JP4109104B2 - Il−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、トランスジェニックマウスまたはその一部を用いる、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
慢性関節リウマチ(RA)は、多発性関節炎を主病変とする慢性炎症性疾患であり、有病率の高い膠原病である(世界人口の約1%)。原因は不明で、遺伝学的素因に感染症などの環境因子が加わって発症すると考えられている。発症とHLA DR4との相関や、滑膜組織におけるT細胞の存在から、病態におけるT細胞異常の関与が示唆されている。また、B細胞の多クローン性活性化による高免疫グロブリン血症や自己抗体の出現といった免疫異常が認められる。これまで、関節炎を伴う自己免疫疾患マウスや誘発関節炎モデルマウスが病態の解析に利用され、近年、関節炎を発症するトランスジェニックマウスや自然発症マウスが報告されている。これまでに報告されている主な関節炎モデルマウスには、例えば以下のものがある。
1.抗原感作などによる誘発関節炎モデルマウス
関節内自己抗原を強力なアジュバントで免疫したり、関節自己抗原と交差し得る微生物抗原を接種して関節炎を誘発する。感作後短期間で発症するところは、RAと異なる。使用される微生物抗原は、疫学上ヒトRAとは無関係である。
(1)II型コラーゲン(IIC)誘発関節炎マウス(Nature,666−668,1980.J.S.Courtenay et al.)
作製方法:DBA/1JマウスにウシIICと完全フロイントアジュバントで作製したエマルジョンを免疫する。3週後にウシIICと不完全フロイントアジュバントで追加免疫するとその1〜2週後に関節炎を発症する。
特徴:ラットのアジュバント関節炎(ヒトのReiter症候群に近い)と異なり、皮膚粘膜と臓器症状を欠く点でよりRAに近いモデルと考えられ、組織所見はヒトRAと酷似している。細胞性免疫と体液性免疫の両方が関与し、抗コラーゲンモノクローナル抗体を用いて誘発することも可能である。IL−6が増悪因子である(J.Exp.Med.187,461−468,1998,Arthritis Rheumat.42,1635−1643,1999)。このモデルマウスは、種々のノックアウトマウスを作製して関節炎を増悪あるいは寛解させる遺伝子産物を同定するのに有用なモデルマウスである。
問題点:非生理的な免疫操作が必要である。ヒトRAのような寛解増悪傾向が認められない。リウマチ因子(RF)が産生されない。
(2)抗原誘発関節炎マウス(Arthritis Rheum.20,841.850,1977)
作製方法:マウスをメチル化ウシ血清アルブミンなどの抗原で感作したのちに、関節内に抗原を再投与することによって関節炎を誘発する。
特徴:IL−6が増悪因子である(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,8222−8226,1998)。C57BL/6、Balb/cマウスが用いられる。
(3)CpG誘発関節炎マウス(Nature Medicine,5,702−705,1999,Arthritis Rheum.43,356−364,2000)
作製方法:免疫刺激作用を持つ細菌DNA、CpGをマウスの関節内に注入することにより関節炎を誘発する。
特徴:マクロファージが関節炎に関与している。関節局所におけるTNFα、IL−12、IL−1β、MCP−1、RANTESの産生、血中IgGとIL−6の産生亢進を伴う。C57BL/6、Balb/c、C3H/HeNマウスなどにおいて関節炎を誘発することが可能である。
2.関節炎自然発症モデルマウス
(1)MRL−lpr/lprおよびgldマウス
特徴:T細胞異常増殖、SLE様の病変、関節炎とRFの産生はヒトRAと似ている。主たる異常は、Fas、Fasリガンドによることが明らかにされている。
問題点:遺伝的背景の影響も関与しており(C57BL/6、C3H、AKRなどでは発症しない)、FAS/FASリガンドの異常だけで関節炎が発症するのではない。T細胞の異常増殖により約6ヶ月齢で死ぬため、長期経過の観察・解析が困難である。
(2)SKGマウス(参考;Molecular Medicine,vol 34,臨時増刊号 免疫 1997−1998,p214−221)
特徴:関節炎はMRL−lpr/lprマウスより著明である。T細胞の異常増殖はない。高免疫グロブリン血症を呈し、抗IIC抗体、IgMクラスのRFなどの自己抗体を産生する。発症マウスのT細胞を正常マウスに移入すると関節炎を発症することから、T細胞異常が主な原因と考えられている。このSKGマウスは、Balb/cマウス由来である。
問題点:発症の原因が不明である。
3.遺伝子操作モデルマウス
遺伝子操作(遺伝子導入、ノックアウト、ノックイン)によって関節炎を発症することから、発症の原因が明らかである。
(1)TNFαトランスジェニックマウス(EMBO J.10,4025,1991)
特徴:サイトカイン過剰産生による関節炎モデルマウスである。抗TNF抗体で関節炎が軽快することが示された。DBA/1の遺伝的背景では、関節炎はより重症である(J.Immunol.159,2867−2876,1997)。滑膜細胞は、IL−1βとIL−6を産生する。滑膜の細胞は、主に好中球、その他線維芽細胞、内皮細胞であり、リンパ球の関与は少ないと考えられている。
(2)HTLV−1tax トランスジェニックマウス(Science,253,1026−1028,1991,J.Immunol,155,1588−1598,1995,J.Immunol,161,6592−6598,1998)
特徴:ヒトT細胞白血病細胞ウイルス1型tax遺伝子の過剰発現により、TNF、IL−1、IL−6などのサイトカインの産生が亢進する。高免疫グロブリン血症を呈し、RF、抗IIC、抗DNA抗体を産生する。関節炎の発症はH−2ハプロタイプと関係ない。Balb/c、C3H/HeN、C57BL/6の順に発症率が低下する。
(3)IL−1受容体アンタゴニストノックアウトマウス:(J.Exp.Med.191,313−320,2000)
特徴:Balb/cの遺伝的背景で関節炎を発症する。C57BL/6では発症率が低い。サイトカインシグナルを抑制性に制御する分子の欠損により、関節炎が発症する。関節局所でのIL−6、IL−1βの産生が亢進する。高免疫グロブリン血症を呈し、RF、抗IIC、抗DNA抗体を産生する。
(4)T細胞抗原受容体トランスジェニックマウス(Cell,87,811−822,1996,Immunity 10,451−461,1999,Science,286,1732−1735,1999)
特徴:I−Ak拘束性にウシ膵臓リボヌクレアーゼペプチドR41−61を認識するT細胞抗原受容体(α、β)のトランスジェニックマウスをNODマウスと交配することによって関節炎が発症する。関節腔内に好中球浸潤がみられる。高免疫グロブリン血症、抗DNA抗体が観察されるが、RFは認められない。発症マウスの血清中の抗体を移入することによって健常マウスに関節炎を発症させることが可能で、この抗体と発症マウスのT細胞によって認識される抗原が、グルコースー6ーリン酸イソメラーゼ(GPI)という普遍的な抗原であることが明らかにされた。リボヌクレアーゼに特異的なT細胞が、NODマウス固有のI−Ag7に結合したGPIを認識して活性化され、関節に特異的な炎症反応を惹起する機序に興味が持たれている。
上述したこれらのモデルマウスは、ヒトRAの病因が多くの因子からなることを反映するかのように、それぞれ異なった機序により関節炎を発症している。これらモデルマウスにおいて発症する病態はいずれも、ヒトRAの病態と完全に一致するものではないが、RAの発症に複数の因子が関与していることを考慮すると、新しい関節炎モデルマウスの出現がRAの病態のある側面を解析することに役立つことは明らかである。
IL−6が関節炎の病態に関与していることは、臨床的知見のみならず、上記のモデルマウスにおいても示されている。しかしながら、これまでに報告されたIL−6関連遺伝子操作マウスにおいて実際に関節炎を発症した例はない。また、遺伝子操作によりサイトカインの産生やその作用を増強することによって発症するモデルマウスも多数作製されているが、これらのモデルマウスには、T細胞の機能異常を解析するのに適したモデルが少ない。前述のT細胞抗原受容体トランスジェニックマウスでは、T細胞レパートリーの中から、どのようにして自己反応性T細胞クローンが選別され自己寛容が破綻するのかは分からない。SKGマウスではT細胞選択などの異常が関与する可能性があるが、自然発症のため病因の追及は困難である。
gp130は、IL−6ファミリーサイトカインに共通の受容体サブユニットである約130KDaの膜タンパク質である。gp130は、IL−6のシグナル伝達だけでなく、他のIL−6ファミリーサイトカインである白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor;LIF)、毛様体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor;CNTF)、オンコスタチンM(oncostatin M;OSM)、インターロイキン−11(IL−11)、およびカーディオトロフィン−1(cardiotrophin−1;CT−1)のシグナル伝達にも関与する(Hirano,T.et al.(1997)Cytokine Growth Factor Rev.8,241−52)。
IL−6ファミリーのサイトカインが受容体に結合すると、gp130タンパク質のホモダイマー形成またはgp130タンパク質と他のgp130関連因子とのヘテロダイマー形成が誘導される。gp130タンパク質のチロシン残基がリン酸化されると、そのリン酸化されたチロシン残基にSHP2(SH2ドメイン含有プロテイン・チロシン・ホスファターゼ2)が会合し、さらにこのSHP2がリン酸化されてシグナルが下流に伝達される。このSHP2のリン酸化には、ヒトgp130の759番目のチロシン残基のリン酸化が必須である(Hirano,T.et al.(1997)Cytokine Growth Factor Rev.8,241−52)。さらに、このヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に、サイトカインシグナルをフィードバック制御するSOCS−3(suppuressor of cytokine signaling−3)と呼ばれる分子が結合することが最近報告された(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,6493−8)。
ヒトgp130タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており、ヒトgp130タンパク質をコードするcDNAも報告されている(Hibi,M et al.,(1990)Cell 63,1149−57)。また、マウスgp130タンパク質のアミノ酸配列も既に知られており、マウスgp130タンパク質をコードするcDNAも報告されている(Saito et al.,(1992)J.Immunol.148,4066−71)。
発明の開示
本発明は、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質をスクリーニングするための、新しい病態モデルを用いる方法を提供する。
本発明は、SHP2(SH2ドメイン含有プロテイン・チロシン・ホスファターゼ2)を介するgp130依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されたトランスジェニックマウスが、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常の結果として、自己免疫疾患、関節炎、慢性関節リウマチなどに特徴的な病態を示すという発見に基づいている。
即ち、本発明は、
1)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
2)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、自己免疫疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
3)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、関節炎を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
4)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、慢性関節リウマチを予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
5)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、抗炎症薬のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
6)前記gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、SHP2を介するgp130依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されている、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
7)前記gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、gp130依存性シグナル伝達経路のSOCS−3による負の制御が損なわれている、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
8)前記gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換または欠失を含んでいる、上記(1)〜(7)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
9)前記gp130変異体における、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換が、gp130遺伝子の点変異によるものである上記(8)に記載のスクリーニング方法、および
10)前記点変異によって、チロシンに代えてフェニルアラニンがコードされる、上記(9)に記載のスクリーニング方法
に関する。
本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症する疾患は、SHP2を介するgp130依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されているということだけでなく、SOCS−3の結合によるサイトカインシグナルのフィードバック制御が作動しないということにも起因している可能性が考えられる。また、ヒトgp130の759番目のチロシン残基(またはこれに対応するチロシン残基)を必要とする未知のさらなるシグナル伝達分子も、本発明のトランスジェニックマウスにおける疾患の発症に関与しているかもしれない。本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症する疾患は、これら可能性のあるシグナル伝達分子のうちのいずれか1つまたは任意の複数のシグナル伝達分子が作動しない、ということに起因していると考えられる。
これまで報告されたモデルマウスにおいてIL−6が関節炎の病態に関与していることが示されているにもかかわらず、実際に関節炎を発症した例がないことを考えると、IL−6ファミリーサイトカインに共通の受容体サブユニットであるgp130の遺伝子の点変異によって関節炎が発症したという本発明者らの知見は、貴重な情報をもたらしたといえる。さらに、サイトカイン受容体は、複数の、ときには拮抗するようなシグナルをも同時に伝達しているという本発明者らのこれまでの研究結果に基づけば、本発明のトランスジェニックマウスは、その複数のシグナルのバランスが崩れるだけで病気になるということを示すユニークなモデルマウスといえる。
また、本発明のトランスジェニックマウスは点変異でも発症するということから、実際のRA類縁疾患症例の中に同様の機序で発症したものが存在する可能性が極めて高いといえる。さらに、リンパ球のないRAG2ノックアウトマウスに、本発明のトランスジェニックマウスの脾臓細胞を移入することによって関節炎を誘発することができるということ、そしてこのRAG2ノックアウトマウスにおいて、活性化CD4+T細胞の生存・増殖が認められたことから、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症した関節炎は、T細胞を中心とする免疫異常による可能性が高いといえる。事実、本発明のトランスジェニックマウスの胸腺において、CD4およびCD8を共に発現しているT細胞(CD4/CD8ダブルポジティブT細胞)が減少し、CD4を単独で発現しているT細胞(CD4シングルポジティブT細胞)が増えること、そして胸腺や末梢リンパ節に活性化抗原を表面発現するCD4+T細胞が増加してくることからその可能性が示唆される。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において用いられる「ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基」とは、ヒトgp130タンパク質において759番目に位置するチロシン残基に対応する、本発明トランスジェニックマウスのgp130タンパク質におけるチロシン残基を意味する。「ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む領域」とは、前記ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む、本発明トランスジェニックマウスのgp130タンパク質におけるアミノ酸残基の領域を意味する。本発明のトランスジェニックマウスが発現するgp130変異体は、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換または欠失している、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1もしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる。
本発明のスクリーニング方法に使用するトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、SHP2およびSOCS−3の結合、並びにヒトgp130の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を必要とする他の任意の未知のシグナル伝達分子の機能を阻害するいかなる変異も有し得る。したがって、本発明のスクリーニング方法に使用するトランスジェニックマウスにおいては、SHP2を介するgp130依存性シグナル伝達経路は選択的に破壊され、SOCS−3の結合によるサイトカインシグナルのフィードバック制御は作動せず、ヒトgp130の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を必要とする任意の未知のシグナル伝達分子の機能は阻害される。
本発明では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む領域において、1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含んでいる。ヒトgp130の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基自身は、該チロシン残基を必要とするシグナル伝達分子の機能を阻害する限り、変異していても変異していなくてもよい。
本発明の好ましい態様では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換または欠失している。
本発明のさらに好ましい態様では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、gp130遺伝子の点変異によって、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換されている。「点変異」とは、DNA上の1つの塩基対が他の異なる塩基対に置き換わった変異を意味する。この点変異は、マウスのゲノムgp130遺伝子に直接導入したものでも、このような点変異を含む変異gp130遺伝子断片とマウスのゲノムgp130遺伝子との相同的組換えにより導入されたものでもよい。本発明の方法における特に好ましい点変異は、例えば、フェニルアラニンをコードするような点変異である。本明細書においては、この点変異を有する変異gp130遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスを「gp130F759マウス」と呼び、この変異gp130遺伝子のホモ接合体について言及する場合は特に「gp130F759/F759マウス」と呼ぶ。また、野生型gp130遺伝子とこの変異gp130遺伝子とのヘテロ接合体を「gp130WT/F759マウス」と呼び、野生型gp130遺伝子のホモ接合体を「gp130WT/WTマウス」と呼ぶ。
本発明のスクリーニング方法において使用するトランスジェニックマウスは、マウスのゲノムgp130遺伝子に上記の変異を直接導入するか、または上記の変異gp130遺伝子の断片とマウスのゲノムgp130遺伝子との相同的組換えにより、変異gp130遺伝子を得た後、この変異gp130遺伝子を、当分野で知られた方法を用いてマウスのES細胞に導入し、gp130ゲノムに変異を有するES細胞を樹立する。その後、他のマウスより採取した胚盤胞にこのES細胞を注入し、胚盤胞を偽妊娠マウスの子宮に移植し、この偽妊娠マウスの出仔によって得られたキメラマウスを野生型マウスと交配させて第1世代のヘテロマウスを得る。そして、この第1世代のヘテロマウスどうしを交配させ、第2世代のホモ接合型マウスを得る。本発明のスクリーニング方法において使用するトランスジェニックマウスの作製は、例えば、Immunity,Vol.12,95−105,January,2000に記載されている方法により行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法に用いることができる試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、血清などが挙げられ、これら試験物質は新規の物質でも、公知の物質でもよい。
本発明のスクリーニング方法における試験物質の投与方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、皮内注射、筋肉注射などが挙げられる。当業者は、試験物質の投与量を、投与経路、試験物質の性質などより適宜選択することができる。試験物質の投与は、予防薬のスクリーニングについては免疫異常が始まる時期より前あるいは疾患の発症時期より前に、治療薬のスクリーニングについては肉眼的に発症が認められてから開始すればよい。
本発明のスクリーニング方法では、野生型マウスと本発明のトランスジェニックマウスの雄あるいは雌をそれぞれ群に分け、試験物質の投与あり、なしで肉眼的にマウスを観察し、症状の重症度についてスコア化する。また、マウスから血液を採取して血球数計測や血清生化学的検査を行ない、尿検査なども行なう。一定期間の観察後、X線画像解析、病理学的解析、免疫学的解析を行う。試験期間中に原因不明の死亡マウスがでれば、病理解剖を行い原因を明らかにする。
本発明のトランスジェニックマウスから組織または細胞を単離し、その組織または細胞を培養後にまたは直接使用することによって、試験物質の予防効果および治療効果、遺伝子改変による細胞表現型の変化、例えば細胞増殖能やサイトカインの産生能等の変化について、試験管内で分析することもできる。
さらに、本発明のトランスジェニックマウスは、交配を行なって種々の遺伝的背景を有するマウスを作製し、発症における影響を調べたり、種々の誘発モデルを試みることにより、治療薬や予防薬のスクリーニングをより短期間で行える実験系をつくりあげることも可能である。
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであって、本発明の範囲を制約するものと解釈すべきではない。
実施例
gp130 F759/F759 マウスの作製
Immunity,Vol.12,95−105,January,2000に記載されている方法に従い、759番目のチロシンに代えてフェニルアラニンをコードする点変異(TATからTTTの変異)を有するヒトgp130cDNAのEcoRI−XhoI断片(Yamanaka,Y et al.(1996)EMBO J.15,1557−65)(XhoI部位はサブクローニングにより作製)をマウスgp130遺伝子に導入し、マウス−ヒト型キメラgp130構築物を得た。この構築物を含むターゲティングベクターを電気穿孔法によりマウスのES細胞に導入し、gp130ゲノムに変異を有するES細胞を樹立した。C57BL/6系統のマウスより胚盤胞を採取し、マイクロインジェクション法により、遺伝子導入されたES細胞を胚盤胞に注入した。精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス(ICR系統)の子宮に、ES細胞を注入した胚盤胞を移植した。偽妊娠マウスの出仔によって得られたキメラマウスをC57BL/6系統の野生型マウスと交配させ、第1世代のヘテロマウスを得た。この第1世代のヘテロマウスどうしの交配により、第2世代のホモ接合型マウス(gp130F759/F759マウス)を得た。
gp130 F759/F759 マウスの病態解析
自己抗体の産生:
5、9、12ヶ月齢のgp130F759/F759マウスより採血後、血清を分離し、血清中の免疫グロブリン、抗ssDNA(1本鎖DNA)、抗dsDNA(2本鎖DNA)、抗nRNP(リボ核タンパク質)抗体、リウマチ因子などの自己抗体の産生についてELISA法を用いて測定した。gp130F759/F759マウスは、9ヶ月齢以降に抗ssDNA、抗dsDNAなどの自己抗体の産生が認められた。5、9、12ヶ月齢のマウスにおける測定結果を図1に示す。
関節炎の発症:
gp130F759/F759マウスを関節炎の発症について生後20ヶ月齢まで観察した。gp130F759/F759マウスの20%が8〜10ヶ月齢で関節炎を発症し、20ヶ月齢では関節炎の発症率がほぼ100%となった(図2)。図3にgp130F759/F759マウス(9.5ヶ月齢)における関節炎の肉眼所見を示す。gp130F759/F759マウスは、四肢の近位指関節の腫脹、可動域制限に始まり、徐々に関節炎が大関節にも波及し、強直性変化を来した。関節炎を発症したgp130F759/F759マウスを屠殺後、関節、胸腺、脾臓、肝臓あるいはリンパ節を採取し、ホルマリン固定を行った。その後常法にしたがって病理標本を作製した後、ヘマトキシリン−エオジン染色を行い、光学顕微鏡にて病理学的検査を行った。図4〜6に、gp130F759/F759マウスの病理組織所見を示す。gp130F759/F759マウスは、関節腔におけるフィブリン析出、好中球浸潤、滑膜の線維芽細胞増生を伴う関節構造の破壊が著明であった(図4および5)。また、肝臓のグリソン梢の周囲に形質細胞の浸潤が認められ(9.5ヶ月齢:図6右上段)、肝細胞の変性も認められた(15.5ヶ月齢:図6右中段)。さらに、リンパ節における形質細胞の浸潤も認められた(図6右下段)。
リンパ組織における異常(フローサイトメーターによる解析):
リンパ組織(胸腺、リンパ節)から細胞を採取し、細胞表面解析装置を用いて各特異的表面抗原に対する抗体と種々の細胞表面マーカーを解析した。胸腺では、CD4およびCD8を共に発現しているT細胞(CD4/CD8ダブルポジティブT細胞)が減少し(対照83%に対し、gp130F759/F759マウスでは2%に減少:図7上段)、CD4あるいはCD8を単独で発現しているT細胞(CD4シングルポジティブT細胞、CD8シングルポジティブT細胞)が増えていた(対照8%および4%に対し、gp130F759/F759マウスでは31%および14%にそれぞれ増加:図7上段)。さらに、gp130F759/F759マウスの胸腺では、正常の胸腺では認められないB細胞(IgD+IgMlo(低度のIgM発現))が異常に増殖していた(32%に増加:図7下段)。gp130F759/F759マウスのリンパ節では、Gr−1+CD11b+の顆粒球が増加した(6%に増加:図8下段)。gp130F759/F759マウスのリンパ節のCD4シングルポジテイブ細胞についてさらに詳しく調べたところ、活性化していることを示すマーカーCD69あるいはCD25が陽性である細胞が増加していた(図9:上段)。CD62LとCD44の発現を解析した結果から、gp130F759/F759マウスのリンパ節のCD4シングルポジテイブ細胞では、ナイーブT細胞(CD62L+CD44−)の減少(対照58%に対し、gp130F759/F759マウスは3%)、および活性化・メモリーT細胞(CD62L−CD44+)の増加(対照25%に対し、gp130F759/F759マウスは71%)が認められた(図9中段)。リンパ節CD8シングルポジティブ細胞でも、ナイーブT細胞(CD62L+CD44−)の減少が認められた(対照49%に対し、gp130F759/F759マウスは2%:図9下段)。これらの解析結果より、関節炎を発症したgp130F759/F759マウスはリンパ節においてはT細胞が異常に活性化されていることが示された。
試験例1
関節炎薬のスクリーニング試験
モデルマウスとして、gp130F759/F759マウスまたはこのマウスをバッククロスして得られたマウス(gp130F759/F759関連マウス)を用いる。試験物質として、ブシラミン、メトトレキセート等の抗リウマチ剤、ジクロフェナク等の非ステロイド性抗炎症剤あるいはデキサテサゾン等のステロイド剤を投与する。予防薬のスクリーニングについては免疫異常が始まる時期より前あるいは関節炎の発症時期より前に、治療薬のスクリーニングについては肉眼的に関節炎が明らかになってから投与を開始する。以下、試験物質としてメトトレキセートを用いた関節炎薬のスクリーニング試験について詳細に述べるが、他の試験物質のスクリーニング試験についても同様の手順に従って行なう。
メトトレキセートを0.4mg/kg体重の用量で9ヶ月齢より週5日間マウスに経口投与した。野生型マウスまたはgp130F759/F759マウスの雄もしくは雌の各2〜3匹を一群とし、関節炎の予防効果あるいは改善効果について、肉眼で経過を観察した。関節炎の重症度を、手足首の可動域制限、指趾関節の腫脹・発赤、強直の有無などについてスコア化し、2週間以上継続して関節炎の症状が認められたマウスを発症とし、経時的に発症率と重症度を評価した。
その結果、対照群(メトトレキセート投与なし)では40週齢(約10ヶ月齢)より関節炎の発症が認められ、46週齢では全例において関節炎が発症した。関節炎を発症したマウスの関節炎スコアをさらに経時的に評価したところ、対照群では48週齢(12ヶ月齢)で4.33±1.86、53週齢で4.67±0.67であったのに対して、メトトレキセート(0.4mg/kg)を投与した群では48週齢(12ヶ月齢)で1.33±0.33、53週齢で0.67±0.33を示し、メトトレキセートは本発明のモデルマウスにおける関節炎を抑制することが示された。
試験例2
抗炎症薬のスクリーニング試験
gp130F759/F759マウスまたはその関連マウスを用いて、air pouchモデルを作製し、抗炎症作用を有する物質のスクリーニングを行う。常法に従って作製したair pouchモデルに、炎症の惹起前あるいは惹起後、抗炎症作用を有する候補物質を投与し、air pouch中の好中球およびマクロファージの浸潤について調べる。さらに、他の炎症惹起物質等によるgp130F759/F759マウスの表現型の変化について、試験例1と同様の方法を用いて解析を行なう。
試験例3
抗感染症薬のスクリーニング試験
gp130F759/F759マウスは、リステリアに対する感受性が亢進しており感染症により死亡することが多いため、感染症に対して治療効果を有する物質のスクリーニングにも応用することができる。たとえば、当該マウスにリステリアを感染させた後、試験物質を投与して、生存率を指標として治療効果を調べる。
試験例4
IL−6ファミリーサイトカインシグナル制御薬のスクリーニング試験
gp130F759/F759マウスは、IL−6によるシグナル伝達に関与するSTAT3の過剰発現により疾患を引き起こすことが考えれられる。従って、gp130F759/F759マウスを用いて、STAT3が関与するシグナル伝達の異常により発症する疾患を予防または治療する物質をスクリーニングすることが可能である。また、このマウスの組織、細胞、遺伝子並びにタンパク質を用いて種々のシグナル制御薬のスクリーニングが可能である。
【図面の簡単な説明】
図1は、12ヶ月齢マウスにおける、抗ssDNA抗体および抗dsDNA抗体の抗体価を示したグラフである。白丸印:gp130WT/WTマウス(n=6)、三角印:gp130WT/F759マウス(n=5)、黒丸印:gp130F759/F759マウス(n=11)。平均値を横棒で示した。
図2は、マウスにおける関節炎の発症率を示す棒グラフである。
図3は、gp130F759/759マウスにおける関節炎の肉眼所見である(9.5ヶ月齢のマウス足関節の写真の模写図)。左側:対照マウス(gp130WT/WTマウス)の足関節。右側:gp130F759/F759マウスの足関節。
図4は、gp130F759/F759マウスの足関節の病理組織写真の模写図である(15ヶ月齢:滑膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色(×40))。左側:対照マウス(gp130WT/WTマウス)。右側:gp130F759/F759マウス。矢頭は線維芽細胞の増生を示し、矢印は好中球の浸潤を示す。
図5は、gp130F759/F759マウスの膝関節の病理組織写真の模写図である(15ヶ月齢:滑膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色(×100))。左側:対照マウス(gp130WT/WTマウス)。右側:gp130F759/F759マウス。JS:関節腔。矢頭は、フィブリン析出を伴う好中球浸潤を示し、矢印は、好中球浸潤と線維芽細胞の増生を伴う滑膜の肥厚を示す。
図6は、gp130F759/F759マウスの肝臓およびリンパ節の病理組織写真の模写図である(ヘマトキシリン・エオジン染色(×100))。左上段:対照マウス(gp130WT/F759マウス)の肝臓(9.5ヶ月齢)。右上段:gp130F759/F759マウスの肝臓(9.5ヶ月齢)。右中段:gp130F759/F759マウスの肝臓(15.5ヶ月齢)。矢印は肝細胞の変性を示す。右下段:gp130F759/F759マウスのリンパ節(15.5ヶ月齢)
図7は、gp130F759/F759マウスの胸腺のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスの胸腺細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。パネルの縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原(縦軸および横軸方向)に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段:CD4およびCD8発現の解析結果。下段:IgDおよびIgM発現の解析結果。左側(WILD/F759)は対照マウス(gp130WT/F759マウス)、右側(F759/F759)はgp130F759/F759マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた、あるいは十字線で仕切られた区画に属する細胞集団の頻度(%)を示したものである。
図8は、gp130F759/F759マウスのリンパ節のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスのリンパ節細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。パネルの縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原(縦軸および横軸方向)に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段:CD8およびCD4発現の解析結果。中段:IgDおよびIgM発現の解析結果。下段:Gr−1およびCD11b発現の解析結果。左側(WILD/F759)は対照マウス(gp130WT/F759マウス)、右側(F759/F759)はgp130F759/F759マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた区画に属する細胞集団の頻度(%)を示したものである。
図9は、gp130F759/F759マウスのリンパ節のCD4およびCD8シングルポジティブ細胞のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスのリンパ節のCD4シングルポジティブ細胞またはCD8シングルポジティブ細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原(縦軸および横軸方向)に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段:CD4シングルポジティブ細胞におけるCD69およびCD25発現の解析結果。中段:CD4シングルポジティブ細胞におけるCD62LおよびCD44発現の解析結果。下段CD8シングルポジティブ細胞におけるCD62LおよびCD44発現の解析結果。左側(WILD/F759)は対照マウス(gp130WT/F759マウス)、右側(F759/F759)はgp130F759/F759マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた、あるいは十字線で仕切られた区画に属する細胞集団の頻度(%)を示したものである。
本発明は、トランスジェニックマウスまたはその一部を用いる、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
慢性関節リウマチ(RA)は、多発性関節炎を主病変とする慢性炎症性疾患であり、有病率の高い膠原病である(世界人口の約1%)。原因は不明で、遺伝学的素因に感染症などの環境因子が加わって発症すると考えられている。発症とHLA DR4との相関や、滑膜組織におけるT細胞の存在から、病態におけるT細胞異常の関与が示唆されている。また、B細胞の多クローン性活性化による高免疫グロブリン血症や自己抗体の出現といった免疫異常が認められる。これまで、関節炎を伴う自己免疫疾患マウスや誘発関節炎モデルマウスが病態の解析に利用され、近年、関節炎を発症するトランスジェニックマウスや自然発症マウスが報告されている。これまでに報告されている主な関節炎モデルマウスには、例えば以下のものがある。
1.抗原感作などによる誘発関節炎モデルマウス
関節内自己抗原を強力なアジュバントで免疫したり、関節自己抗原と交差し得る微生物抗原を接種して関節炎を誘発する。感作後短期間で発症するところは、RAと異なる。使用される微生物抗原は、疫学上ヒトRAとは無関係である。
(1)II型コラーゲン(IIC)誘発関節炎マウス(Nature,666−668,1980.J.S.Courtenay et al.)
作製方法:DBA/1JマウスにウシIICと完全フロイントアジュバントで作製したエマルジョンを免疫する。3週後にウシIICと不完全フロイントアジュバントで追加免疫するとその1〜2週後に関節炎を発症する。
特徴:ラットのアジュバント関節炎(ヒトのReiter症候群に近い)と異なり、皮膚粘膜と臓器症状を欠く点でよりRAに近いモデルと考えられ、組織所見はヒトRAと酷似している。細胞性免疫と体液性免疫の両方が関与し、抗コラーゲンモノクローナル抗体を用いて誘発することも可能である。IL−6が増悪因子である(J.Exp.Med.187,461−468,1998,Arthritis Rheumat.42,1635−1643,1999)。このモデルマウスは、種々のノックアウトマウスを作製して関節炎を増悪あるいは寛解させる遺伝子産物を同定するのに有用なモデルマウスである。
問題点:非生理的な免疫操作が必要である。ヒトRAのような寛解増悪傾向が認められない。リウマチ因子(RF)が産生されない。
(2)抗原誘発関節炎マウス(Arthritis Rheum.20,841.850,1977)
作製方法:マウスをメチル化ウシ血清アルブミンなどの抗原で感作したのちに、関節内に抗原を再投与することによって関節炎を誘発する。
特徴:IL−6が増悪因子である(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,8222−8226,1998)。C57BL/6、Balb/cマウスが用いられる。
(3)CpG誘発関節炎マウス(Nature Medicine,5,702−705,1999,Arthritis Rheum.43,356−364,2000)
作製方法:免疫刺激作用を持つ細菌DNA、CpGをマウスの関節内に注入することにより関節炎を誘発する。
特徴:マクロファージが関節炎に関与している。関節局所におけるTNFα、IL−12、IL−1β、MCP−1、RANTESの産生、血中IgGとIL−6の産生亢進を伴う。C57BL/6、Balb/c、C3H/HeNマウスなどにおいて関節炎を誘発することが可能である。
2.関節炎自然発症モデルマウス
(1)MRL−lpr/lprおよびgldマウス
特徴:T細胞異常増殖、SLE様の病変、関節炎とRFの産生はヒトRAと似ている。主たる異常は、Fas、Fasリガンドによることが明らかにされている。
問題点:遺伝的背景の影響も関与しており(C57BL/6、C3H、AKRなどでは発症しない)、FAS/FASリガンドの異常だけで関節炎が発症するのではない。T細胞の異常増殖により約6ヶ月齢で死ぬため、長期経過の観察・解析が困難である。
(2)SKGマウス(参考;Molecular Medicine,vol 34,臨時増刊号 免疫 1997−1998,p214−221)
特徴:関節炎はMRL−lpr/lprマウスより著明である。T細胞の異常増殖はない。高免疫グロブリン血症を呈し、抗IIC抗体、IgMクラスのRFなどの自己抗体を産生する。発症マウスのT細胞を正常マウスに移入すると関節炎を発症することから、T細胞異常が主な原因と考えられている。このSKGマウスは、Balb/cマウス由来である。
問題点:発症の原因が不明である。
3.遺伝子操作モデルマウス
遺伝子操作(遺伝子導入、ノックアウト、ノックイン)によって関節炎を発症することから、発症の原因が明らかである。
(1)TNFαトランスジェニックマウス(EMBO J.10,4025,1991)
特徴:サイトカイン過剰産生による関節炎モデルマウスである。抗TNF抗体で関節炎が軽快することが示された。DBA/1の遺伝的背景では、関節炎はより重症である(J.Immunol.159,2867−2876,1997)。滑膜細胞は、IL−1βとIL−6を産生する。滑膜の細胞は、主に好中球、その他線維芽細胞、内皮細胞であり、リンパ球の関与は少ないと考えられている。
(2)HTLV−1tax トランスジェニックマウス(Science,253,1026−1028,1991,J.Immunol,155,1588−1598,1995,J.Immunol,161,6592−6598,1998)
特徴:ヒトT細胞白血病細胞ウイルス1型tax遺伝子の過剰発現により、TNF、IL−1、IL−6などのサイトカインの産生が亢進する。高免疫グロブリン血症を呈し、RF、抗IIC、抗DNA抗体を産生する。関節炎の発症はH−2ハプロタイプと関係ない。Balb/c、C3H/HeN、C57BL/6の順に発症率が低下する。
(3)IL−1受容体アンタゴニストノックアウトマウス:(J.Exp.Med.191,313−320,2000)
特徴:Balb/cの遺伝的背景で関節炎を発症する。C57BL/6では発症率が低い。サイトカインシグナルを抑制性に制御する分子の欠損により、関節炎が発症する。関節局所でのIL−6、IL−1βの産生が亢進する。高免疫グロブリン血症を呈し、RF、抗IIC、抗DNA抗体を産生する。
(4)T細胞抗原受容体トランスジェニックマウス(Cell,87,811−822,1996,Immunity 10,451−461,1999,Science,286,1732−1735,1999)
特徴:I−Ak拘束性にウシ膵臓リボヌクレアーゼペプチドR41−61を認識するT細胞抗原受容体(α、β)のトランスジェニックマウスをNODマウスと交配することによって関節炎が発症する。関節腔内に好中球浸潤がみられる。高免疫グロブリン血症、抗DNA抗体が観察されるが、RFは認められない。発症マウスの血清中の抗体を移入することによって健常マウスに関節炎を発症させることが可能で、この抗体と発症マウスのT細胞によって認識される抗原が、グルコースー6ーリン酸イソメラーゼ(GPI)という普遍的な抗原であることが明らかにされた。リボヌクレアーゼに特異的なT細胞が、NODマウス固有のI−Ag7に結合したGPIを認識して活性化され、関節に特異的な炎症反応を惹起する機序に興味が持たれている。
上述したこれらのモデルマウスは、ヒトRAの病因が多くの因子からなることを反映するかのように、それぞれ異なった機序により関節炎を発症している。これらモデルマウスにおいて発症する病態はいずれも、ヒトRAの病態と完全に一致するものではないが、RAの発症に複数の因子が関与していることを考慮すると、新しい関節炎モデルマウスの出現がRAの病態のある側面を解析することに役立つことは明らかである。
IL−6が関節炎の病態に関与していることは、臨床的知見のみならず、上記のモデルマウスにおいても示されている。しかしながら、これまでに報告されたIL−6関連遺伝子操作マウスにおいて実際に関節炎を発症した例はない。また、遺伝子操作によりサイトカインの産生やその作用を増強することによって発症するモデルマウスも多数作製されているが、これらのモデルマウスには、T細胞の機能異常を解析するのに適したモデルが少ない。前述のT細胞抗原受容体トランスジェニックマウスでは、T細胞レパートリーの中から、どのようにして自己反応性T細胞クローンが選別され自己寛容が破綻するのかは分からない。SKGマウスではT細胞選択などの異常が関与する可能性があるが、自然発症のため病因の追及は困難である。
gp130は、IL−6ファミリーサイトカインに共通の受容体サブユニットである約130KDaの膜タンパク質である。gp130は、IL−6のシグナル伝達だけでなく、他のIL−6ファミリーサイトカインである白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor;LIF)、毛様体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor;CNTF)、オンコスタチンM(oncostatin M;OSM)、インターロイキン−11(IL−11)、およびカーディオトロフィン−1(cardiotrophin−1;CT−1)のシグナル伝達にも関与する(Hirano,T.et al.(1997)Cytokine Growth Factor Rev.8,241−52)。
IL−6ファミリーのサイトカインが受容体に結合すると、gp130タンパク質のホモダイマー形成またはgp130タンパク質と他のgp130関連因子とのヘテロダイマー形成が誘導される。gp130タンパク質のチロシン残基がリン酸化されると、そのリン酸化されたチロシン残基にSHP2(SH2ドメイン含有プロテイン・チロシン・ホスファターゼ2)が会合し、さらにこのSHP2がリン酸化されてシグナルが下流に伝達される。このSHP2のリン酸化には、ヒトgp130の759番目のチロシン残基のリン酸化が必須である(Hirano,T.et al.(1997)Cytokine Growth Factor Rev.8,241−52)。さらに、このヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に、サイトカインシグナルをフィードバック制御するSOCS−3(suppuressor of cytokine signaling−3)と呼ばれる分子が結合することが最近報告された(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,6493−8)。
ヒトgp130タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており、ヒトgp130タンパク質をコードするcDNAも報告されている(Hibi,M et al.,(1990)Cell 63,1149−57)。また、マウスgp130タンパク質のアミノ酸配列も既に知られており、マウスgp130タンパク質をコードするcDNAも報告されている(Saito et al.,(1992)J.Immunol.148,4066−71)。
発明の開示
本発明は、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質をスクリーニングするための、新しい病態モデルを用いる方法を提供する。
本発明は、SHP2(SH2ドメイン含有プロテイン・チロシン・ホスファターゼ2)を介するgp130依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されたトランスジェニックマウスが、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常の結果として、自己免疫疾患、関節炎、慢性関節リウマチなどに特徴的な病態を示すという発見に基づいている。
即ち、本発明は、
1)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
2)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、自己免疫疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
3)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、関節炎を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
4)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、慢性関節リウマチを予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
5)gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、抗炎症薬のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法、
6)前記gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、SHP2を介するgp130依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されている、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
7)前記gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、gp130依存性シグナル伝達経路のSOCS−3による負の制御が損なわれている、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
8)前記gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換または欠失を含んでいる、上記(1)〜(7)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
9)前記gp130変異体における、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換が、gp130遺伝子の点変異によるものである上記(8)に記載のスクリーニング方法、および
10)前記点変異によって、チロシンに代えてフェニルアラニンがコードされる、上記(9)に記載のスクリーニング方法
に関する。
本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症する疾患は、SHP2を介するgp130依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されているということだけでなく、SOCS−3の結合によるサイトカインシグナルのフィードバック制御が作動しないということにも起因している可能性が考えられる。また、ヒトgp130の759番目のチロシン残基(またはこれに対応するチロシン残基)を必要とする未知のさらなるシグナル伝達分子も、本発明のトランスジェニックマウスにおける疾患の発症に関与しているかもしれない。本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症する疾患は、これら可能性のあるシグナル伝達分子のうちのいずれか1つまたは任意の複数のシグナル伝達分子が作動しない、ということに起因していると考えられる。
これまで報告されたモデルマウスにおいてIL−6が関節炎の病態に関与していることが示されているにもかかわらず、実際に関節炎を発症した例がないことを考えると、IL−6ファミリーサイトカインに共通の受容体サブユニットであるgp130の遺伝子の点変異によって関節炎が発症したという本発明者らの知見は、貴重な情報をもたらしたといえる。さらに、サイトカイン受容体は、複数の、ときには拮抗するようなシグナルをも同時に伝達しているという本発明者らのこれまでの研究結果に基づけば、本発明のトランスジェニックマウスは、その複数のシグナルのバランスが崩れるだけで病気になるということを示すユニークなモデルマウスといえる。
また、本発明のトランスジェニックマウスは点変異でも発症するということから、実際のRA類縁疾患症例の中に同様の機序で発症したものが存在する可能性が極めて高いといえる。さらに、リンパ球のないRAG2ノックアウトマウスに、本発明のトランスジェニックマウスの脾臓細胞を移入することによって関節炎を誘発することができるということ、そしてこのRAG2ノックアウトマウスにおいて、活性化CD4+T細胞の生存・増殖が認められたことから、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発症した関節炎は、T細胞を中心とする免疫異常による可能性が高いといえる。事実、本発明のトランスジェニックマウスの胸腺において、CD4およびCD8を共に発現しているT細胞(CD4/CD8ダブルポジティブT細胞)が減少し、CD4を単独で発現しているT細胞(CD4シングルポジティブT細胞)が増えること、そして胸腺や末梢リンパ節に活性化抗原を表面発現するCD4+T細胞が増加してくることからその可能性が示唆される。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において用いられる「ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基」とは、ヒトgp130タンパク質において759番目に位置するチロシン残基に対応する、本発明トランスジェニックマウスのgp130タンパク質におけるチロシン残基を意味する。「ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む領域」とは、前記ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む、本発明トランスジェニックマウスのgp130タンパク質におけるアミノ酸残基の領域を意味する。本発明のトランスジェニックマウスが発現するgp130変異体は、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換または欠失している、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1もしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる。
本発明のスクリーニング方法に使用するトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、SHP2およびSOCS−3の結合、並びにヒトgp130の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を必要とする他の任意の未知のシグナル伝達分子の機能を阻害するいかなる変異も有し得る。したがって、本発明のスクリーニング方法に使用するトランスジェニックマウスにおいては、SHP2を介するgp130依存性シグナル伝達経路は選択的に破壊され、SOCS−3の結合によるサイトカインシグナルのフィードバック制御は作動せず、ヒトgp130の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を必要とする任意の未知のシグナル伝達分子の機能は阻害される。
本発明では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基を含む領域において、1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含んでいる。ヒトgp130の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基自身は、該チロシン残基を必要とするシグナル伝達分子の機能を阻害する限り、変異していても変異していなくてもよい。
本発明の好ましい態様では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換または欠失している。
本発明のさらに好ましい態様では、本発明のトランスジェニックマウスにおいて発現するgp130変異体は、gp130遺伝子の点変異によって、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基が置換されている。「点変異」とは、DNA上の1つの塩基対が他の異なる塩基対に置き換わった変異を意味する。この点変異は、マウスのゲノムgp130遺伝子に直接導入したものでも、このような点変異を含む変異gp130遺伝子断片とマウスのゲノムgp130遺伝子との相同的組換えにより導入されたものでもよい。本発明の方法における特に好ましい点変異は、例えば、フェニルアラニンをコードするような点変異である。本明細書においては、この点変異を有する変異gp130遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスを「gp130F759マウス」と呼び、この変異gp130遺伝子のホモ接合体について言及する場合は特に「gp130F759/F759マウス」と呼ぶ。また、野生型gp130遺伝子とこの変異gp130遺伝子とのヘテロ接合体を「gp130WT/F759マウス」と呼び、野生型gp130遺伝子のホモ接合体を「gp130WT/WTマウス」と呼ぶ。
本発明のスクリーニング方法において使用するトランスジェニックマウスは、マウスのゲノムgp130遺伝子に上記の変異を直接導入するか、または上記の変異gp130遺伝子の断片とマウスのゲノムgp130遺伝子との相同的組換えにより、変異gp130遺伝子を得た後、この変異gp130遺伝子を、当分野で知られた方法を用いてマウスのES細胞に導入し、gp130ゲノムに変異を有するES細胞を樹立する。その後、他のマウスより採取した胚盤胞にこのES細胞を注入し、胚盤胞を偽妊娠マウスの子宮に移植し、この偽妊娠マウスの出仔によって得られたキメラマウスを野生型マウスと交配させて第1世代のヘテロマウスを得る。そして、この第1世代のヘテロマウスどうしを交配させ、第2世代のホモ接合型マウスを得る。本発明のスクリーニング方法において使用するトランスジェニックマウスの作製は、例えば、Immunity,Vol.12,95−105,January,2000に記載されている方法により行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法に用いることができる試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、血清などが挙げられ、これら試験物質は新規の物質でも、公知の物質でもよい。
本発明のスクリーニング方法における試験物質の投与方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、皮内注射、筋肉注射などが挙げられる。当業者は、試験物質の投与量を、投与経路、試験物質の性質などより適宜選択することができる。試験物質の投与は、予防薬のスクリーニングについては免疫異常が始まる時期より前あるいは疾患の発症時期より前に、治療薬のスクリーニングについては肉眼的に発症が認められてから開始すればよい。
本発明のスクリーニング方法では、野生型マウスと本発明のトランスジェニックマウスの雄あるいは雌をそれぞれ群に分け、試験物質の投与あり、なしで肉眼的にマウスを観察し、症状の重症度についてスコア化する。また、マウスから血液を採取して血球数計測や血清生化学的検査を行ない、尿検査なども行なう。一定期間の観察後、X線画像解析、病理学的解析、免疫学的解析を行う。試験期間中に原因不明の死亡マウスがでれば、病理解剖を行い原因を明らかにする。
本発明のトランスジェニックマウスから組織または細胞を単離し、その組織または細胞を培養後にまたは直接使用することによって、試験物質の予防効果および治療効果、遺伝子改変による細胞表現型の変化、例えば細胞増殖能やサイトカインの産生能等の変化について、試験管内で分析することもできる。
さらに、本発明のトランスジェニックマウスは、交配を行なって種々の遺伝的背景を有するマウスを作製し、発症における影響を調べたり、種々の誘発モデルを試みることにより、治療薬や予防薬のスクリーニングをより短期間で行える実験系をつくりあげることも可能である。
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであって、本発明の範囲を制約するものと解釈すべきではない。
実施例
gp130 F759/F759 マウスの作製
Immunity,Vol.12,95−105,January,2000に記載されている方法に従い、759番目のチロシンに代えてフェニルアラニンをコードする点変異(TATからTTTの変異)を有するヒトgp130cDNAのEcoRI−XhoI断片(Yamanaka,Y et al.(1996)EMBO J.15,1557−65)(XhoI部位はサブクローニングにより作製)をマウスgp130遺伝子に導入し、マウス−ヒト型キメラgp130構築物を得た。この構築物を含むターゲティングベクターを電気穿孔法によりマウスのES細胞に導入し、gp130ゲノムに変異を有するES細胞を樹立した。C57BL/6系統のマウスより胚盤胞を採取し、マイクロインジェクション法により、遺伝子導入されたES細胞を胚盤胞に注入した。精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス(ICR系統)の子宮に、ES細胞を注入した胚盤胞を移植した。偽妊娠マウスの出仔によって得られたキメラマウスをC57BL/6系統の野生型マウスと交配させ、第1世代のヘテロマウスを得た。この第1世代のヘテロマウスどうしの交配により、第2世代のホモ接合型マウス(gp130F759/F759マウス)を得た。
gp130 F759/F759 マウスの病態解析
自己抗体の産生:
5、9、12ヶ月齢のgp130F759/F759マウスより採血後、血清を分離し、血清中の免疫グロブリン、抗ssDNA(1本鎖DNA)、抗dsDNA(2本鎖DNA)、抗nRNP(リボ核タンパク質)抗体、リウマチ因子などの自己抗体の産生についてELISA法を用いて測定した。gp130F759/F759マウスは、9ヶ月齢以降に抗ssDNA、抗dsDNAなどの自己抗体の産生が認められた。5、9、12ヶ月齢のマウスにおける測定結果を図1に示す。
関節炎の発症:
gp130F759/F759マウスを関節炎の発症について生後20ヶ月齢まで観察した。gp130F759/F759マウスの20%が8〜10ヶ月齢で関節炎を発症し、20ヶ月齢では関節炎の発症率がほぼ100%となった(図2)。図3にgp130F759/F759マウス(9.5ヶ月齢)における関節炎の肉眼所見を示す。gp130F759/F759マウスは、四肢の近位指関節の腫脹、可動域制限に始まり、徐々に関節炎が大関節にも波及し、強直性変化を来した。関節炎を発症したgp130F759/F759マウスを屠殺後、関節、胸腺、脾臓、肝臓あるいはリンパ節を採取し、ホルマリン固定を行った。その後常法にしたがって病理標本を作製した後、ヘマトキシリン−エオジン染色を行い、光学顕微鏡にて病理学的検査を行った。図4〜6に、gp130F759/F759マウスの病理組織所見を示す。gp130F759/F759マウスは、関節腔におけるフィブリン析出、好中球浸潤、滑膜の線維芽細胞増生を伴う関節構造の破壊が著明であった(図4および5)。また、肝臓のグリソン梢の周囲に形質細胞の浸潤が認められ(9.5ヶ月齢:図6右上段)、肝細胞の変性も認められた(15.5ヶ月齢:図6右中段)。さらに、リンパ節における形質細胞の浸潤も認められた(図6右下段)。
リンパ組織における異常(フローサイトメーターによる解析):
リンパ組織(胸腺、リンパ節)から細胞を採取し、細胞表面解析装置を用いて各特異的表面抗原に対する抗体と種々の細胞表面マーカーを解析した。胸腺では、CD4およびCD8を共に発現しているT細胞(CD4/CD8ダブルポジティブT細胞)が減少し(対照83%に対し、gp130F759/F759マウスでは2%に減少:図7上段)、CD4あるいはCD8を単独で発現しているT細胞(CD4シングルポジティブT細胞、CD8シングルポジティブT細胞)が増えていた(対照8%および4%に対し、gp130F759/F759マウスでは31%および14%にそれぞれ増加:図7上段)。さらに、gp130F759/F759マウスの胸腺では、正常の胸腺では認められないB細胞(IgD+IgMlo(低度のIgM発現))が異常に増殖していた(32%に増加:図7下段)。gp130F759/F759マウスのリンパ節では、Gr−1+CD11b+の顆粒球が増加した(6%に増加:図8下段)。gp130F759/F759マウスのリンパ節のCD4シングルポジテイブ細胞についてさらに詳しく調べたところ、活性化していることを示すマーカーCD69あるいはCD25が陽性である細胞が増加していた(図9:上段)。CD62LとCD44の発現を解析した結果から、gp130F759/F759マウスのリンパ節のCD4シングルポジテイブ細胞では、ナイーブT細胞(CD62L+CD44−)の減少(対照58%に対し、gp130F759/F759マウスは3%)、および活性化・メモリーT細胞(CD62L−CD44+)の増加(対照25%に対し、gp130F759/F759マウスは71%)が認められた(図9中段)。リンパ節CD8シングルポジティブ細胞でも、ナイーブT細胞(CD62L+CD44−)の減少が認められた(対照49%に対し、gp130F759/F759マウスは2%:図9下段)。これらの解析結果より、関節炎を発症したgp130F759/F759マウスはリンパ節においてはT細胞が異常に活性化されていることが示された。
試験例1
関節炎薬のスクリーニング試験
モデルマウスとして、gp130F759/F759マウスまたはこのマウスをバッククロスして得られたマウス(gp130F759/F759関連マウス)を用いる。試験物質として、ブシラミン、メトトレキセート等の抗リウマチ剤、ジクロフェナク等の非ステロイド性抗炎症剤あるいはデキサテサゾン等のステロイド剤を投与する。予防薬のスクリーニングについては免疫異常が始まる時期より前あるいは関節炎の発症時期より前に、治療薬のスクリーニングについては肉眼的に関節炎が明らかになってから投与を開始する。以下、試験物質としてメトトレキセートを用いた関節炎薬のスクリーニング試験について詳細に述べるが、他の試験物質のスクリーニング試験についても同様の手順に従って行なう。
メトトレキセートを0.4mg/kg体重の用量で9ヶ月齢より週5日間マウスに経口投与した。野生型マウスまたはgp130F759/F759マウスの雄もしくは雌の各2〜3匹を一群とし、関節炎の予防効果あるいは改善効果について、肉眼で経過を観察した。関節炎の重症度を、手足首の可動域制限、指趾関節の腫脹・発赤、強直の有無などについてスコア化し、2週間以上継続して関節炎の症状が認められたマウスを発症とし、経時的に発症率と重症度を評価した。
その結果、対照群(メトトレキセート投与なし)では40週齢(約10ヶ月齢)より関節炎の発症が認められ、46週齢では全例において関節炎が発症した。関節炎を発症したマウスの関節炎スコアをさらに経時的に評価したところ、対照群では48週齢(12ヶ月齢)で4.33±1.86、53週齢で4.67±0.67であったのに対して、メトトレキセート(0.4mg/kg)を投与した群では48週齢(12ヶ月齢)で1.33±0.33、53週齢で0.67±0.33を示し、メトトレキセートは本発明のモデルマウスにおける関節炎を抑制することが示された。
試験例2
抗炎症薬のスクリーニング試験
gp130F759/F759マウスまたはその関連マウスを用いて、air pouchモデルを作製し、抗炎症作用を有する物質のスクリーニングを行う。常法に従って作製したair pouchモデルに、炎症の惹起前あるいは惹起後、抗炎症作用を有する候補物質を投与し、air pouch中の好中球およびマクロファージの浸潤について調べる。さらに、他の炎症惹起物質等によるgp130F759/F759マウスの表現型の変化について、試験例1と同様の方法を用いて解析を行なう。
試験例3
抗感染症薬のスクリーニング試験
gp130F759/F759マウスは、リステリアに対する感受性が亢進しており感染症により死亡することが多いため、感染症に対して治療効果を有する物質のスクリーニングにも応用することができる。たとえば、当該マウスにリステリアを感染させた後、試験物質を投与して、生存率を指標として治療効果を調べる。
試験例4
IL−6ファミリーサイトカインシグナル制御薬のスクリーニング試験
gp130F759/F759マウスは、IL−6によるシグナル伝達に関与するSTAT3の過剰発現により疾患を引き起こすことが考えれられる。従って、gp130F759/F759マウスを用いて、STAT3が関与するシグナル伝達の異常により発症する疾患を予防または治療する物質をスクリーニングすることが可能である。また、このマウスの組織、細胞、遺伝子並びにタンパク質を用いて種々のシグナル制御薬のスクリーニングが可能である。
【図面の簡単な説明】
図1は、12ヶ月齢マウスにおける、抗ssDNA抗体および抗dsDNA抗体の抗体価を示したグラフである。白丸印:gp130WT/WTマウス(n=6)、三角印:gp130WT/F759マウス(n=5)、黒丸印:gp130F759/F759マウス(n=11)。平均値を横棒で示した。
図2は、マウスにおける関節炎の発症率を示す棒グラフである。
図3は、gp130F759/759マウスにおける関節炎の肉眼所見である(9.5ヶ月齢のマウス足関節の写真の模写図)。左側:対照マウス(gp130WT/WTマウス)の足関節。右側:gp130F759/F759マウスの足関節。
図4は、gp130F759/F759マウスの足関節の病理組織写真の模写図である(15ヶ月齢:滑膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色(×40))。左側:対照マウス(gp130WT/WTマウス)。右側:gp130F759/F759マウス。矢頭は線維芽細胞の増生を示し、矢印は好中球の浸潤を示す。
図5は、gp130F759/F759マウスの膝関節の病理組織写真の模写図である(15ヶ月齢:滑膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色(×100))。左側:対照マウス(gp130WT/WTマウス)。右側:gp130F759/F759マウス。JS:関節腔。矢頭は、フィブリン析出を伴う好中球浸潤を示し、矢印は、好中球浸潤と線維芽細胞の増生を伴う滑膜の肥厚を示す。
図6は、gp130F759/F759マウスの肝臓およびリンパ節の病理組織写真の模写図である(ヘマトキシリン・エオジン染色(×100))。左上段:対照マウス(gp130WT/F759マウス)の肝臓(9.5ヶ月齢)。右上段:gp130F759/F759マウスの肝臓(9.5ヶ月齢)。右中段:gp130F759/F759マウスの肝臓(15.5ヶ月齢)。矢印は肝細胞の変性を示す。右下段:gp130F759/F759マウスのリンパ節(15.5ヶ月齢)
図7は、gp130F759/F759マウスの胸腺のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスの胸腺細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。パネルの縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原(縦軸および横軸方向)に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段:CD4およびCD8発現の解析結果。下段:IgDおよびIgM発現の解析結果。左側(WILD/F759)は対照マウス(gp130WT/F759マウス)、右側(F759/F759)はgp130F759/F759マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた、あるいは十字線で仕切られた区画に属する細胞集団の頻度(%)を示したものである。
図8は、gp130F759/F759マウスのリンパ節のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスのリンパ節細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。パネルの縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原(縦軸および横軸方向)に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段:CD8およびCD4発現の解析結果。中段:IgDおよびIgM発現の解析結果。下段:Gr−1およびCD11b発現の解析結果。左側(WILD/F759)は対照マウス(gp130WT/F759マウス)、右側(F759/F759)はgp130F759/F759マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた区画に属する細胞集団の頻度(%)を示したものである。
図9は、gp130F759/F759マウスのリンパ節のCD4およびCD8シングルポジティブ細胞のフローサイトメーターによる解析結果を示すグラフである。マウスのリンパ節のCD4シングルポジティブ細胞またはCD8シングルポジティブ細胞を蛍光標識モノクローナル抗体で多重染色し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。縦軸および横軸はそれぞれ、パネル左に示した表面抗原(縦軸および横軸方向)に対する蛍光標識抗体の結合量を反映する蛍光強度であり、個々の細胞におけるその表面抗原の発現量を示している。上段:CD4シングルポジティブ細胞におけるCD69およびCD25発現の解析結果。中段:CD4シングルポジティブ細胞におけるCD62LおよびCD44発現の解析結果。下段CD8シングルポジティブ細胞におけるCD62LおよびCD44発現の解析結果。左側(WILD/F759)は対照マウス(gp130WT/F759マウス)、右側(F759/F759)はgp130F759/F759マウスにおける結果である。パネル内の数値は、囲い込まれた、あるいは十字線で仕切られた区画に属する細胞集団の頻度(%)を示したものである。
Claims (10)
- gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、IL−6ファミリーサイトカイン受容体の機能異常に関連する疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
- gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、自己免疫疾患を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
- gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、関節炎を予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
- gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、慢性関節リウマチを予防または治療する物質のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
- gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部を用いることを特徴とする、抗炎症薬のスクリーニング方法であって、該gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換もしくは欠失、および/または該対応するチロシン残基を含む領域において1またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失を含んでいる、スクリーニング方法。
- 前記gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、SHP2を介するgp130依存性シグナル伝達経路が選択的に遮断されている、請求項1〜5のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 前記gp130変異体を発現するトランスジェニックマウスまたはその一部において、gp130依存性シグナル伝達経路のSOCS−3による負の制御が損なわれている、請求項1〜5のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 前記gp130変異体が、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換または欠失を含んでいる、請求項1〜7のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 前記gp130変異体における、ヒトgp130タンパク質の759番目のチロシン残基に対応するチロシン残基の置換が、gp130遺伝子の点変異によるものである請求項8に記載のスクリーニング方法。
- 前記点変異によって、チロシンに代えてフェニルアラニンがコードされる、請求項9に記載のスクリーニング方法。
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