JP2000503319A - インフルエンザ菌のヒト細胞への付着を防止するための生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インフルエンザ菌を少なくとも３個のリン酸基を有するリン酸化された組換えヒトβ−カゼインと接触させることにより、前記菌の咽頭細胞のようなヒト細胞への付着を防止するための製品を提供する。リン酸化された組換えヒトβ−カゼインを含む製品は、乳児用調合乳のような液体経腸栄養製品であり得る。経腸栄養製品は乳児の中耳炎を予防及び治療するために使用することができる。リン酸化された組換えヒトβ−カゼインは、のどスプレーとして、あるいは点鼻薬またはスプレーの形態でも使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】インフルエンザ菌のヒト細胞への付着を防止するための生成物 技術分野 本発明は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｊｌｕｓｊｎｆｌｕｅｎｚａｅ ）のヒト鼻咽頭細胞への付着を防止するのに有用な生成物に関する。特に、本発 明は、インフルエンザ菌を３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ− カゼインと接触させることにより前記菌がヒト細胞に付着するのを防止する方法 に関する。発明の背景 母乳がヒト乳児の最良の栄養源であることは一般的に認められている。母乳は 発育中の乳児にとって理想的な栄養源であるばかりでなく、各種生物による感染 から乳児を保護する免疫グロブリン及び非免疫グロブリンをも含んでいる。また 、母乳の場合、牛乳を主成分とする乳児用調合乳に比べて乳児が消化しやすく、 アレルギー反応を起こしにくい。 母乳は、いろいろな点で牛乳や他の哺乳動物種の乳とは異なっている。母乳と 牛乳とでは総タンパク質含量及びタンパク質 の種類が異なる。４つの主要ウシカゼインが同定されている。牛乳はβ−及びκ −カゼインに加えて２種のα−カゼインを含むのに対して、母乳はβ−及びκ− カゼインしか含まない。更には、母乳のタンパク質と他の哺乳動物乳のタンパク 質とではアミノ酸配列が異なる。 母乳の幾つかの有利な特性を持ちながら、牛乳を主成分とする乳児用調合乳に 伴う欠点、例えばアレルギー反応や乳児が完全に消化できないという欠点を解消 した乳児用調合乳の開発に努力が払われてきた。この目的を達成するための直接 的な望ましい方法は、天然型の母乳タンパク質を含めた公知の母乳成分を数種調 合乳に添加することである。牛乳や他の哺乳動物乳のカゼインとはアミノ酸配列 が異なるヒトカゼインは重要な物質であり、天然型のヒトカゼインを乳児用調合 乳に添加したならば調合乳の栄養価を高め、非母乳タンパク質に固有の欠点を減 ずることができるであろう。 母乳は乳児の発育・発達に必要なタンパク質を合成するために必要なアミノ酸 源であること以外に、母乳は他の重要な生物学的作用をもつタンパク質、例えば カゼインを含むことが確認されている。β−カゼインは乳腺で合成される最も豊 富な母乳 タンパク質のひとつである。ゴルジ装置で翻訳後修飾を受けると、β−カゼイン はミセルと称される大きなカルシウム依存性集合物として分泌される。β−カゼ インは単一の物質ではなく、乳腺刺激性ホルモンに応答して授乳中に分泌される 異種のリンタンパク質群である。ヒトβ−カゼインの一次構造は、Ｇｒｅｅｎｂ ｅｒｇら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５９：５１３２−５１３８，１９８４）により突き止められた。ヒトβ−カ ゼインはアミノ末端の近くに位置する特定のセリル及びトレオニル残基がリン酸 化部位であるリン酸化タンパク質であることが明らかとなった。ヒトβ−カゼイ ンとウシβ−カゼインとを比較すると４７％の同一性を示した。ヒトκ−カゼイ ンの配列は、Ｂｒｉｇｎｏｎら（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８８：４ ８−５４，１９８５）により突き止められた。β−カゼインがリン酸化されるの に対して、κ−カゼインはグリコシル化される。 母乳カゼインにより、幾つかの生物学的効果、例えば（１）カルシウム吸収の 増強、（２）アンギオテンシンＩ−変換酵素の阻害、（３）オピオイド作用、及 び（４）免疫刺激及び免疫 調節効果が得られる。 ヒトカゼインは大量（＞８０％）のβ−カゼインと少量のκ−カゼインから構 成されている（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，１９８４）。天然β−カゼインは２５ｋ Ｄａのタンパク質である。母乳の場合、β−カゼインはポリペプチド鎖当たり０ 〜５個のリン酸基の範囲の異なる翻訳後リン酸化度を示す（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ら，１９８４、Ｈａｎｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａ ｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４：３７３−３８１，１９９３）。天然タンパ ク質中のリン酸基はアミノ末端近くに位置するセリン及びトレオニンの両残基に 結合している（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，１９８４）。 外来遺伝子を細菌細胞中で発現させることは組換え真核タンパク質を産生する ための有用な方法を提供する。しかしながら、大腸菌のような細菌では多くの真 核タンパク質が必要とする翻訳後修飾が起き得ない。なぜならば、細菌は翻訳後 修飾に必要な酵素を内在させていないからである。従って、大腸菌で産生された 真核タンパク質では真核細胞中で起こり得る特定の翻訳後修飾、例えばグリコシ ル化、リン酸化、アセチル化またはアミド化が起きていない。 適切なクローニング技術が開発される以前は、精製タンパク質のキナーゼによる リン酸化がインビトロで化学物質を用いて行われていた。この方法はタンパク質 基質とキナーゼ酵素の精製を必要とし、商業的には効率面からもコスト面からも 効率的でない。また、インビトロの方法は、大量生産するために規模を広げよう とするときに非効率的である。従って、インビボでタンパク質をリン酸化するた めに微生物を遺伝子工学的に操作する方法の開発が要望されている。 カナダ特許出願第２，０８３，５２１号（Ｐａｗｓｏｎら）は、宿主細胞でリ ン酸化外来タンパク質を産生する方法を教示している。Ｐａｗｓｏｎらの方法で は、２つのベクターを細菌細胞中に導入させなければならない。１つのベクター は、タンパク質キナーゼの触媒ドメインによりリン酸化され得る外来タンパク質 をコードするヌクレオチド配列を有する。他方のベクターはタンパク質キナーゼ の触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を有する。両方のベクターを大腸 菌に導入し、外来タンパク質とタンパク質キナーゼの触媒ドメインの産生を誘導 すると、外来タンパク質はリン酸化される。次いで、細菌細胞を溶菌し、外来の リン酸化タンパク質を標準の単離方法により 単離する。 カナダ特許出願第２，０８３，５２１号は、本発明を開示も示唆もしていない 。本発明者らは基質とキナーゼ酵素の両方を発現させる単一ベクターを使用する 。Ｐａｗｓｏｎらの方法では２つのベクターを使用しなければならない。本明細 書に記載の発現系を使用すると、外来タンパク質はリン酸化に対する抗体により 決定される特異的リン酸化を受けるのに対して、Ｐａｗｓｏｎらの発現系では宿 主タンパク質と外来タンパク質の両方が非特異的にリン酸化される。このことは 、工業用に規模を広げようとするときに宿主細菌の増殖に悪影響を与える。Ｐａ ｗｓｏｎらの方法とは異なり、本発明は組換えリン酸化タンパク質を高レベルで 生産する大量生産に適した方法を提供する。 Ｓｉｍｃｏｘら（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌ ｏｇｙ ７（３）：６８−６９（１９９４）は、チロシンキナーゼプラスミドを もつ２つの大腸菌菌株を構築した。これらのＴＫ（チロシンキナーゼ）菌株は、 リン酸化標的ドメインまたはタンパク質をコードする配列を含むプラスミドを用 いて形質転換してリン酸化タンパク質を作り出すために使用さ れ得る。２つの大腸菌株は誘導的チロシンキナーゼ遺伝子を有する。一方の菌株 のＴＫＢ１は、その発現がＴ７プロモーターにより指向される遺伝子を発現させ るために使用される。Ｓｉｍｃｏｘらの開発した系は、２つの構築物、すなわち チロシンキナーゼを含むプラスミドとリン酸化されるタンパク質またはドメイン をコードする遺伝子を含むプラスミドベンターを必要とする点で、本発明の系と は異なる。 ヒトβ−カゼインの構造及び機能をより深く理解するために、またヒトβ−カ ゼインの合成及び分泌の調節に影響を与える要因を研究するために、前記タンパ ク質に対するｃＤＮＡを Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏ ｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６９：１５３−１５６，１９９０）。母乳 β−カゼインは大腸菌及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で産生された（Ｈａｎｓｓｏｎら，１９９３） 。Ｈａｎｓｓｏｎらは、組換えヒトβ−カゼインが酵母サッカロミセス・セレビ シエ中でｐＹＥＳ２．０ベクターを用いて発現されることを立証した（Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，サンディエゴ， カリフォルニア）。産生レベルは大腸菌で産生させたときの約１０％と推定され た。しかしながら、サッカロミセス・セレビシエはタンパク質をリン酸化し得る 外来性酵素を有する真核細胞であるのでこの細胞から得られた組換えβ−カゼイ ンはリン酸化されたが、本来リン酸化する能力を持たない原核細胞である大腸菌 から産生されるタンパク質はリン酸化されなかった。その後、大腸菌において産 生され精製された組換えヒトカゼインキナーゼII（ｒｈＣＫII）はインビトロで タンパク質基質をリン酸化し得ることが明らかとなった（Ｓｈｉら，Ｐｒｏｃｅ ｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ ｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ ９１：２７６７−２７７１，１９９４）。本発明の１つの 特定実施態様では、大腸菌を形質転換し、リン酸化β−カゼインを産生するため に、組換えヒトカゼインキナーゼIIをコードするヌクレオチド配列をβ−カゼイ ンをコードするヌクレオチド配列と一緒に単一構築物中に使用する。本発明のよ うにプロモーター、続いてタンパク質をコードするヌクレオチド配列、続いてキ ナ一ゼをコードするヌクレオチド配列を含む単一ベクターを開示あるいは教示し た先行文献はない。発明の要旨 本明細書では、外来タンパク質と該外来タンパク質を修飾することができる酵 素の両方をコードする単一ベクターを調製することを含む宿主細胞において修飾 組換えタンパク質を産生する方法を開示する。本発明の方法により修飾され得る 代表的な外来タンパク質としては、β−カゼインを含めたヒトカゼイン、細胞受 容体タンパク質、パルミトイル化タンパク質を含めた脂肪アシル化タンパク質、 哺乳動物筋肉タンパク質、レトロフィルスのｇａｇポリタンパク質及びレトロウ ィルスｓｒｃキナーゼにより標的される哺乳動物タンパク質が挙げられるが、こ れらに限定されない。合成後共有結合パルミテートを獲得する膜貫通型糖タンパ ク質にはインシュリン、β₂−アドレナリン受容体及びトランスフェリン受容体 が含まれる。細胞表面受容体、チロシン及びセリン／トレオニンキナーゼ、それ らの基質、ホスファターゼ、Ｇ−タンパク質及びＣａ²⁺として機能するタンパク 質が脂肪アシル化されることは公知である。宿主細胞で特定の外来タンパク質に 対して官能基をトランスファーする能力を有することから本発明で有用な代表的 な酵素として、チロシンキナーゼまたはカゼインキナーゼのようなキナーゼ、哺 乳 動物及び酵母パルミトイルトランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼ、及 びレトロウィルスのｓｒｃ遺伝子によりコードされるキナーゼが挙げられるが、 これらに限定されない。本発明で有用な代表的なプロモーターとして、Ｔ７、λ Ｐ_L、λＰ_R及びＴａｃのような誘導的プロモーター、並びにｂｌａ及びｓｐａの ような構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。形質転換さ れ、次いで修飾タンパク質を発現し得る代表的な宿主細胞としては、大腸菌Ｋ１ ２株、大腸菌Ｂ株、桿菌、乳酸桿菌及び連鎖球菌のような細菌宿主、並びに酵母 細胞や哺乳動物細胞のような真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。 外来タンパク質は、該タンパク質を産生する生物の外側に起源を有するもので ある。この用語は、ＤＮＡクローニング関連の文献では形質転換された受容体生 物から産生される組換えタンパク質を指す用語としてときどき使用されている。 また、ＤＮＡクローニング法を使用して産生される外来タンパク質は組換えタン パク質とも称される。これらの用語がたびたび文献で区別されていないので、本 明細書ではこれらの用語は互換可能に使用され得る。しかしながら、本発明を説 明するとき、「組 換え（体）」とは形質転換された生物から産生されるタンパク質を指し、「外来 」とは、組換えがなされていない天然のタンパク質または該タンパク質をコード するヌクレオチドを指すべく使用される。 本明細書には、プロモーター配列、外来タンパク質配列及び該外来タンパク質 を修飾し得る酵素をコードするヌクレオチド配列を有する単一ベクターを調製す るステップ、宿主細胞を前記ベクターで形質転換するステップ、宿主細胞におい てベクターを発現させ、これにより産生された組換えタンパク質を産生された酵 素により修飾するステップ、及び産生された組換え修飾タンパク質を分離するス テップからなる宿主細胞において組換え修飾タンパク質を産生する方法を開示す る。また、本明細書には、本発明のより特定的な実施態様として、プロモーター 配列、続いてタンパク質キナーゼによりリン酸化され得る外来タンパク質をコー ドするヌクレオチド配列、続いて該外来タンパク質をリン酸化し得るタンパク質 キナーゼをコードするヌクレオチド配列を有する単一ベクターを調製するステッ プ、宿主細胞を前記ベクターで形質転換するステップ、宿主細胞においてベクタ ーを発現させ、これにより産生された組換えタンパク 質を産生されたタンパク質キナーゼにより修飾するステップ、及びリン酸化タン パク質を分離するステップからなる宿主細胞においてリン酸化タンパク質を産生 する方法を開示する。 より特定的には、本発明者らは、インフルエンザ菌がヒト細胞に付着するのを 防止するために、及びヒト乳児の中耳炎を予防及び治療するために使用される組 換え修飾ヒトタンパク質を細菌発現系において産生させる新規な方法を開発した 。本発明者らは、それぞれヒトカゼインキナーゼのα−及びβ−サブユニットを 発現させる、２つのヒトカゼインキナーゼコード配列の組み合わせを使用すると 、組換えリン酸化ヒトβ−カゼインが大腸菌においてインビボで産生されること を立証した。ヒトカゼインキナーゼIIをコードする配列とβ−カゼインをコード する配列をタンデムに配置すると、大腸菌において産生された組換えβ−カゼイ ンの大部分は母乳のようにリン酸化された。本発明の方法は、形質転換された宿 主細胞において組換えタンパク質をインビボで特異的にグリコシル化、アミド化 またはアセチル化するためにも使用され得る。或いは、本発明の方法は、形質転 換された宿主細胞において適切な組換えタンパク質基質に対して脂肪酸をトラン スファーするためにも使用される。 本発明の特定実施態様では、ヒトカゼインキナーゼII（ｈＣＫIIβα）をコー ドするヌクレオチド配列をヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列と一 緒に含む単一構築物を用いて細菌発現系において同時発現させ、インビボで組換 えヒトβ−カゼインの適切なセリン及びトレオニンの両残基を効率的にリン酸化 する。ｈＣＫIIβαをコードするヌクレオチド配列及びヒトβ−カゼインをコー ドするヌクレオチド配列を単一の誘導的発現ベクターを用いて大腸菌において同 時発現させる実験から、組換えｈＣＫIIβαがインビボで組換えβ−カゼインを リン酸化し得ることが証明された。これは、実験作業及び発明力を要する予期せ ぬ意外な結果であった。以前の対照実験でマイナスの結果が得られたことから裏 付けられるように、本発明の結果は予期せぬものであった。本発明の方法は、栄 養製品及び医薬品に対して有用なヒトタンパク質を添加し得るという有用且つ有 利な結果を与える。 本発明の方法で産生されるリン酸化β−カゼインは、インフルエンザ菌のヒト 咽頭細胞に対する付着を防止する能力が示すように天然ヒトβ−カゼインと同じ 生物活性を有することが証明された。図面の簡単な説明 図１は、大腸菌における誘導的細胞内発現のために構築された発現ベクターｐ Ｓ６３７及びｐＲＪＢ−６の物理的地図を示す。ｐＳ６３７から１９１塩基対を 除くとｐＲＪＢ−６が調製される。 図２は、発現ベクターｐＲＪＢ−６及びｐＲＪＢ−９の物理的地図を示し、ｐ ＲＪＢ−６を切断し、ＣＫIIβαに連結してｐＲＪＢ−９を調製する方法を示す 。 図３は、発現ベクターｐＳ６３７及びｐＲＪＢ−７の物理的地図を示し、ｐＳ ６３７を切断し、ＣＫIIβαに連結してｐＲＪＢ−７を調製する方法を示す。ｐ ＲＪＢ−７はβ−カゼイン遺伝子及びカゼインキナーゼ遺伝子の両方の前にＴ７ プロモーターを有する。 図４は、大腸菌において細胞内局在化するタンパク質の産生を媒介するための 、誘導的発現のために構築された発現ベクターｐＳ７５０の物理的地図を示す。 図５は、ベクターｐＳ７５０及びベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用い て大腸菌ＥＬ２１菌株において産生され、クーマシーブリリアントブルーで染色 したＭｅｔ−β−カゼイン のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。プラスミドｐＳ７５０の構築において、β−カゼイ ンコード配列の前にメチオニン（Ｍｅｔ）のコドンを配置した。なぜならば、大 腸菌及び他の細菌においてこのタンパク質の合成はメチオニンで始まるからであ る。こうすることにより、リボソームがペプチド鎖を伸長させるための開始点を 認識することができる。産生すべきタンパク質に対するコード配列の前にＭｅｔ を挿入した場合にのみ、細胞内組換えβ−カゼインを産生することができる。レ ーン１：分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、予染色した、相対分子量１０６，８ ０，４９．５，３２．５，２７．５，１８．５ｋＤａ）、レーン２：非リン酸化 組換えβ−カゼイン、レーン３：５Ｐ−β−カゼイン、レーン４：ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）においてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０、レーン５：ＢＬ２１（ＤＥ３ ）においてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レ ーン６：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５ ０、レーン７：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいてＩＰＴＧで誘導されたｐ Ｓ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン８：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙ ｓＥにおいてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０、レーン ９：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞においてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５ ０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン１０：５個のリン酸基が結合している 天然β−カゼイン（５Ｐ−β−カゼイン）。矢印はβ−カゼインバンドを示す。 図６は、ベクターｐＳ７５０及びベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用い て大腸菌ＢＬ２１菌株において産生され、Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌで 染色したＭｅｔ−β−カゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：５個のリ ン酸基が結合している天然β−カゼイン（５Ｐ−β−カゼイン）、レーン２：Ｂ Ｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞においてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０／ｐ ＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン３：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥにおいて ＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０、レーン４：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに おいてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン ５：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０、 レーン６：ＢＬ２１（ＤＥ３）においてＩＰＴＧで誘導されたｐＳ７５０ｐＥＴ −１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン７：ＢＬ２１（ＤＥ３）においてＩＰＴＧで誘導 されたｐＳ７５０、レーン８：ＳＰ−β−カ ゼイン、レーン９：非リン酸化組換えβ−カゼイン、レーン１０：分子量マーカ ー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、予染色した、相対分子量１０６，８０，４９．５，３２． ５，２７．５，１８．５ｋＤａ）。矢印は、原本の写真ではグリーンのバンドと して認められるリン酸化β−カゼインバンドを示す。 図７は、ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用いて大腸菌 ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて産生され、Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａｉｎ ｓ−Ａｌｌで染色したＭｅｔ−β−カゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン １：分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、予染色した）、レーン２：未誘導のｐＳ ７５０、レーン３：ＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン４：未誘導のｐＳ７ ５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン５：ＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０ ／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン６：未誘導のｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβ α、レーン７：ＩＰＴＧで誘導したｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、レーン８：天 然５Ｐ−β−カゼイン、レーン９：組換えβ−カゼイン、レーン１０：分子量マ ーー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、染色した、相対分子量１０６，８０，４９．５，３２． ５，２７．５，１８．５ｋＤａ）。矢印は、原本の写真ではグリーンのバンド として認められるリン酸化β−カゼインバンドを示す。 図８は、ヒトβ−カゼインに対する抗体を用いたウェスタンイムノブロット分 析を示す。レーン１：分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４３． １，２９．２，１８．８，１６．５，６．４ｋＤａ）、レーン２：５０ｎｇの天 然ヒトβ−カゼイン、レーン３：未誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐ ＲＪＢ−７）、レーン４：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ− ７）、レーン５：未誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ− ＣＫIIβα）、レーン６：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１ １ｄ−ＣＫIIβα）、レーン７：未誘導ＨＭＳＩ７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐ ＲＪＢ−９）、レーン８：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ− ９）。 図９は、ホスホセリンに対する抗体を用いたウェスタンイムノブロット分析を 示す。レーン１：低分子量マーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、相対分子量４４，２８ ．７，１８．５，１４．７，５．８，２．９ｋＤａ）、レーン２：１μｇの天然 ヒトβ−ゼイン、レーン３：２μｇの天然ヒトβ−カゼイン、レーン５：誘導Ｈ ＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫ・βα）、 レーン６：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン７ ：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−７）、レーン８：誘導Ｈ ＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン１０：１μｇの組換え ヒトβ−カゼイン、レーン１１：２μｇの組換えヒトβ−カゼイン。 図１０は、ヒトβ−カゼインに対する抗体を用いたイムノブロット分析を示す 。レーン１：分子量マーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、相対分子量４４，２８．９， １８．５，１４．７，５．８ｋＤａ）、レーン２：天然ヒトβ−カゼイン、レー ン３：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン４：誘 導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン５：誘導ＨＭＳ１ ７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα）、レーン６：組換え ヒトβ−カゼイン。 図１１は、ホスホセリンに対する抗体を用いたイムノブロット分析を示す。レ ーン１：分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４４，２８．９，１ ８．５，１４．７，５．８，２．９ｋＤａ）、レーン２：１μｇの天然ヒトβ− カゼイン、レーン３：５００ｎｇの天然ヒトβ−カゼイン、レーン４：誘導ＨＭ Ｓ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン５：誘 導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン６：誘導ＨＭＳ１ ７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα）、レーン７：１μｇ の組換えヒトβ−カゼイン、レーン８：５００ｎｇの組換えヒトβ−カゼイン。発明の詳細な説明 本明細書には、修飾された組換えタンパク質を宿主細胞において産生する方法 を開示する。より特定的には、本発明は細菌細胞においてリン酸化ヒトタンパク 質を産生する方法に関する。本発明の方法は、タンパン質キナーゼによりリン酸 化され得る外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列と適切なタンパク質キ ナーゼをコードするヌクレオチド配列とを有する単一ベクターを調製するステッ プ、該ベクターを宿主細胞において発現させることにより産生された外来タンパ ク質を産生されたキナーゼによりリン酸化するステップ、及びリン酸化された組 換えタンパク質を分離するステップを含む。プロモーターを含む単一の構築物中 にリン酸化すべきタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びキナーゼをコー ドするヌクレオチド配列をタンデムに配置すると、複数のベクターを使用したと きに生ずる負の効果、例えばマーカーとして複数の抗生物質耐性遺伝子を 使用する必要等を排除して特異的なリン酸化が高レベルで生ずることを本発明者 らは計らずも見い出した。単一構築系を使用すると、本発明の方法を工業的に使 用するために規模を広げることが容易となる。本発明の方法は、外来タンパク質 を発現することができるいかなる宿主細胞系においても有用であると期待される 。適当な宿主細胞には細菌のような原核生物及び酵母や動物細胞のような真核生 物が含まれる。 本発明を実施するのに好ましい宿主細胞は大腸菌である。各種発現フォーマッ トでβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列の、大腸菌株における組換えヒ トβ−カゼインの発現について調べた。一連の実験後、ヒトβ−カゼインをコー ドする配列をヒトカゼインキナーゼＣＫIIβαをコードする配列と一緒に単一構 築物中に配置したときに組換えヒトβ−カゼインが効率的にリン酸化されること が判明した。２つの遺伝子を１つのプラスミド中にタンデムに配置したときには 、キナーゼをコードする配列及びβ−カゼインをコードする配列を２つの別個の ベクター中に配置した実験の場合に比してリン酸化効率は低下しなかった。材料及び方法 下記する材料及び方法を実施例１〜５に記載した実験で使用した。追加の材料 及び／または方法は、必要に応じ実験毎に記載する。実施例６で使用した材料及 び方法は別途に記載する。プラスミド 図１に示すプラスミド構築物ｐＳ６３７は、更に１９位のアミノ酸のグルタミ ン（Ｇｌｎ）をコードする点を除いて、本明細書に参考文献として援用されるＨ ａｎｓｓｏｎら（１９９３）で構築され記載されているｐＳ２６と同一である。 元の発現ベクターｐＳ２６を改変するとｐＳ６３７が調製され、このベクターは 人口中に最も豊富に存在する変異型と同一の組換えβ−カゼインを産生する。 カゼインキナーゼIIをコードするヌクレオチド配列（本明細書に参考文献とし て援用されるＳｈｉら（１９９４））と同時発現させるための構築物ｐＳ６３７ は、カセットとして２つのカゼインキナーゼサブユニットβ及びαをコードする ＣＫIIβαをコードするヌクレオチド配列をβ−カゼインをコードするヌクレオ チド配列の下流に配置することにより調製した。３−シストロンタンデム発現ベ クターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαは、 Ｓｈｉら（１９９４）が調製したＣＫIIβαを含むベクターである。まず、ｐＳ ６３７をβ−カゼインコード配列の下流の２部位で切断し、再連結した。２つの 切断部位間の１９１塩基を喪失させた図１に示すプラスミドｐＲＪＢ−６を単離 した。キナーゼＣＫIIβαはｐＲＪＢ−６に挿入するために作製した。挿入後得 られた構築物を図２に示すようにｐＲＪＢ−９と命名した。ｐＲＪＢ−９はリン 酸化β−カゼインの産生を媒介するように設計された単一構築物である。同様に ｐＳ６３７を改変して、以下に詳細に記載するプラスミドｐＳ７５０及びｐＲＪ Ｂ−７を調製した。宿主細胞 以下に記載する本発明の特定実施態様では、記載のベクターにより形質転換さ れた宿主生物は大腸菌であった。本発明の方法で使用することができる他の代表 的な生物には、桿菌、乳酸桿菌及び連鎖球菌の菌種が含まれる。プロモーター 以下に記載する本発明の特定実施態様では、Ｔ７プロモーターを使用した。本 発明の方法で使用することができる他の代表的なプロモーターには、誘導的プロ モーターλＰ_L、λＰ_R及び Ｔａｃ並びに構成的プロモーターｂｌａ及びｓｐａが含まれる。細菌発現用プラスミドの構築：詳細な方法 発現ベクターｐＳ６３７ 発現ベクターｐＳ６３７は、β−カゼインコード配列の１９位のグルタミン（ Ｇｌｎ）アミノ酸残基をコードするヌクレオチドトリプレツトを含んでいるので 、Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９３）に記載のｐＳ２６と異なる。このヌクレオチド 配列は、ｐＳ２６の配列よりも人口中により一般的に存在するヒトｃＤＮＡ変異 体から単離された。２つの合成ヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 増幅のために合成した。これらのオリゴヌクレオチドは便利な制限部位を提供し 、細菌により優先的に使用されるアミノ酸に対するコドンを含む。２つのオリゴ ヌクレオチドは、ＳＹＭ４１７４（配列番号１）及びＳＹＭ４１７５（配列番号 ２）と命名され、以下の配列を有する。 ＰＣＲ増幅は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕ ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ）」、第２巻、補遺１６、 １５．０．３−１５．１．１７（１９９１）に記載されているように実施され、 増幅された断片をＰｓｔＩ及びＡｖａIIで消化して８５ｂｐ断片を得た。Ｈａｎ ｓｓｏｎら（１９９３）に記載のプラスミドｐＳ２１をＥｃｏＲＶ及びＡｃｃＩ で消化し、３２８ｂｐ断片をゲル電気泳動により分離した。分離した断片を電気 溶出によりアガロースゲルから精製し、ＡｖａIIで消化した。これにより、１９ ７ｂｐのＡｖａII／ＡｃｃＩ断片が得られ、単離した。ＰｓｔＩ及びＡｖａIIで 消化しＰＣＲで増幅した８５ｂｐの断片及び１９７ｂｐのＡｖａII／ＡｃｃＩ断 片を、Ｈａｎｓｓｏｎらが記載しているプラスミドであるＰｓｔＩ／ＡｃｃＩで 消化したｐＳ２５に連結した。得られたプラスミド構築物の配列を決定し、ｐＳ ６３６と命名した。６４４ｂｐのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素断片をｐＳ６ ３６から分離し、Ｈａｎｓｓｏｎらが記載しているプラスミドであるＮｄｅＩ／ ＢａｍＨＩ消化ベクターｐＳ２６に導入した。得られた発現ベクターをｐＳ６３ ７と命名した。発現ベクターｐＲＪＢ−９ Ｓｈｉら（１９９４）が突き止めたＣＫIIβαコード配列を含むｐＥＴ−１１ ｄ−ＣＫIIβαプラスミドを、組換えβ−カ ゼインと同時発現させるために調製した。まず、１９１塩基対（ｂｐ）を、β− カゼインコード配列の下流の２つのＥｃｏＲＩ部位を切断し、ｐＳ６３７に再連 結することにより、１９１塩基対（ｂｐ）を除去した。プラスミドｐＲＪＢ−６ （図１）を単離したが、このプラスミドは２つの部位間の１９１ｂｐが喪失され ているものの、β−カゼインコード配列の３’末端から１３２塩基離れて位置す る１つのＥｃｏＲＶ部位は保持されているものであった。ＣＫIIβαコード配列 を含むプラスミドｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαをＣｌａＩで切断し、該部位をク レノウ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア）を用いて充填し平滑末端 を作製した。こうして充填したＣｌａＩ切断ＣＫIIコード配列を、ｐＲＪＢ−６ のβ−カゼインコード配列の下流に配置した。得られた構築物をｐＲＪＢ−９と 命名し、その配列を図２に示す。発現ベクターｐＲＪＢ−７ 構築物ｐＳ６３７を、組換えβ−カゼイン及びＣＫIIβαキナーゼを同時発現 させるために、β−カゼインコード配列のすぐ後ろにＣＫIIβαコード配列を配 置することにより調製した。 ＣＫIIβαコード配列をＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片としてｐＳ ６３７のＢａｍＨＩ部位に配置し、ｐＲＪＢ−７と命名した。この断片は、元の ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα由来のＴ７プロモーターを含んでいた。従 って、ｐＲＪＢ−７は図３に示すように２つのＴ７プロモーターを含み、そのひ とつはβ−カゼインコード配列の前に、他方はＣＫIIβαコード配列の前に存在 する。発現ベクターｐＳ７５０ 選択マーカーをアンピシリン耐性からカナマイシン耐性に変更するために、プ ラスミドｐＳ６３７をＰｖｕＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平 滑末端とした。線状（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）ベクターを単離、挿入し、Ｈｉｎ ｃIIカナマイシン耐性ジーンブロック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ウプサラ、スウェ ーデン）に連結した。得られた発現ベクターをｐＳ７５０と命名した（図４）。組換えヒトカゼインキナーゼII用発現ベクター 発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα（Ｓｈｉら，１９９４）はマサチュ ーセッツ州ボストンのハーバード医科大学のＣ．Ｗａｌｓｈ博士から供給された 。 発現実験を、Ｓｔｕｄｉｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９，１９９０）に記載されているよう に実施した。細菌を、カルベニシリンに対して耐性を与える遺伝子を含むプラス ミドであるｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαのためのカルベニシリン５０μｇ／ｍｌ 、及びカナマイシンに対して耐性を与える遺伝子を含むプラスミドであるｐＳ７ ５０のためのカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むルリアブロス（ＬＢ培地）で増 殖させた。クロラムフェニコールに対して耐性を与えるｐＬｙｓプラスミドを含 む菌株を使用したときには、培地にクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを補充 した。Ｔ７発現系を誘導するために、培養物をＯＤ₆₀₀が約０．５となるまで増 殖させた後、０．４ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ Ｇ）を加えた。誘導から約９０分後、細胞を収集した。電気泳動及び組換えβ−カゼインの検出 細胞を遠心によりペレット化し、培養物１ｍｌから製造したペレットを、Ｔｒ ｉｓ、グリセロール、ＳＤＳ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びブロモフェノ ールブルーを含むサンプル緩衝液１００μｌに溶解した。Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａ ｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５，１９７０）に記載されているように タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。Ｐｔｏｔｅａｎ（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ，リッチモンド，カリフォルニア）電気泳動装置の非連続緩衝系に勾配ゲルを 充填し流した。ゲルはＬａｅｍｍｌｉに記載されているように染色した。イムノ ブロッティングを製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の仕様書に従って実施した。修飾タンパク質の単離方法 修飾タンパク質は当業者に公知の一般的な方法により単離し得る。一般的な方 法のうちで代表的な方法を以下に示す。 細胞を収集し、一般的な機械的または化学的方法により破砕する。次いで、細 胞を緩衝液に懸濁し、ホモジナイズし、遠心し、上清を捨てる。生じた不溶性ペ レットを再懸濁し、上清を捨てる。こうして、洗浄された不溶性ペレットが得ら れ、これをｐＨ８．２の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び６Ｍ尿素に懸濁し、ホモジナイ ズする。β−カゼイン上清Ｉを取り除くと不溶性抽出物が得られるので、これを 再びｐＨ８．２の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び６Ｍ尿素に懸濁し、ホモジナイズする 。β−カゼイン上清IIを取り除き、上清ＩとIIをプールする。残りの不溶性抽出 物を破棄する。プールした上清をｐＨ８．２の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ で１：１に希釈し、３Ｍ尿素で処理してβ−カゼインを抽出する。β−カゼイン の尿素抽出物をｐＨ９．５の５０ｍＭエタノールアミン及び１００ｍＭ ＮａＣ ｌに対して透析し、遠心し、タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるまでｐＨ９． ５の５０ｍＭエタノールアミン及び１００ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈すると、最終 のβ−カゼイン溶液が得られる。ペレットを破棄する。実施例 実施例１及び２は、本発明の例ではないが本発明の基礎をなす例を記載する。 実施例１及び２に記載の実験では、β−カゼインをコードするヌクレオチド配列 を含むベクターとカゼインキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクタ ーとの２つのベクターを用いて細菌を同時形質転換させた場合には組換えβ−カ ゼインの産生は悪影響を受けないことを示す。上記実験では、組換えリン酸化β −カゼインが細菌系において上記した２つのベクターを用いて産生され得ること をも示している。 実施例３は、単一プラスミドの正確な構造は自明でも又容易に予測され得るも のでもなく、その構築には発明力及び実験作業を要することを示す。実施例４は 、プロモーター、転写及びリン酸化されるべきタンパク質をコードするヌクレオ チド配列 及びキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単一構築物を用いて細菌菌株 を形質転換した例を記載する。実施例４は、単一プラスミドを用いて組換えリン 酸化β−カゼインが産生されることを立証している。実施例５は、ヒトの天然β −カゼインと同一の、細胞外に局在化する組換えリン酸化β−カゼインを発現す るための単一構築物系を記載している。実施例４及び５は本発明の例である。実 施例６は、インフルエンザ菌がヒト咽頭細胞に付着するのを防止する能力につい て、天然ヒトβ−カゼインと本発明のプラスミドの支配下で産生した組換えヒト β−カゼインの６種のリン酸化形態を比較した。実施例１：大腸菌Ｂにおけるβ−カゼインの産生：細胞内に局在化する組換えＭ ｅｔ−β−カゼインのリン酸化：ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株 組換えヒトＣＫII（ｒｈＣＫII）の、細菌発現系においてインビボで組換えβ −カゼインをリン酸化する能力を分析するために、２つの誘導的発現ベクターを 用いて大腸菌において実験を行った。発現ベクターｐＳ７５０を単独でまたは発 現ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαと組み合わせて、Ｔ７宿主細胞ＢＬ２１ （ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ及びＢＬ ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥに形質転換した。ＤＥ３は、ｌａｃ１リプレッサー、 イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され得る ｌａｃＵＶ５プロモーター及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含むラムダ ーファージ由来のＤＮＡ断片である。インデューサーの存在下でＴ７ ＲＮＡポ リメラーゼが産生され、外来遺伝子が転写される。プラスミドｐＬｙｓＳはクロ ラムフェニコールに対する耐性を与え、外来タンパク質の増殖速度及び産生に対 して殆ど影響を与えない。プラスミドｐＬｙｓＳは、大腸菌でのプラスミドの安 定性を高め且つ凍結融解により細胞を溶解し得るＴ７リゾチームを含む。 図５に示す結果から、大腸菌において組換えヒトＭｅｔ−β−カゼインが高レ ベルで産生されること、及び産生される量が組換えヒトＣＫIIβαの同時産生に より影響されないことを示す。タンパク質を電気泳動で分離し、リン酸染色する と、ＣＫIIβαがインビボでリン酸化された組換えヒトＭｅｔ−β−カゼインを 含むことが明らかである。このことは図６に示されており、２つのベクターを用 いて細菌系においてリン酸化されたβ−カゼインを産生し得ることを立証してい る。本実施例は本発明の請求の範囲内ではないが、審査官の実施例４に詳述 する本発明の理解を助けるべく提示したものである。実施例２：大腸菌Ｋ−１２におけるβ−カゼインの産生：細胞内局在化組換えＭ ｅｔ−β−カゼインのリン酸化：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）菌株 大腸菌Ｋ−１２菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙ ｓＳ及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを、組換えヒトＭｅｔ−β−カゼイ ンの産生用宿主として評価し、ｐＳ７５０により形質転換した。ＨＭＳ１７４（ ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを用いたときの産生が最も効率的であった。ｐＳ７５０及び ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを用いる同時発現実験で、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫII βαの存在とは無関係に組換えヒトＭｅｔ−β−カゼインの産生が強く誘導され ることが示された。リン酸染色（図７）から、組換えヒトＣＫIIを用いてインビ ボで同時産生したときにＭｅｔ−β−カゼインが効率的にリン酸化されることが 示された。本実施例は、実施例１と同様に本発明の請求範囲内ではないが、審査 官の実施例４に詳述する本発明の理解を助けるべく提示したものである。２つの プラスミド系は本発明の単一プラスミド系に比して本質的に望ましくない。なぜ ならば、発酵過程で宿主細胞中のプラスミドの存在を追跡 するために各プラスミドが抗生物質マーカーを含んでいなければならないからで ある。このために、増殖培地に２種の抗生物質を使用しなければならず、細菌の 増殖が遅れるからである。実施例３：大腸菌Ｋ−１２におけるヒトβ−カゼインの産生：β−カゼインコー ド配列とＣＫIIβαコード配列とを含む構築物ｐＲＪＢ−７：−カゼインコード 配列の前にＴ７プロモーター：ＣＫIIβαコード配列の前にＴ７プロモーター それぞれの前にＴ７プロモーターが位置するβ−カゼイン遺伝子及びＣＫIIβ α遺伝子を含む構築物ｐＲＪＢ−７を、大腸菌Ｋ−１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ ３）ＬｙｓＳに形質転換した。形質転換及び誘導方法は、実施例４に記載のＮｏ ｖａｇｅｎｐＥＴシステム手順に従った。ウェスタンブロット分析 分離及び転移、ブロッキング及び抗体方法は実施例４に記載されている。図８ は、４種の構築物を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ＬｙｓＳ細胞によるβ− カゼインの産生を比較したイムノブロットを示す。誘導細胞培養物及び非誘導細 胞培養物の溶菌液を分析した。細胞は、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα（ＣＫIIβ 及びαをコードする配列を含むプラスミド）、ｐＲＪＢ −９（β−カゼインコード配列とＣＫIIβαコード配列及びβ−カゼインコード 配列の前にのみＴ７プロモーターを有するハイブリッド構築物）、またはｐＲＪ Ｂ−７（β−カゼインコード配列とＣＫIIβαコード配列及びβ−カゼインコー ド配列とＣＫIIβαコード配列の両方の前にＴ７プロモーターを有するハイブリ ッド構築物）を含む。細菌をｐＲＪＢ−７で形質転換すると、細菌増殖がかなり 抑制された。この大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ＬｙｓＳの倍化時間は、ｐＲＪ Ｂ−９（Ｔ７プロモーターをひとつしか含まない構築物）を用いて形質転換した 同じ菌株のほぼ２倍であった。図８に示すウェスタンブロットは、ｐＲＪＢ−７ を含む誘導細胞を用いる組換えβ−カゼインの産生率はｐＲＪＢ−９を含む細胞 を用いたときよりも低いことを示す。このことは、レーン４（誘導ｐＲＪＢ−７ ）とレーン８（誘導ｐＲＪＢ−９）との比較から明らかである。ｐＲＪＢ−７及 びｐＲＪＢ−９はともにｐＳ６３７から誘導されるが、ｐＲＪＢ−９のみが本発 明の構築物と同等の量のβ−カゼインを産生した。ハイブリッド構築物のＣＫII 遺伝子の前に別のＴ７プロモーターを存在させると、細胞増殖が低下し、その結 果として組換えタンパク質の産生が低下する。 図９は、リン酸化タンパク質を検出するために溶菌液をホスホセリン抗体で展 開したウェスタンブロット分析を示す。ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβα、ｐＲＪＢ −９（１個のＴ７プロモーターしか含まないハイブリッド構築物）、ｐＲＪＢ− ７（２個のＴ７プロモーターを含むハイブリッド構築物）またはｐＳ６３７（β −カゼインコード配列を含むがＣＫIIβαコード配列を含まない）を有する誘導 ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ＬｙｓＳ細胞における組換えリン酸化β−カゼインの産 生を比較した。リン酸化β−カゼインは、ｐＲＪＢ９を含む細胞でのみ産生され た（レーン６）。ｐＲＪＢ７を含む細胞の溶解液を含むレーン７ではリン酸化さ れたタンパク質が検出されなかった。 ２個のＴ７プロモーターを含む構築物ではリン酸化タンパク質が検出されなか ったことから、微生物において適切に修飾された組換えタンパク質を発現するた めの本明細書に開示の単一構築物系を開発するためには発明力と実験作業とを必 要とすることが明瞭である。タンパク質をコードするヌクレオチド配列とキナー ゼをコードするヌクレオチド配列を含む単一構築物中に２個のＴ７プロモーター を使用した実験で否定的な結果が得られたが、実験条件を変えたときに２個以上 のプロ モーター配列を使用することを除外すべきではない。本発明の範囲では、２種の プロモーターを使用することが好ましい。実施例４：大腸菌Ｋ１２株におけるヒトβ−カゼインの産生：β−カゼインコー ド配列及びＣＫIIβαコード配列を含む構築 物ｐＲＪＢ−９ 本明細書に開示の組換えヒトβ−カゼインの産生方法では、特定部位に官能基 をトランスファーさせるための情報及び修飾すべきタンパク質を発現する単一構 築物を使用する。本発明の特定実施態様では、トランスファーされる官能基はリ ン酸基である。トランスファーを、インビボで組換えヒトβ−カゼインの特定部 位をリン酸化することを媒介することが明らかとなっているキナーゼを用いて行 う。ヒトβ−カゼインが大腸菌によりインビボで特定的にリン酸化され得ること 、及びβ−カゼインをコードする配列の前にプロモーターを有しており単一構築 物系の利点を有する単一構築物はこの作用をうまく媒介することがここで立証さ れる。大腸菌Ｋ１２株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへの形質転換 β−カゼイン遺伝子及びＣＫIIβα遺伝子を含む構築物ｐＲＪＢ −９を、大腸菌Ｋ１２株宿主ＨＭＳ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。形質 転換方法は、Ｎｏｖａｇｅｎ ＰＥＴシステム手順（第４版、ＴＢ Ｎｏ．５５ 、１９９４年６月）に従った。発現の誘導 プラスミドｐＲＪＢ−９（図２）、ｐＳ６３７（図１）またはｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫIIβα（Ｓｈｉら、１９９４）を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬ ｙｓＳ宿主細胞を、光学密度ＯＤ₆₀₀が０．５〜０．６になるまで３０℃で増殖 させた。１ｍＭのインデューサ−ＩＰＴＧを添加する前及び添加してから６時間 後に培養物サンプルを採取した。２つの１ｍｌアリコートからの細胞を微量遠心 分離機で遠心してペレット化した。細胞をゲル電気泳動用のサンプル充填緩衝液 中で再懸濁し、その後各アリコートからの上清５００μｌを集めた。捨てた培地 をＭｉｃｒｏｃｏｎ １０スピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１０，０ ００×Ｇで３５分間濃縮した。１，０００×Ｇで３分間スピンした後保持物質を 集め、２倍濃度のサンプル緩衝液を等量添加した。ウェスタンブロット分析 細胞溶解液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドｐｒｅ−ｃａｓｔゲル（Ｉｎｔｅｇ ｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて１０〜２０％勾 配で分離し、半乾燥ブロッターを用いてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉ ｐｏｒｅ，ベッドフォード，マサチューセッツ）に移した。ゲルを定電流（０． ８ｍＡ／ｃｍ²）で４５分間エレクトロブロッティングし、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏ ｔ ＳＤ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転移した。転移緩 衝液は、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭグリシン、１．３ｍＭ ＳＤＳ（ドデシ ル硫酸ナトリウム）及び２０％メタノールを含むものであった。転移する前に、 フィルターをまずメタノールに浸し、次いで転移緩衝液に浸した。ウェスタンブ ロット分析のために、膜を３％ウシ胎仔血清アルブミン及び０．２％Ｔｗｅｅｎ を含むＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．１５４Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で ブロックした。β−カゼインに対する一次抗体及びアルカリホスファターゼヤギ 抗−家兎抗体（二次抗体）をブロック緩衝液中で１：８０００に希釈した。ホス ホセリンを検出するために、追加の抗体を用いた。ブロッキング及び抗体反応 を、２％ゼラチン含有増幅グレード豚皮膚（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）を含むＴＢＳを用いて２５〜２６℃で２時間行った。次いで、ブロットをＴＢ Ｓで３０分間洗浄した。一次抗体のマウスモノクローナル抗−ホスホセリン（Ｓ ｉｇｍａ）を２％ゼラチンブロッカー中で１：２００または１：１００に希釈し 、２時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳ中で２回５分間洗浄した。二次 抗体のヤギ抗−マウスアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）をゼラチンブロッ カー中で１：４，０００に希釈し、１時間インキュベートし、ＴＢＳで上記のよ うに洗浄した。ニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリルホスフェートを発色用基質として使用した。 図１０は、３種の構築物を含む大腸菌Ｋ１２株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）Ｌｙｓ Ｓ細胞によるβ−カゼインの産生を比較したイムノブロットを示す。細胞は、ｐ Ｓ６３７（β−カゼインコード配列を含むプラスミド）、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫ IIβα（ＣＫIIβ及びαコード配列を含むプラスミド）またはｐＲＪＢ−９（β −カゼインコード配列及びＣＫIIβαコード配列を含むハイブリッド構築物）を 含む。レーン３とレーン４との比較 から、ハイブリッド構築物ｐＲＪＢ−９は、ｐＲＪＢ−９の起源のプラスミドで あってＣＫIIβαコード配列を含まないｐＳ６３７の場合と同等量のβ−カゼイ ンを産生することが明らかである。ｐＲＪＢ−９及びｐＳ６３７はともにこの宿 主細胞で４００〜５００ｍｇ／ｌのβ−カゼインを産生した。この実験から、β −カゼインコード配列とＣＫIIβαに対するコード配列をタンデムに配置しても β−カゼインの産生は有意に変化しないことが明らかである。 図１１は、リン酸化タンパク質を検出するために溶菌液をホスホセリン抗体で 展開したウエスタンブロット分析を示す。図８の溶菌液の他に、多量の天然ヒト β−カゼイン及び非リン酸化組換えβ−カゼインについても試験した。ＣＫIIβ αプラスミドからの溶菌液を含むレーン６では細菌タンパク質のリン酸化が見ら れなかったことから、リン酸化は特異的であることが分かる。β−カゼインコー ド配列とＣＫIIβαコード配列をタンデムに含むｐＲＪＢ−９を含むレーン４の 細胞溶解液は、抗体との強い交差反応バンドを示す。レーン４のバンドは、レー ン２及び３に示すように電気泳動分析により天然母乳β−カゼインと同じ分子量 を有している。レーン７及び８のような精製 したものもレーン５のようなインビボでｐＳ６３７で発現させたものでも、組換 え非リン酸化ヒトβ−カゼインと交差反応を示さなかった。この実験から、単一 構築物を使用すると細菌系で大腸菌Ｋ−１２において未改変の組換えヒトβ−カ ゼインを特異的に高レベルでリン酸化し得ることが立証される。実施例５：大腸菌Ｋ−１２におけるβ−カゼインの産生：細胞外に局在化する組 換えβ−カゼインのリン酸化：大腸菌リーダー配列、プロモーター、β−カゼイ ンコード配列、ＤＥＴ−１１ｄ−ＣＫIIβαを含む構築物 本実施例では、大腸菌Ｋ−１２を形質転換し、細胞外に局在化するリン酸化β −カゼインの産生を媒介するために使用される単一プラスミドの構築を記載する 。リン酸化されたタンパク質を細菌細胞のペリプラズム腔に分泌するように設計 された単一構築物を調製するために、タンパク質輸送をペリプラズムに指向する リーダー配列を含む発現ベクターにβ−カゼインコード配列を配置した。上記方 法により作製したクローンを標的ＤＮＡとして用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ Ｒ）を行った。Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ ．（ミッドランド，テキサス）で合成した以下のプライマーを ＰＣＲで使用することができる： ＲＯ−４：５’−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＣＴ−3’（配列番号３ ）、及び ＲＯ−２９：５’−ＧＧＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＡＣ ＧＣＧＴＧＡ ＡＡＣ− 3’（配列番号４）。 タンパク質合成のための細菌の開始コドンであるメチオニンを除去するために、 ＲＯ−２９の下線塩基を置換し、ベータ−カゼインコード配列の末端にＭｌｕｌ 部位を形成している。こうすると、得られたタンパク質はヒトβ−カゼインと同 一のアミノ酸配列を持つようになる。次いで、ＰＣＲ断片を精製する。修飾され ていないコード配列の３’−末端をＢａｍＨＩで切断する。この断片は５’平滑 末端及び３’ＢａｍＨＩ末端を含むが、この断片をＴ７プロモーターを含む発現 ベクターｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，マジソン，ウィスコンシン）でクロ ーニングし、平滑末端をＭｓｃＩ及びＢａｍＨＩで切断する。ここに記載の構築 物はＴ７プロモーターを含むが、他のプロモーター配列を使用することもできる 。ＣＫIIβαコード配列をｐＲＪＢ−９に関して上記したように挿入する。発現 を誘導し、ウェスタンブロット分析を実施例４に記載の方法に従って実施 する。 細菌細胞のペレプラズム腔から単離され、ホスホセリンに対する抗体と交差反 応し且つ天然β−カゼインと同様に泳動するタンパク質を同定するために、ウェ スタンブロットを実施する。この実験で、異種の翻訳開始及びシグナル配列に融 合される配列（この配列の前にプロモーター配列がある）によりコードされる組 換えヒトβ−カゼインがリン酸化され、リン酸化されるべき配列はＣＫIIβαの ようなキナーゼコード配列を含むプラスミド中に存在することが立証される。単 一ベクター系でも２個のベクター系でも細胞外に局在化するリン酸化タンパク質 を産生することを開示したものはこれまでない。 産生されたリン酸化タンバク質が細胞外に局在化することは、細胞内に局在化 している場合に比して精製が容易という利点をもたらす。細菌細胞のペリブラズ ム腔は、細胞内よりもより少なくしか異質物を含んでいないので、精製タンパク 質の単離がはかどる。このことは、大量生産する際には特に有利である。実施例６：天然及び組換えヒトβ−カゼインの抗付着生物活性 ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｈｊｌｕｓ）はリポ多糖−タンパク質細胞壁を有す る小さなグラム陰性菌であり、ヒト及び動物 種の粘膜に存在する偏性寄生体である。インフルエンザ菌の多くの（すべてでは ない）菌株の表面は多糖夾膜で被覆されている。夾膜を持たない型別不能のイン フルエンザ菌株は、生まれて数ヶ月以内の多くの個体の上部気道でコロニーを形 成し、中耳炎や副鼻腔炎のような幾つかの病気に最も一般的に関連する種である （Ｍｕｒｒｙら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，ｐ．２ ６０，１９９４）。上記菌株は慢性気管支炎を悪化させる恐れもある。 天然ヒトβ−カゼインとｐＲＪＢ−９を含む細胞中で合成された組換えヒトβ −カゼインの、インフルエンザ菌のヒト咽頭細胞への付着を防止する能力につい て比較するためにアッセイを行った。０〜５個のリン酸基を含むリン酸化タンパ ク質について比較した。細胞及び細菌菌株 Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭がん腫細胞（ＤＴ ５６２）はアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。 インフルエンザの型別不能の細菌菌株はオハイオ州立大学のＬａｕｒｅｎ Ｂａ ｋａｌｅｔｚ博士から入手した。細胞培養 ９６穴のプレートに１穴当たり２０，０００〜２５，０００個の細胞の密度で 接種したＤＴ ５６２細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ ，ローガン，ユタ）を補充したダルベッコ修正イーグル培地（ＧＩＢＣＯ，グラ ンドアイランド，ニューヨーク）で培養した。細胞を９５％空気及び５％二酸化 炭素の湿潤空気中で３７℃でインキュベートした。細胞が少なくとも９０％の集 密度のとき実験を実施した。細胞を含むプレートをハンクス平衡塩類溶液（ＨＢ ＳＳ）（ＧＩＢＣＯ）２００μｌで３回洗浄して血清タンパク質を除去してから 、細菌を添加した。天然ヒトβ−カゼイン 母乳から分離したβ−カゼインをスウェーデンのＳ−９０２−２４ Ｕｍｅａ 、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １４５１に所在のＳｙｍｂｉｃｏｍＡＢから購入した。リン酸化形態の分離 細胞を４０℃、７０００×ｇで１０分間遠心することにより収集した。上清を 除去し、ペレット化した細胞をＪｏｈｎｓｏｎらが記載している凍結融解方法（ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９４年１２月１２日，ｐｐ．１３５７−１３６０）で処理して、組換えβ− カゼインを遊離させた。０．４５μ膜を通して濾過後、β−カゼインを含むサン プルを陰イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｑ１０／１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ ｉｏｔｅｃｈ，ウプサラ，スウェーデン）にかけた。各種リン酸化形態を、ｐＨ ９．５の２０ｍＭエタノールアミン及び６Ｍ尿素中に０〜０．５ＭのＮａＣｌを 含む直線勾配で５０分以上かけて分離した。 組換えβ−カゼインの各種リン酸化形態を、それらの溶出時間と精製した天然 型母乳β−カゼインの溶出時間とを比較して同定した。細菌の放射線標識 低継代数の冷凍したアリコートからのインフルエンザ菌をチョコレート寒天プ レートに画線し、９５％空気及び５％二酸化炭素の湿潤空気中で３７℃でインキ ュベートして、対数期培養物を得た。０．０５％ウシ胎仔血清アルブミン（ＢＳ Ａ）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に収集した細菌を遠心し、６ ００ｎｍの波長での光学密度（ＯＤ₆₀₀）が２．４となるような量のＰＢＳ／Ｂ ＳＡに再懸濁した。¹¹¹インジウム −オキシン（¹¹¹Ｉｎ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，アーリントンハイツ，イリノイ） を使用して細菌を放射線標識した。５０μＣｉの前記¹¹¹Ｉｎ溶液を細菌懸濁液 ２．５ｍｌに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。放射線標識した細 菌を１０ｍｌのＨＢＳＳで２回洗浄して、未結合の¹¹¹Ｉｎを除去し、３０ｎＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタン スルホン酸）を補充したＨＢＳＳ５ｍｌに再懸濁した。¹¹¹Ｉｎ標識細菌懸濁液 ２５μｌを試験物質２５μｌと共にポリプロピリン９６穴のプレートで３７℃で １５分間プレィンキュベートして、試験物質を細菌に結合させた。付着の定量 放射線標識した細菌と天然ヒトまたは組換え型β−カゼインとを含むプレイン キュベートした混合物２５μｌを、ＤＲ ５６２細胞を含むアッセイプレートの 各穴にピペットで移した。アッセイプレートを３７℃で２０分間インキュベート して、細菌を細胞単層に付着させた。プレートをＨＢＳＳで３回洗浄することに より付着しなかった細菌を除去した。０．０５Ｎ水酸化ナトリウム１００ｐｌを 添加して細胞単層及び付着しているインフルエンザ菌を破壊することにより、ア ッセイを停止させた。 各穴の内容物をＣｏｂｒａポリプロピレンチューブに移し、Ｃｏｂｒａガンマー カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ，メリデン，コネチカット）で計数した。４回の実 験結果を平均して結果を算出した。結果を、試験物質を含まない対照穴における 細菌付着と比較した、６種のリン酸化レベルの異なる天然ヒトまたは組換え（ｐ ＲＪＢ−９）β−カゼインによる細菌付着の抑制パーセントとして示した。結果 β−カゼインを３、４または５個のリン酸基でリン酸化するときにのみ抗付着 活性が常に見られる。リン酸化レベルが低いと、天然β−カゼインでも組換えβ −カゼインでも抗付着活性は殆どまたは全く認められなかった。しかしながら、 β−カゼインが３、４または５個のリン酸基を有する高リン酸化形態では、抗付 着生物活性の点において天然と組換え（ｐＲＪＢ−９）ヒトβ−カゼインとの間 で本質的に差はなかった。これらの結果から、インフルエンザ菌のヒト咽頭細胞 への付着を防止するβ−カゼインの生物活性は、リン酸化レベルに依存すること が分かる。リン酸化が全くまたは殆どされていないβ−カゼインは無効である。 インフルエンザ菌のヒト咽頭細胞への付着を防 止するためには３、４または５個のリン酸基を結合させなければならない。結果 は、インフルエンザ菌の付着防止の点で、本発明のプラスミドを用いて調製され たリン酸化組換えβ−カゼインは天然ヒトβ−カゼインと同等に有効であること をも示す。 これらの結果を表１に示す。インフルエンザ菌は、中耳炎の原因菌であると同定されてきた（Ｍｕｒｒａｙら 、１９９４）。本明細書に記載のプラスミドの下に少なくとも３部位がリン酸化 された組換えヒトβ−カゼインはインフルエンザ菌のヒト細胞への付着を防止す ること が上記した実験で立証されたことから、上記したリン酸化組換えヒトβ−カゼイ ンはヒト、特にヒト乳児の中耳炎の予防及び治療に使用され得ると結論づけられ る。 少なくとも３個のリン酸基を有するリン酸化組換えヒトβ−カゼインを治療上 有効量含む液体経腸栄養製品、例えば乳児用調合乳を経腸的に補給または摂取す ることにより、治療効果を得ることができる。本発明を実施する際に使用される 組換えリン酸化ヒトβ−カゼインは、本質的にプロモーター、続いてヒトβ−カ ゼインをコードするヌクレオチド配列、続いてヒトβ−カゼインをリン酸化し得 る酵素をコードするヌクレオチド配列からなるプラスミドの支配下に合成される ものが好ましい。本発明を実施する際に使用される乳児用調合乳のような液体経 腸栄養製品が更に少なくとも１種の哺乳動物乳（例えば母乳、牛乳またはヤギ乳 ）由来の他のタンパク質及び／または少なくとも１種の植物（例えば大豆または 米）由来の他のタンパク質を含んでもよいことは当然である。インフルエンザ菌 のヒト鼻咽頭細胞への付着は、リン酸化組換えヒトβ−カゼインを有効量含む製 剤を経鼻的にまたはのどスプレーとして投与することによっても防止することが できる。経鼻的に投与される製剤は 点鼻薬またはスプレーの形態であってもよい。前記製剤を経腸的に、のどスプレ ーとしてまたは経鼻的に投与することが有効であると考えられる。なぜならば、 β−カゼインを摂取、消化させた後よりもヒトβ−カゼインが鼻咽腔で直接接触 して相互作用が生ずると考えられるからである。 本明細書に記載の方法により、微生物においてリン酸化組換え哺乳動物タンパ ク質を大量生産することができる。この方法を用いると、組換えヒトβ−カゼイ ンを含めた組換え外来タンパク質を大量に産生することができる。バイオリアク ターでβーカゼインをリン酸化できることから、天然ヒトβ−カゼインと同等の 組換えβ−カゼインを発酵槽で大規模に合成することができる。このことにより 、天然リン酸化形態のヒトβ−カゼインを含む乳児用調合乳の製造が容易となる 。本明細書に記載の方法は、リン酸化及び脱リン酸化により調節され、よって細 胞代謝におけるシグナルとして機能する受容体を含めた細胞タンパク質をリン酸 化するためにも使用することができる。この方法により、ペプチド受容体をリン 酸化するための低コストな方法が提供され、この方法は医薬の製造に使用される 。 組換えリン酸化ヒトβ−カゼインのような発酵タンパク質を 工業的に生産するためには、単一プラスミド系が２−プラスミド系よりも好まし い。増殖培地中に存在する抗生物質により生ずる選択圧なしに組換えタンパク質 を大規模に生産すると、発酵過程でプラスミドの損失が起こる。なぜならば、２ つのプラスミドを含む細胞がプラスミドを１つしか含まないかまたは全く含まな い場合に比して選択的利点を示さず、また２つのプラスミドの存在により負荷が 加わり、増殖が遅くなる。発酵過程で細菌中に両方のプラスミドを維持するため に必要な選択圧を与えるべく複数の抗生物質を使用すると、しばしば細菌の増殖 が遅れ、所望の組換え体の収量が低下する。従って、工業的な目的では本明細書 に記載の単一プラスミド系が従来の２−プラスミド系よりも非常に好ましい。 ３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインは、標準的なま たは特殊な液体経腸栄養製品や幼児用飲料物に配合することができる。前記した 液体経腸栄養製品としては、ヒト以外の哺乳動物乳（例えば、牛乳またはヤギ乳 ）由来のタンパク質または植物（例えば、大豆または米）由来のタンパク質を含 む乳児用調合乳が例示されるが、これに限定されない。 ３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン を配合した製品は、インフルエンザ菌がヒト細胞へ付着するのを防止するために 使用され、ヒト乳児の中耳炎を治療及び予防するために使用される。 本明細書に記載の、天然ヒトβ−カゼインと類似もしくは同一の諸特性を有す る組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを産生するための本発明の新規な方法により 、上記タンパク質を乳児用調合乳に添加することができ、乳児用調合乳を発育中 の幼児に対して重要な利点を有する母乳により近づけることができる。細菌系で 組換え修飾ヒトタンパク質を産生するための本方法により、ヒトタンパク質を他 の食品及び医薬品に添加することが可能となる。 本発明の特に好ましい実施態様を実験及び添付した図面を参照しながら上記し てきたが、本発明がこれらの特定実施態様に限られず、添付の請求の範囲で規定 される発明の趣旨乃至範囲を逸脱しない限り当業者が多くの修正及び変更をなし 得ることは自明である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ハンソン，レンナート スウエーデン国、エス−907 38・ウメオ、 ビヨルクベーゲン・50 (72)発明者 バクスター，ジエニフアー・ハリス アメリカ合衆国、オハイオ・43201、ガレ ナ、ビツク・ウオールナツト・ロード・ 6515 (72)発明者 ハーズ，ロバート・ジヨージ アメリカ合衆国、オハイオ・43015、デラ ウエア、メイナード・ロード・4575 (72)発明者 レオナルド，アマンダ・ユン−ヨン アメリカ合衆国、オハイオ・43230、ガハ ナ、シエイドウツド・コート・581 (72)発明者 アンダーソン，ステイーブン・ニール アメリカ合衆国、オハイオ・43213、コラ ンバス、タラゴン・ウエイ・82 (72)発明者 ハーベイ，リンダ・アン アメリカ合衆国、カリフオルニア・94025、 メンロ・パーク、ウエイバリー・ストリー ト・298

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを治療上有 効量含むことを特徴とするインフルエンザ菌のヒト細胞への付着を防止するため の液体栄養製品。 ２． ３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを治療上有 効量含むことを特徴とするインフルエンザ菌のヒト乳児細胞への付着を防止する ための乳児用調合乳。 ３． ３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを治療上 有効量含むことを特徴とするインフルエンザ菌のヒト細胞への付着を防止するこ とによりヒトの中耳炎を治療及び予防するための液体栄養製品。 ４． ３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを治療上有 効量含むことを特徴とするインフルエンザ菌のヒト細胞への付着を防止すること によりヒト乳児の中耳炎を治療及び予防するための乳児用調合乳。 ５． 組換えリン酸化ヒトβ−カゼインが、本質的にａ．プロモーター、ｂ．続 いてヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列、ｃ．続いてヒトβ−カゼ インをリン酸化し得る酵素 をコードするヌクレオチド配列からなるプラスミドの支配下に合成されることを 特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の製品。 ６． 液体経腸栄養製品が更に、少なくとも１種の哺乳動物乳由来の他のタンパ ク質を含むことを特徴とする請求の範囲第１項または第３項に記載の製品。 ７． 乳児用調合乳が更に、少なくとも１種の哺乳動物乳由来の他のタンパク質 を含むことを特徴とする請求の範囲第２項または第４項に記載の製品。 ８． 液体経腸栄養製品が、少なくとも１種の哺乳動物乳由来の他のタンパク質 、及び本質的にａ．プロモーター、ｂ．続いてヒトβ−カゼインをコードするヌ クレオチド配列、ｃ．続いてヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードす るヌクレオチド配列からなるプラスミドの支配下に合成されるリン酸化ヒトβ− カゼインを含むことを特徴とする請求の範囲第１項または第３項に記載の製品。 ９． 乳児用調合乳が更に、少なくとも１種の哺乳動物乳由来の他のタンパク質 、及び本質的にａ．プロモーター、ｂ．続いてヒトβ−カゼインをコードするヌ クレオチド配列、ｃ．続い てヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオチド配列からな るプラスミドの支配下に合成されるリン酸化ヒトβ−カゼインを含むことを特徴 とする請求の範囲第２項または第４項に記載の製品。 １０． 液体栄養製品が更に、少なくとも１種の植物性タンパク質を含むことを 特徴とする請求の範囲第１項または第３項に記載の製品。 １１． 乳児用調合乳が更に、少なくとも１種の植物性タンパク質を含むことを 特徴とする請求の範囲第２項または第４項に記載の製品。 １２． 液体栄養製品が、少なくとも１種の植物性タンパク質、及び本質的にａ ．プロモーター、ｂ．続いてヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列、 ｃ．続いてヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオチド配 列からなるプラスミドの支配下に合成されるリン酸化ヒトβ−カゼインを含むこ とを特徴とする請求の範囲第１項または第３項に記載の製品。 １３． 乳児用調合乳が、少なくとも１種の哺乳動物乳由来の他のタンパク質、 及び本質的にａ．プロモーター、ｂ．続いて ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列、ｃ．続いてヒトβ−カゼイン をリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオチド配列からなるプラスミドの支配 下に合成されるリン酸化ヒトβ−カゼインを含むことを特徴とする請求の範囲第 ２項または第４項に記載の製品。 １４． 経鼻的に投与される３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ −カゼインを治療上有効量含む製剤からなることを特徴とするインフルエンザ菌 のヒト鼻咽頭細胞への付着を防止するための製品。 １５． ３〜５個のリン酸基を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを治療上 有効量含むことを特徴とするインフルエンザ菌のヒト鼻咽頭細胞への付着を防止 するためののどスプレー製剤。 １６． インフルエンザ菌を少なくとも３個のリン酸基を有する組換えリン酸化 ヒトβ−カゼインと接触させることを特徴とするインフルエンザ菌のヒト咽頭細 胞への付着を防止するための製品。 １７． リン酸化ヒトβ−カゼインが、本質的にａ．プロモーター、ｂ．続いて ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド 配列、ｃ．続いてヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオ チド配列からなるプラスミドの支配下に合成されることを特徴とする請求の範囲 第１４項〜第１６項のいずれか１項に記載の製品。