JP2000500975A - 薬剤の活性の測定のための方法 - Google Patents
薬剤の活性の測定のための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
薬剤の活性、特に細胞増殖抑制活性を測定するための方法に関する。前記方法は、下記工程:(a)細胞と共に薬剤のインキュベーション工程、及び(b)CD95/CD95−L系により引き起こされるアポトーシスの程度の検出工程、を含む。
Description
【発明の詳細な説明】
薬剤の活性の測定のための方法
本発明は、薬剤の活性、特に細胞増殖抑制活性を測定するための方法に関する。
ガン又はエイズ等に対する薬剤活性を評価し得るシステムを開発する苦労は、
今までのところ全く報われてこなかった。例えば、いくらかの種類のガンに有効
であることが分かっていたとしても、薬剤のいくらかは他の種類のガンの場合に
は効果を示さないことが分かっている。個々のケースにおいては、効果さえも患
者に依存し、そして治療中の薬剤によるすべての副作用が受容できる程度の場合
にのみ、治療が成功かどうかを調べることができる。これは、しばしば時間の浪
費に終わり、治療が途中で打ち切られなければならないし、新規の薬剤を患者に
たいして試さなければならなかった。また、この薬剤が思ったように成功するか
どうかは保証されるものではなかった。このように、信頼性の高い、薬剤活性の
測定に有用な方法が望まれている。
したがって、本発明の目的は、薬剤の活性、特に細胞増殖抑制活性を測定する
ために有用な方法を提供することである。
本発明によれば、請求の範囲に示された主題によりこのことが達成される。
本出願人は薬剤の活性、例えば細胞増殖抑制活性を測定するために、薬剤によ
ってアポトーシス陽性細胞で誘導されるアポトーシスの程度が好適であることを
認識した。アポトーシスとは、プログラムされた細胞死に対する名称である。そ
れは、例えば、器官形成および変態、組織の萎縮および腫瘍の退行のケースにお
いて見出される。アポトーシスは、細胞質の濃縮、細胞膜の絨毛の損失、核の分
割および染色体DNAの広範な分解と関連している。アポトーシスの促進は、A
IDS、自己免疫疾患等の最も多様な疾患に関連して発生することがわかった。
AIDSの場合、アポトーシスがCD4−T細胞の強力な減少の原因であるよう
に思われる。腫瘍や白血病のケースにおいては、アポトーシスは減少する。出願
人の研究の結果、腫瘍治療に用いられる、細胞増殖抑制剤と呼ばれる薬剤の細胞
毒性効果は、とりわけ、アポトーシスの誘導に基づくことが示されている。
多くの正常細胞及び悪性細胞において、CD95およびAPO1とそれぞれ称
される細胞表面蛋白質が見出されている。CD95リガンドおよびAPO−1リ
ガンドと称される可溶性または膜結合蛋白質は、それぞれ、この細胞表面蛋白質
に結合して、アポトーシスの誘導を引き起こすことができる。
CD95リガンド、以下CD95−Lと呼ぶ、の発現は、細胞増殖抑制剤等の
薬剤の投与により誘導される。このリガンドは細胞によって外側に放出され、次
いで、細胞膜内に位置するCD95レセプターに結合することができる。アポト
ーシスは、シグナル経路を介して、CD95−LのCD95への結合により誘導
され、そしてその細胞は死滅する(いわゆるオートクリン・スイサイド)。さら
に、CD95リガンドが外側に放出され、隣接するCD95−陽性細胞に結合し
、それによりアポトーシスが引き起こされ得る(いわゆるフラチシド又はパラク
リン・デス)。細胞凝集物の全体の崩壊に至るかもしれないカスケード効果が現
れる。
本発明の方法は、CD95/CD95−Lシステムを利用する、即ち、薬剤と
共に細胞をインキュベートすること、並びにCD95/CD95−Lシステムに
より引き起こされるアポトーシスの程度を測定することを含む。
「細胞」という用語は、CD95/CD95−Lシステムによりアポトーシス
が引き起こされるいかなる細胞をも含む。これらは好ましくは白血病細胞であり
、より好ましくはT−ALL細胞系であり、最も好ましくは細胞系CEM又はJ
urkatである。
「薬剤」という用語は、ヒト又は動物の診断及び/又は治療に使用できるいか
なる物質又は作用剤をも含む。本明細書では、薬剤は好ましくは細胞増殖を抑制
する作用を示す物質又は作用剤であり、細胞増殖抑制剤と呼ばれる。
アポトーシスの程度は様々な方法により検出することができる。以下に、例示
により述べる。
− 細胞膜絨毛の損失、核の分割又は染色体DNAの広範な分解等の、細胞の
形態的な変化、
− DNA断片化のパターン
− FSC/SSC分析
− 低二倍体様核
− ノーザンブロット又はRT−PCRによる、CD95−LのmRNA量の
測定。
顕微鏡の使用等の一般的な方法により、細胞の形態的な変化を介してアポトー
シスを検出することができる。
一般的な方法により、DNA断片化のパターンを介してアポトーシスを検出す
ることができる。例えば、公知の方法により、薬剤で処理した細胞からDNAを
得る。このDNAを、例えば、1.7%アガロースのアガロースゲル上で、例え
ば、30Vで6時間の電気泳動により分離する。エチジウムブロマイドによる染
色及び紫外線光の存在下での可視化の後、アポトーシスの誘導された程度に依存
して、分解されたDNAがより多く又はより少なく見出される。アポトーシスが
進んだ段階では、DNAは、「DNAラダー」として肉眼で知覚される多数のバ
ンドを示す。
一般的な方法により、FSC/SSC分析を介してアポトーシスを検出するこ
とができる。例えば、フローサイトメーターにおける閃光反応(前面散乱/側面
散乱、FSC/SSC)の特徴的な変化により、アポトーシス細胞を同定するこ
とができる。
一般的な方法により、低二倍体様核を介してアポトーシスを検出することがで
きる。例えば、薬剤と共にインキュベートした細胞をNicoletti緩衝液
(プロピジウムヨージドを50μg/mLを含有する、0.1のクエン酸ナトリ
ウム+0.1%のtritonX−100)中で溶解させ、そして、プロピジウ
ムヨージドで染色した核をフローサイトメトリー(FACScan)によって分
析する。
一般的な方法により、CD95−LのmRNAの量を介してアポトーシスの検
出がなされ得る。例えば、CD95−LのcDNA断片を特異的ハイブリダリズ
用プローブとして使用するノーザンブロット法を実施することができる。そのよ
うなプローブは、例えば、CD95−LのcDNAの301〜899位の断片を
含む。
CD95−LのmRNAの量を、RT−PCR反応によって定量的に求めるこ
とができる。CD95−Lについての定量的PCRのケースにおいては、CD9
5−L特異的DNA競合断片をPCR反応に添加することにより、CD95−L
のcDNAの量が滴定される。一定量の全RNAのcDNAへの完全な逆転写は
、この工程より先行する。該競合断片は、ヌクレオチド配列の中央での追加の塩
基対によりCD95−Lの「野生型」cDNAとは異なるが、同一の隣接した配
列を有する。したがって、野生型と競合断片とは、同じプライマーの組合せによ
り認識され、PCRにおいて共同して増幅されうる。同一のプライマー結合部位
と類似のヌクレオチド配列により、両断片は、同じ増幅速度に供される。しかし
ながら、サイズにおける微小な相違は、PCRによるゲル電気泳動により両DN
A種の分離を可能にする。アガロースゲル上でのDNAバンドの強度は、PCR
において使用された最初のcDNAの量を反映する。ゲル上でのCD95−Lお
よび競合DNAバンドの結果が同じならば、競合物とCD95−Lとの同じ初期
濃度が用いられたと結論することができる。この方法により滴定されたCD95
−L cDNAの量は、逆転写が完全に先行するので、全RNA中のCD95−
L mRNAの量を反映する。
本発明の方法は、治療上投与もされる薬剤の濃度を、その活性に関してテスト
することに有用である点で顕著である。このことから、本発明の方法により得ら
れる結果は、患者における薬剤の効果について直接的な提示を可能にする。
さらに、本発明の方法は、確立された薬剤の新しい分類に加え、好ましくは、
腫瘍及びエイズの治療のための新規薬剤の開発のための、骨髄、免疫系、肝臓等
の正常組織におけるそれらの副作用のキャラクタライズを行うための、及び化学
療法に耐性を有する患者細胞の診断のための、分子的な基礎に基づく細胞増殖抑
制剤を提供する。また、該方法は、細胞抑制耐性を突破するためのアプローチを
与える。図面の簡単な説明
図1は、ドキソルビシンによるCD95リガンドの誘導を示す。
図2は、メトトレキセートによるCD95リガンドの誘導を示す。
図3は、CD95抗体による、ドキソルビシン誘導性アポトーシスの阻害を示
す。
本発明を以下の実施例により記述する。実施例:細胞増殖抑制剤によるCD95リガンドの誘導の測定
T−ALL細胞系であるCEMの細胞を、種々の濃度のドキソルビシン及びメ
トトレキセートと共に、それぞれ(4時間、8時間、24時間と)時間を変えて
インキュベートした。オリゴ−dTセルロースを用いて、これらの細胞から全R
NAを単離した。この全RNA250ngを、公知の方法による逆転写酵素を用
いてcDNAに転写した。定量的RT−PCRを行って、全RNA中のCD95
−LのmRNAを測定する。CD95−Lの発現割合を定量化するために、ピペ
ットを用いて、全RNAが逆転写された、250ngのcDNAをPCRの容器
に移した。5〜10000fgの異なる希釈の上記のCD95−L競合断片を、
ネガティブコントロールを除くそれぞれのサンプルに添加する。PCR反応は、
1×PCR緩衝液(10mMのトリス−塩酸、pH8.8;50mMのKCl、
0.08%のNP40)、1mMのMgCl2、200μMのdNTPs、0.
5μMのプライマー(Lup:5’−ATCTTCAAACCTCCATGATG
−3’=ヒトCD95−Lの301/325ヌクレオチドに結合する;Ldw :
5’−CCAGAGAGAGCTCAGATACGTTGAC−3’=ヒトCD
95−Lの775/779ヌクレオチドに結合する)及びバッチ当たり1.12
単位のTaqポリメラーゼを用いての、cDNA(=250ngの逆転写された
全RNA)を含有する、50μLのバッチ内で実施する。
PCR反応条件は次の通りである:94℃で35秒間、56℃で90秒間、及
び72℃で120秒間、36反応サイクル。20μLのPCR反応混合物をそれ
ぞれアガロースゲルに添加し、電気泳動により分離し、そしてエチジウムブロマ
イドで染色した。250ngの逆転写された全RNAに含まれるCD95−Lの
mRNAの量を、野生型のバンド及び競合物のバンドとの強さの比較から推測す
ることができる。
ドキソルビシン及びメトトレキセートにより得られた結果は、図1及び図2に
示されている。それにより、ドキソルビシン及びメトトレキセートはCDM細胞
中でCD95リガンドを誘導し、そしてアポトーシスを剌激することとなる。
図3は、CD95−Lのそのレセプターへの結合によってドキソルビシン誘導
性アポトーシスが伝達されることを示す。CD95の阻害は、ドキソルビシン誘
導性アポトーシスを妨げる。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1997年12月3日(1997.12.3)
【補正内容】
請求の範囲
1. 下記の工程:
(a)細胞と共に細胞増殖抑制剤のインキュベーション工程、及び
(b)CD95/CD95−L系により引き起こされるアポトーシスの程
度の検出工程、
を含む細胞増殖抑制剤の細胞増殖抑制活性を測定するための方法。
2. 該細胞が確立された細胞系又は患者由来であることを特徴とする請求項1
記載の方法。
3. 該細胞が白血病細胞又は腫瘍細胞であることを特徴とする請求項2記載の
方法。
4. 該白血病細胞がT−ALL細胞系であることを特徴とする請求項3記載の
方法。
5. 該T−ALL細胞系が細胞系CEM又はJurkatであることを特徴と
する請求項4記載の方法。
6. アポトーシスの程度が、
− 細胞の形態的な変化、
− DNA断片化のパターン
− 低二倍体様核
− FCS/SSC分析
− CD95−LのmRNAの量の測定により検出されることを特徴とす
る請求項l〜5いずれか記載の方法。
7. 該CD95リガンドのmRNAがノーザンブロット分析又はRT−PCR
により測定されることを特徴とする請求項6記載の方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 フリーゼン,クラウディア
ドイツ連邦共和国 ヌスローハ デー―
69226 ハイドンシュトラーセ 1
(72)発明者 クラメル,ペーテル
ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー
―69120 ヴェルデルシュトラーセ 11
(72)発明者 ヘール,イングリット
ドイツ連邦共和国 ブレッテン デー―
75015 ロイヒリンシュトラーセ 42
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 下記の工程: (a)細胞と共に薬剤のインキュベーション工程、及び (b)CD95/CD95−L系により引き起こされるアポトーシスの程 度の検出工程、 を含む薬剤の活性、特に細胞増殖抑制活性を測定するための方法。 2. 該薬剤が細胞増殖抑制剤であることを特徴とする請求項1記載の方法。 3. 該細胞が確立された細胞系又は患者由来であることを特徴とする請求項1 又は2記載の方法。 4. 該細胞が白血病細胞又は腫瘍細胞であることを特徴とする請求項3記載の 方法。 5. 該白血病細胞がT−ALL細胞系であることを特徴とする請求項4記載の 方法。 6. 該T−ALL細胞系が細胞系CEM又はJurkatであることを特徴と する請求項5記載の方法。 7. アポトーシスの程度が、 − 細胞の形態的な変化、 − DNA断片化のパターン − 低二倍体様核 − FCS/SSC分析 − CD95−LCのmRNAの量の測定により検出されることを特徴と する請求項1〜6いずれか記載の方法。 8. 該CD95リガンドのmRNAがノーザンブロット分析又はRT−PCR により測定されることを特徴とする請求項7記載の方法。
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