DE19962828A1 - Screeningsverfahren für Chemotherapeutika - Google Patents
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die die Figur 5A dargestellte AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors, vorzugsweise des CD95L-Promotors, umfaßt, der mit einem Reportergen oder dem CD95L-Gen funktionell verknüpft ist, b) Inkontaktbringen der DNA-Sequenz von a) mit der Testverbindung in einem zellulären Assay und c) Bestimmung der Aktivierung des Promoters, wobei eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersu
chung, ob eine Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam
ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Bereit
stellung einer DNA-Sequenz, die die in Fig. 5A dargestellte
AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors, vorzugsweise des
CD95L-Promotors, umfaßt, der mit dem CD95L-Gen oder einem
Reportergen funktionell verknüpft ist, b) Inkontaktbringen der
DNA-Sequenz von a) mit der Testverbindung in einem zellulären
Assay und c) Bestimmung der Aktivierung des Promotors, wobei
eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine
Chemotherapie wirksam ist.
Die Umwandlung von normalen Zellen zu Krebszellen vollzieht
sich in mehreren Teilschritten, bei denen es zur Mutation
zellulärer Gene (Proto-Onkogene und Tumorsuppressorgene) oder
zum Erwerb viraler Onkogene kommt. Krebsrelevante Veränderun
gen sind die Aktivierung von Proto-Onkogenen durch Mutationen,
Genamplifikation, Überexpression oder Chromosomen-Transloka
tionen, sowie die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen durch
Mutationen, beispielsweise Deletionen. Bezüglich der Präven
tion bzw. der Behandlung von Krebs erwiesen sich die Tumorsup
pressorgene als besonders interessant, da diese offensichtlich
neue Möglichkeiten in der Krebstherapie bieten. Allerdings
ergibt sich aus den bisherigen Untersuchungen, daß zwar Tumor
suppressorgene ein wichtiges Ziel bei der Behandlung von Krebs
darstellen, leider konnten allerdings die gewonnenen Erkennt
nisse bisher kaum in die Praxis umgesetzt werden und so er
folgt die Krebstherapie bisher im Wesentlichen durch zyto
statische Behandlungen von Krebspatienten, sei es durch rela
tiv unspezifisch wirksame Zytostatika oder durch Strahlenbe
handlung. Die zytostatische Behandlung von Tumoren mit Hilfe
von Zytostatika oder Strahlenbehandlung hat jedoch erhebliche
Nachteile, die auf massiven Nebenwirkungen beruhen. Daher
besteht ein hoher Bedarf an der Identifizierung neuer Chemo
therapeutika, vor allem solcher, die spezifischer wirken bzw.
geringerer Nebenwirkungen aufweisen.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem
zugrunde, Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen be
reitzustellen, die für eine Chemotherapie, beispielsweise bei
der Krebsbekämpfung, wirksam sind.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereit
stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Aus
führungsformen erzielt.
Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß für
die starke Erhöhung der Expression des CD95L-Gens durch Chemo
therapeutika eine spezifische Sequenz im CD95L-Promotor, die
eine AP-1-Stelle enthält, verantwortlich ist. Durch die Erhö
hung der Transkriptionsrate für das CD95L-Gen kommt es wieder
um direkt oder indirekt zu einer Apoptose von Tumorzellen.
Somit können durch Screeningverfahren, bei denen die vorste
hende DNA-Sequenz als Sonde verwendet wird, neue Verbindungen
identifiziert werden, die als Chemotherapeutika von Nutzen
sind.
Zu den Chemotherapeutika zählen u. a. solche Verbindungen, die
in Tumorzellen Apoptose induzieren können. Dabei zeigte sich,
daß an der Induktion der Apoptose in lymphoiden und nicht
lymphoiden Geweben, beispielsweise Lebergewebe und Darmgewebe,
das CD95(Apo-1/Fas)/CD95L-System beteiligt ist, das eine
Schlüsselfunktion bei der Regulation der Apoptose einnimmt.
Die Hochregulierung des Liganden zu CD95 (CD95L) stellt wohl
einen der wichtigsten Mechanismen dar, mittels dessen Krebs
mittel in Tumoren Apoptose induzieren können. Im Laufe der
Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten,
wurde festgestellt, daß die Hochregulation von CD95L zumindest
in Leberzellen funktionell relevant ist und auf der Ebene der
Transkriptionsregulation abläuft. Es zeigte sich, daß die
Stimulierung der CD95L-Expression durch Chemotherapeutika
(z. B. 5-Fluorouracil (5-FU) und Etoposid) von dem basalen
CD95L-Promotor (136 bp) abhängt. Ein AP-1-Element innerhalb
des 5'-nicht-translatierten Bereichs (5'UTR) stromabwärts
einer "TATA-Box" wird zur Induktion des Promotors benötigt.
Diese Steigerung der Transkriptionsrate ist Transkriptions-
und Translations-abhängig und wird durch die Bindung eines
Jun/Fos-Heterodimers an diese AP-1-Stelle vermittelt. Zusam
mengefaßt kann davon ausgegangen werden, daß die von Chemo
therapeutika induzierte Apoptose in Leberzellen vermutlich
nach folgendem Mechanismus abläuft: Einerseits induzieren
Chemotherapeutika das CD95-Gen über einen transkriptionell
regulierten p53-abhängigen Mechanismus. Andererseits wirken
Chemotherapeutika auf den SAPK/JNK-Weg ein, was schließlich
zur Hochregulation von CD95L führt. Nach Anwesenheit beider
Moleküle (CD95 und CD95L) auf der Oberfläche einer Zelle kann
diese entweder "Selbstmord" begehen oder ihre Nachbarzelle
über einen als "Brudermord" bezeichneten Mechanismus abtöten.
Es zeigte sich außerdem, daß die Wirkung der Chemotherapeutika
auf den CD95L-Promotor verzögert ist. Ein steiler Anstieg der
mRNA-Spiegel und der mittels der Aktivierung des Luciferase-
Gens als Reprotergen gemessenen Promotoraktivität tritt 20 bis
25 Stunden nach der Behandlung mit Chemotherapeutika ein und
dieser Anstieg setzt sich danach fort. Interessanterweise
zeigen verschiedene Chemotherapeutika (z. B. 5-FU und Etoposid)
eine synergistische Wirkung hinsichtlich der Aktivierung des
CD95L-Promotors. Diese Beobachtungen können zur Verbesserung
der Chemotherapie für verschiedene Tumore Anwendung finden,
beispielsweise, wie schon vorstehend diskutiert, auch zur
Etablierung eines Screeningsystems zur Isolierung neuer Chemo
therapeutika verwendet werden, und zu einem verbesserten Ver
ständnis der Nebenwirkungen bei der Verabreichung von Chemo
therapeutika an Patienten führen. Damit sollte es auch möglich
sein, neue Chemotherapeutika zu isolieren bzw. zu entwickeln,
die eine Behandlung von Tumoren erlauben, die gegen die bisher
bekannten Chemotherapeutika bereits resistent sind. Auch soll
te es möglich sein, Chemotherapeutika zu finden, die eine
höhere Spezifität aufweisen, wodurch geringere Nebenwirkungen
auf gesunde Zellen die Folge wären.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit
ein Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung für
eine Chemotherapie wirksam ist, wobei das Verfahren folgende
Schritte umfaßt:
- 1. Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die die in Fig. 5A dargestellte AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors, vorzugsweise des CD95L-Promotors, umfaßt, der mit einem Re portergen oder dem CDS95L-Gen funktionell verknüpft ist;
- 2. Inkontaktbringen der DNA-Sequenz von a) mit der Test verbindung in einem zellulären Assay; und
- 3. Bestimmung der Aktivierung des Promotors, wobei eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine Chemo therapie wirksam ist.
Der hier verwendete Ausdruck "AP-1-Stelle" umfaßt die AP-1-
Stelle (a) mit der in Fig. 5A gezeigten Sequenz und (b) mit
einer sich von der in Fig. 5A dargestellten Sequenz durch
eine oder mehrere Insertionen, Austausche oder Additionen von
Nucleotiden unterscheidenden Sequenz, wobei diese Veränderun
gen nicht zu einem Verlust der AP-1-Stelle hinsichtlich der
Aktivierbarkeit durch die hier diskutierten Faktoren führen.
Bei den Testverbindungen kann es sich um sehr unterschiedliche
Verbindungen handeln, sowohl natürlich vorkommende als auch
synthetische, organische und anorganische Verbindungen, sowie
Polymere (z. B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und
Polynucleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper, Zucker,
Fettsäuren, Nucleotide und Nucleotid-Analoge, Analoge von
natürlich vorkommenden Strukturen (z. B. Peptid-"Imitatoren",
Nucleinsäureanaloge etc.) und zahlreiche weitere Verbindungen.
Zur Herstellung der DNA-Sequenz von Schritt a) kann der Fach
mann nach üblichen in vitro-Rekombinationsverfahren, wie sie
beispielsweise in Sambrook J, EF Fritsch, T. Maniatis (1989).
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Ausgabe. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY be
schrieben sind, vorgehen.
Desweiteren kann der Fachmann zur Herstellung des zellulären
Assays übliche Zellen, wie HepG2 oder Hep3B, verwenden und in
diese die DNA-Sequenz von Schritt a) mittels üblicher Verfah
ren, wie Transfektion oder Elektroporation, einführen. Hierzu
wird ebenfalls auf Sambrook J. et al., supra verwiesen. Die
Verbindung kann dann den Zellen z. B. über das Medium zugegeben
werden. Hierbei muß darauf geachtet werden, daß die Testver
bindung mit der DNA-Sequenz von Schritt a) unter solchen Be
dingungen in Kontakt kommt, daß eine spezifische Bindung er
möglicht wird. Danach wird vorzugsweise im selben Testsystem
bestimmt, ob eine Induktion der Transkription des mit dem
Reportergen funktionell verknüpften Promotors durch Anwesen
heit der Testverbindung stattgefunden hat. Dabei werden die
gefundenen Werte hinsichtlich der Transkriptionsrate vorzugs
weise mit den Werten in einem zweiten Testsystem verglichen,
daß sich von dem ersten nur durch die Abwesenheit der Test
verbindung unterscheidet. Grundsätzlich geeignete Assay-Forma
te für die Identifizierung von Verbindungen, die die Expres
sion von CD95L beeinflussen, sind in der biotechnologischen
und pharmazeutischen Industrie gut bekannt und für den Fach
mann sind zusätzliche Assays und Variationen des vorstehend
zur Veranschaulichung bereitgestellten Assays offensichtlich.
Neben dem CD95L-Promotor sind für das erfindungsgemäße Verfah
ren auch andere Promotoren, wie der Trail-Rezeptor-Promotor
oder der CD95-Promotor, geeignet. Veränderungen hinsichtlich
der Promotoraktivität können durch jedes geeignete Verfahren
gemessen werden. Änderungen im Expressionsspiegel können unter
Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren untersucht
werden. Dazu zählt die Überwachung der mRNA-Konzentration
(z. B. unter Verwendung geeigneter Sonden oder Primer), Immunassays
hinsichtlich der Proteinkonzentration (z. B. mittels
der nachstehend beschriebenen Antikörper), RNAse-Schutzassays,
Amplifikationsassays oder jedes andere für einen Nachweis
geeignete Mittel, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Weitere
Nachweisverfahren hinsichtlich der Aktivierung des Promotors
richten sich nach den spezifischen Eigenschaften des jeweili
gen Reportergens.
Das Suchen nach Verbindungen, die für eine Chemotherapie wirk
sam sind, kann auch in großem Maßstab erfolgen, beispielsweise
dadurch, daß eine sehr hohe Anzahl von Kandidaten-Verbindungen
in Substanzbibliotheken gescreent wird, wobei die Substanzbi
bliotheken synthetische oder natürliche Moleküle enthalten
können. Somit ist in einer bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens die Testverbindung Bestandteil
einer Substanzbibliothek.
Das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren kann anhand von
Protokollen modifiziert werden, die in der wissenschaftlichen
Literatur und der Patentliteratur beschrieben und auf dem
Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise kann eine große Anzahl
von möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test
gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld
von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle
1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben
und gleichzeitig getestet werden. Wenn ein Promotor-Aktivator
entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100
aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden,
bis ein individueller Aktivator identifiziert ist. Jedenfalls
können die Herstellung und das simultane Screenen von großen
Banken aus synthetischen Molekülen mittels gut bekannter Ver
fahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe
beispielsweise von Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164
und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Screening mit
hohem Durchsatz ("high throughput screening") stark beschleu
nigt werden. Die hier beschriebenen Assays hinsichtlich der
Promotor-Aktivierung können zur Verwendung in einem solchen
Verfahren entsprechend modifiziert werden. Es ist für den
Fachmann offensichtlich, daß für diesen Zweck zahlreiche Ver
fahren zur Verfügung stehen.
Darüber hinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise nütz
lichen Promotoraktivität-modifizierenden Verbindungen in Ex
trakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial ge
screent werden. Solche Extrakte können aus einer großen Anzahl
von Quellen stammen, beispielsweise den Spezies Pilze, Actino
myceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien.
Die Extrakte, die Aktivität zeigen, können dann zur Isolierung
des aktiven Moleküls analysiert werden. Siehe beispielsweise
Turner, J. Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 und Suh,
Anticancer Res. 15 (1995) 233-239.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens entspricht die die AP-1-Stelle enthaltende
DNA-Sequenz in Schritt a) der in Fig. 5A dargestellten Nu
cleinsäuresequenz von den Positionen -36 bis +100 oder einem
Fragment davon (wobei das Fragment noch die AP-1-Stelle ent
hält), am meisten bevorzugt von den Positionen +84 bis +91.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Reportergen ein CAT-,
Luciferase-, LacZ- oder GFP-Gen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung be
trifft schließlich ein Arzneimittel, das ein Gemisch aus min
destens zwei Verbindungen umfaßt, die gemäß dem erfindungs
gemäßen Verfahren identifiziert wurden und/oder die Expression
des CD95L-Gens fördern. Da in den nachstehenden Beispielen
gezeigt werden konnte, daß die gleichzeitige Verabreichung von
unterschiedlichen mit der Förderung der Expression von CD95L
in Zusammenhang stehenden Verbindungen zu synergistischen
Effekten führt, ist eine solche Vorgehensweise therapeutisch
von besonderem Interesse, da beispielsweise die Dosierung der
Einzelsubstanzen (stark) reduziert werden kann und somit po
tentielle schädliche Nebenwirkungen ausbleiben oder zumindest
verringert werden können. Das erfindungsgemäße Arzneimittel
liegt vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch
verträglichen Träger vor. Zu geeigneten Trägern zählen bei
spielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser,
Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel,
sterile Lösungen, etc.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann oral
oder, vorzugsweise, parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für
die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra
arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intra
thekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder
intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von
dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen
Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem
Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, beispiels
weise des Tumors, der Art der Verabreichung, etc.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich die Verwendung
des erfindungsgemäßen Arzneimittels zur Therapie von verschie
denen Erkrankungen, insbesondere Krebs und Autoimmunerkrankun
gen, wie Diabetes, Multiple Sklerose und rheumatoide Arthri
tis.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 Chemotherapeutika bewirken den CD95-vermittelten Tod
in HepG2-Zellen
HepG2-Zellen wurden fast bis zur Konfluenz gezüchtet und dann mit 100 µg/ml 5-FU über die angegebenen Zeiträume entweder in Gegenwart eines Isotyp-angepaßten Kontroll-Antikörpers oder in Gegenwart des anti-CD95L-Antikörpers NOK-1 (50 µg/ml) inku biert. Das gleiche Experiment wurde unter Hinzugabe von CD95- Fc (50 µg/ml) durchgeführt. Apoptose wurde durch PI-Ausschluß und Messung der Vorwärts/Seiten-Streuung (FSC/SSC) bestimmt. Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte mit Standardabweichun gen aus drei Proben dar. Es wurden verschiedene Experimente mit ähnlichem Ergebnis durchgeführt.
HepG2-Zellen wurden fast bis zur Konfluenz gezüchtet und dann mit 100 µg/ml 5-FU über die angegebenen Zeiträume entweder in Gegenwart eines Isotyp-angepaßten Kontroll-Antikörpers oder in Gegenwart des anti-CD95L-Antikörpers NOK-1 (50 µg/ml) inku biert. Das gleiche Experiment wurde unter Hinzugabe von CD95- Fc (50 µg/ml) durchgeführt. Apoptose wurde durch PI-Ausschluß und Messung der Vorwärts/Seiten-Streuung (FSC/SSC) bestimmt. Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte mit Standardabweichun gen aus drei Proben dar. Es wurden verschiedene Experimente mit ähnlichem Ergebnis durchgeführt.
Fig. 2 Nach Stimulation mit verschiedenen Chemotherapeutika
wird CD95L-mRNA induziert und diese Induktion wird auf der
Transkriptionsebene reguliert
Es wurden PCR-Analysen von HepG2- und Hep3B-Zellen durchge führt. Gesamt-RNA wurde extrahiert und RT-PCR wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. A+B: HepG2- und Hep3B- Zellen wurden 36 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von Bleomycin oder 5-FU inkubiert. C: Hep3B-Zellen wurden mit 100 µg/ml 5-FU über die angegeben Zeiträume inkubiert. D+E: 5- FU (100 µg/ml) wurde 48 Stunden zu HepG2-Zellen gegeben und dazu entweder der Transkritpionsinhibitor Actinomycin C1 (D) oder der Translationsinhibitor Cycloheximid (E) in den angege benen Konzentrationen.
Es wurden PCR-Analysen von HepG2- und Hep3B-Zellen durchge führt. Gesamt-RNA wurde extrahiert und RT-PCR wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. A+B: HepG2- und Hep3B- Zellen wurden 36 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von Bleomycin oder 5-FU inkubiert. C: Hep3B-Zellen wurden mit 100 µg/ml 5-FU über die angegeben Zeiträume inkubiert. D+E: 5- FU (100 µg/ml) wurde 48 Stunden zu HepG2-Zellen gegeben und dazu entweder der Transkritpionsinhibitor Actinomycin C1 (D) oder der Translationsinhibitor Cycloheximid (E) in den angege benen Konzentrationen.
Fig. 3 Die Behandlung mit Chemotherapeutika führt zu einer
Hochregulation von funktionalem CD95L
Es wurde ein 51Cr-Freisetzungs-Assay mit Hep3B-Zellen als Ef fektoren und SKW6.4-Zellen als Ziel verwendet. Hep3B-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet und mit 5-FU behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Chemotherapeutika aus dem Kulturmedium entfernt und 51Cr-markierte SKW6.4-Zellen wurden entweder mit einem Kontrollantikörper oder mit dem anti-CD95L-Antikörper NOK-1 zugegeben. Nach Inkubation über Nacht wurden die Überstände in einem Gamma-Zähler gemessen. Die relative Lyse wurde wie in Beispiel 1 angegeben berechnet. E/T ist das Verhältnis zwischen Effektor- und Zielzellen. Jede Konzentrationsreihe wurde dreifach ausgeführt. Das Diagramm stellt ein Experiment aus einer Serie von unabhängigen Experi menten mit dem gleichen Ergebnis dar.
Es wurde ein 51Cr-Freisetzungs-Assay mit Hep3B-Zellen als Ef fektoren und SKW6.4-Zellen als Ziel verwendet. Hep3B-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet und mit 5-FU behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Chemotherapeutika aus dem Kulturmedium entfernt und 51Cr-markierte SKW6.4-Zellen wurden entweder mit einem Kontrollantikörper oder mit dem anti-CD95L-Antikörper NOK-1 zugegeben. Nach Inkubation über Nacht wurden die Überstände in einem Gamma-Zähler gemessen. Die relative Lyse wurde wie in Beispiel 1 angegeben berechnet. E/T ist das Verhältnis zwischen Effektor- und Zielzellen. Jede Konzentrationsreihe wurde dreifach ausgeführt. Das Diagramm stellt ein Experiment aus einer Serie von unabhängigen Experi menten mit dem gleichen Ergebnis dar.
Fig. 4 Die Hochregulation des CD95L-Promotors durch Chemo
therapeutika wird durch gleichzeitige Stimulation mit ver
schiedenen chemotherapeutischen Verbindungen potenziert und
ist konzentrationsabhängig
A: Potenzierungseffekt verschiedener Chemotherapeutika auf den CD95L-Promotor. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-Konstrukt transfiziert und die Luciferase-Aktivität wurde nach 48stündi ger Behandlung mit 5 µM Etoposid (eto), 100 µg/ml 5-FU oder einer Kombination beider Mittel gemessen. Jeder Balken stellt den berechneten Wert aus behandelten/unbehandelten Zellen dar. Die Transfektionseffizienz in A und B wurde durch Cotrans fektion eines Renilla-Luciferase-Konstrukts, das unter der Kontrolle eines basalen Promotors stand, überwacht. Es wurden verschiedene Experimente mit gleichem Ergebnis durchgeführt.
B: Titration von 5-FU. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100- Promotor-Konstrukt transient transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden mit 1,7 µM Etoposid (eto) und ansteigenden Konzen trationen von 5-FU wie angegeben behandelt. Die Zellen wurden lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde bestimmt.
A: Potenzierungseffekt verschiedener Chemotherapeutika auf den CD95L-Promotor. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-Konstrukt transfiziert und die Luciferase-Aktivität wurde nach 48stündi ger Behandlung mit 5 µM Etoposid (eto), 100 µg/ml 5-FU oder einer Kombination beider Mittel gemessen. Jeder Balken stellt den berechneten Wert aus behandelten/unbehandelten Zellen dar. Die Transfektionseffizienz in A und B wurde durch Cotrans fektion eines Renilla-Luciferase-Konstrukts, das unter der Kontrolle eines basalen Promotors stand, überwacht. Es wurden verschiedene Experimente mit gleichem Ergebnis durchgeführt.
B: Titration von 5-FU. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100- Promotor-Konstrukt transient transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden mit 1,7 µM Etoposid (eto) und ansteigenden Konzen trationen von 5-FU wie angegeben behandelt. Die Zellen wurden lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde bestimmt.
Fig. 5 Ein die Nucleotide +20 bis +100 innerhalb der 5'UTR
des CD95L-Gens umfassender Bereich ist für die Ligandeninduk
tion nach Chemotherapie verantwortlich
A: Übersicht über die 5'UTR des CD95L-Gens. Balken stellen die -36/+100- und -36/+100-Konstrukte dar. Die eingerahmte Sequenz ist die AP-1-Stelle in der Nähe des ersten ATG-Codons. Der Pfeil zeigt die Translationsstartstelle. B: Hep3B-Zellen wur den mit den in A beschriebenen Konstrukten transfiziert und die Luciferase-Aktivität wurde nach 48stündiger Behandlung mit 5-FU (100 µg/ml) gemessen. Es ist ein repräsentatives Experi ment von fünf unabhängigen Experimenten (dreifache Proben) gezeigt. Pnull.luc ist ein als negative Kontrolle verwendetes Konstrukt ohne Promotor. Die Transfektionseffizienz wurde mittels Cotransfektion mit einem Renilla-Luciferase-Konstrukt überwacht.
A: Übersicht über die 5'UTR des CD95L-Gens. Balken stellen die -36/+100- und -36/+100-Konstrukte dar. Die eingerahmte Sequenz ist die AP-1-Stelle in der Nähe des ersten ATG-Codons. Der Pfeil zeigt die Translationsstartstelle. B: Hep3B-Zellen wur den mit den in A beschriebenen Konstrukten transfiziert und die Luciferase-Aktivität wurde nach 48stündiger Behandlung mit 5-FU (100 µg/ml) gemessen. Es ist ein repräsentatives Experi ment von fünf unabhängigen Experimenten (dreifache Proben) gezeigt. Pnull.luc ist ein als negative Kontrolle verwendetes Konstrukt ohne Promotor. Die Transfektionseffizienz wurde mittels Cotransfektion mit einem Renilla-Luciferase-Konstrukt überwacht.
Fig. 6 Die -36/+100- und -36/+19-Konstrukte verhalten sich
bezüglich der Kinetiken der Aktivierung und Induzierbarkeit
durch Cotransfektion mit c-jun und c-fos unterschiedlich
A: Cotransfektionsexperimente in Hep3B-Zellen mit Expressions vektoren für c-jun und c-fos. Die cotransfizierten Zellen wurden danach entweder 48 Stunden mit 100 µg/ml 5-FU behandelt oder unbehandelt gelassen. Die Transfektionseffizienz wurde entweder durch Cotransfektion eines Expressionsvektors für Chloramphenicoltransferase (CAT) oder Renilla-Luciferase (bei de unter Kontrolle eines basalen Promotors) normalisiert. Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem "Dual luciferase"-Assay (Promega) entsprechend den Angaben des Herstellers gemessen, die CAT-Aktivität wurde mittels eines im Handel erhältlichen CAT-ELISA bestimmt. Mittelwerte (mit Standardabweichung) aus verschiedenen unabhängigen Experimenten sind gezeigt. B: "Dual luciferase"-Assay mit Hep3B-Zellen, die mit dem beschriebenen CD95L-Promotor-Konstrukt und einem Renilla-Luciferase-Expres sionsvektor (als Kontrolle für die Transfektionseffizienz) cotransfiziert worden waren. Die Zellen wurden zu den angege benen Zeiten geerntet. Zusätzlich wurde der Proteingehalt der transfizierten Zellen bestimmt. Die Werte sind Mittelwerte (mit Standardabweichung) aus drei Proben eines repräsentativen Experiments. Es wurden vier unabhängige Experimente durch geführt.
A: Cotransfektionsexperimente in Hep3B-Zellen mit Expressions vektoren für c-jun und c-fos. Die cotransfizierten Zellen wurden danach entweder 48 Stunden mit 100 µg/ml 5-FU behandelt oder unbehandelt gelassen. Die Transfektionseffizienz wurde entweder durch Cotransfektion eines Expressionsvektors für Chloramphenicoltransferase (CAT) oder Renilla-Luciferase (bei de unter Kontrolle eines basalen Promotors) normalisiert. Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem "Dual luciferase"-Assay (Promega) entsprechend den Angaben des Herstellers gemessen, die CAT-Aktivität wurde mittels eines im Handel erhältlichen CAT-ELISA bestimmt. Mittelwerte (mit Standardabweichung) aus verschiedenen unabhängigen Experimenten sind gezeigt. B: "Dual luciferase"-Assay mit Hep3B-Zellen, die mit dem beschriebenen CD95L-Promotor-Konstrukt und einem Renilla-Luciferase-Expres sionsvektor (als Kontrolle für die Transfektionseffizienz) cotransfiziert worden waren. Die Zellen wurden zu den angege benen Zeiten geerntet. Zusätzlich wurde der Proteingehalt der transfizierten Zellen bestimmt. Die Werte sind Mittelwerte (mit Standardabweichung) aus drei Proben eines repräsentativen Experiments. Es wurden vier unabhängige Experimente durch geführt.
Fig. 7 Nucleäre Extrakte von mit Chemotherapeutika behandel
ten Leberzellinien verschieben die Mobilität eines Oligonu
cleotids, das die AP-1-Sequenz im CD95L-Promotor enthält
EMSA und "subershift"-Analysen des +73/+99-Bereichs der huma nen CD95L-Promotorsequenz wurden durchgeführt. Nucleäre Ex trakte von HepG2- und Huh7-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert. Die Zellen wurden entweder 48 Stunden mit 100 µg/ml 5-FU behandelt oder unbehandelt gelassen. EMSA- Analysen wurden wie kürzlich beschrieben durchgeführt. Für die "supershift"-Analysen wurden Antikörper gegen c-Jun oder c-Fos zugegeben. Der Isotyp-angepaßte anti-C/EBP-Antikörper wurde als Kontrolle verwendet. : Negative Kontrolle ohne nucleäre Extrakte; -: unbehandelte Zellen; +: behandelte Zellen. Anti körper wurden wie angegeben zugefügt.
EMSA und "subershift"-Analysen des +73/+99-Bereichs der huma nen CD95L-Promotorsequenz wurden durchgeführt. Nucleäre Ex trakte von HepG2- und Huh7-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert. Die Zellen wurden entweder 48 Stunden mit 100 µg/ml 5-FU behandelt oder unbehandelt gelassen. EMSA- Analysen wurden wie kürzlich beschrieben durchgeführt. Für die "supershift"-Analysen wurden Antikörper gegen c-Jun oder c-Fos zugegeben. Der Isotyp-angepaßte anti-C/EBP-Antikörper wurde als Kontrolle verwendet. : Negative Kontrolle ohne nucleäre Extrakte; -: unbehandelte Zellen; +: behandelte Zellen. Anti körper wurden wie angegeben zugefügt.
Fig. 8 Mutationen innerhalb der AP-1-Stelle zerstören die
Induzierbarkeit des Promotor-Konstrukts
Die AP-1-Stelle im basalen Promotor wurde wie angegeben mu tiert. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-Konstrukt (CD95L prom wt) bzw. dem APX4-Konstrukt (mutiertes -36/+100 CD95L.luc; CD95L prom mut) transfiziert. Die Transfektions effizienz wurde durch Cotransfektion mit Renilla-Luciferase überwacht. Nach der Transfektion wurden die Zellen 48 Stunden mit 5-FU (100 µg/ml) behandelt. Die Luciferase-Aktivität wurde gemessen und die Vervielfachung der Induktion berechnet. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 5 Experimenten) ist dargestellt.
Die AP-1-Stelle im basalen Promotor wurde wie angegeben mu tiert. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-Konstrukt (CD95L prom wt) bzw. dem APX4-Konstrukt (mutiertes -36/+100 CD95L.luc; CD95L prom mut) transfiziert. Die Transfektions effizienz wurde durch Cotransfektion mit Renilla-Luciferase überwacht. Nach der Transfektion wurden die Zellen 48 Stunden mit 5-FU (100 µg/ml) behandelt. Die Luciferase-Aktivität wurde gemessen und die Vervielfachung der Induktion berechnet. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 5 Experimenten) ist dargestellt.
Fig. 9 Dominant-negative c-jun- und dominant-negative MEKK-
1- und JNKK-1-Konstrukte hemmen die Promotoraktivierung nach
Chemotherapie
A: Einfluß von DN c-jun. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-, -36/+19- oder pnull.luc-Konstrukt transfiziert. Die Zellen wurden entweder mit einem Kontrollplasmid (c) oder einem Ex pressionskonstrukt für dominant-negatives c-jun (+) cotrans fiziert. Als Kontrolle wurde in einem Experiment c-jun zusätz lich cotransfiziert. Nach Beendigung der Transfektion wurden die Zellen aufgeteilt. Eine Hälfte wurde mit 100 µg/ml 5-FU behandelt, die andere Hälfte blieb unbehandelt. Die Balken zeigen die Vervielfachung der Induktion, die wie folgt be rechnet wurde: RLU (behandelte Zellen)/RLU (unbehandelte Zel len). Relative Luciferase-Einheiten wurden mittels der Re nilla-Luciferase-Aktivität unter Verwendung des "Dual lucife rase"-Systems normalisiert. Es wurden drei unabhängige Experi mente durchgeführt, von denen eines gezeigt ist. B: Einfluß der JNK/SAPK-Kaskade. Cotransfektionsexperimente mit einem Kontrollvektor (pUCSV) oder dominant-negativen Mutanten für die Stress-aktivierten Proteinkinasen JNKK-1, MEKK-1, MKK3 und MKK6 wurden durchgeführt. Die Werte bezüglich der Vervielfa chung der Induktion wurden wie in A berechnet. Eines von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt.
A: Einfluß von DN c-jun. Hep3B-Zellen wurden mit dem -36/+100-, -36/+19- oder pnull.luc-Konstrukt transfiziert. Die Zellen wurden entweder mit einem Kontrollplasmid (c) oder einem Ex pressionskonstrukt für dominant-negatives c-jun (+) cotrans fiziert. Als Kontrolle wurde in einem Experiment c-jun zusätz lich cotransfiziert. Nach Beendigung der Transfektion wurden die Zellen aufgeteilt. Eine Hälfte wurde mit 100 µg/ml 5-FU behandelt, die andere Hälfte blieb unbehandelt. Die Balken zeigen die Vervielfachung der Induktion, die wie folgt be rechnet wurde: RLU (behandelte Zellen)/RLU (unbehandelte Zel len). Relative Luciferase-Einheiten wurden mittels der Re nilla-Luciferase-Aktivität unter Verwendung des "Dual lucife rase"-Systems normalisiert. Es wurden drei unabhängige Experi mente durchgeführt, von denen eines gezeigt ist. B: Einfluß der JNK/SAPK-Kaskade. Cotransfektionsexperimente mit einem Kontrollvektor (pUCSV) oder dominant-negativen Mutanten für die Stress-aktivierten Proteinkinasen JNKK-1, MEKK-1, MKK3 und MKK6 wurden durchgeführt. Die Werte bezüglich der Vervielfa chung der Induktion wurden wie in A berechnet. Eines von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt.
Fig. 10 C-jun wird in Hep3B-Zellen und humanen primären
Hepatozyten nach Behandlung mit Chemotherapeutika hochregu
liert
A+B: Hep3B-Zellen wurden auf LabTek™-Kulturträgern ausgesät und zwei Tage gezüchtet. Danach wurden die Zellen entweder unbehandelt gelassen (A) oder 40 Stunden mit 5-FU (100 µg/ml) behandelt (B), fixiert und wie beschrieben angefärbt.
C+D: Humane primäre Hepatozyten wurden wie in Beispiel 1 be schrieben isoliert und auf Kulturträger ausgesät. Danach wur den die Zellen entweder unbehandelt gelassen (C) oder 40 Stun den mit 5-FU (50 µg/ml) behandelt (D), fixiert und mit einem für c-Jun spezifischen Antikörper angefärbt.
A+B: Hep3B-Zellen wurden auf LabTek™-Kulturträgern ausgesät und zwei Tage gezüchtet. Danach wurden die Zellen entweder unbehandelt gelassen (A) oder 40 Stunden mit 5-FU (100 µg/ml) behandelt (B), fixiert und wie beschrieben angefärbt.
C+D: Humane primäre Hepatozyten wurden wie in Beispiel 1 be schrieben isoliert und auf Kulturträger ausgesät. Danach wur den die Zellen entweder unbehandelt gelassen (C) oder 40 Stun den mit 5-FU (50 µg/ml) behandelt (D), fixiert und mit einem für c-Jun spezifischen Antikörper angefärbt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Die folgenden Zellinien wurden verwendet: 1) HepG2, die von
einem humanen Leberblastom stammt und Wildtyp-p53 mit niedri
ger Konzentration exprimiert, 2) Huh7, die von einem humanen
hepatozellulären Karzinom stammt und eine mutierte Form von
p53 exprimiert, bei der eine Punktmutation an Codon 220 zu
einer kürzeren Halbwertszeit von p53 führt, 3) Hep3B, die von
einem humanen hepatozellulären Karzinom stammt und für p53
defizient ist und 4) SKW6.4, eine humane T-Zelleukämie-Zelli
nie. HepG2-, Hu7- und HepG3-Zellen wurden in DMEM (Gibco BRL,
Eggenstein, Deutschland) gezüchtet, das mit 10% hitzeinakti
viertem fötalem Kälberserum (FCS)(Gibco BRL), 10 mM HEPES
(Gibco BRL), 5 mM L-Glutamin (Gibco BRL) und 100 µg/ml Genta
mycin (Gibco BRL) supplementiert worden war. SKW6.4-Zellen
wurden in RPMI-Medium (Gibco BRL) gehalten, das 10% FCS (Gibco
BRL), 10 mM HEPES (Gibco BRL), 2 mM L-Glutamin (Gibco BRL) und
100 µg/ml Gentamycin (Gibco BRL) enthielt.
Primäre humane Hepatozyten wurden mittels einer 2-Schritt-
Perfusionstechnik aus gesundem Lebergewebe von Patienten er
halten, bei denen eine partielle Leber-Resektion durchgeführt
wurde. Dazu wurde in ein Blutgefäß des entfernten Lebergewebes
eine Kanüle eingeführt und diese wurde 15 bis 20 min mit Ca-
und Mg-freier "Hank's balanced salt solution (HBSS; Gibco BRL)
perfundiert, die 0,5 mM EDTA und 50 mM HEPES enthielt. Die
Perfusion wurde 15 bis 25 min mit "William's Medium E" (WME;
Gibco BRL) fortgesetzt, das 0,05% Collagenase Typ IV (Sigma)
und 5 mM CaCl2 enthielt. Zellen wurde mechanisch von der Leber
kapsel abgetrennt und die erhaltene Zellsuspension wurde ge
filtert und in eiskaltem, Serum-freiem WME gewaschen. Zur
Abtrennung der Hepatozyten von nicht-parenchymalen Zellen
wurde 10 min bei 50 × g mit Percoll™ (eingestellt auf eine
Dichte von 1,065 g/ml; Biochrom, Deutschland, zentrifugiert.
Die Zellen wurden zweimal mit WME gewaschen und in Erhaltungs
medium zu einer Dichte von 1,0-1,5 × 105 lebende Zellen/cm2 auf
Kollagen-beschichtete Kulturplatten (Kollagen Typ I, Serva
Biochemicals, Deutschland) ausgesät. Die Lebensfähigkeit wurde
mittels des Trypan-Blau-Ausschluß-Verfahrens bestimmt. Als
Erhaltungsmedium wurde WME verwendet, das mit folgenden Ver
bindungen supplementiert worden war: 5 mM L-Glutamin (Flow
Laboratory, Deutschland), 0,6% Glucose, 0,02 M HEPES, 50 µg
Gentamycin (Sigma), 100 µg/ml Penicillin (Flow Laboratory),
100 µg/ml Streptomycin (Flow Laboratory), 37 µM Inosin (Ser
va), 17,4% DMSO (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 0,14 E/ml
Insulin (Serva). Am Tag 1 und 2 wurde das Erhaltungsmedium mit
10% FCS (Gibco BRL) supplementiert. Die Zellen wurden bei 37°C
und 5% CO2 inkubiert.
Die seriellen Deletionskonstrukte des CD95L-Promotors wurden
in den pTATA.luc-Vektor (erhältlich von T. Wirth, Institut für
medizinische Strahlen- und Zellforschung, Würzburg, Deutsch
land) cloniert oder in den pGL2-Basisvektor (Promega, Madison,
Wisconsin, USA). Die Deletionskonstrukte von -2269/+100 bis
-36/+100 wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt (Li-Weber
et al., European Journal of Immunology 28 (1998), 2373). Der
-36/+19-Vektor wurde folgendermaßen konstruiert: Das -36/100-
CD95L-Promotorfragment wurde mit Psp5II geschnitten und das
erhaltene kleinere Fragment wieder in den pTATA.luc-Vektor
cloniert. Die Sequenzen aller Konstrukte wurden mittels auto
matisierter Didesoxy-Sequenzierung (TOPLAB, München, Deutsch
land) überprüft und bestätigt.
Dominant-negative MEKK-1-Zellen (SRα3-ΔMEKK (K432M)) und domi
nant-negative JNKK-Zellen (SRα3-JNKK (K611R) wurden von M. Ka
rin zur Verfügung gestellt (Angel et al., Nature 332 (1988),
166), dominant-negative MKK3-Zellen (MKK3b-(A)) und dominant-
negative MKK6-Zellen (MKK6b-(A)) von J. Woodgett (Nishina et
al., Development 126 (1999), 505) und das Kontrollplasmid
pUCSV von P. Angel. Die DN-MEKK-, DN-JNKK-, DN-MKK3-, DN-MKK6-
und pUCSV-Konstrukte wurden bereits beschrieben (Angel et al.,
Nature 332 (1988), 166). Dominant-negative c-jun-Zellen (Δaa
1-192) und der leere Kontrollvektor pCMV wurden von D. Bohmann
zur Verfügung gestellt (Leppa et al., EMBO Journal 17 (1998),
4404). Mutationen in die +90 AP-1-Stelle bei dem -35/+100-
Konstrukt (APX-4) wurden mittels des "QuikChange"-Mutagenese-
Kits (Stratagene Corp., La Jolla, Kalifornien, USA) einge
führt. Die folgenden Primer (MWG Biotech GmbH, Ebersberg,
Deutschland) wurden für die Mutagenese-Reaktion verwendet:
APX-4/Sense: 5'-CCG TTT GCT GGG GCT GGC CTA ATT AAC CAG CTG
CCT CTA GAG G-3'; APX-4/Antisense: CCT CTA GAG GCA GCT GGT TAA
TTA GGC CAG CCC CAG CAA ACG G-3'. Die unterstrichenen Nucleo
tide stellen im Vergleich zur der Wildtypsequenz des CD95L-
Promotors mutierte Stellen dar. Die Mutationen wurden durch
automatisierte Sequenzierung (TOPLAB GmbH, München, Deutsch
land) überprüft und bestätigt.
Neutralisierende anti-CD95L-Antikörper (NOK-1) und Isotyp-an
gepaßte Kontrollantikörper wurden von Pharmingen (Hamburg,
Deutschland) bezogen. Gegen c-jun, c-fos und CEBP gerichtete
Antikörper für "Supershift"-Analysen stammten von Santa Cruz
Biotechnology Inc. (Heidelberg, Deutschland). Die Behandlung
der Zellen mit mAb IgG3-anti-APO-1 erfolgte bei einer Konzen
tration von 100 ng/ml wie kürzlich beschrieben (Berndt et al.,
PNAS USA 95 (1998), 12 556).
Zellkulturen wurden mit Bleomycin (cell pharm GmbH, Hannover,
Deutschland) in einem Dosisbereich von 1 µg/ml bis 1 mg/ml, 5-
FU (ribosepharm GmbH, München, Deutschland) bei einer Konzen
tration von 10 µg/ml bis 150 µg/ml, Etoposid (Bristol-Myers
Sqibb GmbH, München, Deutschland) in einem Dosisbereich von 1
bis 5 µM oder Cisplatin (ribosepharm GmbH, München, Deutsch
land) in einem Dosisbereich von 0,5 µg/ml bis 2,0 µg/ml be
handelt. Die Zellen wurden mit den unterschiedlichen Chemo
therapeutika 2 bis 64 Stunden inkubiert. Die klinisch relevan
ten Konzentrationen bei der Krebstherapie beim Menschen sind
folgendermaßen: Bleomycin: 1,5 µg/ml bis 3,0 µg/ml; 5-FU: -;
Etoposid: -; Cisplatin: 0,4 µg/ml bis 1,6 µg/ml.
Nach der entsprechenden Behandlung wurden die Zellen mit 1%
Trypsin-EDTA 5 min trypsiniert, zweimal mit PBS gewaschen und
mit 2,5 µg/ml Propidiumiodid (PI; Sigma) gefärbt. Die Farb
stoffaufnahme wurde mit einem "FACScan"-Zytometer (Becton
Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland) unter Verwendung der
"CellQuest"-Software gemessen. Veränderungen der Vorwärts-
/Seiten-Streuung (FSC/SSC) der Zellpopulation wurden beglei
tend ausgewertet. Zur Quantifizierung der DNA-Fragmentierung
wurden die Überstände bei 200 × g zentrifugiert, die Zellen
trypsiniert und wie vorstehend angegeben gewaschen. Zellen
wurden zusammen mit der Zelldebris in einem hypotonischen
Lysepuffer (0,1% Natriumcitrat und 0,1% Triton X100™) lysiert,
der 50 µg/ml Propidiumiodid enthielt. Die Inkubation erfolgte
über Nacht bei 4°C. Die Nuclei wurden dann hinsichtlich des
DNA-Gehalts mittels Durchflußzytometrie (Nicoletti et al.,
Journal of Immunological Methods 139 (1991), 271) analysiert.
Durch Chemotherapie induzierte CD95L-vermittelte Zytotoxizität
wurde untersucht. Hep3B-Zellen (Effektorzellen) wurden in
Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und mit Chemotherapeutika
48 Stunden lang behandelt. Nach zwei Tagen wurde das Medium
auf den Effektorzellen ausgetauscht. SKW6.4-Zellen (Zielzel
len) wurden 30 min in Na2 51CrO4 (100 µCi; NEN, Neu-Isenburg,
Deutschland) inkubiert. Danach wurden markierte Zellen zu den
Effektorzellen gegeben. Nach 12 bis 16 Stunden wurden von
jeder Vertiefung 100 µl Überstand gesammelt und diese in einem
Gamma-Zähler gemessen. Die spezifische Lyse wurde entsprechend
der Formel L = (E-S)/(T-S) berechnet, wobei E die Gamma-Zäh
lungen der unbekannten Probe darstellen, S die spontane Lyse
der markierten Zielzellen im Medium ohne Effektorzellen und T
die maximale Freisetzung der in 2 N HCl gehaltenen Zielzellen.
Der Assay wurde nur dann weiter analysiert, wenn S/T ≦ 30%
war. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung durch
geführt.
RNA aus verschiedenen Quellen wurde mittels des "RNeasy"-Kits
(Quiagen GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Hinweisen
des Herstellers gereinigt. Für jede Isolierung wurden 5 × 106-107
Zellen von HepG2- und HepB3-Zellinien verwendet. 1 µg
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von MMLV-RT (Gibco BRL) mit
oligo(dT)15-Primern (Roche Diagnostics, Heidelberg, Deutsch
land) in einer 20 µl-Reaktion durchgeführt, wobei das Reak
tionsgemisch 10 mM DTT und 500 µM dNTPs enthielt. 5 µl Ali
quots wurden in einem DNA-"Thermocycler" (Stratagene, Heidel
berg, Deutschland) mit 0,5 E Taq DNA-Polymerase (Roche Diagno
stics) in einer 50 µl Reaktion amplifiziert. Es wurden 35
Zyklen durchgeführt (Denaturierungsschritt: 30 sec 94°C; An
lagerungsschritt: 30 sec 56°C; Verlängerungsschritt: 30 sec
72°C). Die Reaktion wurde mittels eines Verlängerungsschritts
(10 min 72°C) beendet.
Primer wurden von MWG Biotech GmbH, Ebersberg, Deutschland,
bezogen. Sie hatten folgende Sequenzen: CD95L/Sense: 5'ATG TTT
CAG CTC TTC CAC CTA CAG A-3'; CD95L/Antisense: 5'-CCA GAG AGA
GCT CAG ATA CGT TGA C-3', wobei ein PCR-Produkt mit einer
Länge von 500 bp erhalten wurde. Die Primer überspannen alle
drei Introns von CD95L, was die Unterscheidung zwischen cDNA
und genomischer DNA erleichtert. Als interne Kontrolle wurde
jede revers transkribierte mRNA mittels einer β-actin-PCR
überprüft, wobei die folgenden PCR-Primer verwendet wurden: β
actin/Sense: 5'-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3';
und β-actin/Antisense: 5'-CTA GAA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG-
3', wobei ein PCR-Produkt mit einer Länge von 600 bp erhalten
wird. PCR-Produkte wurden auf 1,5-2% TBE(Tris-Borat-EDTA)-
Agarosegels analysiert.
Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen mit einer
Dichte von 0,6 × 106/9 cm-Petrischalen ausplattiert. Das
Medium wurde zwei Stunden vor der Transfektion ausgetauscht.
Die Transfektion erfolgte mittels des auf Calciumphophatpräzi
pitation beruhenden Verfahrens. Kurz zusammengefaßt wurden 5
bis 40 µg DNA in 500 µl einer Calciumchloridlösung verdünnt.
Das DNA/Calciumchlorid-Gemisch wurde tropfenweise zu 500 µl
HBS gegeben. Die Präzipitation wurde 20 min bei Raumtemperatur
durchgeführt und danach wurde das Präzipitationsgemisch zum
Kulturmedium gegeben. Das Präzipitat wurde 12 bis 24 Stunden
auf den Zellen gelassen. Danach wurden die Zellen 3 min mit
16% Glyzerin in vollständigem Medium schockbehandelt. Nach
dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mindestens sechs
Stunden in Medium gezüchtet, das mit 20% FCS supplementiert
worden war. Schließlich wurden die Zellen auf Platten mit
sechs Vertiefungen aufgeteilt und die chemotherapeutische
Behandlung für verschiedene Zeiträume wurde eingeleitet.
Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Zellen in 200 µl
passivem Lysepuffer (Promega) lysiert. Nach einer 20minütigen
Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen von den Plat
ten abgekratzt. Die Lysate wurden zwei Gefrier/Auftau-Zyklen
unterworfen und danach wurde Zelldebris durch Zentrifugation
abgetrennt. Die Überstände wurden in einem "Duolumat"-Gerät
(Fa. Berthold, Wildbach, Deutschland) mittels des "dual luci
ferase"-Assaysystems von Promega gemessen. Zur Normalisierung
der Transfektionseffizienzen wurde ein von einem basalen Pro
motor gesteuerter Renilla-Luciferase-Expressionsvektor pRenil
la verwendet. Renilla-Luciferase wurde in dem "dual lucifera
se"-Assaysystem gemessen und die CAT-Expression wurde mittels
eines im Handel erhältlichen ELISA (Roche Diagnostics) be
stimmt. Außerdem wurde die Proteinmenge in dem Proteinassay
von Biorad (München, Deutschland) gemessen und zur Normalisie
rung des Proteingehalts der transfizierten Zellen verwendet.
Nucleäre Extrakte von HepG2- und Huh7-Zellen wurden präpa
riert. Kurz zusammengefaßt wurden 4 × 107 Zellen in 10 mM
Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 2 mM MgCl2, 140 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,5
mM PMSF und 0,1% Triton-X100 lysiert. Danach wurde eine Sac
charose-Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt und die
nucleäre Fraktion in 20 mM HEPES, pH-Wert 7,9, 25% Glyzerin,
0,42 M NaCl, 1,5 MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT und 0,5 mM PMSF
abgetrennt. Nach 30 min Zentrifugation wurden die nukleären
Membranen pelletiert und die Überstände in flüssigem Stick
stoff nach Bestimmung des Proteingehalts mit dem vorstehend
beschriebenen Assay aufbewahrt.
Die AP-1-Stelle bei +90 im CD95L-Promotor enthaltenden doppel
strängigen Oligonucleotide wurden mittels T4 Polynucleotidki
nase (MBI Fermentas, St.Leon-Roth, Deutschland) mit [γ-32P]ATP
(5000 Ci/mmol; Amersham GmbH, Braunschweig, Deutschland) end
markiert. Die einzelsträngigen Oligonucleotide hatten folgende
Sequenzen: Sense: 5'-GGG CTG GCC TGA CTC ACC AGC TGC-3'; und
Antisense: 5'-GCA GCT GGT GAG TCA GGC CAG CCC-3'. Freie Nu
cleotide wurden mit "Microspin G-50"-Säulen (Pharmacia GmbH,
Freiburg, Deutschland) entfernt.
Die Bindungsreaktionen wurden 30 min bei 4°C unter Verwendung
von 5 µg nucleärem Protein in einem Puffer durchgeführt, der
100 ng/µl BSA (Roche Diagnostics), 50 ng/µl poly[d(I-C)] (Ro
che Diagnostics), 2 mM DTT (Gibco BRL), 500 µM "Pefablock"
(Roche Diagnostics), 1 µg/ml Aprotinin (Roche Diagnostics),
25 mM HEPES, 5 mM MgCl2 (Sigma), 35 mM KCl (Sigma) und 3 × 104 cpm
des markierten Oligonucleotids enthielt. Für die Supershift-
Analysen wurde 1 µg Antikörper zu der Bindungsreaktion gege
ben. Die Proben wurden auf einem nicht-denaturierenden 6%
Polyacrylamidgel in 0,5% TBE aufgetrennt und über Nacht wurde
eine Autoradiographie erstellt.
Kultivierte Hep3B-Zellen oder frisch isolierte humane primäre
Hepatozyten wurden auf Lab-Tek™-Kammerträgern (Renner GmbH,
Darmstadt, Deutschland) ausplattiert. Nach einer Züchtung über
einen Zeitraum von mindestens zwei Tagen wurden die Zellen mit
Chemotherapeutika behandelt. Im Anschluß daran wurde eine
Fixierung in Methanol/Aceton (5 min bzw. 10 sek bei -20°C)
durchgeführt. Die Zellen wurden danach 1 Stunde bei 37°C zuerst
mit dem spezifischen primären Antikörper gegen humanes c-Jun
(Santa Cruz GmbH, Heidelberg, Deutschland) inkubiert und nach
dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 1 Stunde mit
Fluoreszein-Isothiocyanat-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-
IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) bedeckt. Eine unspezi
fische Anfärbung wurde durch Inkubation mit Maus- oder Kanin
chen-Immunglobulinen anstelle des spezifischen primären Anti
körpers oder durch Blockierung des primären Antikörpers mit
dem immunogenen Peptid überwacht. Die Träger wurden mit Deck
gläschen bedeckt und mittels eines Fluoreszenzmikroskops
ausgewertet.
HepG2-Zellkulturen wurden bei 70% Konfluenz mit dem 5-FU ent
weder in Abwesenheit oder Anwesenheit von einer der CD95L
blockierenden Verbindungen behandelt und die Apoptose wurde
durch PI-Ausschluß und Analyse der Vorwärts-/Seiten-Streuung
(FSC/SSC) bestimmt. Wie aus Fig. 1 ersichtlich führt die
chemotherapeutische Behandlung zu einer signifikanten Erhöhung
der Apoptose-Rate, wobei dies 12 bis 24 Stunden nach Verabrei
chung von 5-FU eintritt und nach 48 Stunden 43% erreicht.
Diese Ergebnisse wurden durch Anfärbung der Zellen hinsicht
lich des subdiploiden DNA-Gehalts bestätigt. Die Wirkung der
Chemotherapeutika konnte durch gleichzeitige Verabreichung von
50 µg/ml CD95-Fc oder 50 µg/ml NOK-1 Antikörper im wesentli
chen blockiert werden, was auf einen starken Einfluß des CD95-
Systems auf die Chemotherapie induzierte Apoptose hinweist.
Ähnliche Ergebnisse wurden durch Behandlung mit Etoposid, ein
Hemmstoff von Topoisomerasen, erzielt.
Nachdem gezeigt werden konnte, daß CD95/CD95L-Interaktionen
für die Induktion der Apoptose nach der Einwirkung von Chemo
therapeutika von Bedeutung sind, wurde die potentielle Hoch
regulierung von CD95L nach Stimulierung untersucht. Wie aus
Fig. 2A ersichtlich ist, wird CD95L-mRNA nach Behandlung mit
Bleomycin, einem Chemotherapeutikum aus der Gruppe der Anti
biotika, hochreguliert. Alle verwendeten Konzentrationen lagen
im klinisch relevanten Bereich. Die Hochregulation konnte
sowohl in HepG2 (wt p53)- als auch Hep3B (p53 -/-)-Zellen
beobachtet werden, ist somit unabhängig von p53, da der Zelli
nie Hep3B dieses Protein fehlt.
5-FU und Etoposid können sowohl in HepG2- als auch Hep3B-Zel
len CD95L Zeit- und Dosis-abhängig hochregulieren (Fig. 2B
und 2C). Die Hochregulation von CD95L ist verzögert und tritt
in zeitlicher Relation zum Auftreten der Apoptose in Leber
zellenkrebs-Zellinien nach 20 bis 25 Stunden ein. Zur Auf
klärung des der Hochregulation von CD95L in Leberzellenkrebs-
Zellinien zugrunde liegenden Mechanismus wurden entweder mit
dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin C1 oder dem Trans
lationsinhibitor Cycloheximid Blockierungsexperimente durch
geführt. Beide Wirkstoffe wurden bei subtoxischen Konzentra
tionen verwendet und diese zeigten keine Auswirkung auf die
Transkription oder Translation des "housekeeping"-Gens β-Ac
tin. Die Hochregulation von CD95L nach Behandlung mit Chemo
therapeutika wurde jedoch effizient verringert (Fig. 2D und
2E), was auf eine Regulation von CD95L auf der Transkriptions
ebene hindeutet.
Zur Untersuchung ob die Hochregulation auf der mRNA-Ebene mit
einer Hochregulation des CD95L-Proteins auf der Zelloberfläche
zusammenfällt, wurde die Fähigkeit behandelter Hep3B-Zellen
CD95-positive Zielzellen zu töten untersucht. 51Cr-markierte
SKW6.4-Zellen, eine B-Zellinie, die hohe CD95-Spiegel expri
miert, wurden auf einem Hep3B-Zellmonolayer über Nacht inku
biert. Die Hep3B-Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen
oder 48 Stunden vor der Inkubation mit SKW6.4-Zellen mit 100
µg/ml 5-FU behandelt. Nach Gewinnung des Überstands wurde die
freigesetzte 51Cr-Aktivität gemessen. Wie in Fig. 3 darge
stellt führt die Behandlung von Hep3B-Zellen mit 5-FU zu einer
signifikanten Abtötung CD95-tragender SKW6.4-Zellen, was auf
eine Wechselwirkung zwischen CD95 und CD95L hindeutet. Um
diesen Effekt weiter zu untersuchen, wurden Blockierungsexpe
rimente mit dem Antikörper NOK-1 durchgeführt. Wie in Fig. 3
dargestellt führt die Hemmung von CD95L zu einer beinahe voll
ständigen Hemmung des Zelltods, wobei lediglich eine restliche
Abtötungsaktivität von etwa 5% zu beobachten ist. Faßt man
zusammen, so belegen diese Daten, daß Chemotherapeuthika zu
einer Hochregulation von funktionalem CD95L-Protein auf der
Zelloberfläche führen.
Da aufgrund der beobachteten Hochregulation auf der Trans
kriptionsebene davon ausgegangen wurde, daß Chemotherapeutika
ihre Wirkung direkt auf den CD95L-Promotor ausüben, wurden
verschiedene Luciferase-Reporterkonstrukte jeweils unter Kon
trolle eines bestimmten Fragments aus dem 5'-nicht
translatierten Bereich des CD95L-Gens hergestellt. Die
-1204/+100-, -860/+100-, -345/+100- und -36/+100-Konstrukte
wurden bereits beschrieben und sind in Jurkat T-Zellinien in
transienten Transfektionsassays nach Stimulation mit Phorbole
ster und Ionomycon gut induzierbar (Li-Weber et al., European
Journal of Immunology 28 (1998), 2373). Um die Wirkung von
Chemotherapeutika auf Leberzellen näher zu untersuchen wurden
Hep3B-Zellen mit den verschiedenen Konstrukten transient
transfiziert und die Zellen wurden dann durch Behandlung mit
5-FU, Etoposid oder einer Kombination beider Verbindungen
stimuliert. Alle vorstehend beschriebenen Konstrukte waren
gleichermaßen induzierbar. Ein repräsentatives Experiment für
das -36/+100-Konstrukt ist in Fig. 4 gezeigt. Die Kombination
verschiedener Chemotherapeutika zeigt einen synergistischen
Effekt auf alle Konstrukte (Fig. 4A). Außerdem zeigen diese
Wirkstoffe eine starke Dosis-Abhängigkeit (Fig. 4B), was ein
Anzeichen dafür ist, daß die Promotorregulation bei physiolo
gischen Konzentrationen der Chemotherapeutika stattfindet, da
die Experimente in einem klinisch relevanten Dosisbereich
durchgeführt wurden.
Da alle Promotor-Konstrukte im Bereich von -1204/+100 bis
-36/+100 die gleiche Induzierbarkeit nach Stimulation mit Che
motherapeutika zeigten, wurde davon ausgegangen, daß ein zwi
schen -36 und dem Translationsstart gelegenes Promotorelement
u. U. für die Promotor-Aktivierung verantwortlich ist. Um diese
vermutete Stelle weiter einzugrenzen wurden 3'-Deletionskon
strukte des CD95L-Promotors erzeugt. Eines dieser Konstrukte
(-36/+19) wurde für weitere Experimente verwendet und dieses
ist in Fig. 5A schematisch im Vergleich zu dem -36/+100-Luci
ferase-Konstrukt gezeigt. Wie in Fig. 5B dargestellt, zeigte
dieses Konstrukt eine signifikant verringerte basale Aktivität
und war außerdem weniger induzierbar als das -36/+100-Kon
strukt. Daraus wurde gefolgert, daß der +20/+100-Bereich des
CD95L-Promotors ein Element enthält, das für die Induzierbar
keit durch Stimulation mit Chemotherapeutika verantwortlich
ist.
Eine Computersuche nach Bindungsstellen für Transkriptions
faktoren ergab eine Konsensus-Sequenz für den dimeren Faktor
AP-1. Die genaue Lage dieser Sequenz ist in Fig. 5A (einge
rahmt) gezeigt. Zur Bestätigung, daß diese Stelle tatsächlich
eine funktionale AP-1-Stelle ist, wurden gemeinsam mit den
-36/+100- und -36/+19-Luciferase-Reporterkonstrukten c-jun- und
c-fos-Konstrukte transfiziert. Wie in Fig. 6A gezeigt, ergab
die Cotransfektion mit c-jun und c-fos eine deutliche Stimula
tion des -36/+100-Konstrukts, das die AP-1-Stelle enthält,
nicht jedoch des -36/+19-Konstrukts, dem diese Stelle bei +90
fehlt. Die Transfektion nur mit c-jun oder nur mit c-fos ergab
auch einen stimulierenden Effekt. Die Cotransfektion mit den
AP-1-Bestandteilen und die Behandlung mit 5-FU führte nicht zu
einer signifikanten Aktivitätssteigerung des -36/+19-Kon
strukts, was stark auf das Fehlen des verantwortlichen Pro
motorfragments hinweist. Im Gegensatz dazu führte die Behand
lung von cotransfizierten Zellen mit 5-FU zu einem weiteren
Anstieg der Luciferase-Aktivität in dem -36/+100-Konstrukt,
vergleichbar mit der Induktion ohne Transfektion mit c-jun und
c-fos.
Zur weiteren Untersuchung der Bedeutung der AP-1-Stelle für
die Induktion durch Chemotherapeutika wurden kinetische Stu
dien durchgeführt (Fig. 6B). Das -36/+100-Konstrukt reagierte
mit einer starken Aktivierung, die 20 bis 25 Stunden nach
Initiation der 5-FU-Behandlung begann. Die Aktivierung
schritt danach fort und erreichte nach 64 Stunden das höchste
Niveau. Das -36/+19-Konstrukt zeigte jedoch keine Reaktion auf
diese Behandlung. Selbst nach einer auf 64 Stunden ausgeweite
ten Inkubation mit 5-FU konnte kein signifikanter Anstieg
beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeu
tung der AP-1-Stelle für die chemotherapeutische Behandlung
weiter.
Da der AP-1-Komplex durch verschiedene Bestandteile, die die
Reaktion auf einen bestimmten zellulären Stimulus bewirken,
gebildet werden kann, wurden Untersuchungen zur Struktur der
Dimerbindung an den Promotor durchgeführt. Dazu wurden "Gels
hift"-Analysen mit Oligonucleotiden durchgeführt, die die
Konsensus-AP-1-Stelle (CCTGACTC) im CD95L-Promotor umfaßten.
Diese Oligonucleotide konnten durch nucleäre Extrakte von 5-
FU-behandelten HepG2-Zellen und von 5-FU-behandleten Huh7-
Zellen (eine weitere Leberzellenkarzinom-Zellinie) hinsicht
lich ihrer Mobilität verschoben werden, wobei mit Extrakten
aus unbehandelten Zellen nur eine geringe Mobilitätsverschie
bung zu beobachten war (Fig. 7). Diese Komplexbildung konnte
mit unmarkiertem Wildtyp-Oligonucleotid und mit einem Konsen
sus-AP-1-Oligonucleotid kompetitiv aufgehoben werden, jedoch
nicht mit unmarkierten Oligonucleotiden, die die Konsensus-
Sequenzen für entweder NF-kB oder SP-1 enthielten, was deut
lich auf eine spezifische Bindung von AP-1 an die Zielstelle
im Promotor hinweist. Zur Identifizierung von Teilkomponenten
des Bindungskomplexes wurden "Supershift"-Experimente durch
geführt. Antikörper gegen c-Jun und c-Fos konnten die Mobili
tät des Komplexes weiter verschieben (Fig. 7). Anti-c-Jun-
und anti-c-Fos-Antikörper verschoben die Mobilität der Kom
plexe mit nucleären Extrakten von beiden Zelltypen (HepG2 und
Huh7), allerdings in unterschiedlichem Ausmaß. Anti-c-Fos-
Antikärper führten bevorzugt in nucleären HepG2-Extrakten zu
einer Mobilitätsverschiebung und anti-c-Jun-Antikörper bevor
zugt in Huh7-Extrakten. Weder Antikörper gegen C/EBP (als eine
Isotyp-angepaßte Kontrolle) (Fig. 7) noch Antikörper gegen
JunD oder ATF2 beeinflußten die Mobilität der Komplexe, was
auf eine Präferenz eines Jun/Fos-Heterodimers für diese Stelle
hinweist.
Als weiterer Nachweis für die Bedeutung dieser CD95L-Promotor
stelle für die Hochregulation als Folge der chemotherapeuti
schen Behandlung wurde dieses AP-1-Element durch ortsgerichte
te Mutagenese mutiert. Die Konsensus-Wildtypseguenz CTGACTCA
wurde an drei unterschiedlichen Positionen zu CTAATTAA mu
tiert. Diese Mutationen zerstören die Antwortbereitschaft
eines AP-1-Luciferase-Reporterkonstrukts. Die Einführung die
ser Mutationen in das -36/+100-Reporterkonstrukt hob die Indu
zierbarkeit des Konstrukts nach 48stündiger Behandlung mit 100
µg/ml 5-FU fast vollständig auf (Fig. 8). Dies ist ein weite
rer Beleg für die Bedeutung der AP-1-Stelle bei der durch
Chemotherapie induzierten Apoptose.
Bei vielen Zellstress auslösenden Faktoren ist die SAPK/JNK-
Kaskade in den Zielzellen beteiligt. Chemotherapeutika stellen
sowohl in vivo als auch in vitro starke Stressfaktoren dar.
Daher wurde untersucht, ob dieses System der nacheinander
aktivierten Kinasen an der Reaktion auf Chemotherapeutika
beteiligt ist. Das letzte Ziel der SAPK-Kaskade ist die Phos
phorylierung von c-Jun. Daher wurden Cotransfektionen eines
dominant-negativen c-jun-Konstrukts (DN c-jun), dem die Amino
säuren 1 bis 192 fehlten (ein Bereich, der die Phosphorylie
rungsstellen an den Serinresten 63 und 73 umfaßt), mit den
verschiedenen Luciferase-Reporterkonstrukten durchgeführt. Das
dominant-negative c-jun beeinträchtigt die Aktivierung des AP-
1-Komplexes beträchtlich, da es zwar noch die Dimerisierungs
domäne enthält, die AP-1-Zielgene jedoch nicht mehr aktivieren
kann. Die Wirksamkeit der Hemmung ist in Fig. 9A gezeigt. Die
Cotransfektion von Hep3B-Zellen mit dem -36/+100-Reporterkon
strukt, c-jun und dominant-negativen c-jun setzte die akti
vierende Wirkung von c-jun auf den Promotor vollständig außer
Kraft (Fig. 9A, die zwei rechten Spalten). Was jedoch noch
bedeutsamer ist, ist die Tatsache, daß dominant-negatives c-
jun die Promotoraktivierung nach Behandlung mit Chemotherapeu
tika auch drastisch hemmt, was die Notwendigkeit der c-jun-
Phosphorylierung für die beobachtete Hochregulation unter
streicht (Fig. 9A).
Schließlich wurde auch die Beteiligung Stress-aktivierter
Kinasen an der Aktivierung des CD95L-Promotors untersucht.
Dazu wurden Hep3B-Zellen mit dominant-negativen Konstrukten
von verschiedenen SAPK/JNKs cotransfiziert. Wie in Fig. 9B
dargestellt konnte die Aktivierung durch 5-FU durch Cotrans
fektion der dominant-negativen MEKK-1 und der dominant-negati
ven JNKK gehemmt werden, was auf die aufeinanderfolgende Akti
vierung der MEKK-1⇒JNKK⇒JNK⇒ c-Jun-Achse hinweist. Als Kon
trolle wurde eine dominant-negative Mutante des p38-Wegs ver
wendet. Beide dominant-negativen Konstrukte des p38-Wegs (DN-
MKK3 und DN-MKK6) hatten praktisch keine Auswirkung auf die
Hochregulierung der Promotoraktivierung nach Behandlung mit
Zytostatika. Es kann deshalb davon ausgegangen werden, daß
Chemotherapeutika CD95L über den vorstehend erwähnten JNK-Weg
induzieren.
Da AP-1 ein Protein der Akut-Phase darstellt und normalerweise
innerhalb von wenigen Minuten nach einem gegebenen Stimulus
aktiviert wird, wurde untersucht, ob eine gesteigerte Akti
vierung von AP-1 in einem zeitlichen Rahmen beobachtet werden
kann, der zu der in dem vorstehenden experimentellen System
gefundenen Hochregulation von CD95L paßt. Dazu wurden Hep3B-
Zellen 40 Stunden nach Behandlung mit 5-FU mit einem Antikör
per gegen c-Jun immungefärbt. Nach Immunfluoreszenz-Färbung
wurden die Intensität der Färbung und die räumliche Verteilung
positiver Signale untersucht. Die Spezifität der Färbung wurde
durch Blockierungsexperimente unter Verwendung antigener Pep
tide bestätigt. Unbehandelte Hep3B-Zellen zeigten leichte
positive Signale (Fig. 10A). Nach Behandlung mit 5-FU für 40
Stunden häuften die Zellen AP-1 im Nucleus stark an, was als
punktförmige positive Signale in Fig. 10B zu sehen ist. Die
ser Befund deutet darauf hin, daß nach ausgedehnter Behandlung
mit Chemotherapeutika eine starke Aktivierung von AP-1 ein
tritt. Es wurde auch untersucht, ob dieses Phänomen auch in
primären humanen Zellen auftritt. Dazu wurden primäre humane
Hepatozyten isoliert, die aus Patientenmaterial während einer
Lebertransplantation erhalten worden waren. Die isolierten
Zellen wurden zur Eliminierung von Stress-Auswirkungen auf
grund des Isolationsverfahrens zwei Tage kultiviert und da
nach 40 Stunden mit 5-FU behandelt, fixiert und immungefärbt.
Die kultivierten primären humanen Hepatozyten waren bezüglich
AP-1 negativ (Fig. 10C). Nach 40stündiger chemotherapeuti
scher Behandlung zeigten die primären Hepatozyten jedoch eine
starke nucleäre Reaktivität, die über den gesamten Nucleus
verstreut war (Fig. 10D), was anzeigt, daß in den primären
humanen Hepatozyten derselbe Reaktionstyp abläuft wie in den
Leberzellenkrebs-Zellinien.
Claims (8)
1. Verfahren zur Untersuchung, ob eine Testverbindung für
eine Chemotherapie wirksam ist, wobei das Verfahren
folgende Schritte umfaßt:
- a) Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die die in Fig. 5A dargestellte AP-1-Stelle als Bestandteil eines Promotors umfaßt, der mit einem Reportergen oder CD95L-Gen funktionell verknüpft ist;
- b) Inkontaktbringen der DNA-Sequenz von a) mit der Testverbindung in einem zellulären Assay; und
- c) Bestimmung der Aktivierung des Promotors, wobei eine Aktivierung anzeigt, daß die Testverbindung für eine Chemotherapie wirksam ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Promotor der
CD95L-Promotor ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Testverbin
dung Bestandteil einer Substanzbibliothek ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
die AP-1-Stelle umfassende DNA-Sequenz die in Fig. 5A
dargestellte Nukleinsäuresequenz von den Positionen -36
bis +100 oder ein Fragment davon ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die die AP-1-Stelle
umfassende DNA-Sequenz die in Fig. 5A dargestellte
Nukleinsäuresequenz von den Positionen +84 bis +91 ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das
Reportergen das CAT-, Luciferase-, LacZ- oder GFP-Gen
ist.
7. Arzneimittel, das ein Gemisch aus mindestens zwei Ver
bindungen umfaßt, die nach dem Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 6 identifiziert wurden und/oder die
Expression des CD95L-Gens fördern.
8. Verwendung des in Anspruch 7 definierten Gemisches zur
Therapie von Krebs und/oder Autoimmunerkrankungen.
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