JP2000338086A

JP2000338086A - 電気泳動装置

Info

Publication number: JP2000338086A
Application number: JP11147648A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Nagaoka; 嘉浩長岡; Shigeo Watabe; 成夫渡部; Hironobu Yamakawa; 寛展山川
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 1999-05-27
Publication date: 2000-12-08

Abstract

(57)【要約】【課題】隣接した分離流路からの蛍光ノイズの発生を防
止し、分離試料の検出感度を向上する。【解決手段】分離流路１１０を一つづつ検出位置に移動
させる。検出位置には検出器７０が設けてあり、励起光
照射部７１からの励起光は検出位置に存在する唯一つの
分離流路に照射され、分離した試料からの蛍光は蛍光受
光部７２で受光され分析される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等
の核酸或いは蛋白質など生体関連物質の分離分析をする
電気泳動装置に係り、特に、試料を自動的に同時に分析
することで高速処理を可能とし、泳動流路を短くするこ
とで緩衝液の消費量を低減できる小型な電気泳動装置に
関する。

【０００２】

【従来の技術】試料を自動的に同時に分析する電気泳動
装置としては、特開平１０―１７０４８０号公報の電気
泳動装置がある。

【０００３】この装置では、蛍光標識された試料を緩衝
液と共に複数のキャピラリ中を電気泳動させることで試
料を分子量毎に分離し、分離後の試料の蛍光を分光計に
より検出するものである。各キャピラリは、試料が泳動
する上流側末端が陰極側電極槽に、下流側末端が陽極側
電極槽に接続されており、両電極槽の電位差で、負に帯
電した試料が各キャピラリ内を陰極側から陽極側へと泳
動する。各キャピラリは蛍光セル内に設けた検出部で分
割され、上流側のキャピラリと下流側のキャピラリは一
定の間隙を保つように設置されている。

【０００４】蛍光セルへは外部から緩衝液が注入され、
上流側のキャピラリから流れ出た試料と一緒に対応する
下流側のキャピラリに流れ込む、シースフロー状態を形
成する。各キャピラリは蛍光セル内において一定間隔で
1列に配置されており、蛍光励起用のレーザ光は、光軸
をキャピラリの列方向に一致させ、前記間隙部を通過す
るように照射される。間隙部を設けるのは、シースフロ
ー状態で流れている試料に直接励起光を照射すること
で、レーザ光がキャピラリで散乱されるのを防ぎ、高感
度に蛍光検出をするためである。このようにキャピラリ
を1直線状に配列して励起光を列方向に照射すること
で、同時に複数のキャピラリでの蛍光計測を可能として
いた。

【０００５】また、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．１８、２１４９〜２１
５４（１９９２）に記載のキャピラリアレー電気泳動を
用いたＤＮＡシーケンサは、キャピラリアレーの検出部
をステージに固定し、ステージを移動することにより個
々のキャピラリーを励起光の焦点に移動する方式であ
る。この方式では、励起光が１本のキャピラリにのみ照
射されるため、隣接したキャピラリからの蛍光が発生せ
ず、高感度な検出が可能であった。

【０００６】また、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔ
ｈｅ μＴＡＳ‘９８Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、１〜６（１
９９８）に記載の電気泳動装置は、直径１０ｃｍ程度の
ガラス基板に最大９６チャンネルの分離用キャピラリを
加工している。微小流路を基板上に形成することによ
り、熱の放散を良くしジュール熱による温度上昇を抑え
ることが可能で、流路の断面積を小さくし分離効率を高
め、長さを短くすることにより分析時間を短縮すること
が可能である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記特開平１０―１７
０４８０号公報の電気泳動装置では、複数のキャピラリ
で同時に蛍光計測を実施するため、検出器には各試料か
らの蛍光が同時に入射する。検出器では分光計を用いる
ことで蛍光の色を識別し、分離された試料の種類を同定
することができる。しかし、どのキャピラリを泳動して
きたかを同定するためには、蛍光強度分布を各キャピラ
リの位置と対応させなければならず、隣接したキャピラ
リからの蛍光は感度を低下させる原因であり、検出誤差
要因となる。

【０００８】上記ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、Ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．１８、２１４９〜２１５
４（１９９２）に記載のキャピラリアレー電気泳動を用
いたDNAシーケンサは、キャピラリアレーの検出部をス
テージに固定しステージとともに移動する構造になって
いるが、陰極側電極槽及びキャピラリアレーの上流側末
端と陽極側電極槽及びキャピラリアレーの下流側末端は
静止しているため、ステージの移動時にキャピラリがよ
じれ、キャピラリの本数が制限されまた小型化し難い。

【０００９】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ
μＴＡＳ‘９８Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、１〜６（１９９
８）に記載の電気泳動装置は、分離流路を固定し、検出
時にレーザ光をスキャンすることで各分離流路からの蛍
光を検出していた。そのため検出器が複雑になり、小型
化が困難であった。

【００１０】本発明の目的は、分離流路を一つづつ検出
位置に移動することにより、隣接した分離流路からの蛍
光ノイズの発生を防止して検出感度を高め、かつ緩衝液
消費量を低減できる小型の電気泳動装置を提供すること
にある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的は、下記構成と
することで達成できる。

【００１２】分離流路を注入部と一体で移動可能とし、
各分離流路を一つづつ検出位置に移動させる構成とす
る。さらに、検出手段で試料を検出する時の検出位置に
分離流路を１本のみ存在させる構成とする。或いは、分
離流路又は注入部、或いは両方を移動する移動機構を備
え、各注入部を試料分注位置に移動後、各分離流路を一
つづつ検出位置に移動する構成とする。

【００１３】更に、複数の分離流路及び注入部をそれぞ
れ円周上に等間隔に配列し、分離流路及び注入部を回転
する回転機構を備え、各注入部を試料分注位置に移動
後、各分離流路を一つづつ検出位置に移動させる構成と
する。或いは、複数の分離流路及び注入部をそれぞれ円
周上に等間隔に配列し、分離流路及び注入部を回転する
回転機構を備え、各注入部を検出位置より外周側に設け
た構成とする。

【００１４】

【発明の実施の形態】図１〜５を参照して、本発明によ
る電気泳動装置の一実施例を説明する。

【００１５】図1に本発明による自動分析装置の全体構
成を示す。図２に本発明の分離流路基板の詳細を示す。
なお、図１には電気泳動装置１０の上面から見た図
（ａ）と側面から見た図（ｂ）を示している。

【００１６】分離流路基板１００は透明なガラス板で構
成されており、電気泳動装置１０に対して回転可能に保
持されている。分離流路基板１００の内部には、複数の
分離流路１１０ａと１１０ｂを備えている。緩衝液槽２
０の内部には、緩衝液２１が保持されている。試料槽４
０の内部には、試料４１が保持され、試料廃棄部４２を
備えている。

【００１７】分離流路基板１００の周囲には、緩衝液２
１を緩衝液注入部１１１に注入するための緩衝液注入器
３０と、試料４１を試料注入部１１２に注入するための
試料注入器５０と、試料注入部１１２から注入された試
料を試料吸引部１１３に吸引する試料吸引器６０と、分
離流路で分離した試料を検出する検出器７０とがそれぞ
れ回転可能に設けてある。尚、緩衝液注入部１１１と、
試料注入部１１２と、試料吸引部１１３とは、各分離流
路１１０ａ、１１０ｂの同一半径位置に設けてある。

【００１８】図１及び図２を用いて、本実施例の動作を
以下に説明する。

【００１９】オペレータは、電気泳動装置１０の回転軸
１２０に分離流路基板１００が、試料槽４０に試料４１
をセットする。分離流路基板１００は、予め分離流路１
１０ａ、１１０ｂ内に緩衝液或いはゲル等が充填されて
いてもよいが、分離流路１１０ａ、１１０ｂ内が空の場
合には、緩衝液２１を緩衝液槽２０にセットする。

【００２０】分析動作を開始すると、分離流路１１０
ａ、１１０ｂ内が空の場合には、分離流路１１０ａは緩
衝液注入位置に停止し、緩衝液注入器３０が緩衝液２１
を吸引し、緩衝液注入ノズル３１を分離流路１１０ａの
緩衝液注入部１１１に挿入し、緩衝液を分離流路１１０
ａ内に注入する。緩衝液は分離流路１１０ａ内を表面張
力の作用で内周側へと流動し、最内周部で分離流路１１
０ｂへと回り込む。さらに、緩衝液は、分離流路１１０
ｂを外周側へと流動し、最終的に分離流路１１０ａ、１
１０ｂで構成されるＶ字形の一組の分離流路に表面張力
の作用で満たされる。

【００２１】分離流路１１０ａ、１１０ｂが長く、表面
張力だけでは緩衝液が分離流路１１０ｂ側に流動しない
場合ある。その時は、緩衝液注入ノズル３１を分離流路
１１０ａの緩衝液注入部１１１に挿入し、緩衝液供給電
源２２０用の緩衝液供給スイッチ２２１を投入し、緩衝
液注入ノズル３１と後述の内周突起電極１４３との間に
電位差を生じさせる。緩衝液注入ノズル３１は陽極に、
内周突起電極１４３は陰極になり、陽極側から陰極側に
流れる電気浸透流が発生する。この電気浸透流の作用に
より、緩衝液は分離流路１１０ａを内側に流れる。一方
分離流路１１０ｂには電位差が生じていないので、分離
流路１１０ａの流れが分離流路１１０ｂでも維持され、
分離流路１１０ｂでは外向きの流れが発生し、全流路が
緩衝液で満たされる。

【００２２】次に、分離流路基板１００は回転軸１２０
と共に反時計方向に回転し、分離流路１１０ｂが緩衝液
注入位置に停止する。分離流路１１０ｂには既に緩衝液
が満たされているので、緩衝液の注入は実施しない。

【００２３】更に分離流路基板１００は約1周回転し、
次の分離流路１１０ａが緩衝液注入位置に停止し、同様
の動作が繰り返される。即ち分離流路１１０ａが緩衝液
注入位置に停止した時緩衝液は注入され、分離流路１１
０ａ、１１０ｂのＶ字形の一組の分離流路が緩衝液に満
たされ、次に分離流路基板１００が反時計方向に回転
し、分離流路１１０ｂが緩衝液注入位置に停止した時は
緩衝液は注入されない。

【００２４】尚、予め分離流路１１０ａ、１１０ｂ内に
緩衝液或いはゲル等が充填されている場合には、上記緩
衝液注入動作は省略され、以下の動作に移る。

【００２５】上記動作で緩衝液注入後の分離流路１１０
ａが試料注入位置に停止した場合、試料注入器５０が試
料４１を吸引し、試料注入ノズル５１を試料注入部１１
２に挿入し、試料を分離流路１１０ａ内に注入する。こ
の時、試料吸引器６０の試料吸引ノズル６１を試料吸引
部１１３に挿入し、試料供給電源２１０用の試料供給ス
イッチ２１１を投入することにより、試料注入ノズル５
１と試料吸引ノズル６１との間に電位差を生じさせる。
試料注入ノズル５１は陰極に、試料吸引ノズル６１は陽
極になり、負に帯電している核酸等の試料は、陰極であ
る試料注入ノズル５１から陽極である試料吸引ノズル６
１へと電気泳動する。

【００２６】次に、分離流路基板１００は反時計方向に
回転し、分離流路１１０bが試料注入位置に停止し、同
様の試料注入動作が繰り返される。

【００２７】試料が分離流路１１０ａ、１１０ｂに注入
されると、分離流路基板１００は反時計方向に約1周回
転する。この回転動作中に、以下のようにして試料の分
離が行われる。

【００２８】分離流路基板１００の外周部と内周部には
それぞれリング状の外周リング電極１３２及び内周リン
グ電極１４２が設けてある。さらに分離流路１１０ａ、
１１０ｂの最外周部と最内周部で、注入された緩衝液に
接するように外周突起電極１３３及び内周突起電極１４
３が設けてある。分離流路基板１００は回転するので、
外周リング電極１３２及び内周リング電極１４２と分離
用電源２００との接続は、外周印加電極１３０及び内周
印加電極１４０と外周リング電極１３２及び内周リング
電極１４２との外周摺動部１３１及び内周摺動部１４１
で接触している。

【００２９】分離用電源２００用の試料分離スイッチ２
０１を投入することにより、外周突起電極１３３と内周
突起電極１４３との間に電位差が生じる。外周突起電極
１３３は陰極に、内周突起電極１４３は陽極になり、負
に帯電している核酸等の試料は、陰極である外周側から
陽極である内周側へと電気泳動する。

【００３０】試料は分子量の小さいものほど泳動速度が
速く、分子量の大きいものほど泳動速度は遅い。そのた
め、分離流路１１０ａ及び１１０ｂを泳動中に、試料は
分子量毎に分離され、分子量の小さいものほど内周側
に、分子量の大きいものほど外周側に位置するようにな
る。

【００３１】例えば４種類の蛍光色素をＤＮＡ断片の末
端の塩基に合わせて予め結合させておき、上記電気泳動
を行うことにより、蛍光色毎に分離するので、泳動して
きた分離試料順に蛍光を計測すれば、対応する塩基の種
類を同定できる。

【００３２】蛍光検出は、検出器７０を用いて行う。検
出器７０は励起光照射部７１と蛍光受光部７２を備えて
いる。検出器７０は、試料吸引部１１３より内径側の所
定の検出位置に励起光照射部７１と蛍光受光部７２を回
転移動させる。試料が注入され電気泳動を開始した分離
流路１１０ａ及び１１０ｂは、分離流路基板１００の回
転と共に、一つづつ検出位置を通過する。検出位置には
唯一つの分離流路１１０ａ又は１１０ｂのみが存在し、
電気泳動により分離した試料が検出位置を通過する際、
励起光照射部７１から発せられた励起光８１が分離試料
に照射され、予め結合された蛍光色素に応じた波長の蛍
光８２を発する。蛍光受光部７２では、蛍光８２を受光
する。

【００３３】検出位置には唯一つの分離流路しか存在し
ないので、励起光が隣接した分離流路に照射されること
はなく、隣接した分離流路からの蛍光を受光することも
ない。従って、本来の検出対象である分離流路のみから
蛍光信号を検出できるので、検出感度が高い。

【００３４】分離流路１１０ａ、１１０ｂの回転動作
は、緩衝液注入位置或いは試料注入位置に分離流路１１
０ａが停止後、引き続き分離流路１１０ｂが緩衝液注入
位置或いは試料注入位置に停止、その後反時計方向に約
１周して、次の分離流路１１０ａ、１１０ｂが緩衝液注
入位置或いは試料注入位置に停止し、反時計方向に約1
周する動作を繰り返す。蛍光検出は、試料注入後の最初
の回転動作時にのみ実施するのではなく、それ以降も繰
り返し実施する。蛍光検出位置では、分離流路１１０
ａ、１１０ｂが移動している時でも、停止している時で
も蛍光検出を実施する。

【００３５】検出結果は、蛍光波長と強度の時系列デー
タとして蓄積され、分離流路１１０ａ及び１１０ｂの総
数毎にサンプリングすれば、各分離流路毎の時系列デー
タとなる。各分離流路は1回転に一度、離散的に蛍光検
出されるため、分離流路基板の回転速度に比べて泳動速
度が速いと、検出位置を通過しないで泳動してしまう分
離試料が発生する。そこで、泳動する全ての分離試料が
検出位置を通過するように、蛍光検出の周期を短くした
り、泳動速度を遅くしたりする必要がある。

【００３６】蛍光検出の周期を短くするには、分離流路
基盤の回転速度を速くすることと、図１に示すように、
検出器７０を複数設けることが考えられる。

【００３７】次に分離流路基板の他の実施例を図３を用
いて説明する。図３は、分離流路基板１００を上から見
た図（ａ）と側面から見た断面図（ｂ）である。

【００３８】表面張力の作用を高めるため、本実施例で
は分離流路をテーパ形状にした。各分離流路１１０ａ、
１１０ｂは外周側ほど断面積が大きく、内周側ほど断面
積が小さい。そのため緩衝液は径方向内向きに分離流路
内面に吸着し易くなり、径方向内向きに流動し易くな
る。さらに、緩衝液注入ノズル３１を緩衝液注入部１１
１に挿入し、緩衝液注入ノズル３１と後述の内周突起電
極１４３との間に電位差を生じさせ、電気浸透流を発生
させれば、分離流路１１０ｂにも緩衝液が満たされる。

【００３９】次に、泳動速度を遅くする一実施例を図４
を用いて説明する。図４に分離流路基板の側面断面図を
示す。

【００４０】泳動速度を遅くするには、分離用電源２０
０の出力を小さくするか、印加時間を短くするか、或い
は図４に示すように電気浸透流を使用する方法が考えら
れる。図４で図１と異なる点は、分離流路基板１００
上面の中央部に内周部吸引孔１５１を備えた緩衝液供給
容器１５０を、外周部に外周部吸引孔１６１を備えた緩
衝液吸引容器１６０を備えている点である。

【００４１】緩衝液の注入は、緩衝液注入ノズル３１を
緩衝液吸引容器１６０の外周部吸引孔１６１から緩衝液
注入部１１１へと挿入し、注入する。緩衝液は表面張力
の作用により、分離流路１１０を内周部へと流動する。
分離流路１１０が緩衝液で満たされた後、緩衝液供給ス
イッチ２２１を投入し、緩衝液注入ノズル３１と内周部
突起電極１４３の間に電位差を生じさせる。分離流路１
１０内には電気浸透流が発生し、表面張力では流動し得
ない緩衝液吸引容器１６０内へも、連通孔１１４を通っ
て流れ込む。

【００４２】緩衝液が満たされると、図２と同様、試料
が注入され、試料分離スイッチ２０１が投入され、電気
泳動が始まる。分離流路１１０は、内周部吸引孔１５１
と外周部吸引孔１６１を通して外部に通じているため、
内部流動が可能となり、電気浸透流による緩衝液の流動
が起こる。即ち、負に帯電した試料は電気泳動力により
外周側から内周側へ泳動し、一方緩衝液は電気浸透流の
作用で内周側から外周側へと流動する。一般に電気泳動
の方が電気浸透流よりも支配的であるため、試料は外周
側から内周側へと泳動するが、電気浸透流が発生しない
場合より泳動速度は遅くなる。

【００４３】電気泳動では流路が長いほど分離の精度は
高い。しかし、印加電圧によるジュール熱の発生を抑
え、放熱を良くする必要があり、分離流路を小さくする
ことが課題となっている。電気浸透流では、緩衝液が試
料の泳動方向と逆向きに流動するため、静止した緩衝液
中を泳動するのに比べ、相対的に長い距離を泳動する効
果が得られる。このため、電気浸透流を利用することに
より、分離流路を短くすることができる。

【００４４】今までの実施例では、分離流路１１０ａ、
１１０ｂは直線状に形成されていたが、図５に示すよう
に曲線状に形成することで分離流路を長くすることがで
き、分離効率を高めることができる。

【００４５】本発明によれば、分離流路を一つづつ検出
位置に移動し、蛍光検出を実施するため、隣接した分離
流路への励起光照射はなく、蛍光の発生もない。従っ
て、検出対象である分離流路からの蛍光検出を高感度に
実現できる。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、分離流路を一つづつ検
出位置に移動させるため、隣接した分離流路には検出器
からの励起光が照射されず、蛍光ノイズは発生しない。
そのため、検出位置に来た分離流路の試料を高感度で検
出できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による電気泳動装置の全体構成図であ
る。

【図２】本発明の分離流路基板の側面詳細図である。

【図３】本発明の分離流路基板の正面図及び側面断面図
である。

【図４】本発明の分離流路基板の正面図及び側面断面図
である。

【図５】本発明の分離流路基板の正面図である。

【符号の説明】

３０…緩衝液注入器、５０…試料注入器、６０…試料吸
引器、７０…検出器、７１…励起光照射部、７２…蛍光
受光部、１００…分離流路基板、１１０a，１００b …
分離流路、２００分離用電源、２１０…試料供給電源、
２２０…緩衝液供給電源。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山川寛展茨城県土浦市神立町502番地株式会社日立製作所機械研究所内Ｆターム(参考） 2G043 AA04 BA16 CA03 DA05 EA01 EA19 FA01 GA07 GA08 GB01 GB19 KA09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の試料を電気泳動させるための複数の
分離流路と、試料を各分離流路に注入するための複数の
注入部と、分離した試料を所定の検出位置にて検出する
検出手段とを備えた電気泳動装置において、前記分離流路は注入部と一体で形成され、各分離流路を
一つづつ検出位置に移動させる駆動手段を備えたことを
特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】複数の試料を電気泳動させるための複数の
分離流路と、試料を各分離流路に注入するための複数の
注入部と、分離した試料を所定の検出位置にて検出する
検出手段とを備えた電気泳動装置において、前記複数の分離流路と注入部とを一体で回転させる回転
機構を備え、前記検出手段が試料を検出する場合に、前
記検出位置には検出対象の１本の分離流路が存在するこ
とを特徴とする電気泳動装置。
【請求項３】複数の試料を電気泳動させるための複数の
分離流路と、試料を各分離流路に注入するための複数の
注入部と、分離した試料を所定の検出位置にて検出する
検出手段とを備えた電気泳動装置において、前記分離流路或いは注入部或いは両方を移動する移動機
構を備え、各注入部を試料分注位置に移動後、各分離流
路を一つづつ検出位置に移動させることを特徴とする電
気泳動装置。
【請求項４】複数の試料を電気泳動させるための複数の
分離流路と、試料を各分離流路に注入するための複数の
注入部と、分離した試料を所定の検出位置にて検出する
検出手段とを備えた電気泳動装置において、前記複数の分離流路及び注入部をそれぞれ円周上に等間
隔に配列し、前記分離流路及び注入部を回転する回転機構を備え、各
注入部を試料分注位置に移動後、各分離流路を一つづつ
検出位置に移動させることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項５】複数の試料を電気泳動させるための複数の
分離流路と、試料を各分離流路に注入するための複数の
注入部と、分離した試料を所定の検出位置にて検出する
検出手段とを備えた電気泳動装置において、前記複数の分離流路及び注入部をそれぞれ円周上に等間
隔に配列し、前記分離流路及び注入部を回転する回転機構を備え、各
注入部を検出位置より外周側に設けたことを特徴とする
電気泳動装置。