JP2003199459A - リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物 - Google Patents

リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物

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JP2003199459A JP2002000707A JP2002000707A JP2003199459A JP 2003199459 A JP2003199459 A JP 2003199459A JP 2002000707 A JP2002000707 A JP 2002000707A JP 2002000707 A JP2002000707 A JP 2002000707A JP 2003199459 A JP2003199459 A JP 2003199459A
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Nobunori Fukui
Takehiko Sasazuki
宣規 福井
健彦 笹月
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 リンパ球特異的にその運動性を制御する分子
を同定し、アレルギー、自己免疫疾患、GvH、移植片
拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明する上
で、あるいは新しい治療法を開発する上で有用なモデル
動物を提供すること。 【解決手段】 DOCK2遺伝子を染色体上で欠損さ
せ、リンパ球遊走制御機能が欠失又は抑制されているモ
デル動物、例えばDOCK2ノックアウトマウスを作製
する。このDOCK2ノックアウトマウスでは、Rac
を活性化してアクチン細胞骨格の再構築を促す機能や、
SLC、SDF−1、BLC等のケモカイン刺激よるリ
ンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の
2次リンパ組織へのホーミング機能や、ELCケモカイ
ン刺激に対する成熟胸腺T細胞の末梢血中への移出機能
が障害されており、その結果免疫応答が抑制される。

Description

【発明の詳細な説明】 【0001】 【発明の属する技術分野】本発明は、造血細胞特異的C
DMファミリータンパク質であるDOCK2遺伝子を染
色体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能
が欠失又は抑制されているリンパ球遊走制御機能欠失モ
デル非ヒト動物や、かかるモデル非ヒト動物を利用する
リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリ
ーニング方法や、Racを活性化して細胞骨格の再構築
を促進するリンパ球遊走制御タンパク質や、かかるリン
パ球遊走制御タンパク質をコードするDNA等に関す
る。 【0002】 【従来の技術】免疫応答は、生体にとって感染に対する
必須の防御機構であり、免疫細胞は、種々の感染源に迅
速に対処すべく生体内を常にパトロールしている。この
ように構成細胞が絶えず動き回るという特徴は、他の生
命複雑系においては認められず、免疫系独自に進化した
ものである。免疫細胞のうち、好中球、マクロファージ
といった細胞は感染の初期防御において機能する一方、
Tリンパ球及びBリンパ球はその抗原受容体を介して外
来異物を認識することで抗原特異的な免疫応答を引き起
こすことが知られている。上記T及びBリンパ球は、胸
腺、骨髄といった1次リンパ組織で分化し、脾臓、リン
パ節、パイエル板(小腸のリンパ組織)といった2次リ
ンパ組織の特定のコンパートメントへ移動した後、ここ
で、種々の組織から集められた抗原を、かかる抗原受容
体を介して認識することにより特異的な免疫応答を惹起
する。この際、リンパ球が2次リンパ組織の特定の部位
に移動することは、免疫応答の成立において極めて重要
である。これまで、リンパ球の移動が、種々のケモカイ
ンと総称されるタンパク質によって導かれることは知ら
れているが、リンパ球の運動性そのものを制御する分子
機構に関しては不明であった。 【0003】細胞運動には、細胞極性の変化と細胞骨格
の再構築が必須であり(Cell 84, 359-369, 1996)、こ
れらはいずれもRho、Rac、Cdc42といった低
分子量G蛋白質によって制御されていることが知られて
いる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5027-5031, 19
95、Science 279, 509-514, 1998、J. Cell Biol. 141,
1147-1157, 1998、Science 287, 1037-1040, 2000)。
この中でもとりわけRacは、葉状突起と呼ばれるアク
チンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動
力を提供している(Science 279, 509-514, 1998、Cell
103, 227-238,2000)。他方、線虫(Caenorhabditis e
legans)、ヒト及びショウジョウバエ(Drosophila mel
anogaster)において、CED5、DOCK180、Myo
blastcity(MBC)という構造上相同性を示す分子が
同定され、これらの分子はその頭文字をとってCDMフ
ァミリー分子と呼ばれており、いずれもRacの上流で
機能することで細胞骨格の再構築に関与すると考えられ
ている(Mol. Cell Biol. 16, 1770-1776, 1996、J. Ce
ll Biol. 138, 589-603, 1997、Nature 392, 501-504,
1998、Genes Dev. 12, 3331-3336, 1998、Genes Dev. 1
2, 3337-3342, 1998、Nature Cell Biol. 2, 131-136,
2000)。上記CED−5及びMyoblast Cityが特定タイ
プの細胞の運動に重要であることが突然変異体を用いた
遺伝学的解析から明らかになっているが(J. Cell Bio
l. 138, 589-603, 1997、Nature 392, 501-504, 1998、
Nature Cell Biol. 2, 131-136, 2000)、CDMファミ
リータンパク質が、哺乳類において生理的にどのように
機能するかは未だ不明であった。 【0004】DOCK2(KIAA0209;DNA Res.
3, 321-329)は、ヒト造血細胞で特異的に発現するC
DMファミリータンパク質の他のメンバーをコードし、
上記DOCK2が293T腎細胞においてRacに結合
し、Racを活性化することが知られている(Biochem.
Biophys. Acta 1452, 179-187, 1999)。一方、本発明
者らは、マウス胸腺cDNAライブラリーよりCDMフ
ァミリーに属する新規遺伝子Hchを単離し、かかる遺
伝子産物が1828のアミノ酸から成り、そのN末端に
はSH3ドメインがコードされていることを見い出した
(Nature, Vol412, 23 August, 826-831, 2001)。ま
た、マウス組織を用いたノザンブロット解析において、
DOCK180がさまざまな臓器に発現しているのに対
して、Hchの発現は胸腺及び脾臓に限局していること
や、細胞株を用いた解析より2種類の変異T細胞株を除
いて、Hchの発現がT細胞、B細胞、マクロファージ
のいずれにおいても認められることを確認した。またH
chの発現を欠く変異T細胞株にHchを導入すること
で細胞形態の著明な変化と接着性の亢進が観察されるこ
とを明らかにしている。Hchのコードする1828ア
ミノ酸のうち1677アミノ酸はヒトDOCK2と同一
であり、HchはマウスDOCK2ホモログと考えられ
たが、上記DOCK2の生理的機能は不明であった。 【0005】 【発明が解決しようとする課題】免疫応答は、生体にと
って必須の防御機構であるが、免疫応答したための疾患
あるいは病態、例えば自己免疫疾患、移植に伴う拒絶や
GvH病などは現代医学がその解決を迫られている問題
としてクローズアップされている。これら疾患や病態を
分子レベルで解明する上で、あるいはこれら疾患や病態
に対する新しい治療法を開発する上で、リンパ球特異的
にその運動性を制御する分子の同定が希求されていた。
本発明の課題は、リンパ球特異的にその運動性を制御す
る分子を同定し、アレルギー、自己免疫疾患、GvH、
移植片拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明
する上で、あるいはこれら疾患や病態に対する新しい治
療法を開発する上で有用なモデル動物を提供することに
ある。 【0006】 【課題を解決するための手段】本発明者らはマウス胸腺
cDNAライブラリーより、免疫系特異的に発現するC
DMファミリー遺伝子DOCK2(Hch)を単離し、
その生体内での機能を明らかにする目的で、ノックアウ
トマウスを作製した。DOCK2ノックアウトマウスは
メンデルの法則に従って出生し、外見上の異常は認めら
れなかった。しかしながら、野生型マウスと比較して脾
臓、リンパ節といった2次リンパ組織におけるT及びB
リンパ球の数が著減していた。リンパ球を蛍光組織でラ
ベルして、DOCK2ノックアウトマウスに静注し、リ
ンパ節へのホーミングを検討したところ、かかるノック
アウトマウスのT及びBリンパ球のホーミング活性は野
生型マウスのそれと比較して約1/10に減少してい
た。一方、野生型マウスのリンパ球はノックアウトマウ
スのリンパ節へ効率よくホーミングしていた。このこと
から、DOCK2ノックアウトマウスでは、リンパ球自
身の異常により、2次リンパ組織へのホーミングが障害
されていると考えられた。 【0007】そこで、リンパ球運動におけるDOCK2
分子の関与を直接検討する目的で、種々のケモカインに
対する遊走活性をノックアウトマウスと野生型マウスで
比較した。MCP−1、SDF−1といったケモカイン
に対するマクロファージの遊走活性はノックアウトマウ
スと野生型マウス間で差を認めなかった。しかしなが
ら、野生型マウスのT及びBリンパ球が、SLC、SD
F−1、BLCといったケモカイン刺激より活発に遊走
するのに対して、ノックアウトマウスのそれは顕著に障
害されていた。野生型マウスのリンパ球をケモカインで
刺激すると15秒をピークとしてRacの活性化及びア
クチン重合が観察されたが、ノックアウトマウスのリン
パ球においてはこれらの反応が消失していた。一方、P
KB、ERKの活性化やカルシウムの流入は両者の間で
差を認めなかった。すなわち、DOCK2は、Racを
活性化し、細胞骨格の再構築を促すことでリンパ球特異
的にその運動性を制御していることが明らかとなった。 【0008】DOCK2ノックアウトマウスの1次リン
パ組織におけるT及びBリンパ球の分化に関して、大き
な異常は認められなかった。しかしながら、ノックアウ
トマウスの末梢血中のTリンパ球は野生型マウスと比較
して著減していた。ところで、ケモカインELCが成熟
胸腺T細胞の胸腺からの移出に関与することが知られて
いることから、胸腺器官培養を用いてELCに対する成
熟胸腺T細胞の移出を検討したところ、その効率がノッ
クアウトマウスでは野生型マウスに比べ約1/20に減
少していた。このことから、成熟胸腺T細胞の移出障害
が、ノックアウトマウス末梢血におけるTリンパ球減少
の原因であることが示唆された。 【0009】SLC、ELC、BLCといったケモカイ
ンは、「免疫ケモカイン」と称され、2次リンパ組織の
構築に重要な役割を演じることが知られている。DOC
K2ノックアウトマウスの脾臓の免疫組織学的解析にお
いて、リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけるリンパ
球の迷入及び辺緑帯B細胞の消失が観察された。リンパ
濾胞の萎縮はリンパ節、パイエル板といった他の2次リ
ンパ系組織においても同様に認められた。さらに、ノッ
クアウトマウスの胸腺において成熟胸腺T細胞の分布に
顕著な異常を認めた。すなわち、DOCK2ノックアウ
トマウスのリンパ球は種々のケモカイン刺激に遊走活性
を示さず、その結果免疫系の構築異常が生じることが示
された。 【0010】DOCK2欠損が免疫応答に及ぼす影響を
検討するため、MHCクラスII I−Abに結合すること
が知られているE由来のペプチドを免疫し、抗原特異的
T細胞応答を解析したところ、野生型マウスでは抗原濃
度依存的にT細胞増殖反応が観察されるのに対して、D
OCK2ノックアウトマウスではこのようなT細胞応答
は認められなかった。また、DNP−KLHを免疫して
KLH特異的抗体産生を解析したが、免疫後7日では、
DOCK2ノックアウトマウスにおける抗体産生は顕著
に障害されていた。すなわち、DOCK2ノックアウト
マウスでは1次免疫応答が抑制されていることが明らか
となった。 【0011】以上のことより、DOCK2はRacを活
性化し、細胞骨格の再構築を促すことでリンパ球の運動
性を制御する重要な分子であり、その欠損が免疫系の構
築並びに免疫応答に多大な影響を与えることが初めて明
らかにされた。かかる知見より、DOCK2を標的とし
てリンパ球の運動性を人為的に制御することでアレルギ
ー、自己免疫疾患、移植片拒絶といった免疫関連疾患に
対する新しい治療法の開発につながることが期待され、
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったもの
である。 【0012】すなわち本発明は、DOCK2遺伝子を染
色体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能
が欠失又は抑制されていることを特徴とするリンパ球遊
走制御機能欠失モデル非ヒト動物(請求項1)や、リン
パ球遊走制御機能が、Racを活性化し、細胞骨格の再
構築を促す機能であることを特徴とする請求項1記載の
リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物(請求項
2)や、リンパ球遊走制御機能が、SLC、SDF−
1、BLC等のケモカイン刺激によるリンパ球の遊走機
能であることを特徴とする請求項1記載のリンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物(請求項3)や、リンパ
球遊走制御機能が、脾臓、リンパ節、パイエル板等の2
次リンパ組織へのホーミング機能であることを特徴とす
る請求項1記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒ
ト動物(請求項4)や、リンパ球遊走制御機能が、EL
Cケモカイン刺激に対する成熟胸腺T細胞の末梢血中へ
の移出機能、又はSDF−1ケモカイン刺激に対するC
D4+CD8+未熟胸腺細胞の胸腺内遊走機能であること
を特徴とする請求項1記載のリンパ球遊走制御機能欠失
モデル非ヒト動物(請求項5)や、リンパ球において、
ケモカイン刺激によるアクチンの重合が殆ど全て消失し
ていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の
リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物(請求項
6)や、リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけるリン
パ球の迷入及び辺緑帯B細胞の消失が観察されることを
特徴とする請求項1〜6のいずれか記載のリンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物(請求項7)や、非ヒト
動物がマウスであることを特徴とする請求項1〜7のい
ずれか記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動
物(請求項8)に関する。 【0013】また本発明は、請求項1〜8のいずれか記
載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検
物質を投与し、又は該モデル非動物及び野生型動物由来
の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させ、リ
ンパ球遊走制御機能の変化を測定・評価することを特徴
とするリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質の
スクリーニング方法(請求項9)や、リンパ球遊走制御
機能の変化が、GTP結合型活性化Racの変化である
ことを特徴とする請求項9記載のリンパ球遊走制御機能
の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法(請求項
10)や、リンパ球遊走制御機能の変化が、SLC、S
DF−1、BLC等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊
走活性の変化であることを特徴とする請求項9記載のリ
ンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリー
ニング方法(請求項11)や、リンパ球遊走制御機能の
変化が、脾臓、リンパ節、パイエル板等の2次リンパ組
織へのホーミング活性の変化であることを特徴とする請
求項9記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法(請求項12)や、リンパ球
遊走制御機能の変化が、ELCケモカイン刺激に対する
末梢血中の成熟T細胞の数の変化、又はSDF−1ケモ
カイン刺激に対するCD4+CD8+未熟胸腺細胞の胸腺
内遊走活性の変化であることを特徴とする請求項9記載
のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスク
リーニング方法(請求項13)や、リンパ球遊走制御機
能の変化が、ケモカイン刺激に対するリンパ球における
アクチンの重合の程度の変化であることを特徴とする請
求項9記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法(請求項14)や、リンパ球
遊走制御機能の変化が、リンパ濾胞の萎縮、赤脾髄にお
けるリンパ球の迷入及び辺緑帯B細胞の消失の程度の変
化であることを特徴とする請求項9記載のリンパ球遊走
制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法
(請求項15)や、DOCK2に結合する分子を被検物
質とすることを特徴とする請求項9〜15のいずれか記
載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のス
クリーニング方法(請求項16)や、DOCK2遺伝子
を染色体上で欠損させた非ヒト動物におけるリンパ球遊
走制御機能の変化の程度と野生型非ヒト動物におけるリ
ンパ球遊走制御機能の変化の程度とを比較・評価するこ
とを特徴とする請求項9〜16のいずれか記載のリンパ
球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニン
グ方法(請求項17)や、非ヒト動物がマウスであるこ
とを特徴とする請求項9〜17のいずれか記載のリンパ
球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニン
グ方法(請求項18)や、請求項9〜18のいずれか記
載のスクリーニング方法により得られることを特徴とす
るリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質(請求
項19)や、抑制物質が、抗DOCK2抗体、DOCK
2結合分子又はDOCK2遺伝子のアンチセンス鎖であ
ることを特徴とする請求項19記載のリンパ球遊走制御
機能の抑制物質(請求項20)や、請求項9〜18のい
ずれか記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
物質のスクリーニング方法を利用することを特徴とする
アレルギー、自己免疫疾患、GvH、移植片拒絶等の免
疫関連疾患に対する治療薬のスクリーニング方法(請求
項21)や、請求項21記載のスクリーニング方法によ
り得られることを特徴とするアレルギー、自己免疫疾
患、GvH、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療
薬(請求項22)や、抗DOCK2抗体、DOCK2結
合分子又はDOCK2遺伝子のアンチセンス鎖であるこ
とを特徴とする請求項22記載の免疫関連疾患に対する
治療薬(請求項23)に関する。 【0014】さらに本発明は、Racを活性化して細胞
骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質
(請求項24)や、DOCK2及び変異DOCK2であ
ることを特徴とする請求項24記載のリンパ球遊走制御
用タンパク質(請求項25)や、DOCK2が、Hch
遺伝子(GenBank:アクセッションナンバーAYO27438)
の発現産物であることを特徴とする請求項25記載のリ
ンパ球遊走制御用タンパク質(請求項26)や、請求項
24〜26のいずれか記載のタンパク質をリンパ球遊走
制御用として使用する方法(請求項27)や、Racを
活性化して細胞骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制
御用タンパク質をコードするDNA(請求項28)や、
DOCK2遺伝子及び変異DOCK2遺伝子であること
を特徴とする請求項28記載のリンパ球遊走制御用タン
パク質をコードするDNA(請求項29)や、DOCK
2遺伝子が、Hch遺伝子(GenBank:アクセッション
ナンバーAYO27438)であることを特徴とする請求項29
記載のリンパ球遊走制御用タンパク質をコードするDN
A(請求項30)や、請求項28〜30のいずれか記載
のDNAをリンパ球遊走制御用タンパク質を発現させる
ために使用する方法(請求項31)に関する。 【0015】 【発明の実施の形態】本発明のリンパ球遊走制御機能欠
失モデル非ヒト動物としては、DOCK2遺伝子を染色
体上で欠損させることにより、リンパ球遊走制御機能が
欠失又は抑制されているモデル動物であれば特に制限さ
れるものではなく、例えば、DOCK2をコードする非
ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・
置換等の遺伝子変異により、その機能を不活性化させる
ことにより、DOCK2遺伝子機能を染色体上で欠損さ
せることができる。本発明における非ヒト動物として
は、マウス、ラット等の齧歯目動物の他、ウサギ、イ
ヌ、ブタ、ヒツジ、サル等を具体的に挙げることができ
るが、これらに限定されるものではなく、中でも、取扱
い易さ等からマウスが好ましい。また、上記DOCK2
遺伝子としては、Hch(マウスDOCK2)遺伝子
(GenBankアクセッションナンバーAYO27438;Nature, V
ol412, 23 August, 826-831, 2001)、ヒトDOCK2
遺伝子(KIAA0209;DNA Res. 3, 321-329)を
具体的に挙げることができるが、DOCK2遺伝子の由
来はマウス及びヒト等に限られるものではない。 【0016】本発明のリンパ球遊走制御機能欠失モデル
非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機能としては、D
OCK2遺伝子の発現に依拠するリンパ球の運動性を制
御する機能であれば特に制限されるものではないが、R
acを活性化してRac−GTP結合体とし、細胞骨格
の再構築、特にリンパ球におけるアクチン重合を促進す
る機能や、SLC、SDF−1、BLC等のケモカイン
刺激よるリンパ球の遊走機能や、脾臓、リンパ節、パイ
エル板等の2次リンパ組織へのホーミング機能や、EL
Cケモカイン刺激に対する成熟胸腺T細胞の末梢血中へ
の移出機能や、SDF−1ケモカイン刺激に対するCD
+CD8+未熟胸腺細胞の遊走機能等を具体的に例示す
ることができる。かかるリンパ球遊走制御機能が欠失又
は抑制されている本発明のリンパ球遊走制御機能欠失モ
デル非ヒト動物は、ケモカイン刺激に対してリンパ球に
おけるアクチン重合が殆ど全て消失しており、また、リ
ンパ濾胞の著明な萎縮や、赤脾髄におけるリンパ球の迷
入や、辺緑帯B細胞の消失が観察されるモデル動物、好
ましくはDOCK2ノックアウトマウスである。以下、
非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。 【0017】DOCK2遺伝子が染色体上で欠損したマ
ウス、すなわちDOCK2ノックアウトマウス(DOC
K2-/-)の作製方法は特に制限されるものではない
が、例えば、文献(Cell 76, 519-529, 1994)に記載す
る方法等によって作製することができる。具体的には、
マウス遺伝子ライブラリーからPCR等の方法により得
られた遺伝子断片を用いて、DOCK2遺伝子をスクリ
ーニングし、スクリーニングされたDOCK2遺伝子を
組換えDNA技術により、DOCK2遺伝子の全部又は
一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺
伝子で置換し、5′末端側にジフテリアトキシンAフラ
グメント(DT−A)遺伝子や単純ヘルペスウイルスの
チミジンキナーゼ(HSV−tk)遺伝子等の遺伝子を
導入してターゲティングベクターを作製し、この作製さ
れたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロ
ポレーション(電気穿孔)法等によってES細胞に導入
し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中か
ら、G418やガンシクロビア(GANC)等の抗生物
質に抵抗性を示すES細胞を選択する。この選択された
ES細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロッ
ト法等により確認することが好ましい。 【0018】上記組換えES細胞をマウスの胚盤胞中に
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウ
スを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを
交配させることによって、DOCK2ノックアウトマウ
スを得ることができる。そして、かかるDOCK2ノッ
クアウトマウスにおけるDOCK2遺伝子が染色体上で
欠損していることを確認する方法としては、例えば、上
記の方法により得られたマウスの尾からDNAを単離し
てサザンブロット法等により調べる方法や、このマウス
のリンパ球細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロ
ット分析等により調べる方法等を挙げることができる。 【0019】本発明のリンパ球遊走制御機能欠失モデル
非ヒト動物は、アレルギー、自己免疫疾患、GvH、移
植片拒絶等の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明す
るためのモデル動物として、あるいはこれら疾患や病態
に対する新しい治療法を開発するためのモデル動物とし
てきわめて有用であり、かかるリンパ球遊走制御機能欠
失モデル非ヒト動物を利用して野生型マウスと比較する
ことで、DOCK2を標的としたリンパ球遊走制御機能
の促進物質又は抑制物質のスクリーニングや、アレルギ
ー、自己免疫疾患、GvH、移植片拒絶等の免疫関連疾
患に対する治療薬のスクリーニングが可能となる。 【0020】本発明のリンパ球遊走制御機能の促進物質
又は抑制物質のスクリーニング方法としては、前記本発
明のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検
物質を投与する方法や、リンパ球遊走制御機能欠失モデ
ル非ヒト動物に由来する組織、器官又は細胞を被検物質
と接触させる方法を挙げることができる。リンパ球遊走
制御機能欠失モデル非ヒト動物、例えば前記DOCK2
ノックアウトマウス及び野生型動物に由来する組織、器
官又は細胞を被検物質と接触させる方法としては、これ
ら動物由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触さ
せ、リンパ球遊走制御機能の変化、例えば、GTPと結
合した活性化Racの変化、核の偏在等の細胞極性の変
化、アクチン重合の変化、SLC、SDF−1、BLC
等のケモカイン刺激よるリンパ球の遊走活性の変化など
を測定・評価する方法を具体的に例示することができ
る。また、リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動
物、例えば前記DOCK2ノックアウトマウス及び野生
型動物に被検物質を投与する方法としては、該マウスの
組織、器官又は細胞におけるリンパ球遊走制御機能の変
化、例えば、リンパ球等の細胞におけるGTPと結合し
た活性化Racの変化、核の偏在等細胞極性の変化の変
化、アクチン重合の変化や、該マウスにおけるSLC、
SDF−1、BLC等のケモカイン刺激よるリンパ球の
遊走活性の変化や、脾臓、リンパ節、パイエル板等の2
次リンパ組織へのホーミング活性の変化や、ELCケモ
カイン刺激に対する末梢血中の成熟T細胞の数の変化
や、SDF−1ケモカイン刺激に対する末梢血中のCD
+CD8+未熟胸腺細胞の遊走活性の変化や、リンパ濾
胞の萎縮、赤脾髄におけるリンパ球の迷入及び辺緑帯B
細胞の消失の程度の変化を測定・評価する方法などを具
体的に挙げることができるが、これらに制限されるもの
ではない。 【0021】上記スクリーニングに際して、インビトロ
等でDOCK2に結合する分子、好ましくはDOCK2
に特異的に結合する分子を被検物質とすることにより、
リンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質、特に抑
制物質を効率よくスクリーニングすることができる。イ
ンビトロ等でDOCK2に結合する分子を探索する方法
としては、酵母のtwo hybrid system、大腸菌発現系を
用いたfar western法、免疫沈降法、アフィニティクロ
マトグラフィーを利用する方法等の公知の相互作用する
タンパク質の探索法を好適に例示することができる。ま
た、上記スクリーニングに際して、DOCK2遺伝子を
染色体上で欠損させた非ヒト動物におけるリンパ球遊走
制御機能の変化の程度と、野生型非ヒト動物、好ましく
は同腹の野生型非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機
能の変化の程度とを比較・評価することが好ましい。 【0022】上記のリンパ球遊走制御機能の促進物質又
は抑制物質のスクリーニング方法を利用すると、DOC
K2を標的としたアレルギー、自己免疫疾患、GvH、
移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬のスクリー
ニングが可能となる。例えば、リンパ球遊走制御機能の
促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法により得ら
れる抗DOCK2抗体、DOCK2結合分子、DOCK
2遺伝子のアンチセンス鎖等のリンパ球遊走制御機能の
抑制物質は、リンパ球の運動性を人為的に抑制しうるこ
とが期待されることから、アレルギー、自己免疫疾患、
GvH、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治療薬と
なりうる可能性がきわめて大きく、かかる治療薬を医薬
品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担
体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、pH緩衝剤、
崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤
用配合成分を添加することができ、通常用いられる投与
形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸
濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるい
は、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注
射の型で非経口投与することができる。 【0023】本発明は、Racを活性化して細胞骨格の
再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質やかか
るリンパ球遊走制御用タンパク質をコードするDNAを
対象としている。また本発明は、Racを活性化して細
胞骨格の再構築を促進するリンパ球遊走制御用タンパク
質をリンパ球遊走制御用として使用する方法や、リンパ
球遊走制御用タンパク質をコードするDNAを、リンパ
球遊走制御用タンパク質を発現させるために使用する方
法を対象としている。上記タンパク質やDNAとして
は、Hch等のDOCK2や、Hch遺伝子(GenBan
k:アクセッションナンバーAYO27438)等のDOCK2
遺伝子を具体的に挙げることができ、前述のように、R
acを活性化して細胞骨格の再構築を促進するリンパ球
遊走制御タンパク質やかかるリンパ球遊走制御タンパク
質をコードするDNAの機能は、本発明においてはじめ
て明らかにされたものである。 【0024】 【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例1(T細胞株においてDOCK2が引き起こすア
クチン細胞骨格の再構築) DOCK2遺伝子(KIAA0209;DNA Res. 3, 32
1-329)は、ヒト造血細胞で特異的に発現するCDMフ
ァミリータンパク質をコードし、上記DOCK2が29
3T腎細胞におけるRacに結合し、Racを活性化す
ることが知られている(Biochem. Biophys. Acta 1452,
179-187, 1999)が、その生理機能は不明であった。 【0025】そこで、本発明者らは、マウス胸腺で発現
する遺伝子をみつけるべく、アミノ末端のSH(Src-ho
mology)−3ドメインを含む1828個のアミノ酸をコ
ードすると推定される相補DNAを単離してHch遺伝
子(GenBank:アクセッションナンバーAYO27438)と命
名した。Hchは、CED−5、MBC、及びDOCK
180と相同であり、さらにHchの1828アミノ酸
のうち、1677個がヒトDOCK2と一致しているこ
とを見い出した。DOCK180遺伝子は、種々の組織
で発現するのに対し、Hch遺伝子の発現は、胸腺、脾
臓、及びリンパ節に限定され、Hch遺伝子が造血細胞
で特異的に発現することが示唆されていた。実験した全
てのT細胞株、B細胞株、及び単球細胞株でHch遺伝
子の発現が観察されたが、二種類のT細胞株、BW51
47α-β-及びその誘導体BEα16−3(以下「16
−3」という。)においては発現が認められなかった。
以上の結果からHch遺伝子が、ヒトDOCK2遺伝子
のマウスの相同体であると結論づけた。 【0026】DOCK2遺伝子を欠失したT細胞株16
−3にマウスDOCK2遺伝子を導入して、DOCK2
遺伝子の発現がアクチン細胞骨格に影響するかどうかを
調べた。ウエスタンブロット分析の結果、導入遺伝子を
安定的に発現する細胞2種(17−11及び25−7)
において、DOCK2が野生型細胞株であるN3−5と
比べ、やや強く(17−11)あるいは弱く(25−
7)発現することが明らかになった(図1a;参考写真
1参照)。17−11及びN3−5では、PAK1と相
互作用するGTP結合型活性化Rac(Nature 367, 40
-46, 1994)が検出されたが、16−3からは検出され
なかった(図1b;参考写真1参照)。細胞株17−1
1及び25−7が、形態的にいくつかの点で16−3と
異なり、N3−5と類似していることを見い出した。す
なわち、16−3は円形細胞だが、17−11、25−
7及びN3−5は、核が偏在し、比較的平坦で極性をも
つ細胞形態を示す(図1c;参考写真1参照)。細胞を
ファロイジンで染色すると、Fアクチンの集合が17−
11、25−7及びN3−5では観察されたが、16−
3では観察されなかった(図1c;参考写真1参照)。
共焦点レーザー顕微鏡の観察の結果、導入されたDOC
K2は葉状突起の根元で、上記Fアクチン集合体と共局
在するのでなく、かかる集合体に隣接して局在すること
が明らかとなった(図1d;参考写真1参照)。これら
のことから、他のCDMファミリータンパク質同様、D
OCK2がRacを活性化し、T細胞においてアクチン
細胞骨格の再構築を促すことが明らかになった。 【0027】実施例2(DOCK2-/-マウスの作製) 129/Svゲノムライブラリーから、DOCK2遺伝
子を有するゲノムクローンを単離した。エクソン3のKp
n I部位からエクソン5と6の間にあるBamH I部位まで
の3.1kb断片を、ネオマイシン耐性カセット(ne
o)に置換してターゲッティングベクターを構築した。
このベクターを線状化し、エレクトロポレーションする
ことによってES細胞に導入し相同的組換え体を作製し
た。かかる相同的組換え体からESクローンを単離し、
G418を用いてネオマイシン耐性ESクローンをスク
リーニングし、サザンブロット法によって相同的組換え
体を確認した。かかる相同的組換え体からゲノムDNA
を単離して、Sph I及びEcoRIでダイジェストし、neo
カセットを含むターゲッティングアレルに置換されてい
ることを確認した。確認後、標的としたESクローンを
C57BL/6胚盤胞にマイクロインジェクションし、
得られた雄キメラマウスをC57BL/6雌マウスと交
配させた。変異アレルをもつヘテロ接合体(DOCK2
+/-)マウス同士を交配させてDOCK2-/-マウスを得
た。なお、変異マウス(DOCK2+/-マウス)につい
ては、野生型DOCK2アレルが特異的に破壊されてい
るか否かをサザンブロット分析により確認した。RT−
PCR(polymerase chainreaction with reverse tran
scription)法により、neoカセットの挿入によって
DOCK2のN末端部分において終止コドンが出現し、
42アミノ酸残基しか残らないことが明らかとなった。
また、ウエスタンブロット法を行ったところ、変異マウ
スの脾臓及び胸腺からDOCK2の発現を確認できなか
った。同腹子のDOCK2+/-マウス及びDOCK2-/-
マウスを用いて、以下の実験を行った。 【0028】実施例3(二次リンパ組織へのDOCK2
-/-マウス由来のリンパ球のホーミングの欠損) 本発明者らは、DOCK2の生理機能を解明するため
に、胚幹(ES)細胞を用いた相同組換えによりDOC
K2欠損マウスを作製した。DOCK2-/-マウスはメ
ンデルの法則に従って出生し、外見上の異常は認められ
なかった。しかし、DOCK2-/-マウスの脾細胞の総
数は、DOCK2+/-マウスのものと比べ50%まで減
少していることが明らかとなった(図2a)。また、脾
細胞において、DOCK2-/-マウスにおけるCD4+
びCD8+T細胞並びにB細胞の比率はDOCK2+/-
ウスのものとそれ程変化はみられなかったが、Mac1
+単球の比率は著しく上昇しているのが確認できた。同
様の傾向は、腸間膜リンパ節細胞及び鼡径リンパ節細胞
でも観察されたが、CD4+T細胞の比率だけは異なっ
た傾向がみられた(図2b、c)。すなわち、DOCK
+/-マウス由来のリンパ節細胞にCD4+T細胞が占め
る割合は約40%であったが、DOCK2-/-マウスに
おける同細胞の割合は25%未満まで減少していた。以
上のことから、DOCK2-/-マウスの脾臓及びリンパ
節におけるT細胞及びB細胞の総数は顕著に減少する
が、単球は減少しないことがわかった。 【0029】これらの知見により、DOCK2-/-マウ
スにおいて、二次リンパ組織へのリンパ球のホーミング
が障害されている可能性があると考え、かかる可能性を
調べるために、蛍光標識したCD4+T細胞又はB細胞
の末梢リンパ節又は脾臓への走化性を比較検討した。D
OCK2+/-マウスから調製した細胞を、野生型マウス
(C57BL/6)の静脈に注射すると、投与したCD
+T細胞又はB細胞のうち、それぞれ平均して0.3
4及び0.05%が鼡径リンパ節に遊走することがわか
った(図2d、左)。しかし、DOCK2-/-マウスか
ら調製した細胞を野生型マウスに投与した場合、遊走し
たCD4+T細胞又はB細胞は、DOCK2+/-マウス由
来の細胞を投与したものと比べ10%程度まで減少して
いた。また、野生型マウスの脾臓への遊走を分析した結
果においても同様の差異が認められた(図2d、右)。
一方、DOCK2+/-マウスから調製したCD4+T細胞
及びB細胞は、DOCK2-/-マウスの鼡径リンパ節及
び脾臓に効率よく遊走することが確認できた(図2
d)。かかる結果から、DOCK2-/-マウスでは、リ
ンパ球自身の異常により、リンパ球のホーミングが障害
されていることが示された。また、野生型マウスの末梢
血に導入したT細胞の発現の頻度においては有意な差は
認められなかったが、導入したDOCK2-/-マウスの
B細胞の割合は、DOCK2+/-マウス由来のB細胞の
ものと比較して2.7倍増加していることがわかった
(図2e)。 【0030】実施例4(DOCK2-/-マウス由来のリ
ンパ球における遊走活性の欠如) 次に、二次リンパ組織ケモカイン(SLC)、Bリンパ
球ケモアトラクタント(BLC)、ストローマ由来因子
(SDF)−1及び単球走化性タンパク質(MCP)―
1等のケモカイン数種を用いて刺激したときの脾臓T細
胞及びB細胞の走化性を検討した。DOCK2+/-マウ
スのT細胞及びB細胞は、SLC、SDF−1及びBL
Cに反応して効率よく遊走したが、DOCK2-/-マウ
ス由来のT細胞及びB細胞は、上記ケモカインによる刺
激に対し、何ら反応を示さなかった(図3a、左及び中
央;参考写真2参照)。これに対して、DOCK2-/-
マウス由来の単球は、MCP−1及びSDF−1による
刺激に対して走化性反応を示し、DOCK2+/-マウス
のものにおいても同様の走化性反応がみられた(図3
a、右;参考写真2参照)。また、SLC及びSDF−
1の走化性が、それぞれの受容体であるCCR7又はC
XCR4との相互作用によって惹起されることが報告さ
れていることから(Nature 382, 829-833, 1996、Natur
e 382, 833-835, 1996、J. Biol. Chem. 273, 7118-712
2, 1998)、脾臓B細胞表面及び脾臓T細胞におけるC
XCR4又はCCR7の発現を調べてみたところ、DO
CK2-/ -及びDOCK2+/-マウス由来の脾臓B細胞表
面におけるCXCR4の発現は同レベルであったが、脾
臓T細胞では、DOCK2+/-マウスよりむしろDOC
K2-/-マウスの方が、高頻度にCXCR4及びCCR
7を発現しているのが確認できた(図3b;参考写真2
参照)。このことから、受容体の発現が極度に低レベル
若しくは無であることが、DOCK2-/-マウス由来の
リンパ球の走化性反応を障害する原因ではないことが明
らかとなった。以上のことから、DOCK2は単球遊走
には関与しないが、DOCK2分子はケモカイン受容体
の下流で機能することにより、リンパ球遊走には不可欠
であることが示された。 【0031】ケモカイン受容体は種々のシグナル経路を
活性化するヘテロ二量体Giタンパク質に結合してお
り、その下流にあるホスファチジルイノシトール−3−
OHキナーゼ(PI(3)K)は、Rac、プロテインキ
ナーゼB(PKB)及び細胞外シグナル調節キナーゼ類
(ERKs)の活性化に関与する重要なシグナル分子で
ある(Immunol. Rev. 177, 217-235, 2000、Nature Imm
unol. 2, 129-134, 2001)。SDF−1を用いてDOC
K2+/-マウス由来のT細胞及びB細胞を刺激すると、
活性化Racが検出されたが、DOCK2-/-マウス由
来のリンパ球ではかかる活性化Racは完全に消失して
いた(図3c;参考写真2参照)。また、この結果と同
様に、SDF−1により誘導されるアクチン重合は、D
OCK2+/ -マウス由来のリンパ球で認められるのに対
し、DOCK2-/-マウス由来のリンパ球では殆ど認め
られないことがわかった(図3d;参考写真2参照)。
一方、SDF−1により誘導されるPKB、ERK1及
びERK2のリン酸化は、DOCK2+/-及びDOCK
-/-マウス由来のB細胞の双方で同等に認められた
(図3e;参考写真2参照)。また、ケモカインはホス
ホリパーゼCを活性化し、細胞内のCa2+濃度[Ca2+]
iを上昇させることが知られていることから(NatureImm
unol. 2, 129-134, 2001)、SDF−1が誘導するCa
2+の流入について調べてみたところ、DOCK2+/-
びDOCK2-/-マウス由来のB細胞で同程度であるこ
とが明らかとなった(図3f;参考写真2参照)。これ
らの結果から、ケモカイン受容体を介するシグナル伝達
経路においては、DOCK2が主ににRacの活性化に
関与していることが示された(図3g;参考写真2参
照)。 【0032】実施例5(DOCK2-/-マウスの免疫系
における構築異常) SLC、BLCといった免疫ケモカインは、2次リンパ
組織のサブコンパートメントへのリンパ球の移動に重要
な役割を担っていることが知られている(Cell87, 1037
-1047, 1996、Blood 91, 2886-2895, 1998、Cell 99, 2
3-33, 1999、J. Exp. Med. 189, 451-460, 1999)。こ
れらのケモカインに対し、DOCK2-/ -マウス由来の
リンパ球は、インビトロにおいて、走化性を消失してい
たので、脾臓、リンパ節及びパイエル板についても調べ
てみた。DOCK2+/-マウスの脾臓では、T細胞帯域
及びその周囲のB細胞領域からなるリンパ濾胞が明確に
存在したが(図4a、左;参考写真3参照)、DOCK
-/-マウスの脾臓では、かかるリンパ濾胞は著明に萎
縮しており、赤脾髄におけるリンパ球(T細胞及びB細
胞)の迷入が見られた(図4a、右;参考写真3参
照)。また、脾臓組織切片の免疫蛍光解析を行ったとこ
ろ、DOCK2-/-マウスでは、通常、metallophilic m
acrophageの周囲に分布している辺縁帯B細胞が顕著に
減少していることが明らかになった(図4b;参考写真
3参照)。かかる辺縁帯B細胞は、CD21/35high
CD23neg-lowB細胞として特徴づけることができる
(Eur. J. Immunol. 27, 2366-2374, 1997)。DOCK
+/-マウスでは、B220+CD23-脾臓B細胞の約
25〜30%がCD21/CD35を発現していたが、
DOCK2-/-マウスでは、このようなB細胞群は殆ど
みられなかった。このことから、DOCK2-/-系統で
は辺縁帯B細胞が欠損していることが確認できた(図4
c;参考写真3参照)。DOCK2-/-マウス由来のリ
ンパ節でもリンパ濾胞が萎縮し、異常なT細胞分布を示
した(図4d;参考写真3参照)。また、DOCK2
-/-マウスではパイエル板が、大きさと細胞密度の点で
発達不良であることも明らかとなった(図4e;参考写
真3参照)。 【0033】SDF−1は、未成熟リンパ球の走化性因
子として機能している。SDF−1(250ng/m
l)刺激に対するDOCK2-/-プロ及びプレB細胞の
走化性反応は、DOCK2+/-マウスと比し著減してい
た(それぞれ、プロB細胞では3.4%VS18.5%;
プレB細胞では0.5%VS5.6%)。しかし、骨髄に
含まれるプロB細胞、プレB細胞、未成熟B細胞及び骨
髄系細胞の量は、DOCK2+/-とDOCK2-/-マウス
の間で変わらなかった。このことから、DOCK2欠損
は、Bリンパ球生成及び骨髄系細胞の生成のいずれにも
影響を及ぼさないことがわかった。DOCK2+/-マウ
スと比べるとDOCK2-/-マウスにおける胸腺細胞の
総数は減少し、また、CD4-CD8-胸腺細胞の割合は
増加していたが、これらの系統では成熟胸腺細胞の割合
は同程度であった。しかしながら、末梢血中のCD4+
及びCD8+T細胞の総数は、DOCK2-/-マウスにお
いて著しく減少していることがわかった(図4f;参考
写真3参照)。次に、成熟胸腺細胞の走化性因子として
機能することが知られているEBI1−リガンドケモカ
イン(ELC)(Blood 91, 4434-4443, 1998)で刺激
したときの各マウスの胸腺細胞の遊走を比較してみた。
CD4+CD8-及びCD4-CD8+成熟胸腺細胞は、D
OCK2+/-マウスの胸腺由来のものでは効率よく移出
するものの、DOCK2-/-マウスの場合は、成熟胸腺
細胞は殆ど検出されなかった(図4g、左;参考写真3
参照)。DOCK2-/-マウスの胸腺由来の成熟胸腺細
胞の移出効率は、野生型マウスのものと比べ5%未満ま
で低下していた(図4g、右;参考写真3参照)。これ
らのことから、成熟胸腺細胞から末梢血流への移出障害
が、DOCK2-/-マウスにみられるTリンパ球減少の
原因となっていることが示唆される。また、DOCK2
-/-マウスの胸腺では、CD4+CD8-又はCD4-CD
+成熟胸腺細胞が、胸腺中にわたって小さな斑点状で
不規則に分布していることが確認できた(図4h;参考
写真3参照)。この詳細な機構は現時点では不明である
が、DOCK2-/-マウスでは胸腺における胸腺細胞の
運動性もまた損なわれている可能性が考えられる。この
ことは、DOCK2-/-マウスでは、SDF−1刺激に
対するCD4+CD8+未熟胸腺細胞の走化性が著しく損
なわれていたことからも裏付けることができる(図4
i;参考写真3参照)。 【0034】実施例6(DOCK2-/-マウスの免疫応
答障害) DOCK2欠損が免疫応答に及ぼす影響を検討するた
め、MHCクラスII I−Abに結合することが知られて
いるEα由来のペプチド50gをDOCK2-/-マウス
及びDOCK2+/-マウスの尾底部にアジュバントと共
に免疫し、10日後所属リンパ節よりCD4+T細胞を
単離してインビトロでEα由来のペプチドと培養するこ
とで抗原特異的T細胞応答を解析した。野生型マウスで
はペプチド濃度依存的にT細胞増殖反応が観察されるの
に対して、DOCK2ノックアウトマウスではこのよう
なT細胞応答は認められなかった。また、DNP−KL
Hを同様に免疫してKLH特異的抗体産生を解析した
が、免疫後7日では、DOCK2ノックアウトマウスに
おける抗体産生は顕著に障害されていた。すなわち、D
OCK2ノックアウトマウスでは1次免疫応答が障害さ
れていることが明らかとなった。 【0035】以上のことから、造血細胞特異的CDMフ
ァミリータンパク質DOCK2が、Racを活性化して
リンパ球遊走における細胞骨格再構築を促す中心的な制
御分子であることが明らかとなった。また、DOCK2
-/-マウスにみられるいくつかの異常は、CCR7、S
LC又はCXCR5(BLCの受容体遺伝子)を欠損す
るマウスにみられる異常(Cell 87, 1037-1047, 1996、
Blood 91, 2886-2895,1998、Cell 99, 23-33, 1999、J.
Exp. Med. 189, 451-460, 1999)といくつかの点で類
似したが、DOCK2-/-マウスでは、Tリンパ球減
少、辺縁帯B細胞消失、胸腺の構築異常及び脾臓へのリ
ンパ球ホーミングの減少等、上記欠損マウスではみられ
ないフェノタイプを示す点でより広範囲な異常を示すこ
とが明かとなった。かかる特徴のうちのいくつかは、未
知若しくはその機能が同定されていないケモカインに対
するDOCK2-/-マウス由来のリンパ球の無反応性に
恐らく起因していると考えられる。さらに、アクチン細
胞骨格を制御するというDOCK2の機能からすると、
DOCK2は、単にケモカインを介するリンパ球遊走に
関与しているだけではなく、他のリンパ球高次機能を制
御している可能性が考えられる。 【0036】方法1(導入遺伝子安定発現細胞の調製) 完全長DOCK2遺伝子、又はインフルエンザヘムアグ
ルチニンペプチド(HA)タグを融合させた完全長DO
CK2遺伝子を、PBJ1発現ベクターに挿入し、エレ
クトロポレーション法により16−3T細胞株に導入し
た。 【0037】方法2(イムノブロット分析) キーホールヘモシアニンが結合したDOCK2のカルボ
キシ末端ペプチドでウサギを免疫し、抗マウスDOCK
2ポリクローナル抗体を作出し、DOCK2の発現の検
出に用いた。Rac活性の測定を行うため、PAK1の
Rac結合ドメイン(RBD)とグルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質の存在下
で細胞抽出物をインキュベーションし、抗Racモノク
ローナル抗体(Upstate Biotechnology)を用いたイム
ノブロット分析を行った。また、PKB又はERKの活
性は、PKB(Ser473)又はERK1若しくはER
K2(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling社製)
に対するリン酸特異的抗体を用いて測定した。 【0038】方法3(免疫蛍光顕微鏡観察) リン酸緩衝溶液(PBS)中で細胞を4%のホルムアル
デヒドで固定し、0.1%のサポニンで浸透処理し、ヨ
ウ化プロピジウム(CALBIOCHEM社製)、Alexa568で標識
したファロイジン(Molecular Probes社製)、及び/又
は抗HA抗体(Santa Cruz社製)と反応させた後Alexa
488で標識した抗ウサギ免疫グロブリン(Ig)−γで
染色した。染色後、Nomarskiレンズを備えた蛍光顕微
鏡、又は二重励起を有するアルゴン/クリプトンレーザ
ー及び測定器を備えた共焦点レーザースキャン顕微鏡を
用いて視覚化した。 【0039】方法4(血液カウント及びフローサイトメ
トリー分析) 後方眼窩静脈叢穿刺により血液を採取し、自動細胞カウ
ンターで分析した。Neubauerチャンバーを用いて骨髄細
胞、胸腺細胞、脾細胞及びリンパ節細胞の細胞数を測定
した。これらの細胞に関連したモノクローナル抗体(Ph
arMingen)を用いて染色し、FACSan(Becton-Dickinso
n)によるフローサイトメトリー分析を行った。また、
アクチン重合の程度を調べるため、精製したT細胞及び
B細胞をPBS中で4%のパラホルムアルデヒドで固定
した後、0.1%のサポニンで処理し、Alexa 488で標
識したファロイジンで染色してフローサイトメトリー分
析を行った。 【0040】方法5(組織染色) 凍結切片をアセトン及び1%のパラホルムアルデヒドで
固定し、Alexa 488又はAlexa 594で標識したモノクロー
ナル抗体で染色した。抗metallophilic macrophageモノ
クローナル抗体(MOMA1)での染色は、ビオチン化
抗ラットIgG抗体と反応させた後、ストレプトアビジ
ンで標識したCy5.5で反応させ染色した。いくつか
の実験においては、組織切片をビオチン化モノクローナ
ル抗体で染色し、Vectastain ABC-PO kit(Vector Labo
ratories社製)により視覚化した。 【0041】方法6(リンパ球ホーミングアッセイ) 精製したCD4+T細胞又はB細胞(4×107/ml)
を3μMのBCECF−AM溶液(Dojindo社製)で標
識した後、PBSで洗浄し、8×106〜1×107個の
細胞をマウスに静脈投与した。48時間後、脾臓及び鼡
径リンパ節から細胞を調製し、カウントした。細胞移入
の前後に、抗CD4モノクローナル抗体又は抗B220
モノクローナル抗体で細胞を染色し、遊走した細胞の割
合(%)を算出した。移入してから48時間後に、抗T
hy1.2モノクローナル抗体又は抗B220モノクロ
ーナル抗体で細胞を染色し、末梢血中に移入したT細胞
及びB細胞)の割合(%)を算出した。 【0042】方法7(走化性アッセイ) 100μlのRPMI培地中の胸腺組織、脾細胞(1.
5×106)、骨髄細胞(1.5×106)、及び胸腺細
胞(1.5×106)をトランスウエル(孔径5μm;C
oaster社製)に入れ、種々の濃度のケモカイン(Genzym
e/Techne)を含む450μlのRPMI培地の入った2
4ウエルプレートで培養した。37℃で3時間インキュ
ベーションした後、下のチャンバーに遊走した細胞を回
収し、各種細胞に対する抗体により染色し、FACScanで
細胞数をカウントした。 【0043】方法8(細胞内Ca2+濃度の測定) Attofluor(蛍光色素)のデジタル蛍光顕微鏡システム
(Carl Zeiss社製)を用いて[Ca2+]iを測定した。fur
a-2/AM(Dojindo社製)をロードした細胞を、0.5m
l容量のチャンバーに入れ、倒立顕微鏡にセットした。
細胞内Ca2+濃度の測定は、細胞を浸した容器を改変Kr
ebs溶液(pH7.3)で絶えず潅流した。Fura-2蛍光
画像を約1Hzの速度で再書き込み可能な光学ディスク
レコーダーに記録し、Ca2+濃度に変換することにより
行った。 【0044】方法9(免疫応答の解析) マウスの尾底部に抗原ペプチドをアジュバントと共に免
疫し、所属リンパ節よりCD4+T細胞を単離し抗原ペ
プチドと培養し3H−チミジンの取り込みを計測するこ
とで、T細胞増殖を解析した。また、免疫後血液を採取
し、酵素抗体法を用いて抗原特異的IgGを定量した。 【0045】 【発明の効果】本発明により、造血細胞特異的CDMフ
ァミリータンパク質であるDOCK2が、リンパ球の走
化性に不可欠であることが明らかとなった。DOCK2
欠損マウス(DOCK2-/-)では、ケモカイン刺激に
よる単球の遊走能は損なわれなかったものの、Tリンパ
球及びBリンパ球の遊走活性は認められず、Tリンパ球
減少、リンパ濾胞の萎縮、及び辺緑帯B細胞の消失等の
異常を引き起こした。DOCK2-/-由来リンパ球で
は、ケモカインによって誘導されるRacの活性化及び
アクチン重合が、殆ど全て消失していた。このことから
DOCK2が、Racを活性化して細胞骨格再構築を促
す中心的な分子として、リンパ球遊走を制御することが
明らかになった。それ故、本発明のモデル動物を用いる
と、アレルギー、自己免疫疾患、GvH、移植片拒絶等
の免疫関連疾患や病態を分子レベルで解明することがで
き、またDOCK2を標的としてこれら疾患や病態に対
する新しい治療法を開発することができる。

【図面の簡単な説明】 【図1】T細胞株においてDOCK2が引き起こすアク
チン細胞骨格の再構築についての結果を示す図である。 a:抗DOCK2ポリクローナル抗体を用いたイムノブ
ロット分析により、全細胞抽出物を分析した。ローデイ
ングコントロールとして非特異的なバンド(NS)を示
す。 b:GST融合PAK1 RBDの存在下(下のパネ
ル)又は非存在下(上のパネル)でインキュベーション
し、抗Racモノクローナル抗体を用いて全細胞抽出物
の分析を行った。 c:細胞をヨウ化プロピジウム(PI)又はファロイジ
ンで染色し、Nomarskiレンズを備えた蛍光顕微鏡で分析
した。なお、Nomarski画像及びファロイジン(Phalloid
in)で染色した画像は、同じ細胞から撮影したものであ
る。 d:25−7細胞を抗HA抗体で染色し、DOCK2
(参考写真1参照;緑色の部分)及びファロイジン(参
考写真1参照;赤色の部分)を検出した。レーザー共焦
点顕微鏡により、2μmの間隔で細胞を上から下まで
(1〜9)スキャンして細胞の画像を作成した。なお、
図1d中のスケールバーは1μmを意味する。 【図2】二次リンパ組織へのDOCK2-/-マウス由来
のリンパ球のホーミングについて調べた結果を示す図で
ある。 a〜c:脾細胞及びリンパ節細胞を染色し、CD4、C
D8、B220及びMac1を検出した。(a)は脾
臓、(b)は腸間膜リンパ節、(c)は鼡径リンパ節に
おける細胞総数及び各サブセットの細胞数をそれぞれ示
す。なお、図中の白抜きのバーはDOCK2+/-マウス
(n=4)由来のものを、黒色のバーはDOCK2-/-
マウス(aはn=7、bとcはn=4)由来のものをそ
れぞれ示す。 d:細胞を移入してから48時間後に、鼡径リンパ節及
び脾臓における蛍光標識化CD4+T細胞及びB細胞の
割合を解析した。なお、図中の白抜きのバーはDOCK
+/-マウス由来の細胞をC57BL/6マウス(n=
4)に移入した結果を、黒色のバーはDOCK2-/-
ウス由来の細胞をC57BL/6マウス(n=5)へ移
入した結果を、斜線のバー;DOCK2+/-マウス由来
の細胞をDOCK2-/-マウス(n=5)へ移入した結
果を、それぞれ示す。 e:細胞を移入してから48時間後における移入した細
胞の割合(%)について、末梢血T細胞又はB細胞を分
析した。なお、図中の白抜きのバーはDOCK2 +/-
ウス由来の細胞をC57BL/6マウス(T細胞はn=
7、B細胞はn=5)へ移入した結果を、黒色のバーは
DOCK2-/-マウス由来の細胞をC57BL/6マウ
ス(n=6)へ移入した結果を、それぞれ示す。 【図3】本発明のDOCK2-/-マウス由来リンパ球に
おける遊走活性を調べた結果を示す図である。 a:DOCK2+/-マウス(白抜きのバー)及びDOC
K2-/-マウス(黒色のバー)由来の脾細胞を用いてト
ランスウエルによる走化性アッセイを行った。なお、図
中の結果はインプットされた細胞に対する割合を示す。 b:脾細胞を、抗CXCR4抗体若しくは抗CCR7抗
体(Blood 96, 2074-2080, 2000)で染色し[の線;
参考写真2参照(赤色の線)]、又はコントロールとし
てThy1.2若しくはB220に対するモノクローナ
ル抗体で染色し[の線;参考写真2参照(緑色の
線)]、Thy1.2+T細胞又はB220+B細胞にお
ける受容体の発現を調べた(グラフは細胞の相対数を示
す)。 c:図中に示された時間、SDF−1(500ng/m
l)で処理した脾臓T細胞及びB細胞(1.5×1
7)のRac活性を、GST−融合PAK1 RBDを
用いて分析した。 d:DOCK2-/-マウス(■)及びDOCK2+/-マウ
ス(●)由来の脾臓T細胞又はB細胞(5×106)を
図中に示される時間、SDF−1(500ng/ml)
で処理し、アクチン重合の程度をフローサイトメトリー
により分析した。個々の実験を3回行い、ベースライン
の蛍光を100として得られたMCF(mean channel f
luorescence)の平均値を示した。 e:図中に示す時間、SDF−1(500ng/ml)
で処理した脾臓B細胞(5〜8×106)におけるPK
B又はERKのリン酸化を、PKB(Ser473)又は
ERK1若しくはERK2(Thr202/Tyr204)に
対するリン酸特異的抗体を用いて分析した。 f:Fura−2をロードした脾臓B細胞を、250n
g/mlのSDF−1で処理し、デジタル蛍光顕微鏡シ
ステムを用いて[Ca2+]iを測定した。 g:ケモカイン受容体からRac活性化へ至るシグナル
伝達経路を図式化した。 【図4】本発明のDOCK2-/-マウスの免疫系にみら
れる構築異常を示す図である。 a:B細胞(上段パネル)又はT細胞(下段パネル)の
切片を、抗B220抗体又は抗Thy1.2モノクロー
ナル抗体でそれぞれ染色した。 b:抗B220モノクローナル抗体、抗CD4モノクロ
ーナル抗体及び抗CD8モノクローナル抗体の混合物、
及びMOMA1で脾臓切片を染色し、B細胞(参考写真
3参照;緑色の部分)、T細胞(参考写真3参照;赤色
の部分)、及びmetallophilic macrophages(参考写真
3参照;青色の部分)を検出した。なお、図中の矢頭は
辺縁帯B細胞を示す。 c:脾細胞を染色し、B220、CD23及びCD21
/35を検出し、B220+CD23-B細胞におけるC
D21/35の発現を分析した(グラフは相対的な細胞
数を示す。)。ゲーティングされたDOCK2+/-マウ
ス由来の脾細胞群[上図のの線(参考写真3参照;赤
色の線)、及び下図の白色のバー]及びDOCK2-/-
マウス由来の脾細胞群[上図のの線(参考写真3参
照;緑色の線)、及び下図の黒色のバー]のフローサイ
トメトリー分析プロフィール(上図)及びCD21/3
+細胞の割合(下図)を示す。 d:bに記載の方法と同様にリンパ節の切片を染色し、
B細胞(参考写真3参照;緑色の部分)及びT細胞(参
考写真3参照;赤色の部分)を検出した。 e:bに記載の方法と同様にパイエル板を染色し、B細
胞(参考写真3参照;緑色の部分)及びT細胞(参考写
真3参照;赤色の部分)検出した。 f:血液試料をカウントした後染色し、CD4、CD
8、B220及びMac1を検出し、末梢血白血球の総
数及び各サブセットに含まれる数を測定した。なお、図
中の白抜きのバーはDOCK2+/-マウス(n=4)に
ついての結果を、黒色のバーはDOCK2-/-マウス
(n=4)についての結果を、それぞれ示す。 g:胸腺器官培養を用いてトランスウエル走化性アッセ
イをELC存在下で行った。図左は遊走してきた胸腺細
胞で発現しているCD4及びCD8を測定した結果を、
図右はDOCK2+/-マウス(白抜きのバー;n=3)
及びDOCK2-/-マウス(黒色のバー;n=3)由来
の胸腺から90秒間回収したCD4+CD8-及びCD4
-CD8+成熟胸腺細胞(SP)とCD4+CD8+胸腺細
胞(DP)の数を測定した結果を示す。 h:胸腺切片を染色してCD4(参考写真3参照;緑色
の部分)及びCD8(参考写真3参照;赤色の部分)の
検出を行った。 i:トランスウエル走化性アッセイによりSDF−1に
対するCD4+CD8+胸腺細胞の走化性反応を測定し、
DOCK2+/-マウス(白抜きのバー)の場合と、DO
CK2-/-マウス(黒色のバー)の場合で比較した。イ
ンプットした細胞の割合(%)を結果として示す。 【図5】本発明のDOCK2-/-マウスにおける免疫応
答の抑制を示す図である。 a:Eα由来の抗原ペプチドをアジュバントと共に免疫
し、10日後所属リンパ節よりCD4+T細胞を単離
し、ペプチドと培養することでT細胞増殖を解析した。
縦軸に3H−チミジンの取り込みを、横軸にEα由来の
抗原ペプチドの濃度を示す。 b:DNP−KLHをアジュバントと共に免疫し、7日
後血液を採取し、酵素抗体法を用いて血清中の抗原特異
的IgGを定量した。縦軸にOD450の値を、横軸に
血清の希釈系列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 37/06 A61P 37/08 37/08 43/00 105 43/00 105 C07K 14/47 C07K 14/47 16/18 16/18 G01N 33/15 Z C12N 15/09 33/50 K G01N 33/15 Z 33/50 C12N 15/00 A A61K 37/02 Fターム(参考) 2G045 AA24 AA40 BA14 BB24 CA17 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB12 4B024 AA01 AA11 BA80 DA02 GA11 HA11 HA20 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA44 NA14 ZB082 ZB132 ZB212 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 NA14 ZB08 ZB13 ZB21 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項1】 DOCK2遺伝子を染色体上で欠損させ
    ることにより、リンパ球遊走制御機能が欠失又は抑制さ
    れていることを特徴とするリンパ球遊走制御機能欠失モ
    デル非ヒト動物。 【請求項2】 リンパ球遊走制御機能が、Racを活性
    化し、細胞骨格の再構築を促す機能であることを特徴と
    する請求項1記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル非
    ヒト動物。 【請求項3】 リンパ球遊走制御機能が、SLC、SD
    F−1、BLC等のケモカイン刺激によるリンパ球の遊
    走機能であることを特徴とする請求項1記載のリンパ球
    遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物。 【請求項4】 リンパ球遊走制御機能が、脾臓、リンパ
    節、パイエル板等の2次リンパ組織へのホーミング機能
    であることを特徴とする請求項1記載のリンパ球遊走制
    御機能欠失モデル非ヒト動物。 【請求項5】 リンパ球遊走制御機能が、ELCケモカ
    イン刺激に対する成熟胸腺T細胞の末梢血中への移出機
    能、又はSDF−1ケモカイン刺激に対するCD4+
    D8+未熟胸腺細胞の胸腺内遊走機能であることを特徴
    とする請求項1記載のリンパ球遊走制御機能欠失モデル
    非ヒト動物。 【請求項6】 リンパ球において、ケモカイン刺激によ
    るアクチンの重合が殆ど全て消失していることを特徴と
    する請求項1〜5のいずれか記載のリンパ球遊走制御機
    能欠失モデル非ヒト動物。 【請求項7】 リンパ濾胞の著明な萎縮、赤脾髄におけ
    るリンパ球の迷入及び辺緑帯B細胞の消失が観察される
    ことを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載のリンパ
    球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物。 【請求項8】 非ヒト動物がマウスであることを特徴と
    する請求項1〜7のいずれか記載のリンパ球遊走制御機
    能欠失モデル非ヒト動物。 【請求項9】 請求項1〜8のいずれか記載のリンパ球
    遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物に被検物質を投与
    し、又は該モデル非動物及び野生型動物由来の組織、器
    官、若しくは細胞を被検物質と接触させ、リンパ球遊走
    制御機能の変化を測定・評価することを特徴とするリン
    パ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニ
    ング方法。 【請求項10】 リンパ球遊走制御機能の変化が、GT
    P結合型活性化Racの変化であることを特徴とする請
    求項9記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
    物質のスクリーニング方法。 【請求項11】 リンパ球遊走制御機能の変化が、SL
    C、SDF−1、BLC等のケモカイン刺激よるリンパ
    球の遊走活性の変化であることを特徴とする請求項9記
    載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のス
    クリーニング方法。 【請求項12】 リンパ球遊走制御機能の変化が、脾
    臓、リンパ節、パイエル板等の2次リンパ組織へのホー
    ミング活性の変化であることを特徴とする請求項9記載
    のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスク
    リーニング方法。 【請求項13】 リンパ球遊走制御機能の変化が、EL
    Cケモカイン刺激に対する末梢血中の成熟T細胞の数の
    変化、又はSDF−1ケモカイン刺激に対するCD4+
    CD8+未熟胸腺細胞の胸腺内遊走活性の変化であるこ
    とを特徴とする請求項9記載のリンパ球遊走制御機能の
    促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。 【請求項14】 リンパ球遊走制御機能の変化が、ケモ
    カイン刺激に対するリンパ球におけるアクチンの重合の
    程度の変化であることを特徴とする請求項9記載のリン
    パ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニ
    ング方法。 【請求項15】 リンパ球遊走制御機能の変化が、リン
    パ濾胞の萎縮、赤脾髄におけるリンパ球の迷入及び辺緑
    帯B細胞の消失の程度の変化であることを特徴とする請
    求項9記載のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制
    物質のスクリーニング方法。 【請求項16】 DOCK2に結合する分子を被検物質
    とすることを特徴とする請求項9〜15のいずれか記載
    のリンパ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスク
    リーニング方法。 【請求項17】 DOCK2遺伝子を染色体上で欠損さ
    せた非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機能の変化の
    程度と野生型非ヒト動物におけるリンパ球遊走制御機能
    の変化の程度とを比較・評価することを特徴とする請求
    項9〜16のいずれか記載のリンパ球遊走制御機能の促
    進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。 【請求項18】 非ヒト動物がマウスであることを特徴
    とする請求項9〜17のいずれか記載のリンパ球遊走制
    御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。 【請求項19】 請求項9〜18のいずれか記載のスク
    リーニング方法により得られることを特徴とするリンパ
    球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質。 【請求項20】 抑制物質が、抗DOCK2抗体、DO
    CK2結合分子又はDOCK2遺伝子のアンチセンス鎖
    であることを特徴とする請求項19記載のリンパ球遊走
    制御機能の抑制物質。 【請求項21】 請求項9〜18のいずれか記載のリン
    パ球遊走制御機能の促進物質又は抑制物質のスクリーニ
    ング方法を利用することを特徴とするアレルギー、自己
    免疫疾患、GvH、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対す
    る治療薬のスクリーニング方法。 【請求項22】 請求項21記載のスクリーニング方法
    により得られることを特徴とするアレルギー、自己免疫
    疾患、GvH、移植片拒絶等の免疫関連疾患に対する治
    療薬。 【請求項23】 抗DOCK2抗体、DOCK2結合分
    子又はDOCK2遺伝子のアンチセンス鎖であることを
    特徴とする請求項22記載の免疫関連疾患に対する治療
    薬。 【請求項24】 Racを活性化して細胞骨格の再構築
    を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質。 【請求項25】 DOCK2及び変異DOCK2である
    ことを特徴とする請求項24記載のリンパ球遊走制御用
    タンパク質。 【請求項26】 DOCK2が、Hch遺伝子(GenBan
    k:アクセッションナンバーAYO27438)の発現産物であ
    ることを特徴とする請求項25記載のリンパ球遊走制御
    用タンパク質。 【請求項27】 請求項24〜26のいずれか記載のタ
    ンパク質をリンパ球遊走制御用として使用する方法。 【請求項28】 Racを活性化して細胞骨格の再構築
    を促進するリンパ球遊走制御用タンパク質をコードする
    DNA。 【請求項29】 DOCK2遺伝子及び変異DOCK2
    遺伝子であることを特徴とする請求項28記載のリンパ
    球遊走制御用タンパク質をコードするDNA。 【請求項30】 DOCK2遺伝子が、Hch遺伝子
    (GenBank:アクセッションナンバーAYO27438)である
    ことを特徴とする請求項29記載のリンパ球遊走制御用
    タンパク質をコードするDNA。 【請求項31】 請求項28〜30のいずれか記載のD
    NAをリンパ球遊走制御用タンパク質を発現させるため
    に使用する方法。
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