＣＫ２+/-マウスの尾底部にアジュバントと共
に免疫し、１０日後所属リンパ節よりＣＤ４+Ｔ細胞を
単離してインビトロでＥα由来のペプチドと培養するこ
とで抗原特異的T細胞応答を解析した。野生型マウスで
はペプチド濃度依存的にＴ細胞増殖反応が観察されるの
に対して、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスではこのよう
なＴ細胞応答は認められなかった。また、ＤＮＰ−ＫＬ
Ｈを同様に免疫してＫＬＨ特異的抗体産生を解析した
が、免疫後７日では、ＤＯＣＫ２ノックアウトマウスに
おける抗体産生は顕著に障害されていた。すなわち、Ｄ
ＯＣＫ２ノックアウトマウスでは１次免疫応答が障害さ
れていることが明らかとなった。
【００３５】以上のことから、造血細胞特異的ＣＤＭフ
ァミリータンパク質ＤＯＣＫ２が、Ｒａｃを活性化して
リンパ球遊走における細胞骨格再構築を促す中心的な制
御分子であることが明らかとなった。また、ＤＯＣＫ２
-/-マウスにみられるいくつかの異常は、ＣＣＲ７、Ｓ
ＬＣ又はＣＸＣＲ５（ＢＬＣの受容体遺伝子）を欠損す
るマウスにみられる異常（Cell 87, 1037-1047, 1996、
Blood 91, 2886-2895,1998、Cell 99, 23-33, 1999、J.
Exp. Med. 189, 451-460, 1999）といくつかの点で類
似したが、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、Ｔリンパ球減
少、辺縁帯Ｂ細胞消失、胸腺の構築異常及び脾臓へのリ
ンパ球ホーミングの減少等、上記欠損マウスではみられ
ないフェノタイプを示す点でより広範囲な異常を示すこ
とが明かとなった。かかる特徴のうちのいくつかは、未
知若しくはその機能が同定されていないケモカインに対
するＤＯＣＫ２-/-マウス由来のリンパ球の無反応性に
恐らく起因していると考えられる。さらに、アクチン細
胞骨格を制御するというＤＯＣＫ２の機能からすると、
ＤＯＣＫ２は、単にケモカインを介するリンパ球遊走に
関与しているだけではなく、他のリンパ球高次機能を制
御している可能性が考えられる。
ァミリータンパク質ＤＯＣＫ２が、Ｒａｃを活性化して
リンパ球遊走における細胞骨格再構築を促す中心的な制
御分子であることが明らかとなった。また、ＤＯＣＫ２
-/-マウスにみられるいくつかの異常は、ＣＣＲ７、Ｓ
ＬＣ又はＣＸＣＲ５（ＢＬＣの受容体遺伝子）を欠損す
るマウスにみられる異常（Cell 87, 1037-1047, 1996、
Blood 91, 2886-2895,1998、Cell 99, 23-33, 1999、J.
Exp. Med. 189, 451-460, 1999）といくつかの点で類
似したが、ＤＯＣＫ２-/-マウスでは、Ｔリンパ球減
少、辺縁帯Ｂ細胞消失、胸腺の構築異常及び脾臓へのリ
ンパ球ホーミングの減少等、上記欠損マウスではみられ
ないフェノタイプを示す点でより広範囲な異常を示すこ
とが明かとなった。かかる特徴のうちのいくつかは、未
知若しくはその機能が同定されていないケモカインに対
するＤＯＣＫ２-/-マウス由来のリンパ球の無反応性に
恐らく起因していると考えられる。さらに、アクチン細
胞骨格を制御するというＤＯＣＫ２の機能からすると、
ＤＯＣＫ２は、単にケモカインを介するリンパ球遊走に
関与しているだけではなく、他のリンパ球高次機能を制
御している可能性が考えられる。
【００３６】方法１（導入遺伝子安定発現細胞の調製）
完全長ＤＯＣＫ２遺伝子、又はインフルエンザヘムアグ
ルチニンペプチド（ＨＡ）タグを融合させた完全長ＤＯ
ＣＫ２遺伝子を、ＰＢＪ１発現ベクターに挿入し、エレ
クトロポレーション法により１６−３Ｔ細胞株に導入し
た。
ルチニンペプチド（ＨＡ）タグを融合させた完全長ＤＯ
ＣＫ２遺伝子を、ＰＢＪ１発現ベクターに挿入し、エレ
クトロポレーション法により１６−３Ｔ細胞株に導入し
た。
【００３７】方法２（イムノブロット分析）
キーホールヘモシアニンが結合したＤＯＣＫ２のカルボ
キシ末端ペプチドでウサギを免疫し、抗マウスＤＯＣＫ
２ポリクローナル抗体を作出し、ＤＯＣＫ２の発現の検
出に用いた。Ｒａｃ活性の測定を行うため、ＰＡＫ１の
Ｒａｃ結合ドメイン（ＲＢＤ）とグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質の存在下
で細胞抽出物をインキュベーションし、抗Ｒａｃモノク
ローナル抗体（Upstate Biotechnology）を用いたイム
ノブロット分析を行った。また、ＰＫＢ又はＥＲＫの活
性は、ＰＫＢ（Ｓｅｒ473）又はＥＲＫ１若しくはＥＲ
Ｋ２（Ｔｈｒ202／Ｔｙｒ204）（Cell Signaling社製）
に対するリン酸特異的抗体を用いて測定した。
キシ末端ペプチドでウサギを免疫し、抗マウスＤＯＣＫ
２ポリクローナル抗体を作出し、ＤＯＣＫ２の発現の検
出に用いた。Ｒａｃ活性の測定を行うため、ＰＡＫ１の
Ｒａｃ結合ドメイン（ＲＢＤ）とグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質の存在下
で細胞抽出物をインキュベーションし、抗Ｒａｃモノク
ローナル抗体（Upstate Biotechnology）を用いたイム
ノブロット分析を行った。また、ＰＫＢ又はＥＲＫの活
性は、ＰＫＢ（Ｓｅｒ473）又はＥＲＫ１若しくはＥＲ
Ｋ２（Ｔｈｒ202／Ｔｙｒ204）（Cell Signaling社製）
に対するリン酸特異的抗体を用いて測定した。
【００３８】方法３（免疫蛍光顕微鏡観察）
リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で細胞を４％のホルムアル
デヒドで固定し、０．１％のサポニンで浸透処理し、ヨ
ウ化プロピジウム（CALBIOCHEM社製）、Alexa568で標識
したファロイジン（Molecular Probes社製）、及び／又
は抗ＨＡ抗体（Santa Cruz社製）と反応させた後Alexa
488で標識した抗ウサギ免疫グロブリン（Ｉｇ）−γで
染色した。染色後、Nomarskiレンズを備えた蛍光顕微
鏡、又は二重励起を有するアルゴン／クリプトンレーザ
ー及び測定器を備えた共焦点レーザースキャン顕微鏡を
用いて視覚化した。
デヒドで固定し、０．１％のサポニンで浸透処理し、ヨ
ウ化プロピジウム（CALBIOCHEM社製）、Alexa568で標識
したファロイジン（Molecular Probes社製）、及び／又
は抗ＨＡ抗体（Santa Cruz社製）と反応させた後Alexa
488で標識した抗ウサギ免疫グロブリン（Ｉｇ）−γで
染色した。染色後、Nomarskiレンズを備えた蛍光顕微
鏡、又は二重励起を有するアルゴン／クリプトンレーザ
ー及び測定器を備えた共焦点レーザースキャン顕微鏡を
用いて視覚化した。
【００３９】方法４（血液カウント及びフローサイトメ
トリー分析） 後方眼窩静脈叢穿刺により血液を採取し、自動細胞カウ
ンターで分析した。Neubauerチャンバーを用いて骨髄細
胞、胸腺細胞、脾細胞及びリンパ節細胞の細胞数を測定
した。これらの細胞に関連したモノクローナル抗体（Ph
arMingen）を用いて染色し、FACSan（Becton-Dickinso
n）によるフローサイトメトリー分析を行った。また、
アクチン重合の程度を調べるため、精製したＴ細胞及び
Ｂ細胞をＰＢＳ中で４％のパラホルムアルデヒドで固定
した後、０．１％のサポニンで処理し、Alexa 488で標
識したファロイジンで染色してフローサイトメトリー分
析を行った。
トリー分析） 後方眼窩静脈叢穿刺により血液を採取し、自動細胞カウ
ンターで分析した。Neubauerチャンバーを用いて骨髄細
胞、胸腺細胞、脾細胞及びリンパ節細胞の細胞数を測定
した。これらの細胞に関連したモノクローナル抗体（Ph
arMingen）を用いて染色し、FACSan（Becton-Dickinso
n）によるフローサイトメトリー分析を行った。また、
アクチン重合の程度を調べるため、精製したＴ細胞及び
Ｂ細胞をＰＢＳ中で４％のパラホルムアルデヒドで固定
した後、０．１％のサポニンで処理し、Alexa 488で標
識したファロイジンで染色してフローサイトメトリー分
析を行った。
【００４０】方法５（組織染色）
凍結切片をアセトン及び１％のパラホルムアルデヒドで
固定し、Alexa 488又はAlexa 594で標識したモノクロー
ナル抗体で染色した。抗metallophilic macrophageモノ
クローナル抗体（ＭＯＭＡ１）での染色は、ビオチン化
抗ラットＩｇＧ抗体と反応させた後、ストレプトアビジ
ンで標識したＣｙ５．５で反応させ染色した。いくつか
の実験においては、組織切片をビオチン化モノクローナ
ル抗体で染色し、Vectastain ABC-PO kit（Vector Labo
ratories社製）により視覚化した。
固定し、Alexa 488又はAlexa 594で標識したモノクロー
ナル抗体で染色した。抗metallophilic macrophageモノ
クローナル抗体（ＭＯＭＡ１）での染色は、ビオチン化
抗ラットＩｇＧ抗体と反応させた後、ストレプトアビジ
ンで標識したＣｙ５．５で反応させ染色した。いくつか
の実験においては、組織切片をビオチン化モノクローナ
ル抗体で染色し、Vectastain ABC-PO kit（Vector Labo
ratories社製）により視覚化した。
【００４１】方法６（リンパ球ホーミングアッセイ）
精製したＣＤ４+Ｔ細胞又はＢ細胞（４×１０7／ｍｌ）
を３μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ溶液（Dojindo社製）で標
識した後、ＰＢＳで洗浄し、８×１０6〜１×１０7個の
細胞をマウスに静脈投与した。４８時間後、脾臓及び鼡
径リンパ節から細胞を調製し、カウントした。細胞移入
の前後に、抗ＣＤ４モノクローナル抗体又は抗Ｂ２２０
モノクローナル抗体で細胞を染色し、遊走した細胞の割
合（％）を算出した。移入してから４８時間後に、抗Ｔ
ｈｙ１．２モノクローナル抗体又は抗Ｂ２２０モノクロ
ーナル抗体で細胞を染色し、末梢血中に移入したＴ細胞
及びＢ細胞）の割合（％）を算出した。
を３μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ溶液（Dojindo社製）で標
識した後、ＰＢＳで洗浄し、８×１０6〜１×１０7個の
細胞をマウスに静脈投与した。４８時間後、脾臓及び鼡
径リンパ節から細胞を調製し、カウントした。細胞移入
の前後に、抗ＣＤ４モノクローナル抗体又は抗Ｂ２２０
モノクローナル抗体で細胞を染色し、遊走した細胞の割
合（％）を算出した。移入してから４８時間後に、抗Ｔ
ｈｙ１．２モノクローナル抗体又は抗Ｂ２２０モノクロ
ーナル抗体で細胞を染色し、末梢血中に移入したＴ細胞
及びＢ細胞）の割合（％）を算出した。
【００４２】方法７（走化性アッセイ）
１００μｌのＲＰＭＩ培地中の胸腺組織、脾細胞（１．
５×１０6）、骨髄細胞（１．５×１０6）、及び胸腺細
胞（１．５×１０6）をトランスウエル（孔径５μｍ；C
oaster社製）に入れ、種々の濃度のケモカイン（Genzym
e/Techne）を含む４５０μｌのＲＰＭＩ培地の入った２
４ウエルプレートで培養した。３７℃で３時間インキュ
ベーションした後、下のチャンバーに遊走した細胞を回
収し、各種細胞に対する抗体により染色し、FACScanで
細胞数をカウントした。
５×１０6）、骨髄細胞（１．５×１０6）、及び胸腺細
胞（１．５×１０6）をトランスウエル（孔径５μｍ；C
oaster社製）に入れ、種々の濃度のケモカイン（Genzym
e/Techne）を含む４５０μｌのＲＰＭＩ培地の入った２
４ウエルプレートで培養した。３７℃で３時間インキュ
ベーションした後、下のチャンバーに遊走した細胞を回
収し、各種細胞に対する抗体により染色し、FACScanで
細胞数をカウントした。
【００４３】方法８（細胞内Ｃａ2+濃度の測定）
Attofluor（蛍光色素）のデジタル蛍光顕微鏡システム
（Carl Zeiss社製）を用いて[Ｃａ2+]iを測定した。fur
a-2/AM（Dojindo社製）をロードした細胞を、０．５ｍ
ｌ容量のチャンバーに入れ、倒立顕微鏡にセットした。
細胞内Ｃａ2+濃度の測定は、細胞を浸した容器を改変Kr
ebs溶液（ｐＨ７．３）で絶えず潅流した。Fura-2蛍光
画像を約１Ｈｚの速度で再書き込み可能な光学ディスク
レコーダーに記録し、Ｃａ2+濃度に変換することにより
行った。
（Carl Zeiss社製）を用いて[Ｃａ2+]iを測定した。fur
a-2/AM（Dojindo社製）をロードした細胞を、０．５ｍ
ｌ容量のチャンバーに入れ、倒立顕微鏡にセットした。
細胞内Ｃａ2+濃度の測定は、細胞を浸した容器を改変Kr
ebs溶液（ｐＨ７．３）で絶えず潅流した。Fura-2蛍光
画像を約１Ｈｚの速度で再書き込み可能な光学ディスク
レコーダーに記録し、Ｃａ2+濃度に変換することにより
行った。
【００４4】方法９（免疫応答の解析）
マウスの尾底部に抗原ペプチドをアジュバントと共に免
疫し、所属リンパ節よりＣＤ４+Ｔ細胞を単離し抗原ペ
プチドと培養し3Ｈ−チミジンの取り込みを計測するこ
とで、Ｔ細胞増殖を解析した。また、免疫後血液を採取
し、酵素抗体法を用いて抗原特異的ＩｇＧを定量した。
疫し、所属リンパ節よりＣＤ４+Ｔ細胞を単離し抗原ペ
プチドと培養し3Ｈ−チミジンの取り込みを計測するこ
とで、Ｔ細胞増殖を解析した。また、免疫後血液を採取
し、酵素抗体法を用いて抗原特異的ＩｇＧを定量した。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、造血細胞特異的ＣＤＭフ
ァミリータンパク質であるＤＯＣＫ２が、リンパ球の走
化性に不可欠であることが明らかとなった。ＤＯＣＫ２
欠損マウス（ＤＯＣＫ２-/-）では、ケモカイン刺激に
よる単球の遊走能は損なわれなかったものの、Ｔリンパ
球及びＢリンパ球の遊走活性は認められず、Ｔリンパ球
減少、リンパ濾胞の萎縮、及び辺緑帯Ｂ細胞の消失等の
異常を引き起こした。ＤＯＣＫ２-/-由来リンパ球で
は、ケモカインによって誘導されるＲａｃの活性化及び
アクチン重合が、殆ど全て消失していた。このことから
ＤＯＣＫ２が、Ｒａｃを活性化して細胞骨格再構築を促
す中心的な分子として、リンパ球遊走を制御することが
明らかになった。それ故、本発明のモデル動物を用いる
と、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等
の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明することがで
き、またＤＯＣＫ２を標的としてこれら疾患や病態に対
する新しい治療法を開発することができる。
ァミリータンパク質であるＤＯＣＫ２が、リンパ球の走
化性に不可欠であることが明らかとなった。ＤＯＣＫ２
欠損マウス（ＤＯＣＫ２-/-）では、ケモカイン刺激に
よる単球の遊走能は損なわれなかったものの、Ｔリンパ
球及びＢリンパ球の遊走活性は認められず、Ｔリンパ球
減少、リンパ濾胞の萎縮、及び辺緑帯Ｂ細胞の消失等の
異常を引き起こした。ＤＯＣＫ２-/-由来リンパ球で
は、ケモカインによって誘導されるＲａｃの活性化及び
アクチン重合が、殆ど全て消失していた。このことから
ＤＯＣＫ２が、Ｒａｃを活性化して細胞骨格再構築を促
す中心的な分子として、リンパ球遊走を制御することが
明らかになった。それ故、本発明のモデル動物を用いる
と、アレルギー、自己免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等
の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明することがで
き、またＤＯＣＫ２を標的としてこれら疾患や病態に対
する新しい治療法を開発することができる。
【図１】Ｔ細胞株においてＤＯＣＫ２が引き起こすアク
チン細胞骨格の再構築についての結果を示す図である。 ａ：抗ＤＯＣＫ２ポリクローナル抗体を用いたイムノブ
ロット分析により、全細胞抽出物を分析した。ローデイ
ングコントロールとして非特異的なバンド（ＮＳ）を示
す。 ｂ：ＧＳＴ融合ＰＡＫ１ ＲＢＤの存在下（下のパネ
ル）又は非存在下（上のパネル）でインキュベーション
し、抗Ｒａｃモノクローナル抗体を用いて全細胞抽出物
の分析を行った。 ｃ：細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）又はファロイジ
ンで染色し、Nomarskiレンズを備えた蛍光顕微鏡で分析
した。なお、Nomarski画像及びファロイジン（Phalloid
in）で染色した画像は、同じ細胞から撮影したものであ
る。 ｄ：２５−７細胞を抗ＨＡ抗体で染色し、ＤＯＣＫ２
（参考写真１参照；緑色の部分）及びファロイジン（参
考写真１参照；赤色の部分）を検出した。レーザー共焦
点顕微鏡により、２μｍの間隔で細胞を上から下まで
（１〜９）スキャンして細胞の画像を作成した。なお、
図１ｄ中のスケールバーは１μｍを意味する。
チン細胞骨格の再構築についての結果を示す図である。 ａ：抗ＤＯＣＫ２ポリクローナル抗体を用いたイムノブ
ロット分析により、全細胞抽出物を分析した。ローデイ
ングコントロールとして非特異的なバンド（ＮＳ）を示
す。 ｂ：ＧＳＴ融合ＰＡＫ１ ＲＢＤの存在下（下のパネ
ル）又は非存在下（上のパネル）でインキュベーション
し、抗Ｒａｃモノクローナル抗体を用いて全細胞抽出物
の分析を行った。 ｃ：細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）又はファロイジ
ンで染色し、Nomarskiレンズを備えた蛍光顕微鏡で分析
した。なお、Nomarski画像及びファロイジン（Phalloid
in）で染色した画像は、同じ細胞から撮影したものであ
る。 ｄ：２５−７細胞を抗ＨＡ抗体で染色し、ＤＯＣＫ２
（参考写真１参照；緑色の部分）及びファロイジン（参
考写真１参照；赤色の部分）を検出した。レーザー共焦
点顕微鏡により、２μｍの間隔で細胞を上から下まで
（１〜９）スキャンして細胞の画像を作成した。なお、
図１ｄ中のスケールバーは１μｍを意味する。
【図２】二次リンパ組織へのＤＯＣＫ２-/-マウス由来
のリンパ球のホーミングについて調べた結果を示す図で
ある。 ａ〜ｃ：脾細胞及びリンパ節細胞を染色し、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８、Ｂ２２０及びＭａｃ１を検出した。（ａ）は脾
臓、（ｂ）は腸間膜リンパ節、（ｃ）は鼡径リンパ節に
おける細胞総数及び各サブセットの細胞数をそれぞれ示
す。なお、図中の白抜きのバーはＤＯＣＫ２+/-マウス
（ｎ＝４）由来のものを、黒色のバーはＤＯＣＫ２-/-
マウス（ａはｎ＝７、ｂとｃはｎ＝４）由来のものをそ
れぞれ示す。 ｄ：細胞を移入してから４８時間後に、鼡径リンパ節及
び脾臓における蛍光標識化ＣＤ４+Ｔ細胞及びＢ細胞の
割合を解析した。なお、図中の白抜きのバーはＤＯＣＫ
２+/-マウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝
４）に移入した結果を、黒色のバーはＤＯＣＫ２-/-マ
ウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）へ移
入した結果を、斜線のバー；ＤＯＣＫ２+/-マウス由来
の細胞をＤＯＣＫ２-/-マウス（ｎ＝５）へ移入した結
果を、それぞれ示す。 ｅ：細胞を移入してから４８時間後における移入した細
胞の割合（％）について、末梢血Ｔ細胞又はＢ細胞を分
析した。なお、図中の白抜きのバーはＤＯＣＫ２ +/-マ
ウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔ細胞はｎ＝
７、Ｂ細胞はｎ＝５）へ移入した結果を、黒色のバーは
ＤＯＣＫ２-/-マウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウ
ス（ｎ＝６）へ移入した結果を、それぞれ示す。
のリンパ球のホーミングについて調べた結果を示す図で
ある。 ａ〜ｃ：脾細胞及びリンパ節細胞を染色し、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８、Ｂ２２０及びＭａｃ１を検出した。（ａ）は脾
臓、（ｂ）は腸間膜リンパ節、（ｃ）は鼡径リンパ節に
おける細胞総数及び各サブセットの細胞数をそれぞれ示
す。なお、図中の白抜きのバーはＤＯＣＫ２+/-マウス
（ｎ＝４）由来のものを、黒色のバーはＤＯＣＫ２-/-
マウス（ａはｎ＝７、ｂとｃはｎ＝４）由来のものをそ
れぞれ示す。 ｄ：細胞を移入してから４８時間後に、鼡径リンパ節及
び脾臓における蛍光標識化ＣＤ４+Ｔ細胞及びＢ細胞の
割合を解析した。なお、図中の白抜きのバーはＤＯＣＫ
２+/-マウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝
４）に移入した結果を、黒色のバーはＤＯＣＫ２-/-マ
ウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）へ移
入した結果を、斜線のバー；ＤＯＣＫ２+/-マウス由来
の細胞をＤＯＣＫ２-/-マウス（ｎ＝５）へ移入した結
果を、それぞれ示す。 ｅ：細胞を移入してから４８時間後における移入した細
胞の割合（％）について、末梢血Ｔ細胞又はＢ細胞を分
析した。なお、図中の白抜きのバーはＤＯＣＫ２ +/-マ
ウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔ細胞はｎ＝
７、Ｂ細胞はｎ＝５）へ移入した結果を、黒色のバーは
ＤＯＣＫ２-/-マウス由来の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウ
ス（ｎ＝６）へ移入した結果を、それぞれ示す。
【図３】本発明のＤＯＣＫ２-/-マウス由来リンパ球に
おける遊走活性を調べた結果を示す図である。 ａ：ＤＯＣＫ２+/-マウス（白抜きのバー）及びＤＯＣ
Ｋ２-/-マウス（黒色のバー）由来の脾細胞を用いてト
ランスウエルによる走化性アッセイを行った。なお、図
中の結果はインプットされた細胞に対する割合を示す。 ｂ：脾細胞を、抗ＣＸＣＲ４抗体若しくは抗ＣＣＲ７抗
体（Blood 96, 2074-2080, 2000）で染色し［の線；
参考写真２参照（赤色の線）］、又はコントロールとし
てＴｈｙ１．２若しくはＢ２２０に対するモノクローナ
ル抗体で染色し［の線；参考写真２参照（緑色の
線）］、Ｔｈｙ１．２+Ｔ細胞又はＢ２２０+Ｂ細胞にお
ける受容体の発現を調べた（グラフは細胞の相対数を示
す）。 ｃ：図中に示された時間、ＳＤＦ−１（５００ｎｇ／ｍ
ｌ）で処理した脾臓Ｔ細胞及びＢ細胞（１．５×１
０7）のＲａｃ活性を、ＧＳＴ−融合ＰＡＫ１ ＲＢＤを
用いて分析した。 ｄ：ＤＯＣＫ２-/-マウス（■）及びＤＯＣＫ２+/-マウ
ス（●）由来の脾臓Ｔ細胞又はＢ細胞（５×１０6）を
図中に示される時間、ＳＤＦ−１（５００ｎｇ／ｍｌ）
で処理し、アクチン重合の程度をフローサイトメトリー
により分析した。個々の実験を３回行い、ベースライン
の蛍光を１００として得られたＭＣＦ（mean channel f
luorescence）の平均値を示した。 ｅ：図中に示す時間、ＳＤＦ−１（５００ｎｇ／ｍｌ）
で処理した脾臓Ｂ細胞（５〜８×１０6）におけるＰＫ
Ｂ又はＥＲＫのリン酸化を、ＰＫＢ（Ｓｅｒ473）又は
ＥＲＫ１若しくはＥＲＫ２（Ｔｈｒ202／Ｔｙｒ204）に
対するリン酸特異的抗体を用いて分析した。 ｆ：Ｆｕｒａ−２をロードした脾臓Ｂ細胞を、２５０ｎ
ｇ／ｍｌのＳＤＦ−１で処理し、デジタル蛍光顕微鏡シ
ステムを用いて[Ｃａ2+]iを測定した。 ｇ：ケモカイン受容体からＲａｃ活性化へ至るシグナル
伝達経路を図式化した。
おける遊走活性を調べた結果を示す図である。 ａ：ＤＯＣＫ２+/-マウス（白抜きのバー）及びＤＯＣ
Ｋ２-/-マウス（黒色のバー）由来の脾細胞を用いてト
ランスウエルによる走化性アッセイを行った。なお、図
中の結果はインプットされた細胞に対する割合を示す。 ｂ：脾細胞を、抗ＣＸＣＲ４抗体若しくは抗ＣＣＲ７抗
体（Blood 96, 2074-2080, 2000）で染色し［の線；
参考写真２参照（赤色の線）］、又はコントロールとし
てＴｈｙ１．２若しくはＢ２２０に対するモノクローナ
ル抗体で染色し［の線；参考写真２参照（緑色の
線）］、Ｔｈｙ１．２+Ｔ細胞又はＢ２２０+Ｂ細胞にお
ける受容体の発現を調べた（グラフは細胞の相対数を示
す）。 ｃ：図中に示された時間、ＳＤＦ−１（５００ｎｇ／ｍ
ｌ）で処理した脾臓Ｔ細胞及びＢ細胞（１．５×１
０7）のＲａｃ活性を、ＧＳＴ−融合ＰＡＫ１ ＲＢＤを
用いて分析した。 ｄ：ＤＯＣＫ２-/-マウス（■）及びＤＯＣＫ２+/-マウ
ス（●）由来の脾臓Ｔ細胞又はＢ細胞（５×１０6）を
図中に示される時間、ＳＤＦ−１（５００ｎｇ／ｍｌ）
で処理し、アクチン重合の程度をフローサイトメトリー
により分析した。個々の実験を３回行い、ベースライン
の蛍光を１００として得られたＭＣＦ（mean channel f
luorescence）の平均値を示した。 ｅ：図中に示す時間、ＳＤＦ−１（５００ｎｇ／ｍｌ）
で処理した脾臓Ｂ細胞（５〜８×１０6）におけるＰＫ
Ｂ又はＥＲＫのリン酸化を、ＰＫＢ（Ｓｅｒ473）又は
ＥＲＫ１若しくはＥＲＫ２（Ｔｈｒ202／Ｔｙｒ204）に
対するリン酸特異的抗体を用いて分析した。 ｆ：Ｆｕｒａ−２をロードした脾臓Ｂ細胞を、２５０ｎ
ｇ／ｍｌのＳＤＦ−１で処理し、デジタル蛍光顕微鏡シ
ステムを用いて[Ｃａ2+]iを測定した。 ｇ：ケモカイン受容体からＲａｃ活性化へ至るシグナル
伝達経路を図式化した。
【図４】本発明のＤＯＣＫ２-/-マウスの免疫系にみら
れる構築異常を示す図である。 ａ：Ｂ細胞（上段パネル）又はＴ細胞（下段パネル）の
切片を、抗Ｂ２２０抗体又は抗Ｔｈｙ１．２モノクロー
ナル抗体でそれぞれ染色した。 ｂ：抗Ｂ２２０モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクロ
ーナル抗体及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体の混合物、
及びＭＯＭＡ１で脾臓切片を染色し、Ｂ細胞（参考写真
３参照；緑色の部分）、Ｔ細胞（参考写真３参照；赤色
の部分）、及びmetallophilic macrophages（参考写真
３参照；青色の部分）を検出した。なお、図中の矢頭は
辺縁帯Ｂ細胞を示す。 ｃ：脾細胞を染色し、Ｂ２２０、ＣＤ２３及びＣＤ２１
／３５を検出し、Ｂ２２０+ＣＤ２３-Ｂ細胞におけるＣ
Ｄ２１／３５の発現を分析した（グラフは相対的な細胞
数を示す。）。ゲーティングされたＤＯＣＫ２+/-マウ
ス由来の脾細胞群［上図のの線（参考写真３参照；赤
色の線）、及び下図の白色のバー］及びＤＯＣＫ２-/-
マウス由来の脾細胞群［上図のの線（参考写真３参
照；緑色の線）、及び下図の黒色のバー］のフローサイ
トメトリー分析プロフィール（上図）及びＣＤ２１／３
５+細胞の割合（下図）を示す。 ｄ：ｂに記載の方法と同様にリンパ節の切片を染色し、
Ｂ細胞（参考写真３参照；緑色の部分）及びＴ細胞（参
考写真３参照；赤色の部分）を検出した。 ｅ：ｂに記載の方法と同様にパイエル板を染色し、Ｂ細
胞（参考写真３参照；緑色の部分）及びＴ細胞（参考写
真３参照；赤色の部分）検出した。 ｆ：血液試料をカウントした後染色し、ＣＤ４、ＣＤ
８、Ｂ２２０及びＭａｃ１を検出し、末梢血白血球の総
数及び各サブセットに含まれる数を測定した。なお、図
中の白抜きのバーはＤＯＣＫ２+/-マウス（ｎ＝４）に
ついての結果を、黒色のバーはＤＯＣＫ２-/-マウス
（ｎ＝４）についての結果を、それぞれ示す。 ｇ：胸腺器官培養を用いてトランスウエル走化性アッセ
イをＥＬＣ存在下で行った。図左は遊走してきた胸腺細
胞で発現しているＣＤ４及びＣＤ８を測定した結果を、
図右はＤＯＣＫ２+/-マウス（白抜きのバー；ｎ＝３）
及びＤＯＣＫ２-/-マウス（黒色のバー；ｎ＝３）由来
の胸腺から９０秒間回収したＣＤ４+ＣＤ８-及びＣＤ４
-ＣＤ８+成熟胸腺細胞（ＳＰ）とＣＤ４+ＣＤ８+胸腺細
胞（ＤＰ）の数を測定した結果を示す。 ｈ：胸腺切片を染色してＣＤ４（参考写真３参照；緑色
の部分）及びＣＤ８（参考写真３参照；赤色の部分）の
検出を行った。 ｉ:トランスウエル走化性アッセイによりＳＤＦ−１に
対するＣＤ４+ＣＤ８+胸腺細胞の走化性反応を測定し、
ＤＯＣＫ２+/-マウス（白抜きのバー）の場合と、ＤＯ
ＣＫ２-/-マウス（黒色のバー）の場合で比較した。イ
ンプットした細胞の割合（％）を結果として示す。
れる構築異常を示す図である。 ａ：Ｂ細胞（上段パネル）又はＴ細胞（下段パネル）の
切片を、抗Ｂ２２０抗体又は抗Ｔｈｙ１．２モノクロー
ナル抗体でそれぞれ染色した。 ｂ：抗Ｂ２２０モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクロ
ーナル抗体及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体の混合物、
及びＭＯＭＡ１で脾臓切片を染色し、Ｂ細胞（参考写真
３参照；緑色の部分）、Ｔ細胞（参考写真３参照；赤色
の部分）、及びmetallophilic macrophages（参考写真
３参照；青色の部分）を検出した。なお、図中の矢頭は
辺縁帯Ｂ細胞を示す。 ｃ：脾細胞を染色し、Ｂ２２０、ＣＤ２３及びＣＤ２１
／３５を検出し、Ｂ２２０+ＣＤ２３-Ｂ細胞におけるＣ
Ｄ２１／３５の発現を分析した（グラフは相対的な細胞
数を示す。）。ゲーティングされたＤＯＣＫ２+/-マウ
ス由来の脾細胞群［上図のの線（参考写真３参照；赤
色の線）、及び下図の白色のバー］及びＤＯＣＫ２-/-
マウス由来の脾細胞群［上図のの線（参考写真３参
照；緑色の線）、及び下図の黒色のバー］のフローサイ
トメトリー分析プロフィール（上図）及びＣＤ２１／３
５+細胞の割合（下図）を示す。 ｄ：ｂに記載の方法と同様にリンパ節の切片を染色し、
Ｂ細胞（参考写真３参照；緑色の部分）及びＴ細胞（参
考写真３参照；赤色の部分）を検出した。 ｅ：ｂに記載の方法と同様にパイエル板を染色し、Ｂ細
胞（参考写真３参照；緑色の部分）及びＴ細胞（参考写
真３参照；赤色の部分）検出した。 ｆ：血液試料をカウントした後染色し、ＣＤ４、ＣＤ
８、Ｂ２２０及びＭａｃ１を検出し、末梢血白血球の総
数及び各サブセットに含まれる数を測定した。なお、図
中の白抜きのバーはＤＯＣＫ２+/-マウス（ｎ＝４）に
ついての結果を、黒色のバーはＤＯＣＫ２-/-マウス
（ｎ＝４）についての結果を、それぞれ示す。 ｇ：胸腺器官培養を用いてトランスウエル走化性アッセ
イをＥＬＣ存在下で行った。図左は遊走してきた胸腺細
胞で発現しているＣＤ４及びＣＤ８を測定した結果を、
図右はＤＯＣＫ２+/-マウス（白抜きのバー；ｎ＝３）
及びＤＯＣＫ２-/-マウス（黒色のバー；ｎ＝３）由来
の胸腺から９０秒間回収したＣＤ４+ＣＤ８-及びＣＤ４
-ＣＤ８+成熟胸腺細胞（ＳＰ）とＣＤ４+ＣＤ８+胸腺細
胞（ＤＰ）の数を測定した結果を示す。 ｈ：胸腺切片を染色してＣＤ４（参考写真３参照；緑色
の部分）及びＣＤ８（参考写真３参照；赤色の部分）の
検出を行った。 ｉ:トランスウエル走化性アッセイによりＳＤＦ−１に
対するＣＤ４+ＣＤ８+胸腺細胞の走化性反応を測定し、
ＤＯＣＫ２+/-マウス（白抜きのバー）の場合と、ＤＯ
ＣＫ２-/-マウス（黒色のバー）の場合で比較した。イ
ンプットした細胞の割合（％）を結果として示す。
【図５】本発明のＤＯＣＫ２-/-マウスにおける免疫応
答の抑制を示す図である。 ａ：Ｅα由来の抗原ペプチドをアジュバントと共に免疫
し、１０日後所属リンパ節よりＣＤ４+Ｔ細胞を単離
し、ペプチドと培養することでＴ細胞増殖を解析した。
縦軸に3Ｈ−チミジンの取り込みを、横軸にＥα由来の
抗原ペプチドの濃度を示す。 ｂ：ＤＮＰ−ＫＬＨをアジュバントと共に免疫し、７日
後血液を採取し、酵素抗体法を用いて血清中の抗原特異
的ＩｇＧを定量した。縦軸にＯＤ４５０の値を、横軸に
血清の希釈系列を示す。
答の抑制を示す図である。 ａ：Ｅα由来の抗原ペプチドをアジュバントと共に免疫
し、１０日後所属リンパ節よりＣＤ４+Ｔ細胞を単離
し、ペプチドと培養することでＴ細胞増殖を解析した。
縦軸に3Ｈ−チミジンの取り込みを、横軸にＥα由来の
抗原ペプチドの濃度を示す。 ｂ：ＤＮＰ−ＫＬＨをアジュバントと共に免疫し、７日
後血液を採取し、酵素抗体法を用いて血清中の抗原特異
的ＩｇＧを定量した。縦軸にＯＤ４５０の値を、横軸に
血清の希釈系列を示す。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｐ 37/08
37/08 43/00 １０５
43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/47
Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18
16/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｎ 15/09 33/50 Ｋ
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ａ６１Ｋ 37/02
Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA40 BA14 BB24 CA17
DA12 DA13 DA14 DA36 FA16
FB12
4B024 AA01 AA11 BA80 DA02 GA11
HA11 HA20
4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17
BA44 NA14 ZB082 ZB132
ZB212
4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 NA14
ZB08 ZB13 ZB21
4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA20
EA50 FA74
Claims (31)
- 【請求項１】 ＤＯＣＫ２遺伝子を染色体上で欠損させ
ることにより、リンパ球遊走制御機能が欠失又は抑制さ
れていることを特徴とするリンパ球遊走制御機能欠失モ
デル非ヒト動物。 - 【請求項２】 リンパ球遊走制御機能が、Ｒａｃを活性
化し、細胞骨格の再構築を促す機能であることを特徴と
する請求項１記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非
ヒト動物。 - 【請求項３】 リンパ球遊走制御機能が、ＳＬＣ、ＳＤ
Ｆ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激によるリンパ球の遊
走機能であることを特徴とする請求項１記載のリンパ球
遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物。 - 【請求項４】 リンパ球遊走制御機能が、脾臓、リンパ
節、パイエル板等の２次リンパ組織へのホーミング機能
であることを特徴とする請求項１記載のリンパ球遊走制
御機能欠失モデル非ヒト動物。 - 【請求項５】 リンパ球遊走制御機能が、ＥＬＣケモカ
イン刺激に対する成熟胸腺Ｔ細胞の末梢血中への移出機
能、又はＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣＤ４+Ｃ
Ｄ８+未熟胸腺細胞の胸腺内遊走機能であることを特徴
とする請求項１記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル
非ヒト動物。 - 【請求項６】 リンパ球において、ケモカイン刺激によ
るアクチンの重合が殆ど全て消失していることを特徴と
する請求項１〜５のいずれか記載のリンパ球遊走制御機
能欠失モデル非ヒト動物。 - 【請求項７】 リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけ
るリンパ球の迷入及び辺緑帯Ｂ細胞の消失が観察される
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のリンパ
球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物。 - 【請求項８】 非ヒト動物がマウスであることを特徴と
する請求項１〜７のいずれか記載のリンパ球遊走制御機
能欠失モデル非ヒト動物。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか記載のリンパ球
遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検物質を投与
し、又は該モデル非動物及び野生型動物由来の組織、器
官、若しくは細胞を被検物質と接触させ、リンパ球遊走
制御機能の変化を測定・評価することを特徴とするリン
パ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項１０】 リンパ球遊走制御機能の変化が、ＧＴ
Ｐ結合型活性化Ｒａｃの変化であることを特徴とする請
求項９記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１１】 リンパ球遊走制御機能の変化が、ＳＬ
Ｃ、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ等のケモカイン刺激よるリンパ
球の遊走活性の変化であることを特徴とする請求項９記
載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のス
クリーニング方法。 - 【請求項１２】 リンパ球遊走制御機能の変化が、脾
臓、リンパ節、パイエル板等の２次リンパ組織へのホー
ミング活性の変化であることを特徴とする請求項９記載
のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスク
リーニング方法。 - 【請求項１３】 リンパ球遊走制御機能の変化が、ＥＬ
Ｃケモカイン刺激に対する末梢血中の成熟Ｔ細胞の数の
変化、又はＳＤＦ−１ケモカイン刺激に対するＣＤ４+
ＣＤ８+未熟胸腺細胞の胸腺内遊走活性の変化であるこ
とを特徴とする請求項９記載のリンパ球遊走制御機能の
促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１４】 リンパ球遊走制御機能の変化が、ケモ
カイン刺激に対するリンパ球におけるアクチンの重合の
程度の変化であることを特徴とする請求項９記載のリン
パ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項１５】 リンパ球遊走制御機能の変化が、リン
パ濾胞の萎縮、赤脾髄におけるリンパ球の迷入及び辺緑
帯Ｂ細胞の消失の程度の変化であることを特徴とする請
求項９記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１６】 ＤＯＣＫ２に結合する分子を被検物質
とすることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載
のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスク
リーニング方法。 - 【請求項１７】 ＤＯＣＫ２遺伝子を染色体上で欠損さ
せた非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機能の変化の
程度と野生型非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機能
の変化の程度とを比較・評価することを特徴とする請求
項９〜１６のいずれか記載のリンパ球遊走制御機能の促
進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１８】 非ヒト動物がマウスであることを特徴
とする請求項９〜１７のいずれか記載のリンパ球遊走制
御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１９】 請求項９〜１８のいずれか記載のスク
リーニング方法により得られることを特徴とするリンパ
球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質。 - 【請求項２０】 抑制物質が、抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯ
ＣＫ２結合分子又はＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖
であることを特徴とする請求項１９記載のリンパ球遊走
制御機能の抑制物質。 - 【請求項２１】 請求項９〜１８のいずれか記載のリン
パ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニ
ング方法を利用することを特徴とするアレルギー、自己
免疫疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対す
る治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項２２】 請求項２１記載のスクリーニング方法
により得られることを特徴とするアレルギー、自己免疫
疾患、ＧｖＨ、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治
療薬。 - 【請求項２３】 抗ＤＯＣＫ２抗体、ＤＯＣＫ２結合分
子又はＤＯＣＫ２遺伝子のアンチセンス鎖であることを
特徴とする請求項２２記載の免疫関連疾患に対する治療
薬。 - 【請求項２４】 Ｒａｃを活性化して細胞骨格の再構築
を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質。 - 【請求項２５】 ＤＯＣＫ２及び変異ＤＯＣＫ２である
ことを特徴とする請求項２４記載のリンパ球遊走制御用
タンパク質。 - 【請求項２６】 ＤＯＣＫ２が、Ｈｃｈ遺伝子（GenBan
k：アクセッションナンバーAYO27438）の発現産物であ
ることを特徴とする請求項２５記載のリンパ球遊走制御
用タンパク質。 - 【請求項２７】 請求項２４〜２６のいずれか記載のタ
ンパク質をリンパ球遊走制御用として使用する方法。 - 【請求項２８】 Ｒａｃを活性化して細胞骨格の再構築
を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質をコードする
ＤＮＡ。 - 【請求項２９】 ＤＯＣＫ２遺伝子及び変異ＤＯＣＫ２
遺伝子であることを特徴とする請求項２８記載のリンパ
球遊走制御用タンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項３０】 ＤＯＣＫ２遺伝子が、Ｈｃｈ遺伝子
（GenBank：アクセッションナンバーAYO27438）である
ことを特徴とする請求項２９記載のリンパ球遊走制御用
タンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項３１】 請求項２８〜３０のいずれか記載のＤ
ＮＡをリンパ球遊走制御用タンパク質を発現させるため
に使用する方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002000707A JP2003199459A (ja) | 2002-01-07 | 2002-01-07 | リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物 |
| PCT/JP2002/008372 WO2003056913A1 (fr) | 2002-01-07 | 2002-08-20 | Modele animal non humain ne presentant pas l'aptitude a reguler la migration des lymphocytes |
| AU2002325542A AU2002325542A1 (en) | 2002-01-07 | 2002-08-20 | Nonhuman model animal lacking the ability to control lymphocyte migration |
| CA2471432A CA2471432C (en) | 2002-01-07 | 2002-08-20 | Nonhuman model animal lacking the ability to control lymphocyte migration |
| US10/886,364 US7312373B2 (en) | 2002-01-07 | 2004-07-07 | Nonhuman model animal lacking the ability to control lymphocyte migration |
| US11/973,432 US20080160613A1 (en) | 2002-01-07 | 2007-10-09 | Nonhuman model animal lacking the ability to control lymphocyte migration |
| US11/973,490 US20080167457A1 (en) | 2002-01-07 | 2007-10-09 | Nonhuman model animal lacking the ability to control lymphocyte migration |
| US12/696,201 US8263346B2 (en) | 2002-01-07 | 2010-01-29 | Nonhuman model animal lacking the ability to control lymphocyte migration |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2002000707A JP2003199459A (ja) | 2002-01-07 | 2002-01-07 | リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物 |
Publications (1)
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