JP2000325091A - 相同組換え用ジーンターゲティングＤＮＡの製造方法及びｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法 - Google Patents
相同組換え用ジーンターゲティングＤＮＡの製造方法及びｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 医薬品の研究開発に有用なノックアウト動物
やノックイン動物の製造に必須である相同組換え用ター
ゲティングDNA（ベクター）の製造に要する労力、期間
及びコストを飛躍的に低減することができ、またESTの
ような短いDNA配列のジーンターゲティングにも適用可
能なの新規な製造方法、並びに該ターゲティングDNAに
よりジーンターゲティングされた細胞、細菌またはウイ
ルスを正確に選別することができる新規な方法を提供す
る。 【解決手段】 標的DNA配列を含むゲノムDNA断片を分子
内連結（自己環状化）させた環状ゲノムDNAをを鋳型と
し、該標的DNA配列を基に設計した一対のプライマーDNA
を用いた逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）を
利用することにより、従来ターゲティングDNAの製造に
必要であったプラークハイブリダイゼーションや制限酵
素地図の作成を必要とせず、製造期間を約1/10以下に短
縮可能な新規製造方法を見出した。
やノックイン動物の製造に必須である相同組換え用ター
ゲティングDNA（ベクター）の製造に要する労力、期間
及びコストを飛躍的に低減することができ、またESTの
ような短いDNA配列のジーンターゲティングにも適用可
能なの新規な製造方法、並びに該ターゲティングDNAに
よりジーンターゲティングされた細胞、細菌またはウイ
ルスを正確に選別することができる新規な方法を提供す
る。 【解決手段】 標的DNA配列を含むゲノムDNA断片を分子
内連結（自己環状化）させた環状ゲノムDNAをを鋳型と
し、該標的DNA配列を基に設計した一対のプライマーDNA
を用いた逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）を
利用することにより、従来ターゲティングDNAの製造に
必要であったプラークハイブリダイゼーションや制限酵
素地図の作成を必要とせず、製造期間を約1/10以下に短
縮可能な新規製造方法を見出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、相同組換えによる
ゲノムＤＮＡの修飾に用いられるターゲティングDNA
（ベクター）の製造方法、組換え細胞の製造方法、組換
え非ヒト哺乳動物の製造方法、該ターゲティングDNA
（ベクター）の製造に用いられるゲノムDNAライブラリ
ー、並びに該ターゲティングDNAに関する。さらに本発
明は、ｃDNAライブラリーから所望のｃDNAクローンをス
クリーニングする方法に関する。
ゲノムＤＮＡの修飾に用いられるターゲティングDNA
（ベクター）の製造方法、組換え細胞の製造方法、組換
え非ヒト哺乳動物の製造方法、該ターゲティングDNA
（ベクター）の製造に用いられるゲノムDNAライブラリ
ー、並びに該ターゲティングDNAに関する。さらに本発
明は、ｃDNAライブラリーから所望のｃDNAクローンをス
クリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物に生来備わっていない生物学的性状
を付与したり、生物が生来備えている生物学的性状の発
現を抑制したり、さらには該生物のある遺伝子が担う機
能を解析するための方法として、該生物の内在性ゲノム
ＤＮＡの所望の部位（標的ＤＮＡ配列）を人為的に修飾
する遺伝子ターゲティング（ジーンターゲティング）が
注目されている。この方法は、生物の生体において自然
に起こり得る遺伝子相同組換えを、該生物の染色体上に
存在する内在性ゲノムＤＮＡと外来性ターゲティングＤ
ＮＡ（ターゲティングベクター）との間で人為的に起こ
させることにより、該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮ
Ａ配列中に該外来性ターゲティングＤＮＡ中に含まれる
所望の外来性遺伝子を組込むことを基本原理とするもの
である。ターゲティングＤＮＡの構造を適切に設計する
ことにより、該標的ＤＮＡ配列中の所望の部位に外来性
遺伝子の挿入のみを行うこともできるし、また該標的Ｄ
ＮＡ配列と外来性遺伝子との置換により該標的ＤＮＡ配
列を欠失させると同時に該外来性遺伝子を挿入すること
ができる。
を付与したり、生物が生来備えている生物学的性状の発
現を抑制したり、さらには該生物のある遺伝子が担う機
能を解析するための方法として、該生物の内在性ゲノム
ＤＮＡの所望の部位（標的ＤＮＡ配列）を人為的に修飾
する遺伝子ターゲティング（ジーンターゲティング）が
注目されている。この方法は、生物の生体において自然
に起こり得る遺伝子相同組換えを、該生物の染色体上に
存在する内在性ゲノムＤＮＡと外来性ターゲティングＤ
ＮＡ（ターゲティングベクター）との間で人為的に起こ
させることにより、該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮ
Ａ配列中に該外来性ターゲティングＤＮＡ中に含まれる
所望の外来性遺伝子を組込むことを基本原理とするもの
である。ターゲティングＤＮＡの構造を適切に設計する
ことにより、該標的ＤＮＡ配列中の所望の部位に外来性
遺伝子の挿入のみを行うこともできるし、また該標的Ｄ
ＮＡ配列と外来性遺伝子との置換により該標的ＤＮＡ配
列を欠失させると同時に該外来性遺伝子を挿入すること
ができる。
【０００３】この方法により、内在性ゲノムＤＮＡの一
部が修飾（欠失、挿入または置換）を有し、該修飾の結
果、（１）生来備わっていない生物学的性状を発現した
り、あるいは逆に（２）生来備わっている生物学的性状
を発現しないような組換え細胞や組換え生物（組換え非
ヒト哺乳動物、組換え細菌、組換えウイルスなど）を作
製することができる。前者（１）は、例えば、生物のあ
る生理活性蛋白をコードする内在性遺伝子の近傍に該遺
伝子の発現を増大させることができる調節遺伝子配列を
挿入することにより該生理活性蛋白の分泌を増大させる
遺伝子活性化（ジーンアクチベーション）と称される技
術の実施において用いることができる。このジーンアク
チベーションを施された組換え細胞は、養子免疫療法に
より種々疾患治療を治療するための細胞医薬として有望
視されている（国際出願公開公報WO91/06667など）。
部が修飾（欠失、挿入または置換）を有し、該修飾の結
果、（１）生来備わっていない生物学的性状を発現した
り、あるいは逆に（２）生来備わっている生物学的性状
を発現しないような組換え細胞や組換え生物（組換え非
ヒト哺乳動物、組換え細菌、組換えウイルスなど）を作
製することができる。前者（１）は、例えば、生物のあ
る生理活性蛋白をコードする内在性遺伝子の近傍に該遺
伝子の発現を増大させることができる調節遺伝子配列を
挿入することにより該生理活性蛋白の分泌を増大させる
遺伝子活性化（ジーンアクチベーション）と称される技
術の実施において用いることができる。このジーンアク
チベーションを施された組換え細胞は、養子免疫療法に
より種々疾患治療を治療するための細胞医薬として有望
視されている（国際出願公開公報WO91/06667など）。
【０００４】一方、現在のところ、相同組換えによるジ
ーンターゲティングは、後者（２）の目的、即ち、標的
としてのある機能を有する蛋白あるいは機能が不明な蛋
白をコードする内在性遺伝子の一部が相同組換えにより
ターゲティングＤＮＡ由来の外来性マーカー遺伝子（例
えば、ネオマイシン耐性遺伝子）で置換されることによ
り結果的に該マーカー遺伝子が該内在性遺伝子配列中に
挿入され、該遺伝子のmRNAへの転写が阻害されることに
より該蛋白の機能発現が阻害されている（即ち、標的遺
伝子の不活性化、破壊）組換え細胞や組換え生物（例え
ば、組換え非ヒト哺乳動物、組換え細菌、組換えウイル
スなど）の作製において汎用されている。このようにし
て作製された組換え細胞や組換え動物は、各々ノックア
ウト細胞及びノックアウト動物と称されている。
ーンターゲティングは、後者（２）の目的、即ち、標的
としてのある機能を有する蛋白あるいは機能が不明な蛋
白をコードする内在性遺伝子の一部が相同組換えにより
ターゲティングＤＮＡ由来の外来性マーカー遺伝子（例
えば、ネオマイシン耐性遺伝子）で置換されることによ
り結果的に該マーカー遺伝子が該内在性遺伝子配列中に
挿入され、該遺伝子のmRNAへの転写が阻害されることに
より該蛋白の機能発現が阻害されている（即ち、標的遺
伝子の不活性化、破壊）組換え細胞や組換え生物（例え
ば、組換え非ヒト哺乳動物、組換え細菌、組換えウイル
スなど）の作製において汎用されている。このようにし
て作製された組換え細胞や組換え動物は、各々ノックア
ウト細胞及びノックアウト動物と称されている。
【０００５】この相同組換えによるジーンターゲティン
グは、さらに、ノックイン細胞及びノックイン動物の製
造においても汎用される有用な方法である。このノック
イン細胞及びノックイン動物は、前述のような相同組換
えを、該マーカー遺伝子の上流にレポーター遺伝子（ル
シフェラーゼ遺伝子やβラクタマーゼなど）などの所望
の他の１つ以上の外来性遺伝子を発現可能なように配置
されたターゲティングＤＮＡを用いて行い、標的である
内在性遺伝子の一部のＤＮＡ配列が該レポーター遺伝子
とマーカー遺伝子とからなるＤＮＡで置換されることに
より製造され得、該内在性遺伝子のmRNAへの転写が阻害
される（即ち、標的遺伝子の不活性化、破壊）一方で、
該マーカー遺伝子に加えて該レポーター遺伝子などの所
望の外来性遺伝子を発現することができる組換え細胞や
組換え動物である。
グは、さらに、ノックイン細胞及びノックイン動物の製
造においても汎用される有用な方法である。このノック
イン細胞及びノックイン動物は、前述のような相同組換
えを、該マーカー遺伝子の上流にレポーター遺伝子（ル
シフェラーゼ遺伝子やβラクタマーゼなど）などの所望
の他の１つ以上の外来性遺伝子を発現可能なように配置
されたターゲティングＤＮＡを用いて行い、標的である
内在性遺伝子の一部のＤＮＡ配列が該レポーター遺伝子
とマーカー遺伝子とからなるＤＮＡで置換されることに
より製造され得、該内在性遺伝子のmRNAへの転写が阻害
される（即ち、標的遺伝子の不活性化、破壊）一方で、
該マーカー遺伝子に加えて該レポーター遺伝子などの所
望の外来性遺伝子を発現することができる組換え細胞や
組換え動物である。
【０００６】ノックアウト細胞やノックアウト動物は、
該標的内在性遺伝子が不活性化されることにより現れる
細胞の形態学的変化、組織学的変化、個体の表現型上の
変化、疾患症状の発現の有無、あるいは生存率等の種々
の変化を、同一種の正常な細胞あるいは動物のそれを比
較することにより、該不活性化された遺伝子がコードす
る蛋白の生理学的機能の解明を可能とする。
該標的内在性遺伝子が不活性化されることにより現れる
細胞の形態学的変化、組織学的変化、個体の表現型上の
変化、疾患症状の発現の有無、あるいは生存率等の種々
の変化を、同一種の正常な細胞あるいは動物のそれを比
較することにより、該不活性化された遺伝子がコードす
る蛋白の生理学的機能の解明を可能とする。
【０００７】一方、ノックイン細胞やノックイン動物
は、前述のノックアウト細胞やノックアウト動物におい
て可能となる該不活性化内在性遺伝子の機能解析だけで
なく、該標的内在性遺伝子の機能のさらに詳細な解析、
並びに該標的内在性遺伝子の発現を調節する薬剤の同定
を可能とするものである。即ち、ノックイン細胞やノッ
クイン動物は、該不活性化された標的内在性遺伝子のか
わりに挿入された外来性のルシフェラーゼやβラクタマ
ーゼ等の外来性のレポーター遺伝子を発現するように作
製されていることから、該標的内在性遺伝子の機能が不
明である場合には、該ノックイン細胞やノックイン動物
に医薬上の活性が判明している種々の薬剤や化合物を投
与し、該薬剤の投与に依存する該レポーター遺伝子の発
現の増減を測定することにより、該標的内在性遺伝子が
関わる疾患を推定することが可能となる。また、該内在
性遺伝子の機能並びに該遺伝子の疾患との関わりが明ら
かな場合には、該ノックイン細胞やノックイン動物に種
々の化合物を投与することにより、該化合物の投与に依
存する該レポーター遺伝子の発現の増減を誘導する活性
を有する化合物を同定することができる。そのようにし
て同定された化合物は該標的内在性遺伝子の発現調節剤
として該遺伝子が関わる疾患の治療剤として開発される
価値を有する。
は、前述のノックアウト細胞やノックアウト動物におい
て可能となる該不活性化内在性遺伝子の機能解析だけで
なく、該標的内在性遺伝子の機能のさらに詳細な解析、
並びに該標的内在性遺伝子の発現を調節する薬剤の同定
を可能とするものである。即ち、ノックイン細胞やノッ
クイン動物は、該不活性化された標的内在性遺伝子のか
わりに挿入された外来性のルシフェラーゼやβラクタマ
ーゼ等の外来性のレポーター遺伝子を発現するように作
製されていることから、該標的内在性遺伝子の機能が不
明である場合には、該ノックイン細胞やノックイン動物
に医薬上の活性が判明している種々の薬剤や化合物を投
与し、該薬剤の投与に依存する該レポーター遺伝子の発
現の増減を測定することにより、該標的内在性遺伝子が
関わる疾患を推定することが可能となる。また、該内在
性遺伝子の機能並びに該遺伝子の疾患との関わりが明ら
かな場合には、該ノックイン細胞やノックイン動物に種
々の化合物を投与することにより、該化合物の投与に依
存する該レポーター遺伝子の発現の増減を誘導する活性
を有する化合物を同定することができる。そのようにし
て同定された化合物は該標的内在性遺伝子の発現調節剤
として該遺伝子が関わる疾患の治療剤として開発される
価値を有する。
【０００８】相同組換えによるジーンターゲティングに
おいて用いられるターゲティングＤＮＡ（ターゲティン
グベクター）は、内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配
列の上流のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列、及び
該標的ＤＮＡ配列の下流のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤ
ＮＡ配列を各々の末端に有し、当該２つの相同なＤＮＡ
配列の間にマーカー遺伝子などの外来性遺伝子を含む基
本構造を有する。ターゲティングＤＮＡと内在性ゲノム
ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせるためには、ター
ゲティングＤＮＡの２つの相同領域は各々少なくとも約
２乃至５Kbの塩基長が必要とされる。従って、ターゲテ
ィングＤＮＡの製造のためには、標的内在性ＤＮＡ配列
を含むゲノムＤＮＡをクローニングし、該２つの相同な
長鎖ゲノムＤＮＡ配列を得る必要があり、相同組換え用
ターゲティングＤＮＡ（ベクター）の製造においては、
この工程が最も時間と労力を必要とする工程である。
おいて用いられるターゲティングＤＮＡ（ターゲティン
グベクター）は、内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配
列の上流のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列、及び
該標的ＤＮＡ配列の下流のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤ
ＮＡ配列を各々の末端に有し、当該２つの相同なＤＮＡ
配列の間にマーカー遺伝子などの外来性遺伝子を含む基
本構造を有する。ターゲティングＤＮＡと内在性ゲノム
ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせるためには、ター
ゲティングＤＮＡの２つの相同領域は各々少なくとも約
２乃至５Kbの塩基長が必要とされる。従って、ターゲテ
ィングＤＮＡの製造のためには、標的内在性ＤＮＡ配列
を含むゲノムＤＮＡをクローニングし、該２つの相同な
長鎖ゲノムＤＮＡ配列を得る必要があり、相同組換え用
ターゲティングＤＮＡ（ベクター）の製造においては、
この工程が最も時間と労力を必要とする工程である。
【０００９】例えば、ノックアウトマウスあるいはノッ
クインマウスの作製を例に挙げるならば、該マウスの作
製に必要なターゲティングＤＮＡ（ベクター）、即ち、
マウスの内在性ゲノムＤＮＡ中のあるＤＮＡ配列（標的
ＤＮＡ配列）をマーカー遺伝子で置換することにより不
活性化（破壊）するための相同組換えターゲティングＤ
ＮＡの製造は、これまでのところ概ね下記のような操作
工程が必要とされ、またこの方法が最も汎用されている
唯一の方法である。
クインマウスの作製を例に挙げるならば、該マウスの作
製に必要なターゲティングＤＮＡ（ベクター）、即ち、
マウスの内在性ゲノムＤＮＡ中のあるＤＮＡ配列（標的
ＤＮＡ配列）をマーカー遺伝子で置換することにより不
活性化（破壊）するための相同組換えターゲティングＤ
ＮＡの製造は、これまでのところ概ね下記のような操作
工程が必要とされ、またこの方法が最も汎用されている
唯一の方法である。
【００１０】（１）標的ＤＮＡ配列の一部のＤＮＡ配列
を基に該ＤＮＡ配列を含むＤＮＡにハイブリダイズする
少なくとも約２００bp以上の塩基長を有するプローブを
作製し、該プローブを放射性標識し、プラークハイブリ
ダイゼーション用の標識プローブを調製する。 （２）該放射性標識プローブ及び市販または必要に応じ
て調製したマウスゲノムＤＮＡのλファージライブラリ
ーを用いてプラークハイブリダイゼーションを行い、該
標的ＤＮＡ配列を含む長鎖ゲノムＤＮＡがクローニング
されている陽性λファージプラークを同定、取得する
（Crunsteinら、Proc. Natl. Acid. Sci.USA、第72巻、
第3961頁、1975年）。 （３）該陽性クローンを複数の適当な制限酵素の組み合
わせで消化して得られるゲノムＤＮＡ断片を電気泳動に
供して各々のゲノムＤＮＡ断片の遺伝子の大きさを解析
する。
を基に該ＤＮＡ配列を含むＤＮＡにハイブリダイズする
少なくとも約２００bp以上の塩基長を有するプローブを
作製し、該プローブを放射性標識し、プラークハイブリ
ダイゼーション用の標識プローブを調製する。 （２）該放射性標識プローブ及び市販または必要に応じ
て調製したマウスゲノムＤＮＡのλファージライブラリ
ーを用いてプラークハイブリダイゼーションを行い、該
標的ＤＮＡ配列を含む長鎖ゲノムＤＮＡがクローニング
されている陽性λファージプラークを同定、取得する
（Crunsteinら、Proc. Natl. Acid. Sci.USA、第72巻、
第3961頁、1975年）。 （３）該陽性クローンを複数の適当な制限酵素の組み合
わせで消化して得られるゲノムＤＮＡ断片を電気泳動に
供して各々のゲノムＤＮＡ断片の遺伝子の大きさを解析
する。
【００１１】（４）下記工程（５）で調製する２つのゲ
ノムＤＮＡ断片を調製するための必要な遺伝子情報を得
るために、該解析結果を基に該長鎖ゲノムＤＮＡの制限
酵素地図を作成する。 （５）該標的ＤＮＡ配列の上流及び下流に位置する各々
少なくとも２乃至５Kbの遺伝子長を有するゲノムＤＮＡ
断片が得られるように、該制限酵素地図を基に、該長鎖
ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断する。ここで得ら
れた２つのゲノムＤＮＡ断片を、相同組換え用ターゲテ
ィングＤＮＡの両端に各々配置する相同ＤＮＡ配列とし
て用いる。 （６）ネオマイシン等のマーカー遺伝子が発現可能なよ
うに配置されている発現ベクター、あるいは該マーカー
遺伝子並びにルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子が発
現可能なように配置されている発現ベクターを、適当な
制限酵素を用い消化し、線状化発現ベクターＤＮＡを調
製、取得する。 （７）前記（５）で調製した２つの相同ゲノムＤＮＡ配
列の各々を、該線状化が発現ベクターＤＮＡの各々の末
端に連結し、目的のターゲティングＤＮＡを得る。
ノムＤＮＡ断片を調製するための必要な遺伝子情報を得
るために、該解析結果を基に該長鎖ゲノムＤＮＡの制限
酵素地図を作成する。 （５）該標的ＤＮＡ配列の上流及び下流に位置する各々
少なくとも２乃至５Kbの遺伝子長を有するゲノムＤＮＡ
断片が得られるように、該制限酵素地図を基に、該長鎖
ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断する。ここで得ら
れた２つのゲノムＤＮＡ断片を、相同組換え用ターゲテ
ィングＤＮＡの両端に各々配置する相同ＤＮＡ配列とし
て用いる。 （６）ネオマイシン等のマーカー遺伝子が発現可能なよ
うに配置されている発現ベクター、あるいは該マーカー
遺伝子並びにルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子が発
現可能なように配置されている発現ベクターを、適当な
制限酵素を用い消化し、線状化発現ベクターＤＮＡを調
製、取得する。 （７）前記（５）で調製した２つの相同ゲノムＤＮＡ配
列の各々を、該線状化が発現ベクターＤＮＡの各々の末
端に連結し、目的のターゲティングＤＮＡを得る。
【００１２】上記方法により目的のターゲティングＤＮ
Ａを得るためには、種々の条件が全て整った条件下でヒ
ト一人が一日約８時間作業を行ったとして、通常約３ヶ
月の期間を必要とする。また、上述のような従来法の実
施においては、下記のような作業上の制約を受けるだけ
でなく種々の煩雑な操作を必要とする。工程（１）にお
いてプラークハイブリダイゼーション用のプローブを作
製するためには、標的ＤＮＡ配列の塩基配列が少なくと
も約２００bp以上決定されていることが必要である。昨
今多数報告されているマウスＥＳＴ（Expressed Sequen
ce Tag）などは、塩基長が２００bpに満たないものも多
数あるため、そのような短い塩基長のマウスＥＳＴを標
的ＤＮＡ配列とする場合には、ターゲティングＤＮＡの
作製は不可能である。工程（２）におけるプラークハイ
ブリダーゼーションは、放射性物質を扱わねばならない
ことから、特殊な施設と取り扱い上の細心の注意を必要
とし操作が非常に煩雑となる。さらに、当該プラークハ
イブリダイゼーションにより再現性を以って陽性プラー
クを同定するためには、通常少なくとも３回の同一操作
が必要とされ時間と労力を要する。
Ａを得るためには、種々の条件が全て整った条件下でヒ
ト一人が一日約８時間作業を行ったとして、通常約３ヶ
月の期間を必要とする。また、上述のような従来法の実
施においては、下記のような作業上の制約を受けるだけ
でなく種々の煩雑な操作を必要とする。工程（１）にお
いてプラークハイブリダイゼーション用のプローブを作
製するためには、標的ＤＮＡ配列の塩基配列が少なくと
も約２００bp以上決定されていることが必要である。昨
今多数報告されているマウスＥＳＴ（Expressed Sequen
ce Tag）などは、塩基長が２００bpに満たないものも多
数あるため、そのような短い塩基長のマウスＥＳＴを標
的ＤＮＡ配列とする場合には、ターゲティングＤＮＡの
作製は不可能である。工程（２）におけるプラークハイ
ブリダーゼーションは、放射性物質を扱わねばならない
ことから、特殊な施設と取り扱い上の細心の注意を必要
とし操作が非常に煩雑となる。さらに、当該プラークハ
イブリダイゼーションにより再現性を以って陽性プラー
クを同定するためには、通常少なくとも３回の同一操作
が必要とされ時間と労力を要する。
【００１３】工程（３）及び（４）においては、工程
（３）で得られた種々の組み合わせの制限酵素で切断し
て得られるゲノムＤＮＡ断片の各々を電気泳動に供し各
々の断片の塩基長を解析し、該解析結果を基に正確な制
限酵素地図を作成する必要がある。この制限酵素地図作
成の工程は、上記全行程の中で最も時間と労力を必要と
する工程である。
（３）で得られた種々の組み合わせの制限酵素で切断し
て得られるゲノムＤＮＡ断片の各々を電気泳動に供し各
々の断片の塩基長を解析し、該解析結果を基に正確な制
限酵素地図を作成する必要がある。この制限酵素地図作
成の工程は、上記全行程の中で最も時間と労力を必要と
する工程である。
【００１４】ノックアウトマウスあるいはノックインマ
ウスの作製のための次の操作は、そのような方法により
作製されたターゲティングＤＮＡを用いて、ノックアウ
ト胚性幹細胞（Embryonic stem cell；ES細胞）または
ノックアウトＥＳ細胞を作製する工程である。該組換え
ＥＳ細胞は、これまでのところ概ね下記のようにして作
製されている。 （８）正常マウスの受精卵から取得される胚性幹細胞
（Embryonic stem cell；ES細胞）に、ターゲティング
ベクターをマイクロインジェクションする（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 19
80；米国特許第4,873,191号公報）。 （９）該細胞の内在性ゲノムＤＮＡと該ターゲティング
ＤＮＡとの相同組換えの結果生じる該内在性ゲノムＤＮ
Ａに該ターゲティングＤＮＡが組込まれたＥＳ細胞を、
該ターゲティングＤＮＡ中に含まれるマーカー遺伝子の
ＤＮＡ配列を基に設計されたプライマーと、該ターゲテ
ィングＤＮＡのさらに外側に位置する該内在性ゲノムＤ
ＮＡの既知の塩基配列を基に設計されたプライマーとを
用いたポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain react
ion；PCR反応、（「遺伝子増幅ＰＣＲ法・基礎と新しい
展開」、共立出版株式会社発行、1992年など））による
遺伝子増幅により得られる遺伝子増幅産物の大きさを解
析することにより選別し、目的のノックアウトＥＳ細胞
またはノックインＥＳ細胞として回収する。
ウスの作製のための次の操作は、そのような方法により
作製されたターゲティングＤＮＡを用いて、ノックアウ
ト胚性幹細胞（Embryonic stem cell；ES細胞）または
ノックアウトＥＳ細胞を作製する工程である。該組換え
ＥＳ細胞は、これまでのところ概ね下記のようにして作
製されている。 （８）正常マウスの受精卵から取得される胚性幹細胞
（Embryonic stem cell；ES細胞）に、ターゲティング
ベクターをマイクロインジェクションする（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 19
80；米国特許第4,873,191号公報）。 （９）該細胞の内在性ゲノムＤＮＡと該ターゲティング
ＤＮＡとの相同組換えの結果生じる該内在性ゲノムＤＮ
Ａに該ターゲティングＤＮＡが組込まれたＥＳ細胞を、
該ターゲティングＤＮＡ中に含まれるマーカー遺伝子の
ＤＮＡ配列を基に設計されたプライマーと、該ターゲテ
ィングＤＮＡのさらに外側に位置する該内在性ゲノムＤ
ＮＡの既知の塩基配列を基に設計されたプライマーとを
用いたポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain react
ion；PCR反応、（「遺伝子増幅ＰＣＲ法・基礎と新しい
展開」、共立出版株式会社発行、1992年など））による
遺伝子増幅により得られる遺伝子増幅産物の大きさを解
析することにより選別し、目的のノックアウトＥＳ細胞
またはノックインＥＳ細胞として回収する。
【００１５】上記工程（９）のようなＰＣＲによるＥＳ
細胞の選別は、内在性ゲノムＤＮＡに組込まれたターゲ
ティングＤＮＡのさらに外側に位置する該内在性ゲノム
の塩基配列が既知である場合にのみ可能であり、該配列
が不明な場合には、煩雑な試験操作を必要とするサザン
ハイブリダイゼーション（Southern hybridization）法
により解析する必要がある。上述したとおり、ノックア
ウト動物あるいはノックイン動物の作製のために必要な
ターゲティングＤＮＡ並びにノックアウトＥＳ細胞ある
いはノックインＥＳ細胞の作製は、煩雑な操作に加え、
多大な時間と労力を必要とするものあった。
細胞の選別は、内在性ゲノムＤＮＡに組込まれたターゲ
ティングＤＮＡのさらに外側に位置する該内在性ゲノム
の塩基配列が既知である場合にのみ可能であり、該配列
が不明な場合には、煩雑な試験操作を必要とするサザン
ハイブリダイゼーション（Southern hybridization）法
により解析する必要がある。上述したとおり、ノックア
ウト動物あるいはノックイン動物の作製のために必要な
ターゲティングＤＮＡ並びにノックアウトＥＳ細胞ある
いはノックインＥＳ細胞の作製は、煩雑な操作に加え、
多大な時間と労力を必要とするものあった。
【００１６】一方、上述のような従来のターゲティング
DNAの作製のためのツールの１つとしてのゲノムDNAライ
ブラリー（例えば、市販のマウスゲノムDNAライブラリ
ー）と同様に、マウスやヒトのcDNAライブラリーも市販
品の購入や所望に応じ常法に従って作製することにより
入手可能である。ｃDNAライブラリーには種々のｃDNAラ
イブラリーが入手可能であるが、例えば、哺乳動物の蛋
白質の全長をコードするオープンリーディングフレーム
（open reading frame; ORF）あるいはＯＲＦに加え5'U
TRや3'UTRを含むcDNAライブラリーが遺伝子解析、医学
及び薬学の研究分野で汎用されている。
DNAの作製のためのツールの１つとしてのゲノムDNAライ
ブラリー（例えば、市販のマウスゲノムDNAライブラリ
ー）と同様に、マウスやヒトのcDNAライブラリーも市販
品の購入や所望に応じ常法に従って作製することにより
入手可能である。ｃDNAライブラリーには種々のｃDNAラ
イブラリーが入手可能であるが、例えば、哺乳動物の蛋
白質の全長をコードするオープンリーディングフレーム
（open reading frame; ORF）あるいはＯＲＦに加え5'U
TRや3'UTRを含むcDNAライブラリーが遺伝子解析、医学
及び薬学の研究分野で汎用されている。
【００１７】この全長ｃDNAライブラリーをハイブリダ
イゼーションプローブを用いるプラークハイブリダイゼ
ーションや一対のプライマーを用いるＰＣＲ（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）によりスクリーニングすることにより、
所望の蛋白の全長をコードするORFを含むｃDNAを選別、
取得することが可能である。即ち、昨今の多数報告され
ているＥＳＴのような既知または未知の所望の蛋白をコ
ードするＯＲＦ、5'UTR及び／または3'UTRの一部の塩基
配列を知り得ている場合には、該塩基配列を基にプロー
ブまたはプライマーを設計することによりハイブリダイ
ゼーション法やＰＣＲにより該所望の蛋白の全長（ＯＲ
Ｆ）をコードするｃＤＮＡを入手することが可能であ
る。さらに、該同定されたｃＤＮＡの塩基配列を決定す
ることにより該既知または未知の所望の蛋白の全長アミ
ノ酸配列を知ることができる。
イゼーションプローブを用いるプラークハイブリダイゼ
ーションや一対のプライマーを用いるＰＣＲ（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）によりスクリーニングすることにより、
所望の蛋白の全長をコードするORFを含むｃDNAを選別、
取得することが可能である。即ち、昨今の多数報告され
ているＥＳＴのような既知または未知の所望の蛋白をコ
ードするＯＲＦ、5'UTR及び／または3'UTRの一部の塩基
配列を知り得ている場合には、該塩基配列を基にプロー
ブまたはプライマーを設計することによりハイブリダイ
ゼーション法やＰＣＲにより該所望の蛋白の全長（ＯＲ
Ｆ）をコードするｃＤＮＡを入手することが可能であ
る。さらに、該同定されたｃＤＮＡの塩基配列を決定す
ることにより該既知または未知の所望の蛋白の全長アミ
ノ酸配列を知ることができる。
【００１８】上述のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングは、その操作の簡便性の観点から一対のプライマー
を用いるＰＣＲによるスクリーニングが有用である。し
かしながら、このＰＣＲによるスクリーニングを商業的
に業として営む外部サービスが存在する理由の一つでも
あるように、その実験操作を研究者自身が行う場合に
は、後述するようにその操作の煩雑性と多大な時間を要
するものである。即ち、該ＰＣＲによるスクリーニング
は下記のような３回のＰＣＲを含む工程からなる。
ングは、その操作の簡便性の観点から一対のプライマー
を用いるＰＣＲによるスクリーニングが有用である。し
かしながら、このＰＣＲによるスクリーニングを商業的
に業として営む外部サービスが存在する理由の一つでも
あるように、その実験操作を研究者自身が行う場合に
は、後述するようにその操作の煩雑性と多大な時間を要
するものである。即ち、該ＰＣＲによるスクリーニング
は下記のような３回のＰＣＲを含む工程からなる。
【００１９】（１）各々のｃＤＮＡクローンを複数枚の
96ウェルマイクロプレートの各ウェルに配備したｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する（市販品も使用可能。例え
ば、Sawady/Origene社のRapid Screen cDNAライブラリ
ーパネルなど）。 （２）所望の蛋白をコードするＯＲＦ、5'UTR及び／ま
たは3'UTRの一部の塩基配列を基に設計された一対のプ
ライマーＤＮＡであって、該一対のプライマーは鋳型ｃ
ＤＮＡにアニーリングしＰＣＲ反応により該一対のプラ
イマーの各々に対して内向きに塩基配列を増幅する一対
のプライマーを作製する。 （３）該一対のプライマーを用いて、該複数枚のマイク
ロプレート各々の全てのウェル中のクローン（約50万ク
ローン）に対してＰＣＲを施した後、ＰＣＲ産物をゲル
電気泳動することにより遺伝子増幅の認められる陽性ウ
ェル（約5000クローン）を同定する。 （４）前記（３）で同定された陽性ウェルのクローンを
配備したサブプレート各々の全ウェル中のクローン（約
5000クローン）に対してＰＣＲを施した後、ＰＣＲ産物
をゲル電気泳動することにより遺伝子増幅の認められる
陽性ウェル（約50クローン）を同定する。 （５）前記（４）で同定された陽性ウェルのクローンを
配備したマイクロプレートの全てのクローン（約50クロ
ーン）に対してＰＣＲを施した後、ＰＣＲ産物をゲル電
気泳動することにより遺伝子増幅の有無を確認する。 （６）遺伝子増幅が確認されたクローンを目的のｃＤＮ
Ａクローンをして取得する。
96ウェルマイクロプレートの各ウェルに配備したｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する（市販品も使用可能。例え
ば、Sawady/Origene社のRapid Screen cDNAライブラリ
ーパネルなど）。 （２）所望の蛋白をコードするＯＲＦ、5'UTR及び／ま
たは3'UTRの一部の塩基配列を基に設計された一対のプ
ライマーＤＮＡであって、該一対のプライマーは鋳型ｃ
ＤＮＡにアニーリングしＰＣＲ反応により該一対のプラ
イマーの各々に対して内向きに塩基配列を増幅する一対
のプライマーを作製する。 （３）該一対のプライマーを用いて、該複数枚のマイク
ロプレート各々の全てのウェル中のクローン（約50万ク
ローン）に対してＰＣＲを施した後、ＰＣＲ産物をゲル
電気泳動することにより遺伝子増幅の認められる陽性ウ
ェル（約5000クローン）を同定する。 （４）前記（３）で同定された陽性ウェルのクローンを
配備したサブプレート各々の全ウェル中のクローン（約
5000クローン）に対してＰＣＲを施した後、ＰＣＲ産物
をゲル電気泳動することにより遺伝子増幅の認められる
陽性ウェル（約50クローン）を同定する。 （５）前記（４）で同定された陽性ウェルのクローンを
配備したマイクロプレートの全てのクローン（約50クロ
ーン）に対してＰＣＲを施した後、ＰＣＲ産物をゲル電
気泳動することにより遺伝子増幅の有無を確認する。 （６）遺伝子増幅が確認されたクローンを目的のｃＤＮ
Ａクローンをして取得する。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】従って、（１）従来の
ターゲティングDNAの製造方法が有していた上述のよう
な種々の問題点を改善し、短期間に低労力で簡便に相同
組換え用ターゲティングＤＮＡ（ベクター）を作製で
き、また内在性ゲノムＤＮＡに所望の修飾を施した細胞
の簡便な選別を可能とする新規な方法の開発が強く望ま
れていた。また、（２）ｃＤＮＡライブラリーをさらに
簡便に且つ迅速にスクリーニングして所望のｃＤＮＡを
保持するクローンを同定、取得できる方法の開発が強く
望まれていた。即ち、本発明は、（１）従来のターゲテ
ィングDNAの製造方法が有していた全ての問題点を解決
し、ノックアウト動物やノックイン動物の作製の効率を
増大させる新規且つ有用な方法、（２）該方法により作
製されるターゲティングDNA、（３）ｃＤＮＡライブラ
リーを極めて簡便に且つ迅速にスクリーニングして所望
のｃＤＮＡを保持するクローンを同定、取得できる新規
且つ有用な方法、及び（４）該ターゲティングDNAの製
造において極めて有用であり、且つ該ターゲティングDN
Aの作製の効率を大幅に増大させる新規ゲノムDNAライブ
ラリーを提供することを課題とする。
ターゲティングDNAの製造方法が有していた上述のよう
な種々の問題点を改善し、短期間に低労力で簡便に相同
組換え用ターゲティングＤＮＡ（ベクター）を作製で
き、また内在性ゲノムＤＮＡに所望の修飾を施した細胞
の簡便な選別を可能とする新規な方法の開発が強く望ま
れていた。また、（２）ｃＤＮＡライブラリーをさらに
簡便に且つ迅速にスクリーニングして所望のｃＤＮＡを
保持するクローンを同定、取得できる方法の開発が強く
望まれていた。即ち、本発明は、（１）従来のターゲテ
ィングDNAの製造方法が有していた全ての問題点を解決
し、ノックアウト動物やノックイン動物の作製の効率を
増大させる新規且つ有用な方法、（２）該方法により作
製されるターゲティングDNA、（３）ｃＤＮＡライブラ
リーを極めて簡便に且つ迅速にスクリーニングして所望
のｃＤＮＡを保持するクローンを同定、取得できる新規
且つ有用な方法、及び（４）該ターゲティングDNAの製
造において極めて有用であり、且つ該ターゲティングDN
Aの作製の効率を大幅に増大させる新規ゲノムDNAライブ
ラリーを提供することを課題とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行い、従来のターゲティングDN
Aの製造方法に比べ、低労力で極めて簡便に相同組換え
用ターゲティングＤＮＡ（ベクター）を製造でき、且つ
製造に要する期間を飛躍的に短縮することが可能な新規
且つ有用な本発明の相同組換え用ターゲティングDNAの
製造方法を見出すに至った。本発明のターゲティングDN
Aの製造方法の概略を、図９乃至図11並びに図15に模式
的に示す。さらに、本発明の方法により製造されるター
ゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換え
により、該内在性ゲノムＤＮＡの一部が修飾された組換
え細胞（例えば、胚性幹細胞など）または組換え生物
（例えば、組換え非ヒト哺乳動物、組換え細菌、組換え
ウイルスなど）を簡便に選別できる新規且つ有用な本発
明の方法を見出すに至った。その選別方法の概略を図12
乃至図14に模式的に示す。また、ｃＤＮＡライブラリー
を極めて簡便に且つ迅速にスクリーニングして所望のｃ
ＤＮＡを保持するクローンを同定、取得できる新規且つ
有用な本発明の方法を見出すに到った。その方法の概略
を図16に模式的に示す。
を解決すべく鋭意研究を行い、従来のターゲティングDN
Aの製造方法に比べ、低労力で極めて簡便に相同組換え
用ターゲティングＤＮＡ（ベクター）を製造でき、且つ
製造に要する期間を飛躍的に短縮することが可能な新規
且つ有用な本発明の相同組換え用ターゲティングDNAの
製造方法を見出すに至った。本発明のターゲティングDN
Aの製造方法の概略を、図９乃至図11並びに図15に模式
的に示す。さらに、本発明の方法により製造されるター
ゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換え
により、該内在性ゲノムＤＮＡの一部が修飾された組換
え細胞（例えば、胚性幹細胞など）または組換え生物
（例えば、組換え非ヒト哺乳動物、組換え細菌、組換え
ウイルスなど）を簡便に選別できる新規且つ有用な本発
明の方法を見出すに至った。その選別方法の概略を図12
乃至図14に模式的に示す。また、ｃＤＮＡライブラリー
を極めて簡便に且つ迅速にスクリーニングして所望のｃ
ＤＮＡを保持するクローンを同定、取得できる新規且つ
有用な本発明の方法を見出すに到った。その方法の概略
を図16に模式的に示す。
【００２２】本発明の相同組換え用ターゲティングＤＮ
Ａの製造方法の１つは、下記の工程を含むものである。 内在性ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に相同組換えに
よる修飾を施そうとする宿主のゲノムＤＮＡ断片であっ
て、該標的ＤＮＡ配列を含むゲノムＤＮＡ断片を取得す
る。 該ゲノムＤＮＡ断片を該標的ＤＮＡ配列の外側の部位
で所望の制限酵素により切断する。 該切断したゲノムＤＮＡ断片を、分子内連結（自己環
状化）による環状ゲノムＤＮＡを調製する。さらに、所
望に応じ、該連結部位に所望の制限酵素により切断可能
な塩基配列を含むリンカーＤＮＡを挿入した環状ゲノム
ＤＮＡを調製する。 逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）により、
該環状ゲノムＤＮＡを該標的ＤＮＡ配列から互いに外向
きに増幅し得る一対のプライマーＤＮＡを調製する。 該環状ゲノムＤＮＡを鋳型とし、該一対のプライマー
ＤＮＡを用いて逆PCR反応を行い、該各々のプライマー
ＤＮＡと同一の塩基及び／またはそれらに相補的な塩基
配列を各々の末端に有し、前記で用いた制限酵素によ
り認識される塩基配列または前記のリンカーＤＮＡに
含まれる制限酵素認識塩基配列を内部に含む組換えゲノ
ムＤＮＡ断片を調製する。 該組換えゲノムＤＮＡ断片を、宿主生物の内在性ゲノ
ムＤＮＡに導入したい所望の外来性ＤＮＡ（例えば、ネ
オマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子、ルシフェ
ラーゼあるいはβラクタマーゼなどのレポーター遺伝
子、あるいはその両方の遺伝子など）が発現可能なよう
に配置された発現ベクターＤＮＡを所望の制限酵素で切
断して得られる線状化発現ベクターＤＮＡ配列と連結
し、再び環状化する。さらに、前記工程におけるリン
カーＤＮＡ配列の挿入を本工程で行うことができる。即
ち、所望に応じ、該連結部位に所望の制限酵素により切
断可能な塩基配列を含むリンカーＤＮＡを挿入した環状
ゲノムＤＮＡを調製する。得られた環状化ＤＮＡ構築物
は、適当な宿主（例えば、大腸菌など）を該ＤＮＡ構築
物で形質転換することにより増幅することができる。 該環状化ＤＮＡ構築物を、該前記で用いた制限酵素
により認識される塩基配列または前記のリンカーＤＮ
Ａに含まれる制限酵素認識塩基配列で切断して得られる
組換えゲノムＤＮＡ断片を目的のターゲティングＤＮＡ
（ベクター）として回収する。該ターゲティングＤＮＡ
は、該標的ＤＮＡ配列の外側に位置する該内在性ゲノム
のＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列（相同領域）であっ
て、該内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換えに必要な十分
な長さの相同領域を両端に有し、且つ該外来性ＤＮＡを
配列の内部に有する。
Ａの製造方法の１つは、下記の工程を含むものである。 内在性ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に相同組換えに
よる修飾を施そうとする宿主のゲノムＤＮＡ断片であっ
て、該標的ＤＮＡ配列を含むゲノムＤＮＡ断片を取得す
る。 該ゲノムＤＮＡ断片を該標的ＤＮＡ配列の外側の部位
で所望の制限酵素により切断する。 該切断したゲノムＤＮＡ断片を、分子内連結（自己環
状化）による環状ゲノムＤＮＡを調製する。さらに、所
望に応じ、該連結部位に所望の制限酵素により切断可能
な塩基配列を含むリンカーＤＮＡを挿入した環状ゲノム
ＤＮＡを調製する。 逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）により、
該環状ゲノムＤＮＡを該標的ＤＮＡ配列から互いに外向
きに増幅し得る一対のプライマーＤＮＡを調製する。 該環状ゲノムＤＮＡを鋳型とし、該一対のプライマー
ＤＮＡを用いて逆PCR反応を行い、該各々のプライマー
ＤＮＡと同一の塩基及び／またはそれらに相補的な塩基
配列を各々の末端に有し、前記で用いた制限酵素によ
り認識される塩基配列または前記のリンカーＤＮＡに
含まれる制限酵素認識塩基配列を内部に含む組換えゲノ
ムＤＮＡ断片を調製する。 該組換えゲノムＤＮＡ断片を、宿主生物の内在性ゲノ
ムＤＮＡに導入したい所望の外来性ＤＮＡ（例えば、ネ
オマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子、ルシフェ
ラーゼあるいはβラクタマーゼなどのレポーター遺伝
子、あるいはその両方の遺伝子など）が発現可能なよう
に配置された発現ベクターＤＮＡを所望の制限酵素で切
断して得られる線状化発現ベクターＤＮＡ配列と連結
し、再び環状化する。さらに、前記工程におけるリン
カーＤＮＡ配列の挿入を本工程で行うことができる。即
ち、所望に応じ、該連結部位に所望の制限酵素により切
断可能な塩基配列を含むリンカーＤＮＡを挿入した環状
ゲノムＤＮＡを調製する。得られた環状化ＤＮＡ構築物
は、適当な宿主（例えば、大腸菌など）を該ＤＮＡ構築
物で形質転換することにより増幅することができる。 該環状化ＤＮＡ構築物を、該前記で用いた制限酵素
により認識される塩基配列または前記のリンカーＤＮ
Ａに含まれる制限酵素認識塩基配列で切断して得られる
組換えゲノムＤＮＡ断片を目的のターゲティングＤＮＡ
（ベクター）として回収する。該ターゲティングＤＮＡ
は、該標的ＤＮＡ配列の外側に位置する該内在性ゲノム
のＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列（相同領域）であっ
て、該内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換えに必要な十分
な長さの相同領域を両端に有し、且つ該外来性ＤＮＡを
配列の内部に有する。
【００２３】本発明の相同組換え用ターゲティングＤＮ
Ａの製造方法の他の１つは、下記の工程を含むものであ
る。 内在性ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に相同組換えに
よる修飾を施そうとする宿主のゲノムＤＮＡ断片であっ
て、該標的ＤＮＡ配列を含むゲノムＤＮＡ断片と、所望
の制限酵素で切断可能な制限酵素認識塩基配列を有する
発現ベクターDNAとからなる環状ゲノムDNAを取得する。 逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）により、
該環状ゲノムＤＮＡを該標的ＤＮＡ配列から互いに外向
きに増幅し得る一対のプライマーＤＮＡを調製する。さ
らに所望に応じ、該一対のプライマーDNAの各々は、そ
の5'末端に所望の制限酵素認識塩基配列を有することが
できる。 該環状ゲノムＤＮＡを鋳型とし、該一対のプライマー
ＤＮＡを用いて逆PCR反応を行い、該各々のプライマー
ＤＮＡと同一の塩基及び／またはそれらに相補的な塩基
配列を各々の末端に有し、該発現ベクターDNAを内部に
含む組換えゲノムＤＮＡ断片を調製する。 所望に応じ、前記で得た組換えゲノムDNA断片を、
各々の末端で分子内連結（自己環状化）することにより
環状ゲノムDNAを調製し、この環状ゲノムDNAで形質転換
した適当な宿主（例えば、大腸菌など）を培養すること
により所望の量の該環状ゲノムDNAを調製する。 前記で得た組換えゲノムDNA断片または前記で増
幅した環状ゲノムDNAを、前記におけるプライマーの
5'末端に配備した制限酵素認識配列を認識する制限酵素
で処理する。この処理により、前記で得た組換えゲノ
ムDNA断片の両末端が、制限酵素切断末端塩基配列を有
することとなる。 前記で得た組換えゲノムＤＮＡ断片を、宿主生物の
内在性ゲノムＤＮＡに導入したい所望のマーカー遺伝子
（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子など）及び／または
レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼあるいはβ
ラクタマーゼなど）を含む外来性ＤＮＡ（好ましくは、
該組換えゲノムＤＮＡ断片と同一の制限酵素切断末端Ｄ
ＮＡ配列を有する）と連結することにより再び環状ゲノ
ムＤＮＡを調製する。 前記で得た環状ゲノムＤＮＡを、この環状ゲノムＤ
ＮＡの塩基配列中に含まれる前記の発現ベクターＤＮ
Ａ中の任意に部位で、制限酵素により切断して得られる
組換えゲノムＤＮＡ断片を目的のターゲティングＤＮＡ
（ベクター）として回収する。該ターゲティングＤＮＡ
は、該標的ＤＮＡ配列の外側に位置する該内在性ゲノム
のＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列（相同領域）であっ
て、該内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換えに必要な十分
な長さの相同領域を両端に有し、且つ該外来性ＤＮＡを
配列の内部に有する。
Ａの製造方法の他の１つは、下記の工程を含むものであ
る。 内在性ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に相同組換えに
よる修飾を施そうとする宿主のゲノムＤＮＡ断片であっ
て、該標的ＤＮＡ配列を含むゲノムＤＮＡ断片と、所望
の制限酵素で切断可能な制限酵素認識塩基配列を有する
発現ベクターDNAとからなる環状ゲノムDNAを取得する。 逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）により、
該環状ゲノムＤＮＡを該標的ＤＮＡ配列から互いに外向
きに増幅し得る一対のプライマーＤＮＡを調製する。さ
らに所望に応じ、該一対のプライマーDNAの各々は、そ
の5'末端に所望の制限酵素認識塩基配列を有することが
できる。 該環状ゲノムＤＮＡを鋳型とし、該一対のプライマー
ＤＮＡを用いて逆PCR反応を行い、該各々のプライマー
ＤＮＡと同一の塩基及び／またはそれらに相補的な塩基
配列を各々の末端に有し、該発現ベクターDNAを内部に
含む組換えゲノムＤＮＡ断片を調製する。 所望に応じ、前記で得た組換えゲノムDNA断片を、
各々の末端で分子内連結（自己環状化）することにより
環状ゲノムDNAを調製し、この環状ゲノムDNAで形質転換
した適当な宿主（例えば、大腸菌など）を培養すること
により所望の量の該環状ゲノムDNAを調製する。 前記で得た組換えゲノムDNA断片または前記で増
幅した環状ゲノムDNAを、前記におけるプライマーの
5'末端に配備した制限酵素認識配列を認識する制限酵素
で処理する。この処理により、前記で得た組換えゲノ
ムDNA断片の両末端が、制限酵素切断末端塩基配列を有
することとなる。 前記で得た組換えゲノムＤＮＡ断片を、宿主生物の
内在性ゲノムＤＮＡに導入したい所望のマーカー遺伝子
（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子など）及び／または
レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼあるいはβ
ラクタマーゼなど）を含む外来性ＤＮＡ（好ましくは、
該組換えゲノムＤＮＡ断片と同一の制限酵素切断末端Ｄ
ＮＡ配列を有する）と連結することにより再び環状ゲノ
ムＤＮＡを調製する。 前記で得た環状ゲノムＤＮＡを、この環状ゲノムＤ
ＮＡの塩基配列中に含まれる前記の発現ベクターＤＮ
Ａ中の任意に部位で、制限酵素により切断して得られる
組換えゲノムＤＮＡ断片を目的のターゲティングＤＮＡ
（ベクター）として回収する。該ターゲティングＤＮＡ
は、該標的ＤＮＡ配列の外側に位置する該内在性ゲノム
のＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列（相同領域）であっ
て、該内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換えに必要な十分
な長さの相同領域を両端に有し、且つ該外来性ＤＮＡを
配列の内部に有する。
【００２４】本発明のターゲティングＤＮＡ（ベクタ
ー）の製造方法は、前述した従来の方法において避ける
ことができなかった下記（１）乃至（３）のような煩雑
な操作を必要としないことから、本発明の方法を用いれ
ば、従来法によるターゲティングＤＮＡの製造に要して
いた約３ヶ月という製造期間を最短で約２週間に短縮す
ることが可能である。： （１）標的ＤＮＡ配列を含む内在性ゲノムＤＮＡ断片の
取得に、時間と労力を要するプラークハイブリダイゼー
ション法を行う必要がある。 （２）プラークハイブリダーゼーションの実施には、放
射性物質とＲＩ（放射性同位体）管理施設等の特殊な試
薬及び施設の使用を必要とする。 （３）多大な時間と労力を要する得られた内在性ゲノム
ＤＮＡ断片の制限酵素地図の作成が必須である。
ー）の製造方法は、前述した従来の方法において避ける
ことができなかった下記（１）乃至（３）のような煩雑
な操作を必要としないことから、本発明の方法を用いれ
ば、従来法によるターゲティングＤＮＡの製造に要して
いた約３ヶ月という製造期間を最短で約２週間に短縮す
ることが可能である。： （１）標的ＤＮＡ配列を含む内在性ゲノムＤＮＡ断片の
取得に、時間と労力を要するプラークハイブリダイゼー
ション法を行う必要がある。 （２）プラークハイブリダーゼーションの実施には、放
射性物質とＲＩ（放射性同位体）管理施設等の特殊な試
薬及び施設の使用を必要とする。 （３）多大な時間と労力を要する得られた内在性ゲノム
ＤＮＡ断片の制限酵素地図の作成が必須である。
【００２５】また、従来の方法では、その煩雑な操作の
必要性から複数種類のターゲティングＤＮＡの製造を一
人で同時に行うことが不可能であったが、本発明の方法
を用いれば、その簡便性により、一人で複数種類のター
ゲティングＤＮＡの製造を同時に行うことが可能であ
る。従って、それら２つの効果が合わさることにより、
本発明の製造方法を用いれば、一種類のターゲティング
ベクターの製造のための期間を、最短で約１週間に短縮
できることとなる。また、この製造期間の飛躍的な短縮
により、ターゲティングベクターの製造に要するコスト
を大幅に低減することが可能となる。
必要性から複数種類のターゲティングＤＮＡの製造を一
人で同時に行うことが不可能であったが、本発明の方法
を用いれば、その簡便性により、一人で複数種類のター
ゲティングＤＮＡの製造を同時に行うことが可能であ
る。従って、それら２つの効果が合わさることにより、
本発明の製造方法を用いれば、一種類のターゲティング
ベクターの製造のための期間を、最短で約１週間に短縮
できることとなる。また、この製造期間の飛躍的な短縮
により、ターゲティングベクターの製造に要するコスト
を大幅に低減することが可能となる。
【００２６】さらに、従来の方法においては、プラーク
ハイブリダイゼーション用のプローブを作製するため
に、標的ＤＮＡ配列の塩基配列が少なくとも約２００bp
以上決定されていることが必要であったため、ＥＳＴ
（Expressed Sequence Tag）のような塩基長が２００bp
に満たないＤＮＡ配列を標的とするターゲティングＤＮ
Ａの作製は不可能であった。一方、本発明の製造方法に
よるターゲティングＤＮＡの製造においては、各々標的
ＤＮＡ配列の一部に相補的な２種類のＰＣＲ用プライマ
ーＤＮＡを設計することが可能な最低約７０bpの塩基配
列が決定されていれば十分である。即ち、本発明の製造
方法を用いれば、従来法では不可能であった、塩基長が
２００bpに満たないＥＳＴのような短いＤＮＡ配列を標
的としたターゲティングＤＮＡの製造が可能である。
ハイブリダイゼーション用のプローブを作製するため
に、標的ＤＮＡ配列の塩基配列が少なくとも約２００bp
以上決定されていることが必要であったため、ＥＳＴ
（Expressed Sequence Tag）のような塩基長が２００bp
に満たないＤＮＡ配列を標的とするターゲティングＤＮ
Ａの作製は不可能であった。一方、本発明の製造方法に
よるターゲティングＤＮＡの製造においては、各々標的
ＤＮＡ配列の一部に相補的な２種類のＰＣＲ用プライマ
ーＤＮＡを設計することが可能な最低約７０bpの塩基配
列が決定されていれば十分である。即ち、本発明の製造
方法を用いれば、従来法では不可能であった、塩基長が
２００bpに満たないＥＳＴのような短いＤＮＡ配列を標
的としたターゲティングＤＮＡの製造が可能である。
【００２７】本発明の他の一つは、上述の本発明のター
ゲティングＤＮＡを用いた相同組換えにより製造され得
る組換え細胞（例えば、組換えＥＳ細胞など）または組
換え生物（例えば、組換え非ヒト哺乳動物、組換え細
菌、組換えウイルス、組換え植物など）、即ち、該ター
ゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換え
により該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列が修飾
された組換え細胞または組換え生物の選別方法である。
本発明の選別方法は、下記の工程を含む方法である。 前述のようにして製造されたターゲティングＤＮＡの
いずれかの末端から該ターゲティングＤＮＡに含まれる
外来性ＤＮＡ（例えば、ネオマイシン等のマーカー遺伝
子）の所望の領域までのＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅
することが可能な下記Ａ及びＢの一対のプライマーＤＮ
Ａを設計、調製する。 Ａ）該外来性ＤＮＡの一部の塩基配列に相補的なプライ
マーＤＮＡ。 Ｂ）該ターゲティングＤＮＡのいずれかの末端の塩基配
列に相補的なプライマーＤＮＡ。 被験組換え細胞または被験組換え生物の内在性ゲノム
ＤＮＡを鋳型とし、前記２つのプライマーＤＮＡを用い
たポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ増幅を
行う。 ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない組換
え細胞または組換え生物を同定し、回収する。
ゲティングＤＮＡを用いた相同組換えにより製造され得
る組換え細胞（例えば、組換えＥＳ細胞など）または組
換え生物（例えば、組換え非ヒト哺乳動物、組換え細
菌、組換えウイルス、組換え植物など）、即ち、該ター
ゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換え
により該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列が修飾
された組換え細胞または組換え生物の選別方法である。
本発明の選別方法は、下記の工程を含む方法である。 前述のようにして製造されたターゲティングＤＮＡの
いずれかの末端から該ターゲティングＤＮＡに含まれる
外来性ＤＮＡ（例えば、ネオマイシン等のマーカー遺伝
子）の所望の領域までのＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅
することが可能な下記Ａ及びＢの一対のプライマーＤＮ
Ａを設計、調製する。 Ａ）該外来性ＤＮＡの一部の塩基配列に相補的なプライ
マーＤＮＡ。 Ｂ）該ターゲティングＤＮＡのいずれかの末端の塩基配
列に相補的なプライマーＤＮＡ。 被験組換え細胞または被験組換え生物の内在性ゲノム
ＤＮＡを鋳型とし、前記２つのプライマーＤＮＡを用い
たポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ増幅を
行う。 ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない組換
え細胞または組換え生物を同定し、回収する。
【００２８】従来のＰＣＲを利用した相同組換えによる
組換え細胞または組換え生物の選別は、該ターゲティン
グＤＮＡ中に含まれるマーカー遺伝子のＤＮＡ配列を基
に設計されたプライマーと、該ターゲティングＤＮＡの
さらに外側に位置する該内在性ゲノムＤＮＡの既知の塩
基配列を基に設計されたプライマーとを用いたＰＣＲに
基づくものであった。しかしながら、この方法は、内在
性ゲノムＤＮＡに組込まれたターゲティングＤＮＡのさ
らに外側に位置する該内在性ゲノムの塩基配列が既知で
ある場合にのみ可能であり、該外側の配列が不明な場合
には、煩雑な試験操作を必要とするサザンハイブリダイ
ゼーション（Southern hybridization）法による解析を
せざるを得なかった。
組換え細胞または組換え生物の選別は、該ターゲティン
グＤＮＡ中に含まれるマーカー遺伝子のＤＮＡ配列を基
に設計されたプライマーと、該ターゲティングＤＮＡの
さらに外側に位置する該内在性ゲノムＤＮＡの既知の塩
基配列を基に設計されたプライマーとを用いたＰＣＲに
基づくものであった。しかしながら、この方法は、内在
性ゲノムＤＮＡに組込まれたターゲティングＤＮＡのさ
らに外側に位置する該内在性ゲノムの塩基配列が既知で
ある場合にのみ可能であり、該外側の配列が不明な場合
には、煩雑な試験操作を必要とするサザンハイブリダイ
ゼーション（Southern hybridization）法による解析を
せざるを得なかった。
【００２９】一方、ターゲティングＤＮＡと内在性ゲノ
ムＤＮＡとの相同組換えにおいては、これまでの実験に
よる分析から次のような事実が明らかとなっている。即
ち、ターゲティングＤＮＡが正しい相同組換えにより標
的ＤＮＡ配列中に組み込まれた場合には、該ターゲティ
ングＤＮＡは末端配列を欠落することなく組み込まれて
いる。しかしながら、ランダムインテグレーション（ra
ndom integration）のように、ターゲティングＤＮＡ
が、標的ＤＮＡ配列以外の部位あるいは誤った形で内在
性ゲノムＤＮＡに組み込まれた場合には、組み込まれた
ターゲティングＤＮＡは、かなり高い確率でその末端配
列を欠落している。
ムＤＮＡとの相同組換えにおいては、これまでの実験に
よる分析から次のような事実が明らかとなっている。即
ち、ターゲティングＤＮＡが正しい相同組換えにより標
的ＤＮＡ配列中に組み込まれた場合には、該ターゲティ
ングＤＮＡは末端配列を欠落することなく組み込まれて
いる。しかしながら、ランダムインテグレーション（ra
ndom integration）のように、ターゲティングＤＮＡ
が、標的ＤＮＡ配列以外の部位あるいは誤った形で内在
性ゲノムＤＮＡに組み込まれた場合には、組み込まれた
ターゲティングＤＮＡは、かなり高い確率でその末端配
列を欠落している。
【００３０】本発明者らは、この実験的事実に着目し
て、組換え細胞（または組換え生物）の内在性ゲノムＤ
ＮＡ中に組み込まれたターゲティングＤＮＡの末端配列
の有無を上述したＰＣＲにより解析することにより極め
て高い精度で正常な相同組換えが起こった組換え細胞
（または組換え生物）を選別できることを見出し、上述
の本発明の選別方法を完成するに至った。即ち、本発明
の選別方法を用いれば、上述した従来の方法に問題点を
容易に解決することが可能である。
て、組換え細胞（または組換え生物）の内在性ゲノムＤ
ＮＡ中に組み込まれたターゲティングＤＮＡの末端配列
の有無を上述したＰＣＲにより解析することにより極め
て高い精度で正常な相同組換えが起こった組換え細胞
（または組換え生物）を選別できることを見出し、上述
の本発明の選別方法を完成するに至った。即ち、本発明
の選別方法を用いれば、上述した従来の方法に問題点を
容易に解決することが可能である。
【００３１】本発明は、さらに、上述した本発明のター
ゲティングＤＮＡの製造方法により作製されるターゲテ
ィングＤＮＡ、該ターゲティングＤＮＡを用いて作製さ
れる組換え細胞または組換え生物（組換え細菌、組換え
ウイルス、組換え非ヒト哺乳動物、組換え植物など）に
関する。該組換え体の作製においては、必要に応じ前記
に概略した本発明の組換え細胞等の選別方法を用いるこ
とができる。
ゲティングＤＮＡの製造方法により作製されるターゲテ
ィングＤＮＡ、該ターゲティングＤＮＡを用いて作製さ
れる組換え細胞または組換え生物（組換え細菌、組換え
ウイルス、組換え非ヒト哺乳動物、組換え植物など）に
関する。該組換え体の作製においては、必要に応じ前記
に概略した本発明の組換え細胞等の選別方法を用いるこ
とができる。
【００３２】本発明は、さらなる１つは、ｃＤＮＡライ
ブラリーから所望のアミノ酸配列または蛋白質をコード
するｃＤＮＡを保持するクローン（陽性クローン）を同
定、取得する（スクリーニング）方法に関し、例えば、
下記の工程を含む方法である。 市販のｃＤＮＡライブラリーまたは独自に作製したｃ
ＤＮＡライブラリーを準備する。 既知のアミノ酸配列をコードする塩基配列または既知
の蛋白質をコードする塩基配列（ＯＲＦ、5'UTRまたは
3'UTR）を基に設計される一対のプライマーであって、
逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）により、該
ｃＤＮＡライブラリーの特定のクローン（環状ＤＮＡク
ローン）の塩基配列を、該プライマーがアニーリングし
た部位から互いに外向きに塩基配列を増幅し得る一対の
プライマーＤＮＡを調製する。さらに所望に応じ、該一
対のプライマーDNAの各々は、その5'末端に所望の制限
酵素認識塩基配列を有することができる。 該ｃＤＮＡライブラリーの各々のクローンを鋳型と
し、該各々のクローンに対して該一対のプライマーＤＮ
Ａを用いて逆PCR反応を行う。 各々のクローンについてのＰＣＲ産物をゲル電気泳動
に供することにより、遺伝子増幅の有無を確認し、遺伝
子増幅の認められるクローンを同定し、目的の陽性クロ
ーンとして得る。 所望に応じ、該陽性クローンの塩基配列を決定し、該
クローンに目的のアミノ酸配列または蛋白質をコードす
る塩基配列（ｃＤＮＡ）が保持されていることを確認す
る。 本発明のｃＤＮＡのスクリーニング方法を用いれば、従
来必要とした複数回のＰＣＲ反応といった煩雑な操作が
不要とされ、所望のｃＤＮＡクローンを極めて簡便且つ
迅速に同定、取得（選別）することができる。
ブラリーから所望のアミノ酸配列または蛋白質をコード
するｃＤＮＡを保持するクローン（陽性クローン）を同
定、取得する（スクリーニング）方法に関し、例えば、
下記の工程を含む方法である。 市販のｃＤＮＡライブラリーまたは独自に作製したｃ
ＤＮＡライブラリーを準備する。 既知のアミノ酸配列をコードする塩基配列または既知
の蛋白質をコードする塩基配列（ＯＲＦ、5'UTRまたは
3'UTR）を基に設計される一対のプライマーであって、
逆PCR反応（inverse PCR；inside-out PCR）により、該
ｃＤＮＡライブラリーの特定のクローン（環状ＤＮＡク
ローン）の塩基配列を、該プライマーがアニーリングし
た部位から互いに外向きに塩基配列を増幅し得る一対の
プライマーＤＮＡを調製する。さらに所望に応じ、該一
対のプライマーDNAの各々は、その5'末端に所望の制限
酵素認識塩基配列を有することができる。 該ｃＤＮＡライブラリーの各々のクローンを鋳型と
し、該各々のクローンに対して該一対のプライマーＤＮ
Ａを用いて逆PCR反応を行う。 各々のクローンについてのＰＣＲ産物をゲル電気泳動
に供することにより、遺伝子増幅の有無を確認し、遺伝
子増幅の認められるクローンを同定し、目的の陽性クロ
ーンとして得る。 所望に応じ、該陽性クローンの塩基配列を決定し、該
クローンに目的のアミノ酸配列または蛋白質をコードす
る塩基配列（ｃＤＮＡ）が保持されていることを確認す
る。 本発明のｃＤＮＡのスクリーニング方法を用いれば、従
来必要とした複数回のＰＣＲ反応といった煩雑な操作が
不要とされ、所望のｃＤＮＡクローンを極めて簡便且つ
迅速に同定、取得（選別）することができる。
【００３３】さらに本発明の他の１つは、生物（例え
ば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物）のゲノムＤＮＡ
ライブラリーに関する。具体的には、約５乃至12Kbの遺
伝子長を有するゲノムDNA断片を、適切なプラスミドや
ファージに挿入してなる環状ゲノムDNAクローンからな
るゲノムDNAライブラリーである。該ライブラリーは、
該環状ゲノムDNAクローンの各々を、例えば、多数のウ
ェルを有するマイクロプレートに配備してなるライブラ
リーである。本発明のゲノムDNAライブラリーを用いれ
ば、上述した相同組換え用ターゲティングDNAの作製で
必要とする所望のゲノムDNA断片を極めて簡便に取得す
ることが可能である。
ば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物）のゲノムＤＮＡ
ライブラリーに関する。具体的には、約５乃至12Kbの遺
伝子長を有するゲノムDNA断片を、適切なプラスミドや
ファージに挿入してなる環状ゲノムDNAクローンからな
るゲノムDNAライブラリーである。該ライブラリーは、
該環状ゲノムDNAクローンの各々を、例えば、多数のウ
ェルを有するマイクロプレートに配備してなるライブラ
リーである。本発明のゲノムDNAライブラリーを用いれ
ば、上述した相同組換え用ターゲティングDNAの作製で
必要とする所望のゲノムDNA断片を極めて簡便に取得す
ることが可能である。
【００３４】本発明は、具体的には下記のとおりであ
る。 （１）生物の内在性ゲノムDNA中のDNA配列の一部を、相
同組換えにより修飾するためのターゲティングＤＮＡの
製造方法であって、下記工程（ａ）乃至（ｅ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]を該切断末端ＤＮＡ配列で
分子内連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を調
製する工程； （ｃ）該環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型とし、
下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E1]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[X]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
る。 （１）生物の内在性ゲノムDNA中のDNA配列の一部を、相
同組換えにより修飾するためのターゲティングＤＮＡの
製造方法であって、下記工程（ａ）乃至（ｅ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]を該切断末端ＤＮＡ配列で
分子内連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を調
製する工程； （ｃ）該環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型とし、
下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E1]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[X]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
【００３５】（２）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子
からなるＤＮＡであることを特徴とする前記（１）に記
載の製造方法。 （３）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（１）に記載の製造方法。 （４）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（３）に記載の製造方法。 （５）該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子で
あることを特徴とする前記（２）乃至前記（４）のいず
れかに記載の製造方法。 （６）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の制限酵素
であることを特徴とする前記（１）乃至前記（５）のい
ずれかに記載の製造方法。 （７）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる制限
酵素であることを特徴とする前記（１）乃至前記（５）
のいずれかに記載の製造方法。 （８）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（１）乃
至前記（７）のいずれかに記載の製造方法。 （９）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（８）に記載の製造方法。 （10）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（９）に記載の製造方法。 （11）該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮＡ断片をバ
クテリア人工染色体（BAC）または酵母人工染色体（YA
C）中にクローン化してなるマウスゲノムＤＮＡ断片の
ライブラリーから選別されるものであることを特徴とす
る前記（10）に記載の製造方法。 （12）該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへの転写を不
能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめ
るものであることを特徴とする前記（１）乃至前記（1
1）のいずれかに記載の製造方法。
からなるＤＮＡであることを特徴とする前記（１）に記
載の製造方法。 （３）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（１）に記載の製造方法。 （４）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（３）に記載の製造方法。 （５）該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子で
あることを特徴とする前記（２）乃至前記（４）のいず
れかに記載の製造方法。 （６）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の制限酵素
であることを特徴とする前記（１）乃至前記（５）のい
ずれかに記載の製造方法。 （７）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる制限
酵素であることを特徴とする前記（１）乃至前記（５）
のいずれかに記載の製造方法。 （８）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（１）乃
至前記（７）のいずれかに記載の製造方法。 （９）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（８）に記載の製造方法。 （10）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（９）に記載の製造方法。 （11）該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮＡ断片をバ
クテリア人工染色体（BAC）または酵母人工染色体（YA
C）中にクローン化してなるマウスゲノムＤＮＡ断片の
ライブラリーから選別されるものであることを特徴とす
る前記（10）に記載の製造方法。 （12）該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへの転写を不
能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめ
るものであることを特徴とする前記（１）乃至前記（1
1）のいずれかに記載の製造方法。
【００３６】（13）生物の内在性ゲノムDNA中のDNA配列
の一部を、相同組換えにより修飾するためのターゲティ
ングＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃至
（ｆ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]を該切断末端ＤＮＡ配列で
分子内連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を調
製する工程； （ｃ）該環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型とし、
下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムDNA[C2]を、制限酵素[E1]により切
断し、該制限酵素切断部位に制限酵素[E4]により切断可
能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]を含むリンカーＤＮＡ
を挿入することにより、該制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]
及び該標的ＤＮＡ配列[T]を含む組換え環状ゲノムＤＮ
Ａ[C3]を調製する工程； （ｆ）該環状ゲノムＤＮＡ[C3]を制限酵素[E4]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
の一部を、相同組換えにより修飾するためのターゲティ
ングＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃至
（ｆ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]を該切断末端ＤＮＡ配列で
分子内連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を調
製する工程； （ｃ）該環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型とし、
下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムDNA[C2]を、制限酵素[E1]により切
断し、該制限酵素切断部位に制限酵素[E4]により切断可
能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]を含むリンカーＤＮＡ
を挿入することにより、該制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]
及び該標的ＤＮＡ配列[T]を含む組換え環状ゲノムＤＮ
Ａ[C3]を調製する工程； （ｆ）該環状ゲノムＤＮＡ[C3]を制限酵素[E4]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
【００３７】（14）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子
からなるＤＮＡであることを特徴とする前記（13）に記
載の製造方法。 （15）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（13）に記載の製造方法。 （16）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（15）に記載の製造方法。 （17）該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子で
あることを特徴とする前記（14）乃至前記（16）のいず
れかに記載の製造方法。 （18）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の制限酵素
であることを特徴とする前記（13）乃至前記（17）のい
ずれかに記載の製造方法。 （19）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる制限
酵素であることを特徴とする前記（13）乃至前記（17）
のいずれかに記載の製造方法。 （20）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（13）乃
至前記（19）のいずれかに記載の製造方法。 （21）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（20）に記載の製造方法。 （22）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（21）に記載の製造方法。 （23）該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮＡ断片をバ
クテリア人工染色体（BAC）または酵母人工染色体（YA
C）中にクローン化してなるマウスゲノムＤＮＡ断片の
ライブラリーから選別されるものであることを特徴とす
る前記（22）に記載の製造方法。 （24）該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへの転写を不
能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめ
るものであることを特徴とする前記（13）乃至前記（2
3）のいずれかに記載の製造方法。
からなるＤＮＡであることを特徴とする前記（13）に記
載の製造方法。 （15）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（13）に記載の製造方法。 （16）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（15）に記載の製造方法。 （17）該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子で
あることを特徴とする前記（14）乃至前記（16）のいず
れかに記載の製造方法。 （18）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の制限酵素
であることを特徴とする前記（13）乃至前記（17）のい
ずれかに記載の製造方法。 （19）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる制限
酵素であることを特徴とする前記（13）乃至前記（17）
のいずれかに記載の製造方法。 （20）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（13）乃
至前記（19）のいずれかに記載の製造方法。 （21）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（20）に記載の製造方法。 （22）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（21）に記載の製造方法。 （23）該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮＡ断片をバ
クテリア人工染色体（BAC）または酵母人工染色体（YA
C）中にクローン化してなるマウスゲノムＤＮＡ断片の
ライブラリーから選別されるものであることを特徴とす
る前記（22）に記載の製造方法。 （24）該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへの転写を不
能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめ
るものであることを特徴とする前記（13）乃至前記（2
3）のいずれかに記載の製造方法。
【００３８】（25）生物の内在性ゲノムDNA中のDNA配列
の一部を、相同組換えにより修飾するためのターゲティ
ングＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃至
（ｅ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]と、制限酵素[E4]により切
断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]を含むリンカーＤ
ＮＡとを連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配
列[Y]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を
調製する工程； （ｃ）該組換え環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型
とし、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ
[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[Y]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E4]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
の一部を、相同組換えにより修飾するためのターゲティ
ングＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃至
（ｅ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]と、制限酵素[E4]により切
断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]を含むリンカーＤ
ＮＡとを連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配
列[Y]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を
調製する工程； （ｃ）該組換え環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型
とし、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ
[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[Y]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E4]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
【００３９】（26）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子
からなるＤＮＡであることを特徴とする前記（25）に記
載の製造方法。 （27）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（25）に記載の製造方法。 （28）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（27）に記載の製造方法。 （29）該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子で
あることを特徴とする前記（25）乃至前記（28）のいず
れかに記載の製造方法。 （30）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の制限酵素
であることを特徴とする前記（25）乃至前記（29）のい
ずれかに記載の製造方法。 （31）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる制限
酵素であることを特徴とする前記（25）乃至前記（29）
のいずれかに記載の製造方法。 （32）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（25）乃
至前記（31）のいずれかに記載の製造方法。 （33）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（32）に記載の製造方法。 （34）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（33）に記載の製造方法。 （35）該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮＡ断片をバ
クテリア人工染色体（BAC）または酵母人工染色体（YA
C）中にクローン化してなるマウスゲノムＤＮＡ断片のB
ACライブラリーから選別されるものであることを特徴と
する前記（34）に記載の製造方法。 （36）該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへの転写を不
能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめ
るものであることを特徴とする前記（25）乃至前記（3
5）のいずれかに記載の製造方法。
からなるＤＮＡであることを特徴とする前記（25）に記
載の製造方法。 （27）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（25）に記載の製造方法。 （28）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（27）に記載の製造方法。 （29）該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子で
あることを特徴とする前記（25）乃至前記（28）のいず
れかに記載の製造方法。 （30）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の制限酵素
であることを特徴とする前記（25）乃至前記（29）のい
ずれかに記載の製造方法。 （31）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる制限
酵素であることを特徴とする前記（25）乃至前記（29）
のいずれかに記載の製造方法。 （32）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（25）乃
至前記（31）のいずれかに記載の製造方法。 （33）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（32）に記載の製造方法。 （34）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（33）に記載の製造方法。 （35）該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮＡ断片をバ
クテリア人工染色体（BAC）または酵母人工染色体（YA
C）中にクローン化してなるマウスゲノムＤＮＡ断片のB
ACライブラリーから選別されるものであることを特徴と
する前記（34）に記載の製造方法。 （36）該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへの転写を不
能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめ
るものであることを特徴とする前記（25）乃至前記（3
5）のいずれかに記載の製造方法。
【００４０】（37）生物の内在性ゲノムＤＮＡ中のＤＮ
Ａ配列の一部を、相同組換えにより修飾するためのター
ゲティングＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）
乃至（ｃ）の工程： （ａ）該生物のゲノムＤＮＡ断片であって該ＤＮＡ配列
[T]を含むゲノムＤＮＡ断片[L1]と制限酵素[E1]で切断
可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を有する発現ベクタ
ーＤＮＡとからなる環状ゲノムＤＮＡ[C1]の各々のＤＮ
Ａ鎖を鋳型とし、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライ
マーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]
の5'末端側にアニーリングするように設計されたプライ
マーＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングするように設計されたプ
ライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応によ
るＤＮＡ増幅により、下記ＤＮＡ鎖[III]及びＤＮＡ鎖
[IV]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマー[P1]に相補的なＤＮＡ配
列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配列を各
々の末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を含
むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマー[P1]と同一のＤＮＡ配列及
び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列を各々
の末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を含む
ＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]を調
製する工程； （ｂ）該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]の末端を制限酵素
[E2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断
片[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限
酵素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]に
よる切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有する該生物に
とって外来である外来性ＤＮＡと連結させることにより
環状ゲノムＤＮＡ[C3]を調製する工程；及び （ｃ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E1]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[X]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
Ａ配列の一部を、相同組換えにより修飾するためのター
ゲティングＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）
乃至（ｃ）の工程： （ａ）該生物のゲノムＤＮＡ断片であって該ＤＮＡ配列
[T]を含むゲノムＤＮＡ断片[L1]と制限酵素[E1]で切断
可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を有する発現ベクタ
ーＤＮＡとからなる環状ゲノムＤＮＡ[C1]の各々のＤＮ
Ａ鎖を鋳型とし、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライ
マーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]
の5'末端側にアニーリングするように設計されたプライ
マーＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングするように設計されたプ
ライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応によ
るＤＮＡ増幅により、下記ＤＮＡ鎖[III]及びＤＮＡ鎖
[IV]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマー[P1]に相補的なＤＮＡ配
列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配列を各
々の末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を含
むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマー[P1]と同一のＤＮＡ配列及
び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列を各々
の末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を含む
ＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]を調
製する工程； （ｂ）該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]の末端を制限酵素
[E2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断
片[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限
酵素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]に
よる切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有する該生物に
とって外来である外来性ＤＮＡと連結させることにより
環状ゲノムＤＮＡ[C3]を調製する工程；及び （ｃ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E1]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[X]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。
【００４１】（38）下記工程（ａ2）乃至（ａ4）： （ａ2）工程（ａ）で得た組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]
を分子内連結することにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を調
製する工程； （ａ3）宿主を該環状ゲノムＤＮＡ[C2]で形質転換する
ことにより得られる形質転換宿主を培養することにより
該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を増幅する工程；及び （ａ4）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E2]及び／
または制限酵素[E3]により該分子内連結部位で切断し
て、所望の量の該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]を調製す
る工程、をさらに含むことを特徴とする前記（37）に記
載の製造方法。 （39）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子からなるＤＮ
Ａであることを特徴とする前記（37）または前記（38）
に記載の製造方法。 （40）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（37）または前記（38）に記載の製造方法。 （41）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（40）に記載の製造方法。 （42）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の酵素であ
ることを特徴とする前記（37）乃至前記（41）のいずれ
かに記載の製造方法。 （43）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる酵素
であることを特徴とする前記（37）乃至前記（41）のい
ずれかに記載の製造方法。 （44）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（37）乃
至前記（43）のいずれかに記載の製造方法。 （45）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（44）に記載の製造方法。 （46）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（45）に記載の製造方法。 （47）該ゲノムＤＮＡ断片[L1]が、マウスのゲノムＤＮ
Ａ断片をバクテリア人工染色体（BAC）または酵母人工
染色体（YAC）中にクローン化してなるマウスゲノムＤ
ＮＡ断片のライブラリーから選別されたクローン中に含
まれるマウスゲノムＤＮＡ断片に由来するものであるこ
とを特徴とする前記（46）に記載の製造方法。
を分子内連結することにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を調
製する工程； （ａ3）宿主を該環状ゲノムＤＮＡ[C2]で形質転換する
ことにより得られる形質転換宿主を培養することにより
該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を増幅する工程；及び （ａ4）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E2]及び／
または制限酵素[E3]により該分子内連結部位で切断し
て、所望の量の該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]を調製す
る工程、をさらに含むことを特徴とする前記（37）に記
載の製造方法。 （39）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子からなるＤＮ
Ａであることを特徴とする前記（37）または前記（38）
に記載の製造方法。 （40）該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及びレポータ
ー遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とする前記
（37）または前記（38）に記載の製造方法。 （41）該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼまたはβ
ラクタマーゼをコードする遺伝子であることを特徴とす
る前記（40）に記載の製造方法。 （42）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の酵素であ
ることを特徴とする前記（37）乃至前記（41）のいずれ
かに記載の製造方法。 （43）該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異なる酵素
であることを特徴とする前記（37）乃至前記（41）のい
ずれかに記載の製造方法。 （44）該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、植物、細
菌またはウイルスであることを特徴とする前記（37）乃
至前記（43）のいずれかに記載の製造方法。 （45）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（44）に記載の製造方法。 （46）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（45）に記載の製造方法。 （47）該ゲノムＤＮＡ断片[L1]が、マウスのゲノムＤＮ
Ａ断片をバクテリア人工染色体（BAC）または酵母人工
染色体（YAC）中にクローン化してなるマウスゲノムＤ
ＮＡ断片のライブラリーから選別されたクローン中に含
まれるマウスゲノムＤＮＡ断片に由来するものであるこ
とを特徴とする前記（46）に記載の製造方法。
【００４２】（48）該環状ゲノムＤＮＡ[C1]が、該生物
のゲノムＤＮＡを制限酵素で消化して得られる任意のゲ
ノムＤＮＡ断片の各々と制限酵素[E1]で切断可能な制限
酵素認識ＤＮＡ配列[X]を有する発現ベクターＤＮＡと
からなる複数種類の環状ゲノムＤＮＡからなるゲノムＤ
ＮＡライブラリー中に含まれていることを特徴とする前
記（37）乃至前記（47）のいずれかに記載の製造方法。 （49）該ゲノムＤＮＡライブラリーが、該環状ゲノムＤ
ＮＡを複数のウェルを有するマイクロプレートに配備し
てなるゲノムＤＮＡライブラリーであることを特徴とす
る前記（48）に記載の製造方法。 （50）該環状ゲノムＤＮＡ中に含まれる該ゲノムＤＮＡ
断片の大きさが、約５乃至約12Kbであることを特徴とす
る前記（48）または前記（49）に記載の製造方法。 （51） 約５乃至約12Kbの大きさの生物のゲノムＤＮＡ
断片を発現ベクターにクローン化してなる複数種類のク
ローンからなるゲノムＤＮＡ断片ライブラリー。 （52）該ゲノムＤＮＡライブラリーが、該クローンの各
々を多数のウェルを有するマイクロプレートに配備して
なることを特徴とする前記（51）に記載のゲノムＤＮＡ
ライブラリー。 （53）前記（１）乃至前記（50）のいずれかに記載の製
造方法により得られるターゲティングＤＮＡ。 （54） 内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列が修飾され
た組換え細胞、組換え細菌または組換えウイルスの製造
方法であって、生物の細胞、細菌またはウイルスを前記
（１）乃至前記（12）または前記（37）乃至前記（50）
のいずれかに記載の製造方法により製造されるターゲテ
ィングベクターＤＮＡで形質転換し、該ターゲティング
ＤＮＡと該内在性ゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結
果、該内在性ゲノムＤＮＡに該ターゲティングベクター
ＤＮＡが組込まれている細胞、細菌またはウイルスを選
別し、取得することからなる製造方法。 （55）内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列が修飾された
組換え細胞、組換え細菌または組換えウイルスの製造方
法であって、生物の細胞、細菌またはウイルスを前記
（13）乃至前記（36）のいずれかに記載の製造方法によ
り製造されるターゲティングベクターＤＮＡで形質転換
し、該ターゲティングＤＮＡと該内在性ゲノムＤＮＡと
の間の相同組換えの結果、該内在性ゲノムＤＮＡに該タ
ーゲティングベクターＤＮＡが組込まれている細胞、細
菌またはウイルスを選別し、取得することからなる製造
方法。
のゲノムＤＮＡを制限酵素で消化して得られる任意のゲ
ノムＤＮＡ断片の各々と制限酵素[E1]で切断可能な制限
酵素認識ＤＮＡ配列[X]を有する発現ベクターＤＮＡと
からなる複数種類の環状ゲノムＤＮＡからなるゲノムＤ
ＮＡライブラリー中に含まれていることを特徴とする前
記（37）乃至前記（47）のいずれかに記載の製造方法。 （49）該ゲノムＤＮＡライブラリーが、該環状ゲノムＤ
ＮＡを複数のウェルを有するマイクロプレートに配備し
てなるゲノムＤＮＡライブラリーであることを特徴とす
る前記（48）に記載の製造方法。 （50）該環状ゲノムＤＮＡ中に含まれる該ゲノムＤＮＡ
断片の大きさが、約５乃至約12Kbであることを特徴とす
る前記（48）または前記（49）に記載の製造方法。 （51） 約５乃至約12Kbの大きさの生物のゲノムＤＮＡ
断片を発現ベクターにクローン化してなる複数種類のク
ローンからなるゲノムＤＮＡ断片ライブラリー。 （52）該ゲノムＤＮＡライブラリーが、該クローンの各
々を多数のウェルを有するマイクロプレートに配備して
なることを特徴とする前記（51）に記載のゲノムＤＮＡ
ライブラリー。 （53）前記（１）乃至前記（50）のいずれかに記載の製
造方法により得られるターゲティングＤＮＡ。 （54） 内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列が修飾され
た組換え細胞、組換え細菌または組換えウイルスの製造
方法であって、生物の細胞、細菌またはウイルスを前記
（１）乃至前記（12）または前記（37）乃至前記（50）
のいずれかに記載の製造方法により製造されるターゲテ
ィングベクターＤＮＡで形質転換し、該ターゲティング
ＤＮＡと該内在性ゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結
果、該内在性ゲノムＤＮＡに該ターゲティングベクター
ＤＮＡが組込まれている細胞、細菌またはウイルスを選
別し、取得することからなる製造方法。 （55）内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列が修飾された
組換え細胞、組換え細菌または組換えウイルスの製造方
法であって、生物の細胞、細菌またはウイルスを前記
（13）乃至前記（36）のいずれかに記載の製造方法によ
り製造されるターゲティングベクターＤＮＡで形質転換
し、該ターゲティングＤＮＡと該内在性ゲノムＤＮＡと
の間の相同組換えの結果、該内在性ゲノムＤＮＡに該タ
ーゲティングベクターＤＮＡが組込まれている細胞、細
菌またはウイルスを選別し、取得することからなる製造
方法。
【００４３】（56）該細胞、細菌またはウイルスの選別
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程；及び ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程、を含
むことを特徴とする前記（55）に記載の製造方法。
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程；及び ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程、を含
むことを特徴とする前記（55）に記載の製造方法。
【００４４】（57）該細胞、細菌またはウイルスの選別
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖[I]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ
由来のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]によ
る切断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖[II]に含まれる該外来性ＤＮＡの一
部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマ
ーＤＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ
増幅を行う工程； ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｃ）工程ｂ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記
のプライマーＤＮＡ[P5]及びプライマーＤＮＡ[P6]： プライマーＤＮＡ[P5]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P6]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[I]に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程；及び ｄ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程、を含
むことを特徴とする前記（55）に記載の製造方法。
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖[I]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ
由来のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]によ
る切断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖[II]に含まれる該外来性ＤＮＡの一
部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマ
ーＤＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ
増幅を行う工程； ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｃ）工程ｂ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記
のプライマーＤＮＡ[P5]及びプライマーＤＮＡ[P6]： プライマーＤＮＡ[P5]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P6]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[I]に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程；及び ｄ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程、を含
むことを特徴とする前記（55）に記載の製造方法。
【００４５】（58）該細胞、細菌またはウイルスの選別
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖[I]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ
由来のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]によ
る切断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖[II]に含まれる該外来性ＤＮＡの一
部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマ
ーＤＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ
増幅を行う工程； ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｃ）工程ｂ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記
のプライマーＤＮＡ[P5]及びプライマーＤＮＡ[P6]： プライマーＤＮＡ[P5]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P6]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[I]に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程； ｄ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｅ）該ターゲティングＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型と
し、該プライマーＤＮＡ[Ｐ3]及びプライマーＤＮＡ[P
5]を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を行
う工程； ｆ）増幅されたＤＮＡの各々の末端側に存在する制限酵
素認識ＤＮＡ配列[X]に隣接する内側のＤＮＡ配列を決
定する工程； ｇ）工程ｄ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、工程
ｆ）で決定されたＤＮＡ配列を基に下記のプライマーＤ
ＮＡ[P7]及びプライマーＤＮＡ[P8]：プライマーＤＮＡ
[P7]：該ターゲティングベクターＤＮＡの該ＤＮＡ鎖
[I]の3'末端側に存在する制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]及
びそれに隣接する内側のＤＮＡ配列の一部に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P8]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側に存在する制限酵素認識
ＤＮＡ配列[X]及びそれに隣接する内側のＤＮＡ配列の
一部に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡ、
を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を行う
工程；及び、 ｈ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められる細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程；を含
むことを特徴とする前記（55）に記載の製造方法。
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖[I]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ
由来のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]によ
る切断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖[II]に含まれる該外来性ＤＮＡの一
部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマ
ーＤＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ
増幅を行う工程； ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｃ）工程ｂ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記
のプライマーＤＮＡ[P5]及びプライマーＤＮＡ[P6]： プライマーＤＮＡ[P5]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P6]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[I]に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程； ｄ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｅ）該ターゲティングＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型と
し、該プライマーＤＮＡ[Ｐ3]及びプライマーＤＮＡ[P
5]を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を行
う工程； ｆ）増幅されたＤＮＡの各々の末端側に存在する制限酵
素認識ＤＮＡ配列[X]に隣接する内側のＤＮＡ配列を決
定する工程； ｇ）工程ｄ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、工程
ｆ）で決定されたＤＮＡ配列を基に下記のプライマーＤ
ＮＡ[P7]及びプライマーＤＮＡ[P8]：プライマーＤＮＡ
[P7]：該ターゲティングベクターＤＮＡの該ＤＮＡ鎖
[I]の3'末端側に存在する制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]及
びそれに隣接する内側のＤＮＡ配列の一部に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P8]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側に存在する制限酵素認識
ＤＮＡ配列[X]及びそれに隣接する内側のＤＮＡ配列の
一部に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡ、
を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を行う
工程；及び、 ｈ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められる細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程；を含
むことを特徴とする前記（55）に記載の製造方法。
【００４６】（59）該生物の細胞が、脊椎動物、昆虫、
原生動物、及び植物からなる群から選ばれるいずれかの
生物の細胞であることを特徴とする前記（54）乃至前記
（58）のいずれかに記載の製造方法。 （60）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（59）に記載の製造方法。 （61）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（60）に記載の方法。 （62）該ターゲティングベクターＤＮＡが、前記（1
1）、前記（23）、前記（35）または前記（47）のいず
れかに記載の製造方法により製造されるターゲティング
ベクターＤＮＡであることを特徴とする前記（61）に記
載の製造方法。 （63）該細胞が、胚性幹細胞であることを特徴とする前
記（60）乃至前記（62）のいずれかに記載の製造方法。 （64）該修飾が、該ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不能た
らしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめるも
のであることを特徴とする前記（54）乃至前記（63）の
いずれかに記載の製造方法。 （65）前記（54）乃至前記（64）のいずれかに記載の製
造方法により得られる組換え細胞、組換え細菌または組
換えウイルス。 （66）前記（63）に記載の製造方法により得られる組換
え胚性幹細胞。
原生動物、及び植物からなる群から選ばれるいずれかの
生物の細胞であることを特徴とする前記（54）乃至前記
（58）のいずれかに記載の製造方法。 （60）該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴
とする前記（59）に記載の製造方法。 （61）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（60）に記載の方法。 （62）該ターゲティングベクターＤＮＡが、前記（1
1）、前記（23）、前記（35）または前記（47）のいず
れかに記載の製造方法により製造されるターゲティング
ベクターＤＮＡであることを特徴とする前記（61）に記
載の製造方法。 （63）該細胞が、胚性幹細胞であることを特徴とする前
記（60）乃至前記（62）のいずれかに記載の製造方法。 （64）該修飾が、該ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不能た
らしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめるも
のであることを特徴とする前記（54）乃至前記（63）の
いずれかに記載の製造方法。 （65）前記（54）乃至前記（64）のいずれかに記載の製
造方法により得られる組換え細胞、組換え細菌または組
換えウイルス。 （66）前記（63）に記載の製造方法により得られる組換
え胚性幹細胞。
【００４７】（67）内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列
が修飾された組換え非ヒト哺乳動物の製造方法であっ
て、下記（ａ）乃至（ｅ）の工程： （ａ）雌性非ヒト哺乳動物[A]の受精卵に、前記（63）
に記載の製造方法により得られる組換え胚性幹細胞を注
入し組換え受精卵を得る工程； （ｂ）該組換え受精卵を、雌性非ヒト哺乳動物[B]の子
宮に移植する工程；及び、 （ｃ）該雌性非ヒト哺乳動物[B]が出産する雄性または
雌性の胎児[P]を得る工程、 （ｄ）下記（１）または（２）のいずれかの工程： （１）該胎児[P]が成長してなる雄性非ヒト哺乳動物[C]
を雌性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[D]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る工
程；または、 （２）該胎児[P]が成長してなる雌性非ヒト哺乳動物[C]
を雄性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[C]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る工
程； （ｅ）該胎児[Q]が成長してなる雄性または雌性の非ヒ
ト哺乳動物[E]から、該組換え胚性幹細胞のゲノムＤＮ
Ａ中の修飾に由来する修飾を、一対の染色体の一方に有
する雄性または雌性の該非ヒト哺乳動物[E]を選別し、
組換え非ヒト哺乳動物として得る工程、からなることを
特徴とする製造方法。
が修飾された組換え非ヒト哺乳動物の製造方法であっ
て、下記（ａ）乃至（ｅ）の工程： （ａ）雌性非ヒト哺乳動物[A]の受精卵に、前記（63）
に記載の製造方法により得られる組換え胚性幹細胞を注
入し組換え受精卵を得る工程； （ｂ）該組換え受精卵を、雌性非ヒト哺乳動物[B]の子
宮に移植する工程；及び、 （ｃ）該雌性非ヒト哺乳動物[B]が出産する雄性または
雌性の胎児[P]を得る工程、 （ｄ）下記（１）または（２）のいずれかの工程： （１）該胎児[P]が成長してなる雄性非ヒト哺乳動物[C]
を雌性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[D]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る工
程；または、 （２）該胎児[P]が成長してなる雌性非ヒト哺乳動物[C]
を雄性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[C]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る工
程； （ｅ）該胎児[Q]が成長してなる雄性または雌性の非ヒ
ト哺乳動物[E]から、該組換え胚性幹細胞のゲノムＤＮ
Ａ中の修飾に由来する修飾を、一対の染色体の一方に有
する雄性または雌性の該非ヒト哺乳動物[E]を選別し、
組換え非ヒト哺乳動物として得る工程、からなることを
特徴とする製造方法。
【００４８】（68）該雌性非ヒト哺乳動物[A]と該雌性
非ヒト哺乳動物[B]とが同一の個体であることを特徴と
する前記（67）に記載の製造方法。 （69）該雌性非ヒト哺乳動物[A]と該雌性非ヒト哺乳動
物[B]とが各々異なる個体であることを特徴とする前記
（67）に記載の製造方法。 （70）前記（67）乃至前記（69）のいずれかに記載の製
造方法であって、さらに下記の工程（ｆ）及び（ｇ）： （ｆ）下記（１）または（２）のいずれかの工程： （１）工程（ｅ）で得られた雄性組換え非ヒト哺乳動物
[E]を雌性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺
乳動物[F]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工
程；または、 （２）工程（ｅ）で得られた雌性組換え非ヒト哺乳動物
[E]を雄性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺
乳動物[E]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工
程；及び、 （ｇ）該胎児[R]が成長してなる雄性または雌性の非ヒ
ト哺乳動物[G]から、該組換え胚性幹細胞のゲノムＤＮ
Ａ中の修飾に由来する修飾を、一対の染色体の両方に有
する雄性または雌性の該非ヒト哺乳動物[G]を選別し、
組換え非ヒト哺乳動物として得る工程、からなることを
特徴とする製造方法。
非ヒト哺乳動物[B]とが同一の個体であることを特徴と
する前記（67）に記載の製造方法。 （69）該雌性非ヒト哺乳動物[A]と該雌性非ヒト哺乳動
物[B]とが各々異なる個体であることを特徴とする前記
（67）に記載の製造方法。 （70）前記（67）乃至前記（69）のいずれかに記載の製
造方法であって、さらに下記の工程（ｆ）及び（ｇ）： （ｆ）下記（１）または（２）のいずれかの工程： （１）工程（ｅ）で得られた雄性組換え非ヒト哺乳動物
[E]を雌性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺
乳動物[F]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工
程；または、 （２）工程（ｅ）で得られた雌性組換え非ヒト哺乳動物
[E]を雄性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺
乳動物[E]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工
程；及び、 （ｇ）該胎児[R]が成長してなる雄性または雌性の非ヒ
ト哺乳動物[G]から、該組換え胚性幹細胞のゲノムＤＮ
Ａ中の修飾に由来する修飾を、一対の染色体の両方に有
する雄性または雌性の該非ヒト哺乳動物[G]を選別し、
組換え非ヒト哺乳動物として得る工程、からなることを
特徴とする製造方法。
【００４９】（71）該工程（ｄ）が、雄性非ヒト哺乳動
物[C]を雌性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト
哺乳動物[C]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る
工程からなることを特徴とする前記（67）乃至前記（7
0）のいずれかに記載の製造方法。 （72）該工程（ｆ）が、雄性組換え非ヒト哺乳動物[E]
を雌性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[F]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工程
からなることを特徴とする前記（70）または前記（71）
に記載の製造方法。 （73）該修飾が、該ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不能た
らしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめるも
のであることを特徴とする前記（67）乃至前記（72）の
いずれかに記載の製造方法。 （74）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（67）乃至前記（73）のいずれかに記載の製造
方法。
物[C]を雌性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト
哺乳動物[C]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る
工程からなることを特徴とする前記（67）乃至前記（7
0）のいずれかに記載の製造方法。 （72）該工程（ｆ）が、雄性組換え非ヒト哺乳動物[E]
を雌性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[F]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工程
からなることを特徴とする前記（70）または前記（71）
に記載の製造方法。 （73）該修飾が、該ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不能た
らしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめるも
のであることを特徴とする前記（67）乃至前記（72）の
いずれかに記載の製造方法。 （74）該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴と
する前記（67）乃至前記（73）のいずれかに記載の製造
方法。
【００５０】（75）ｃＤＮＡライブラリーに含まれる所
望のｃＤＮＡを保持するクローンを同定し取得する方法
であって、下記工程（ａ）乃至（ｃ）： （ａ）該ｃＤＮＡライブラリーの各々のクローンに対し
て、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P
2]： プライマーＤＮＡ[P1]：該所望のｃＤＮＡの一方のＤＮ
Ａ鎖[I]の一部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤＮＡの
3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]の一部のＤＮＡ配列の5'末端側
にアニーリングするように設計されたプライマーＤＮ
Ａ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：該所望のｃＤＮＡの他方のＤＮ
Ａ鎖[II]の一部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤＮＡの
3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]の一部のＤＮＡ配列の5'末端側
にアニーリングするように設計されたプライマーＤＮ
Ａ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を施す工程； （ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡ増幅が認められるクロ
ーンを同定する工程；及び （ｃ）該同定したクローンを取得する工程、からなる方
法。
望のｃＤＮＡを保持するクローンを同定し取得する方法
であって、下記工程（ａ）乃至（ｃ）： （ａ）該ｃＤＮＡライブラリーの各々のクローンに対し
て、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P
2]： プライマーＤＮＡ[P1]：該所望のｃＤＮＡの一方のＤＮ
Ａ鎖[I]の一部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤＮＡの
3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]の一部のＤＮＡ配列の5'末端側
にアニーリングするように設計されたプライマーＤＮ
Ａ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：該所望のｃＤＮＡの他方のＤＮ
Ａ鎖[II]の一部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤＮＡの
3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]の一部のＤＮＡ配列の5'末端側
にアニーリングするように設計されたプライマーＤＮ
Ａ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を施す工程； （ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡ増幅が認められるクロ
ーンを同定する工程；及び （ｃ）該同定したクローンを取得する工程、からなる方
法。
【００５１】（76）該ｃＤＮＡライブラリーが、各々の
クローンを多数のウェルを有するマイクロプレートに配
備してなるｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とす
る前記（75）に記載の方法。 （77）該所望のｃＤＮＡが、オープンリーディングフレ
ーム（ORF）を含むことを特徴とする前記（75）または
前記（76）に記載の方法。 （78）該所望のｃＤＮＡが、3'UTR、ORF及び5'UTRを含
むことを特徴とする前記（75）乃至前記（77）のいずれ
かに記載の方法。 （79）該プライマー[P1]及びプライマー[P2]の各々が、
下記のいずれか： （ａ）該所望のｃＤＮＡのＯＲＦにアニーリングする； （ｂ）一方が該所望のｃＤＮＡのORFにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの5'UTRにアニーリン
グする； （ｃ）一方が該所望のｃＤＮＡのORFにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの3'UTRにアニーリン
グする；または （ｄ）一方が該所望のｃＤＮＡの5'UTRにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの3'UTRにアニーリン
グする、 の特徴を有するものであることを特徴とする前記（75）
乃至前記（78）のいずれかに記載の方法。 （80）該ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳動物のｍＲＮＡ
に対応するｃＤＮＡのライブラリーであることを特徴と
する前記（75）乃至前記（79）のいずれかに記載の方
法。 （81）該哺乳動物が、マウス、ラットまたはヒトである
ことを特徴とする前記（80）に記載の方法。 （82）配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を有する
タンパクをコードするＤＮＡまたはその断片。 （83）配列番号２４に記載される塩基配列を含むＤＮＡ
またはその断片。 （84）配列番号２４に記載される塩基配列の塩基番号３
乃至524の塩基を含むＤＮＡまたはその断片。 （85）配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を有する
タンパクまたはその断片。 （86）前記（82）乃至前記（84）のいずれかに記載のＤ
ＮＡ若しくはその断片を含む発現ベクター。 （97）前記（86）に記載の発現ベクターで形質転換され
た形質転換細胞。
クローンを多数のウェルを有するマイクロプレートに配
備してなるｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とす
る前記（75）に記載の方法。 （77）該所望のｃＤＮＡが、オープンリーディングフレ
ーム（ORF）を含むことを特徴とする前記（75）または
前記（76）に記載の方法。 （78）該所望のｃＤＮＡが、3'UTR、ORF及び5'UTRを含
むことを特徴とする前記（75）乃至前記（77）のいずれ
かに記載の方法。 （79）該プライマー[P1]及びプライマー[P2]の各々が、
下記のいずれか： （ａ）該所望のｃＤＮＡのＯＲＦにアニーリングする； （ｂ）一方が該所望のｃＤＮＡのORFにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの5'UTRにアニーリン
グする； （ｃ）一方が該所望のｃＤＮＡのORFにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの3'UTRにアニーリン
グする；または （ｄ）一方が該所望のｃＤＮＡの5'UTRにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの3'UTRにアニーリン
グする、 の特徴を有するものであることを特徴とする前記（75）
乃至前記（78）のいずれかに記載の方法。 （80）該ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳動物のｍＲＮＡ
に対応するｃＤＮＡのライブラリーであることを特徴と
する前記（75）乃至前記（79）のいずれかに記載の方
法。 （81）該哺乳動物が、マウス、ラットまたはヒトである
ことを特徴とする前記（80）に記載の方法。 （82）配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を有する
タンパクをコードするＤＮＡまたはその断片。 （83）配列番号２４に記載される塩基配列を含むＤＮＡ
またはその断片。 （84）配列番号２４に記載される塩基配列の塩基番号３
乃至524の塩基を含むＤＮＡまたはその断片。 （85）配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を有する
タンパクまたはその断片。 （86）前記（82）乃至前記（84）のいずれかに記載のＤ
ＮＡ若しくはその断片を含む発現ベクター。 （97）前記（86）に記載の発現ベクターで形質転換され
た形質転換細胞。
【００５２】
【発明の実施の形態】以下、本発明で用いる語句の意味
を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物」とは、脊椎動物、昆虫、原生動
物、植物、細菌及びウイルス等のあらゆる生命体を意味
する。好ましくは脊椎動物、細菌またはウイルスであ
り、さらに好ましくは脊椎動物またはウイルスであり、
特に好ましくは脊椎動物である。
を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物」とは、脊椎動物、昆虫、原生動
物、植物、細菌及びウイルス等のあらゆる生命体を意味
する。好ましくは脊椎動物、細菌またはウイルスであ
り、さらに好ましくは脊椎動物またはウイルスであり、
特に好ましくは脊椎動物である。
【００５３】脊椎動物としては、ヒト以外の哺乳動物
（非ヒト哺乳動物）が好ましい。非ヒト哺乳動物として
は、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウ
サギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウス等
を挙げることができ、好ましくはマウスである。植物と
しては、食用植物、森林植物、観葉植物、あるいは雑草
などのあらゆる植物を挙げることができる。細菌として
は、例えば、外毒素または内毒素を産生する種々の細菌
が好ましく、例えば、グラム陽性病原菌（例えば、ジフ
テリア菌、破傷風菌、ガス壊疽菌、ボツリヌス菌、百日
咳菌、ブドウ球菌、連鎖状球菌など）、あるいはグラム
陰性病原菌（例えば、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、サル
モネラ菌、赤痢菌、髄膜菌炎菌、淋菌、など）などが挙
げられる。本発明のターゲティングＤＮＡを用いて、こ
のような細菌の内在性ゲノムＤＮＡに修飾を施すことに
より、細菌を弱毒化あるいは無毒化し、ワクチンを製造
することが可能である。
（非ヒト哺乳動物）が好ましい。非ヒト哺乳動物として
は、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウ
サギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウス等
を挙げることができ、好ましくはマウスである。植物と
しては、食用植物、森林植物、観葉植物、あるいは雑草
などのあらゆる植物を挙げることができる。細菌として
は、例えば、外毒素または内毒素を産生する種々の細菌
が好ましく、例えば、グラム陽性病原菌（例えば、ジフ
テリア菌、破傷風菌、ガス壊疽菌、ボツリヌス菌、百日
咳菌、ブドウ球菌、連鎖状球菌など）、あるいはグラム
陰性病原菌（例えば、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、サル
モネラ菌、赤痢菌、髄膜菌炎菌、淋菌、など）などが挙
げられる。本発明のターゲティングＤＮＡを用いて、こ
のような細菌の内在性ゲノムＤＮＡに修飾を施すことに
より、細菌を弱毒化あるいは無毒化し、ワクチンを製造
することが可能である。
【００５４】ウイルスとしては、例えば、レトロウイル
ス（例えば、マウス白血病ウイルス等のオンコルナウイ
ルス、レンチウイルス、スプーマウイルスなど）、アデ
ノウイルス（例えば、II型、V型など）、アデノ随伴ウ
イルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、非
Ａ非Ｂ型、Ｄ型など）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ポ
リオウイルス、ポックスウイルスなどが挙げられる。好
ましくは、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイ
ルス等のオンコルナウイルス、レンチウイルス、スプー
マウイルスなど）、アデノウイルス（例えば、II型、V
型など）、アデノ随伴ウイルス、肝炎ウイルス（例え
ば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、非Ａ非Ｂ型、Ｄ型など）、ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス
である。本発明のターゲティングＤＮＡを用いて、この
ようなウイルスの内在性ゲノムＤＮＡに修飾を施すこと
により、細菌を弱毒化、無毒化、あるいは非増殖性とす
ることにより、ワクチンを製造することが可能である。
とりわけ、レトロウイルス（特に、マウス白血病ウイル
ス等のオンコルナウイルス）、アデノウイルス及びアデ
ノ随伴ウイルスについては、ウイルスの複製に必要なＤ
ＮＡ領域のmRNAへの翻訳を阻害するように修飾すること
により、遺伝子治療に汎用されているウイルスベクター
を作製することができる。
ス（例えば、マウス白血病ウイルス等のオンコルナウイ
ルス、レンチウイルス、スプーマウイルスなど）、アデ
ノウイルス（例えば、II型、V型など）、アデノ随伴ウ
イルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、非
Ａ非Ｂ型、Ｄ型など）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ポ
リオウイルス、ポックスウイルスなどが挙げられる。好
ましくは、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイ
ルス等のオンコルナウイルス、レンチウイルス、スプー
マウイルスなど）、アデノウイルス（例えば、II型、V
型など）、アデノ随伴ウイルス、肝炎ウイルス（例え
ば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、非Ａ非Ｂ型、Ｄ型など）、ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス
である。本発明のターゲティングＤＮＡを用いて、この
ようなウイルスの内在性ゲノムＤＮＡに修飾を施すこと
により、細菌を弱毒化、無毒化、あるいは非増殖性とす
ることにより、ワクチンを製造することが可能である。
とりわけ、レトロウイルス（特に、マウス白血病ウイル
ス等のオンコルナウイルス）、アデノウイルス及びアデ
ノ随伴ウイルスについては、ウイルスの複製に必要なＤ
ＮＡ領域のmRNAへの翻訳を阻害するように修飾すること
により、遺伝子治療に汎用されているウイルスベクター
を作製することができる。
【００５５】本発明における「ターゲティングＤＮＡ」
とは、相同組換えにより、前記生物の内在性ゲノムＤＮ
Ａ中の所望の標的ＤＮＡ配列を修飾するために用いられ
るＤＮＡ構造体を意味する。ここで当該「ＤＮＡ構造
体」は、各々の末端側に、該標的ＤＮＡ配列の外側に存
在する各々のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列（相
同領域）を有し、該２つの相同領域に挟まれるＤＮＡ配
列中に該内在性ゲノムＤＮＡにとって外来である所望の
外来性ＤＮＡを有するという基本構造からなる。該各々
の「相同領域」の塩基長は、該ターゲティングＤＮＡが
該内在性ゲノムＤＮＡとハイブリダイズして両者の間で
相同組換えが起こすことができる限り、どのような長さ
であってもよいが、好ましくは約２kbp（約2,000bp）以
上である。しかしながら、当該例示の塩基長は、該相同
組換を高い確率で起こさせるために必要な長さを、単に
1,000bpの単位で示しただけである。即ち、当該相同領
域の塩基長は数bp乃至数百bpの単位で増減し得る。
とは、相同組換えにより、前記生物の内在性ゲノムＤＮ
Ａ中の所望の標的ＤＮＡ配列を修飾するために用いられ
るＤＮＡ構造体を意味する。ここで当該「ＤＮＡ構造
体」は、各々の末端側に、該標的ＤＮＡ配列の外側に存
在する各々のゲノムＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列（相
同領域）を有し、該２つの相同領域に挟まれるＤＮＡ配
列中に該内在性ゲノムＤＮＡにとって外来である所望の
外来性ＤＮＡを有するという基本構造からなる。該各々
の「相同領域」の塩基長は、該ターゲティングＤＮＡが
該内在性ゲノムＤＮＡとハイブリダイズして両者の間で
相同組換えが起こすことができる限り、どのような長さ
であってもよいが、好ましくは約２kbp（約2,000bp）以
上である。しかしながら、当該例示の塩基長は、該相同
組換を高い確率で起こさせるために必要な長さを、単に
1,000bpの単位で示しただけである。即ち、当該相同領
域の塩基長は数bp乃至数百bpの単位で増減し得る。
【００５６】また、標的ＤＮＡ配列の「修飾」とは、タ
ーゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換
えにより、該内在性ゲノムの一部に導入される下記のよ
うなＤＮＡ配列の改変を意味する。 （１）該標的ＤＮＡの一部または全部のＤＮＡ配列の欠
失。 （２）該標的ＤＮＡの一部または全部のＤＮＡ配列の外
来性ＤＮＡとの置換。 （３）該標的ＤＮＡの一部または全部のＤＮＡ配列中へ
の外来性ＤＮＡの挿入。 好ましい「修飾」としては、前記（２）の置換を挙げる
ことができる。また当該「置換」としては、当該置換
が、該標的ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不可能たらしめ
るような置換であることが好ましい。さらに好ましく
は、該標的ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不可能たらし
め、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめるような
置換である。
ーゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換
えにより、該内在性ゲノムの一部に導入される下記のよ
うなＤＮＡ配列の改変を意味する。 （１）該標的ＤＮＡの一部または全部のＤＮＡ配列の欠
失。 （２）該標的ＤＮＡの一部または全部のＤＮＡ配列の外
来性ＤＮＡとの置換。 （３）該標的ＤＮＡの一部または全部のＤＮＡ配列中へ
の外来性ＤＮＡの挿入。 好ましい「修飾」としては、前記（２）の置換を挙げる
ことができる。また当該「置換」としては、当該置換
が、該標的ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不可能たらしめ
るような置換であることが好ましい。さらに好ましく
は、該標的ＤＮＡ配列のmRNAへの転写を不可能たらし
め、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能たらしめるような
置換である。
【００５７】当該「外来性ＤＮＡ」としては、所望のい
かなるＤＮＡであってもよいが、例えば、マーカー遺伝
子、レポーター遺伝子、遺伝子増幅遺伝子、内在性ゲノ
ムＤＮＡ中の所望の遺伝子のmRNAへの転写を制御する能
力を有する遺伝子発現制御ＤＮＡ配列、あるいはそれら
の１つ以上を含むＤＮＡ配列を挙げることができる。該
「マーカー遺伝子」としては、遺伝子組換え技術分野に
おいて通常使用されるいかなるマーカー遺伝子も用いる
ことができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリ
ン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイシ
ンまたはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示
される。好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子である。
かなるＤＮＡであってもよいが、例えば、マーカー遺伝
子、レポーター遺伝子、遺伝子増幅遺伝子、内在性ゲノ
ムＤＮＡ中の所望の遺伝子のmRNAへの転写を制御する能
力を有する遺伝子発現制御ＤＮＡ配列、あるいはそれら
の１つ以上を含むＤＮＡ配列を挙げることができる。該
「マーカー遺伝子」としては、遺伝子組換え技術分野に
おいて通常使用されるいかなるマーカー遺伝子も用いる
ことができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリ
ン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイシ
ンまたはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示
される。好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子である。
【００５８】該「遺伝子増幅遺伝子」としては、ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナ
ーゼ遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシン
デアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺
伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ
遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子
等を例示することができる。さらに、HPRT（フォスフォ
リボシルオトランスフェラーゼ）遺伝子も使用可能であ
る。
ロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナ
ーゼ遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシン
デアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺
伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ
遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子
等を例示することができる。さらに、HPRT（フォスフォ
リボシルオトランスフェラーゼ）遺伝子も使用可能であ
る。
【００５９】該「レポーター遺伝子」としては、蛍若し
くはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、クラ
ゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）あるい
はβラクタマーゼなどをコードする遺伝子を挙げること
ができる。該「遺伝子発現制御ＤＮＡ配列」としては、
例えば、遺伝子活性化（ジーンアクチベーション）と称
される技術において用いられるようなＤＮＡ配列を挙げ
ることができる（国際出願公開公報WO91/06667など）。
くはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、クラ
ゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）あるい
はβラクタマーゼなどをコードする遺伝子を挙げること
ができる。該「遺伝子発現制御ＤＮＡ配列」としては、
例えば、遺伝子活性化（ジーンアクチベーション）と称
される技術において用いられるようなＤＮＡ配列を挙げ
ることができる（国際出願公開公報WO91/06667など）。
【００６０】本発明における「ノックアウト細胞」及び
「ノックアウト動物」とは、例えば、相同組換え用ター
ゲティングＤＮＡを用いて、内在性ゲノムＤＮＡ中の標
的ＤＮＡ配列（例えば、生理活性蛋白をコードする内在
性遺伝子）の一部または全部に、前記に定義したような
「修飾」が導入される結果、該標的ＤＮＡ配列のmRNAへ
の転写が不能である（不活性化されている）細胞及び生
物を意味する。
「ノックアウト動物」とは、例えば、相同組換え用ター
ゲティングＤＮＡを用いて、内在性ゲノムＤＮＡ中の標
的ＤＮＡ配列（例えば、生理活性蛋白をコードする内在
性遺伝子）の一部または全部に、前記に定義したような
「修飾」が導入される結果、該標的ＤＮＡ配列のmRNAへ
の転写が不能である（不活性化されている）細胞及び生
物を意味する。
【００６１】該「細胞」には、前記に定義した種々の
「脊椎動物」の種々の体細胞、生殖細胞（受精卵、精子
など）に由来する生細胞または樹立された細胞株が含ま
れる。さらには、受精卵に含まれる胚性幹細胞（Embryo
nic stem cell；ＥＳ細胞）が包含される。また、植物
由来の生細胞または樹立した細胞株も包含される該「動
物」としては、前記に定義した種々の脊椎動物、好まし
くは非ヒト哺乳動物を挙げることができ、より好ましく
はマウスである。
「脊椎動物」の種々の体細胞、生殖細胞（受精卵、精子
など）に由来する生細胞または樹立された細胞株が含ま
れる。さらには、受精卵に含まれる胚性幹細胞（Embryo
nic stem cell；ＥＳ細胞）が包含される。また、植物
由来の生細胞または樹立した細胞株も包含される該「動
物」としては、前記に定義した種々の脊椎動物、好まし
くは非ヒト哺乳動物を挙げることができ、より好ましく
はマウスである。
【００６２】本発明における「ノックイン細胞」及び
「ノックイン動物」とは、例えば相同組換え用ターゲテ
ィングＤＮＡを用いて、内在性ゲノム中の標的ＤＮＡ配
列（例えば、生理活性蛋白をコードする内在性遺伝子）
の一部または全部に、前記（２）において例示したよう
な外来性ＤＮＡとの置換により修飾が導入された結果、
該標的ＤＮＡ配列のmRNAへの転写が阻害される（即ち、
標的遺伝子の不活性化、破壊）一方で、該外来性遺伝子
を発現する能力を獲得した細胞や動物を意味する。該外
来性ＤＮＡとしては、前記に例示したような種々のマー
カー遺伝子及び／またはレポーター遺伝子を含むＤＮＡ
を挙げることができる。好ましくはマーカー遺伝子とレ
ポーター遺伝子を共に含むＤＮＡであることが好まし
い。好ましい具体的態様の一例としては、ネオマイシン
耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の上流にルシフェラーゼ
やβラクタマーゼなどのレポーター蛋白をコードする遺
伝子を含む外来性ＤＮＡを挙げることができる。
「ノックイン動物」とは、例えば相同組換え用ターゲテ
ィングＤＮＡを用いて、内在性ゲノム中の標的ＤＮＡ配
列（例えば、生理活性蛋白をコードする内在性遺伝子）
の一部または全部に、前記（２）において例示したよう
な外来性ＤＮＡとの置換により修飾が導入された結果、
該標的ＤＮＡ配列のmRNAへの転写が阻害される（即ち、
標的遺伝子の不活性化、破壊）一方で、該外来性遺伝子
を発現する能力を獲得した細胞や動物を意味する。該外
来性ＤＮＡとしては、前記に例示したような種々のマー
カー遺伝子及び／またはレポーター遺伝子を含むＤＮＡ
を挙げることができる。好ましくはマーカー遺伝子とレ
ポーター遺伝子を共に含むＤＮＡであることが好まし
い。好ましい具体的態様の一例としては、ネオマイシン
耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の上流にルシフェラーゼ
やβラクタマーゼなどのレポーター蛋白をコードする遺
伝子を含む外来性ＤＮＡを挙げることができる。
【００６３】該「ノックイン動物」で言うところの「動
物」としては、前記に定義した種々の脊椎動物、好まし
くは非ヒト哺乳動物を挙げることができ、より好ましく
はマウスである。該「ノックイン細胞」で言うところの
「細胞」には、前記に定義した種々の「脊椎動物」の種
々の体細胞、生殖細胞（受精卵、精子など）に由来する
生細胞または樹立された細胞株が含まれる。さらには、
受精卵に含まれる胚性幹細胞（Embryonic stem cell；
ＥＳ細胞）が包含される。また、植物由来の生細胞また
は樹立した細胞株も包含される。さらに、前記「ノック
イン動物」に由来する種々の体細胞及び生殖細胞も包含
される。
物」としては、前記に定義した種々の脊椎動物、好まし
くは非ヒト哺乳動物を挙げることができ、より好ましく
はマウスである。該「ノックイン細胞」で言うところの
「細胞」には、前記に定義した種々の「脊椎動物」の種
々の体細胞、生殖細胞（受精卵、精子など）に由来する
生細胞または樹立された細胞株が含まれる。さらには、
受精卵に含まれる胚性幹細胞（Embryonic stem cell；
ＥＳ細胞）が包含される。また、植物由来の生細胞また
は樹立した細胞株も包含される。さらに、前記「ノック
イン動物」に由来する種々の体細胞及び生殖細胞も包含
される。
【００６４】該ノックアウト細胞やノックアウト動物
は、該標的ＤＮＡ配列（例えば、生理活性蛋白をコード
する内在性遺伝子）が不活性化されることにより現れる
細胞の形態学的変化、組織学的変化、個体の表現型上の
変化、疾患症状の発現の有無、あるいは生存率等の種々
の変化を、同一種の正常な細胞あるいは動物のそれらと
比較することにより、該不活性化された遺伝子がコード
する蛋白の生理学的機能の解明を可能とする。
は、該標的ＤＮＡ配列（例えば、生理活性蛋白をコード
する内在性遺伝子）が不活性化されることにより現れる
細胞の形態学的変化、組織学的変化、個体の表現型上の
変化、疾患症状の発現の有無、あるいは生存率等の種々
の変化を、同一種の正常な細胞あるいは動物のそれらと
比較することにより、該不活性化された遺伝子がコード
する蛋白の生理学的機能の解明を可能とする。
【００６５】一方、ノックイン細胞やノックイン動物
は、前述のノックアウト細胞やノックアウト動物におい
て可能となる該不活性化内在性遺伝子の機能解析だけで
なく、該標的内在性遺伝子の機能のさらに詳細な解析、
並びに該標的内在性遺伝子の発現を調節する薬剤の同定
を可能とするものである。即ち、ノックイン細胞やノッ
クイン動物は、該不活性化された標的内在性遺伝子の代
わりに、挿入された外来性のルシフェラーゼやβラクタ
マーゼ等の外来性のレポーター遺伝子を発現するように
作製されていることから、該標的内在性遺伝子の機能が
不明である場合には、該ノックイン細胞やノックイン動
物に医薬上の活性が判明している種々の薬剤や化合物を
投与し、該薬剤の投与に依存する該レポーター遺伝子の
発現の増減を測定することにより、該標的内在性遺伝子
が関わる疾患を推定することが可能となる。また、該内
在性遺伝子の機能並びに該遺伝子の疾患との関わりが明
らかな場合には、該ノックイン細胞やノックイン動物に
種々の化合物を投与することにより、該化合物の投与に
依存する該レポーター遺伝子の発現の増減を誘導する活
性を有する化合物を同定することができる。そのように
して同定された化合物は該標的内在性遺伝子の発現調節
剤として該遺伝子が関わる疾患の治療剤として開発され
る価値を有する。
は、前述のノックアウト細胞やノックアウト動物におい
て可能となる該不活性化内在性遺伝子の機能解析だけで
なく、該標的内在性遺伝子の機能のさらに詳細な解析、
並びに該標的内在性遺伝子の発現を調節する薬剤の同定
を可能とするものである。即ち、ノックイン細胞やノッ
クイン動物は、該不活性化された標的内在性遺伝子の代
わりに、挿入された外来性のルシフェラーゼやβラクタ
マーゼ等の外来性のレポーター遺伝子を発現するように
作製されていることから、該標的内在性遺伝子の機能が
不明である場合には、該ノックイン細胞やノックイン動
物に医薬上の活性が判明している種々の薬剤や化合物を
投与し、該薬剤の投与に依存する該レポーター遺伝子の
発現の増減を測定することにより、該標的内在性遺伝子
が関わる疾患を推定することが可能となる。また、該内
在性遺伝子の機能並びに該遺伝子の疾患との関わりが明
らかな場合には、該ノックイン細胞やノックイン動物に
種々の化合物を投与することにより、該化合物の投与に
依存する該レポーター遺伝子の発現の増減を誘導する活
性を有する化合物を同定することができる。そのように
して同定された化合物は該標的内在性遺伝子の発現調節
剤として該遺伝子が関わる疾患の治療剤として開発され
る価値を有する。
【００６６】本発明の「組換え非ヒト哺乳動物」とは、
前述のノックアウト動物及びノックイン動物に各々包含
される、ノックアウト非ヒト哺乳動物及びノックイン非
ヒト哺乳動物を意味する。本発明の「組換え細胞」と
は、前述したノックアウト細胞またはノックイン細胞を
包含する。
前述のノックアウト動物及びノックイン動物に各々包含
される、ノックアウト非ヒト哺乳動物及びノックイン非
ヒト哺乳動物を意味する。本発明の「組換え細胞」と
は、前述したノックアウト細胞またはノックイン細胞を
包含する。
【００６７】本発明の「ターゲティングＤＮＡ」の製造
に用いられる所望の生物のゲノムＤＮＡ断片は、修飾を
施そうとする標的ＤＮＡ配列の一部または全部を基にＤ
ＮＡプローブまたはPCR用プライマーＤＮＡを作製し、
市販または所望に応じて独自に調製したゲノムＤＮＡラ
イブラリー（本発明のゲノムDNAライブラリーを含む）
を所望の方法でスクリーニングし、該標的ＤＮＡ配列を
含むゲノムＤＮＡ断片を含む陽性クローンを同定するこ
とにより得ることができる。ゲノムＤＮＡライブラリー
としては、例えば、ファージライブラリー、ＢＡＣ（Ba
cteria Artificial Chromosome）ライブラリーあるいは
ＹＡＣライブラリー（Yeast Artificial Chromosome）
などを用いることができる。好ましくは、ＢＡＣライブ
ラリーまたはＹＡＣライブラリーであり、特に好ましく
はＢＡＣライブラリーである。また、ゲノムライブラリ
ーとしては、本発明のゲノムDNAライブラリーも極めて
有用である。
に用いられる所望の生物のゲノムＤＮＡ断片は、修飾を
施そうとする標的ＤＮＡ配列の一部または全部を基にＤ
ＮＡプローブまたはPCR用プライマーＤＮＡを作製し、
市販または所望に応じて独自に調製したゲノムＤＮＡラ
イブラリー（本発明のゲノムDNAライブラリーを含む）
を所望の方法でスクリーニングし、該標的ＤＮＡ配列を
含むゲノムＤＮＡ断片を含む陽性クローンを同定するこ
とにより得ることができる。ゲノムＤＮＡライブラリー
としては、例えば、ファージライブラリー、ＢＡＣ（Ba
cteria Artificial Chromosome）ライブラリーあるいは
ＹＡＣライブラリー（Yeast Artificial Chromosome）
などを用いることができる。好ましくは、ＢＡＣライブ
ラリーまたはＹＡＣライブラリーであり、特に好ましく
はＢＡＣライブラリーである。また、ゲノムライブラリ
ーとしては、本発明のゲノムDNAライブラリーも極めて
有用である。
【００６８】ファージライブラリー作製に用いられるフ
ァージベクターとしては、例えば、λDASH-II、λFIX-I
I、λ2001、EMBL3、EMBL4、Charon4A、Charon21A、Char
on32、Charon35、λgt10、λgt11、λZapII、P1ファー
ジ、及びT3ファージなどを挙げることができる。ゲノム
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、常法に従っ
て、例えば下記の方法により行うことができる。 （１）該標的ＤＮＡ配列の一部または全部を含むＤＮＡ
を放射性同位体で標識したＤＮＡプローブを用いるプラ
ークハイブリダイゼーション法（プラークハイブリダイ
ゼーション法）（実験医学別冊、「遺伝子工学ハンドブ
ック」、p.58-64, 1992、羊土社発行などを参照）。 （２）該標的ＤＮＡ配列を基に設計された一対のプライ
マーＤＮＡを用いるＰＣＲ法と該プラークハイブリダイ
ゼーションを組み合せた方法（蛋白質核酸酵素増刊、
「ゲノム解析研究」、Vol.38, No.3, p.591-599,1993、
共立出版株式会社発行などを参照）。 （３）該標的ＤＮＡ配列を基に設計された一対のプライ
マーＤＮＡを用いるＰＣＲ法のみを用いる方法（蛋白質
核酸酵素増刊、「ゲノム解析研究」、Vol.38,No.3, p.5
91-599,1993、共立出版株式会社発行などを参照）。 （４）パルスフィールドゲル電子泳動とサザンハイブリ
ダイゼーションを用いる方法（蛋白質核酸酵素増刊、
「ゲノム解析研究」、Vol.38, No.3, p.591-599,1993、
共立出版株式会社発行などを参照）。所望のゲノムＤＮ
ＡクローンをＹＡＣライブラリーまたはＢＡＣライブラ
リーから単離する場合には、前記（２）乃至（３）のい
ずれかの方法を用いることができる。実験操作の簡便性
並びに時間の節減の観点を考慮すると、プラークハイブ
リダイゼーションやラジオグラフィー等の煩雑な操作を
必要としない前記（３）の方法を用いるのが好ましい。
ァージベクターとしては、例えば、λDASH-II、λFIX-I
I、λ2001、EMBL3、EMBL4、Charon4A、Charon21A、Char
on32、Charon35、λgt10、λgt11、λZapII、P1ファー
ジ、及びT3ファージなどを挙げることができる。ゲノム
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、常法に従っ
て、例えば下記の方法により行うことができる。 （１）該標的ＤＮＡ配列の一部または全部を含むＤＮＡ
を放射性同位体で標識したＤＮＡプローブを用いるプラ
ークハイブリダイゼーション法（プラークハイブリダイ
ゼーション法）（実験医学別冊、「遺伝子工学ハンドブ
ック」、p.58-64, 1992、羊土社発行などを参照）。 （２）該標的ＤＮＡ配列を基に設計された一対のプライ
マーＤＮＡを用いるＰＣＲ法と該プラークハイブリダイ
ゼーションを組み合せた方法（蛋白質核酸酵素増刊、
「ゲノム解析研究」、Vol.38, No.3, p.591-599,1993、
共立出版株式会社発行などを参照）。 （３）該標的ＤＮＡ配列を基に設計された一対のプライ
マーＤＮＡを用いるＰＣＲ法のみを用いる方法（蛋白質
核酸酵素増刊、「ゲノム解析研究」、Vol.38,No.3, p.5
91-599,1993、共立出版株式会社発行などを参照）。 （４）パルスフィールドゲル電子泳動とサザンハイブリ
ダイゼーションを用いる方法（蛋白質核酸酵素増刊、
「ゲノム解析研究」、Vol.38, No.3, p.591-599,1993、
共立出版株式会社発行などを参照）。所望のゲノムＤＮ
ＡクローンをＹＡＣライブラリーまたはＢＡＣライブラ
リーから単離する場合には、前記（２）乃至（３）のい
ずれかの方法を用いることができる。実験操作の簡便性
並びに時間の節減の観点を考慮すると、プラークハイブ
リダイゼーションやラジオグラフィー等の煩雑な操作を
必要としない前記（３）の方法を用いるのが好ましい。
【００６９】前記（３）の方法は、48ウェル（48穴）、
96ウェル（96穴）あるいは364ウェル（穴）等の多数の
ウェルを有するマイクロプレートの各ウェルに各々異な
るゲノムＤＮＡクローンを一種類ずつ備えられた複多数
の該マイクロプレートから構成されるＹＡＣライブラリ
ーまたはＢＡＣライブラリーをいわゆる三次元ＰＣＲ
（3D-PCR）と呼称される方法を用いてスクリーニングす
ることを特徴とするものである。
96ウェル（96穴）あるいは364ウェル（穴）等の多数の
ウェルを有するマイクロプレートの各ウェルに各々異な
るゲノムＤＮＡクローンを一種類ずつ備えられた複多数
の該マイクロプレートから構成されるＹＡＣライブラリ
ーまたはＢＡＣライブラリーをいわゆる三次元ＰＣＲ
（3D-PCR）と呼称される方法を用いてスクリーニングす
ることを特徴とするものである。
【００７０】以下に各々異なるクローンが例えば多数の
96穴マイクロプレート（縦８ウェル×横12ウェル）の各
ウェルに保存されているＢＡＣライブラリーまたはＹＡ
Ｃライブラリーを想定した場合の3D-PCRによるスクリー
ニング方法の基本原理を概略する。但し、用いられる市
販のライブラリーによって多少の実験操作の差異がある
ことから、実際のスクリーニングにおいては、該ライブ
ラリーに添付の実験操作マニュアルに従って行うのが好
ましい。 例えば、該96穴マイクロプレートを縦5枚×横３枚に
隣接して並べ、さらに、各プレートの各々に各々別のプ
レートを重ね合計４７段とする。縦、横及び高さを各々
Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸とすると、Ｘ軸方向には合計40ウェ
ル（８ウェル×５枚、座標：X1乃至X40）、Ｙ軸方向に
は合計36ウェル（12ウェル×3枚、座標：Y1乃至Y36）、
Ｚ軸方向には合計47ウェル（４７段、座標：Z1乃至Z4
7）が存在することとなる。 Ｚ軸上の座標がZ1である全てのウェルの各クローンサ
ンプルを混合して混合サンプルｍZ1を調製する。次い
で、Ｚ軸上の座標がZ2である全てのウェルの各クローン
サンプルを混合して混合サンプルmZ2を調製する。同様
にして、座標Z3乃至Z47の各々について、混合サンプルm
Z3乃至mZ47を調製する。
96穴マイクロプレート（縦８ウェル×横12ウェル）の各
ウェルに保存されているＢＡＣライブラリーまたはＹＡ
Ｃライブラリーを想定した場合の3D-PCRによるスクリー
ニング方法の基本原理を概略する。但し、用いられる市
販のライブラリーによって多少の実験操作の差異がある
ことから、実際のスクリーニングにおいては、該ライブ
ラリーに添付の実験操作マニュアルに従って行うのが好
ましい。 例えば、該96穴マイクロプレートを縦5枚×横３枚に
隣接して並べ、さらに、各プレートの各々に各々別のプ
レートを重ね合計４７段とする。縦、横及び高さを各々
Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸とすると、Ｘ軸方向には合計40ウェ
ル（８ウェル×５枚、座標：X1乃至X40）、Ｙ軸方向に
は合計36ウェル（12ウェル×3枚、座標：Y1乃至Y36）、
Ｚ軸方向には合計47ウェル（４７段、座標：Z1乃至Z4
7）が存在することとなる。 Ｚ軸上の座標がZ1である全てのウェルの各クローンサ
ンプルを混合して混合サンプルｍZ1を調製する。次い
で、Ｚ軸上の座標がZ2である全てのウェルの各クローン
サンプルを混合して混合サンプルmZ2を調製する。同様
にして、座標Z3乃至Z47の各々について、混合サンプルm
Z3乃至mZ47を調製する。
【００７１】Ｘ軸上の座標がX1である全てのウェルの
各クローンサンプルを混合して混合サンプルｍX1を調製
する。次いで、Ｘ軸上の座標がX2である全てのウェルの
各クローンサンプルを混合して混合サンプルmX2を調製
する。同様にして、座標X3乃至X40の各々について、混
合サンプルmX3乃至mX40を調製する。 Ｙ軸上の座標がY1である全てのウェルの各クローンサ
ンプルを混合して混合サンプルｍY1を調製する。次い
で、Ｙ軸上の座標がY2である全てのウェルの各クローン
サンプルを混合して混合サンプルmY2を調製する。同様
にして、座標Y3乃至Y36の各々について、混合サンプルm
Y3乃至mY36を調製する。
各クローンサンプルを混合して混合サンプルｍX1を調製
する。次いで、Ｘ軸上の座標がX2である全てのウェルの
各クローンサンプルを混合して混合サンプルmX2を調製
する。同様にして、座標X3乃至X40の各々について、混
合サンプルmX3乃至mX40を調製する。 Ｙ軸上の座標がY1である全てのウェルの各クローンサ
ンプルを混合して混合サンプルｍY1を調製する。次い
で、Ｙ軸上の座標がY2である全てのウェルの各クローン
サンプルを混合して混合サンプルmY2を調製する。同様
にして、座標Y3乃至Y36の各々について、混合サンプルm
Y3乃至mY36を調製する。
【００７２】修飾を施そうとする標的ＤＮＡ配列を基
に、一対のプライマーＤＮＡを調製する。 前記乃至で調製した合計123種類の混合サンプル
（即ち、mZ1乃至mZ47、mX1乃至mX40、及びmY1乃至mY3
6）の各々について、該一対のプライマーＤＮＡを用い
て常法によりＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行う。 ＰＣＲ産物を電気泳動に供し、ＤＮＡ増幅が認められ
る複数の混合サンプルを同定する。 同定された複数の混合サンプルの各々の座標から、該
標的ＤＮＡ配列を含むゲノムＤＮＡ断片がクローニング
された陽性クローンが保存されているプレート及びウェ
ルの位置を同定し、目的のゲノムＤＮＡクローンとして
回収する。例えば、前記工程で混合サンプルmX1、mY1
及びmZ1の各々でＤＮＡ増幅が認められた場合には、目
的の陽性クローンは座標（X1,Y1,Z1）のウェルに存在す
ることが判明する。
に、一対のプライマーＤＮＡを調製する。 前記乃至で調製した合計123種類の混合サンプル
（即ち、mZ1乃至mZ47、mX1乃至mX40、及びmY1乃至mY3
6）の各々について、該一対のプライマーＤＮＡを用い
て常法によりＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行う。 ＰＣＲ産物を電気泳動に供し、ＤＮＡ増幅が認められ
る複数の混合サンプルを同定する。 同定された複数の混合サンプルの各々の座標から、該
標的ＤＮＡ配列を含むゲノムＤＮＡ断片がクローニング
された陽性クローンが保存されているプレート及びウェ
ルの位置を同定し、目的のゲノムＤＮＡクローンとして
回収する。例えば、前記工程で混合サンプルmX1、mY1
及びmZ1の各々でＤＮＡ増幅が認められた場合には、目
的の陽性クローンは座標（X1,Y1,Z1）のウェルに存在す
ることが判明する。
【００７３】上述したとおり、ゲノムDNA断片は、本発
明のゲノムDNAライブラリーを上述と同様の方法でスク
リーニングすることによっても得ることができる。本発
明のゲノムDNAライブラリーは、生物（例えば、マウ
ス、ラットまたはヒトなどの哺乳動物、好ましくはマウ
スまたはヒト）のゲノムDNA断片であって約５乃至12Kb
の塩基長を有するゲノムDNA断片を上述のベクター中に
挿入してなる多数のクローンからなるゲノムDNAライブ
ラリーである。好ましくは、該クローンの各々をマイク
ロチューブまたは多数のウェルを有するマイクロプレー
ト中に配備してなるゲノムDNAライブラリーである。こ
こで、該マイクロチューブの各々、または該マイクロプ
レートのウェルの各々に配備されるクローンは、単一の
クローンであってもよいし、あるいは複数種類のクロー
ンの混合物であってもよい。上述したとおりターゲティ
ングDNAと内在性ゲノムとの間で相同組換えを誘発する
ためには、ターゲティングDNA中の5'及び3'側に各々含
まれる相同領域は、各々少なくとも約２乃至約５Kbの塩
基長、両者併せて少なくとも約４乃至約10Kbあるいは約
５乃至12Kbの塩基長を必要とされる。
明のゲノムDNAライブラリーを上述と同様の方法でスク
リーニングすることによっても得ることができる。本発
明のゲノムDNAライブラリーは、生物（例えば、マウ
ス、ラットまたはヒトなどの哺乳動物、好ましくはマウ
スまたはヒト）のゲノムDNA断片であって約５乃至12Kb
の塩基長を有するゲノムDNA断片を上述のベクター中に
挿入してなる多数のクローンからなるゲノムDNAライブ
ラリーである。好ましくは、該クローンの各々をマイク
ロチューブまたは多数のウェルを有するマイクロプレー
ト中に配備してなるゲノムDNAライブラリーである。こ
こで、該マイクロチューブの各々、または該マイクロプ
レートのウェルの各々に配備されるクローンは、単一の
クローンであってもよいし、あるいは複数種類のクロー
ンの混合物であってもよい。上述したとおりターゲティ
ングDNAと内在性ゲノムとの間で相同組換えを誘発する
ためには、ターゲティングDNA中の5'及び3'側に各々含
まれる相同領域は、各々少なくとも約２乃至約５Kbの塩
基長、両者併せて少なくとも約４乃至約10Kbあるいは約
５乃至12Kbの塩基長を必要とされる。
【００７４】以下に、本発明のゲノムDNAライブラリー
の作製方法をマウスゲノムDNAライブラリーの作製を例
にとして例示する。マウスゲノムDNAは、併せて約３×1
06Kbの塩基長を有する。このゲノムDNAを正確に所望の
長さ、例えば約10KbのゲノムDNA断片に切断できるなら
ば、約３×105種類のDNA断片が生ずることとなるが、現
実的には不可能である。従って、本発明のゲノムDNAラ
イブラリーの作製に用いられるゲノムDNA断片は、種々
の制限酵素を用いておおよその所望の長さをなるよう
に、該ゲノムDNAを消化することにより調製することが
できる。ゲノムＤＮＡには、４塩基認識制限酵素により
認識される４塩基配列が、確率上４4（＝256）塩基ご
と、即ち約250bごとに出現する。従って、４塩基配列認
識制限酵素を用いて、ゲノムＤＮＡを種々の部分消化す
ることにより所望の大きさのゲノムＤＮＡ断片を調製す
ることができる。また、該４塩基認識制限酵素による部
分消化だけでなく、所望により５塩基認識制限酵素及び
／または６塩基認識制限酵素による消化も行うことがで
きる。４塩基認識制限酵素としては、Alu I、Hae III、
Hha I、Hpa II、Msp I、NlaIII、Rsa I、Sau3A I、Taq
I及びTspE Iなどが挙げられる。５塩基認識制限酵素と
しては、Cfr13 I、Dde I、EcoR II、Eco 47 I、Hinf
I、Mva I、ScrF I及びSau96 Iなどが挙げられる。６塩
基認識制限酵素は遺伝子工学の分野で汎用されている多
数の制限酵素から所望に応じ選択し使用できる。このよ
うにして作製したゲノムＤＮＡ断片の各々を所望のプラ
スミドやファージ中に挿入して得た多数のクローンの各
々を、マイクロチューブまたは多数のウェルを有するマ
イクロプレート中に配備することによりゲノムDNAライ
ブラリーとする。ここで、該マイクロチューブの各々、
または該マイクロプレートのウェルの各々に配備される
クローンは、単一のクローンであってもよいし、あるい
は複数種類のクローンの混合物であってもよい。
の作製方法をマウスゲノムDNAライブラリーの作製を例
にとして例示する。マウスゲノムDNAは、併せて約３×1
06Kbの塩基長を有する。このゲノムDNAを正確に所望の
長さ、例えば約10KbのゲノムDNA断片に切断できるなら
ば、約３×105種類のDNA断片が生ずることとなるが、現
実的には不可能である。従って、本発明のゲノムDNAラ
イブラリーの作製に用いられるゲノムDNA断片は、種々
の制限酵素を用いておおよその所望の長さをなるよう
に、該ゲノムDNAを消化することにより調製することが
できる。ゲノムＤＮＡには、４塩基認識制限酵素により
認識される４塩基配列が、確率上４4（＝256）塩基ご
と、即ち約250bごとに出現する。従って、４塩基配列認
識制限酵素を用いて、ゲノムＤＮＡを種々の部分消化す
ることにより所望の大きさのゲノムＤＮＡ断片を調製す
ることができる。また、該４塩基認識制限酵素による部
分消化だけでなく、所望により５塩基認識制限酵素及び
／または６塩基認識制限酵素による消化も行うことがで
きる。４塩基認識制限酵素としては、Alu I、Hae III、
Hha I、Hpa II、Msp I、NlaIII、Rsa I、Sau3A I、Taq
I及びTspE Iなどが挙げられる。５塩基認識制限酵素と
しては、Cfr13 I、Dde I、EcoR II、Eco 47 I、Hinf
I、Mva I、ScrF I及びSau96 Iなどが挙げられる。６塩
基認識制限酵素は遺伝子工学の分野で汎用されている多
数の制限酵素から所望に応じ選択し使用できる。このよ
うにして作製したゲノムＤＮＡ断片の各々を所望のプラ
スミドやファージ中に挿入して得た多数のクローンの各
々を、マイクロチューブまたは多数のウェルを有するマ
イクロプレート中に配備することによりゲノムDNAライ
ブラリーとする。ここで、該マイクロチューブの各々、
または該マイクロプレートのウェルの各々に配備される
クローンは、単一のクローンであってもよいし、あるい
は複数種類のクローンの混合物であってもよい。
【００７５】本発明で用いられるＰＣＲによる遺伝子増
幅は、既存のＤＮＡポリメラーゼ及び市販のＰＣＲ装置
を用いて、常法及び試薬に添付の取扱いマニュアルにし
たがって行うことができる（実験医学・増刊、「PCRと
その応用」、第８巻、第９号、1990年；並びに「遺伝子
増幅PCR法・基礎と新しい展開」、共立出版株式会社発
行、1992年）。また、ＰＣＲの条件は、所望に応じて調
整することができる。
幅は、既存のＤＮＡポリメラーゼ及び市販のＰＣＲ装置
を用いて、常法及び試薬に添付の取扱いマニュアルにし
たがって行うことができる（実験医学・増刊、「PCRと
その応用」、第８巻、第９号、1990年；並びに「遺伝子
増幅PCR法・基礎と新しい展開」、共立出版株式会社発
行、1992年）。また、ＰＣＲの条件は、所望に応じて調
整することができる。
【００７６】本発明における「制限酵素認識ＤＮＡ配
列」とは、遺伝子組換え技術の分野で慣用される任意の
制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）により認識される
ＤＮＡ配列を意味する。以下にその一例を挙げる。下記
塩基配列中の斜線は該制限酵素による切断部位を意味す
る。 制限酵素：EcoRI、認識DNA配列：G/AATTC； 制限酵素：EcoRV、認識DNA配列：GAT/ATC； 制限酵素：HindIII、認識DNA配列：A/AGCTT； 制限酵素：XhoI、認識DNA配列：C/TCGAG； 制限酵素：XbaI、認識DNA配列：T/CTAGA； 制限酵素：BglII、認識DNA配列：A/GATCT； 制限酵素：PstI、認識DNA配列：CTGCA/G； 制限酵素：PvuII、認識DNA配列：CAG/CTG； 制限酵素：BamHI、認識DNA配列：G/GATCC； 制限酵素：ScaI、認識DNA配列：AGT/ACT； 制限酵素：NotI、認識DNA配列：GC/GGCCGC； 制限酵素：PacI、認識DNA配列：TTAAT/TAA。
列」とは、遺伝子組換え技術の分野で慣用される任意の
制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）により認識される
ＤＮＡ配列を意味する。以下にその一例を挙げる。下記
塩基配列中の斜線は該制限酵素による切断部位を意味す
る。 制限酵素：EcoRI、認識DNA配列：G/AATTC； 制限酵素：EcoRV、認識DNA配列：GAT/ATC； 制限酵素：HindIII、認識DNA配列：A/AGCTT； 制限酵素：XhoI、認識DNA配列：C/TCGAG； 制限酵素：XbaI、認識DNA配列：T/CTAGA； 制限酵素：BglII、認識DNA配列：A/GATCT； 制限酵素：PstI、認識DNA配列：CTGCA/G； 制限酵素：PvuII、認識DNA配列：CAG/CTG； 制限酵素：BamHI、認識DNA配列：G/GATCC； 制限酵素：ScaI、認識DNA配列：AGT/ACT； 制限酵素：NotI、認識DNA配列：GC/GGCCGC； 制限酵素：PacI、認識DNA配列：TTAAT/TAA。
【００７７】本発明における「制限酵素による切断末端
DNA配列」とは、例えば、ＤＮＡが前記に例示したよう
な制限酵素により認識される特定の塩基配列（例えば、
連続する特定の６塩基）で該制限酵素により切断されて
生ずる平滑末端（blunt end,flush end）または付着末
端（cohesive end, sticky end, staggered end, protr
uding end, recessive end）を意味する。
DNA配列」とは、例えば、ＤＮＡが前記に例示したよう
な制限酵素により認識される特定の塩基配列（例えば、
連続する特定の６塩基）で該制限酵素により切断されて
生ずる平滑末端（blunt end,flush end）または付着末
端（cohesive end, sticky end, staggered end, protr
uding end, recessive end）を意味する。
【００７８】本発明における「リンカーＤＮＡ」とは、
所望に応じ２つのＤＮＡ末端の間に挿入され、該２つの
ＤＮＡ末端を該リンカーＤＮＡを介して連結させるため
の任意のＤＮＡ配列を意味する。該リンカーＤＮＡは、
所望に応じどのような塩基配列を有するようにも設計す
ることが可能である。
所望に応じ２つのＤＮＡ末端の間に挿入され、該２つの
ＤＮＡ末端を該リンカーＤＮＡを介して連結させるため
の任意のＤＮＡ配列を意味する。該リンカーＤＮＡは、
所望に応じどのような塩基配列を有するようにも設計す
ることが可能である。
【００７９】本発明の態様に即して、下記に該リンカー
ＤＮＡの使用方法の一例を挙げる。例えば、まず、特定
の制限酵素[E]により認識される塩基配列[Y]を内部に有
する連続する50塩基からなるリンカーＤＮＡを人工的に
合成する。このリンカーＤＮＡを、ＤＮＡ末端[A]及び
[B]を有するＤＮＡ[I]と常法により連結させることによ
り、該ＤＮＡ末端[A]と[B]の間に該リンカーＤＮＡが挿
入された環状ＤＮＡ[C]を調製することができる。この
環状ＤＮＡを、該制限酵素[E]で処理することにより、
該環状ＤＮＡは該制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断さ
れ、制限酵素[E]による切断末端ＤＮＡ配列を各々の末
端に有する線状化ＤＮＡ[II]が得られる。該リンカーＤ
ＮＡを挿入することにより生じる効果としては下記が挙
げられる。 （１）該環状ＤＮＡ[C]に所望の制限酵素認識部位を挿
入することができる。 （２）該ＤＮＡ[II]の末端に所望の制限酵素切断末端Ｄ
ＮＡ配列を持たせることができる。 （３）該ＤＮＡ[II]のＤＮＡ末端に、所望の塩基長を有
する配列既知の塩基配列を付与することができる。
ＤＮＡの使用方法の一例を挙げる。例えば、まず、特定
の制限酵素[E]により認識される塩基配列[Y]を内部に有
する連続する50塩基からなるリンカーＤＮＡを人工的に
合成する。このリンカーＤＮＡを、ＤＮＡ末端[A]及び
[B]を有するＤＮＡ[I]と常法により連結させることによ
り、該ＤＮＡ末端[A]と[B]の間に該リンカーＤＮＡが挿
入された環状ＤＮＡ[C]を調製することができる。この
環状ＤＮＡを、該制限酵素[E]で処理することにより、
該環状ＤＮＡは該制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断さ
れ、制限酵素[E]による切断末端ＤＮＡ配列を各々の末
端に有する線状化ＤＮＡ[II]が得られる。該リンカーＤ
ＮＡを挿入することにより生じる効果としては下記が挙
げられる。 （１）該環状ＤＮＡ[C]に所望の制限酵素認識部位を挿
入することができる。 （２）該ＤＮＡ[II]の末端に所望の制限酵素切断末端Ｄ
ＮＡ配列を持たせることができる。 （３）該ＤＮＡ[II]のＤＮＡ末端に、所望の塩基長を有
する配列既知の塩基配列を付与することができる。
【００８０】本発明の「組換え非ヒト哺乳動物」、即
ち、ノックアウト非ヒト哺乳動物及びノックイン非ヒト
哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通
常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マ
ニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜
第４０８頁、１９９０年を参照）に従って作製すること
が可能である。
ち、ノックアウト非ヒト哺乳動物及びノックイン非ヒト
哺乳動物は、トランスジェニック動物の製造において通
常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マ
ニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜
第４０８頁、１９９０年を参照）に従って作製すること
が可能である。
【００８１】本発明で使用される「ＤＮＡ」なる用語
は、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によ
って得られるＤＮＡ、ｍＲＮＡから調製される相補ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣ
Ｒ法で増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適
当に組み合わせて構築される組換えＤＮＡのいずれをも
包含する。
は、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によ
って得られるＤＮＡ、ｍＲＮＡから調製される相補ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣ
Ｒ法で増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適
当に組み合わせて構築される組換えＤＮＡのいずれをも
包含する。
【００８２】ゲノムＤＮＡからの所望のＤＮＡの調製
は、前述したゲノムＤＮＡライブラリーから所望のゲノ
ムＤＮＡ断片を選択し、常法に従って所望の制限酵素で
切断することにより調製することができる。所望の蛋白
をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては以下の方
法が例示される。まず、所望の蛋白を発現・産生する前
述のような組織あるいは細胞から該蛋白をコードするｍ
ＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジ
ンチオシアネート法（Chirgwinら、Biochemistry, Vol.
18, p.5294, 1979）、熱フェノール法もしくはAGPC法等
の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ(dT)セ
ルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティ
クロマトグラフィーにかけることによって行うことがで
きる。
は、前述したゲノムＤＮＡライブラリーから所望のゲノ
ムＤＮＡ断片を選択し、常法に従って所望の制限酵素で
切断することにより調製することができる。所望の蛋白
をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては以下の方
法が例示される。まず、所望の蛋白を発現・産生する前
述のような組織あるいは細胞から該蛋白をコードするｍ
ＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジ
ンチオシアネート法（Chirgwinら、Biochemistry, Vol.
18, p.5294, 1979）、熱フェノール法もしくはAGPC法等
の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ(dT)セ
ルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティ
クロマトグラフィーにかけることによって行うことがで
きる。
【００８３】次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例
えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤ
マらの方法（Mol.Cell.Biol., Vol.2, p.161, 1982；同
誌、Vol.3, p.280, 1983）やHoffmaらの方法（Gene, Vo
l.25, p.263, 1983）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃ
ＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡ
をプラスミドベクターもしくはファージベクターに組み
込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッ
ケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）
することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤ
マらの方法（Mol.Cell.Biol., Vol.2, p.161, 1982；同
誌、Vol.3, p.280, 1983）やHoffmaらの方法（Gene, Vo
l.25, p.263, 1983）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃ
ＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡ
をプラスミドベクターもしくはファージベクターに組み
込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッ
ケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）
することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【００８４】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてλZipLox、ｐUC19、λgt1
0、λgt11等が例示される。ただし、後述の免疫学的ス
クリーニングに供する場合は、宿主内で本発明のタンパ
クをコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有
したベクターであることが好ましい。プラスミドにｃＤ
ＮＡを組み込む方法としては、例えばManiatisらの方法
（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second e
dition、p.1.53,1989, ColdSpring Harbor Laborator
y）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベ
クターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunhらの
方法（DNA Cloning, a practical approach, Vol.1, p.
49, 1985）などが挙げられる。簡便には、市販のクロー
ニングキット（例えば、GIBCO製あるいは宝酒造製等）
を用いることもできる。このようにして得られる組換え
プラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、
E.Coli:JM109、HB101、DH5αまたはMC1061/P3等）等の
適当な宿主に導入する。
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてλZipLox、ｐUC19、λgt1
0、λgt11等が例示される。ただし、後述の免疫学的ス
クリーニングに供する場合は、宿主内で本発明のタンパ
クをコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有
したベクターであることが好ましい。プラスミドにｃＤ
ＮＡを組み込む方法としては、例えばManiatisらの方法
（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second e
dition、p.1.53,1989, ColdSpring Harbor Laborator
y）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベ
クターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunhらの
方法（DNA Cloning, a practical approach, Vol.1, p.
49, 1985）などが挙げられる。簡便には、市販のクロー
ニングキット（例えば、GIBCO製あるいは宝酒造製等）
を用いることもできる。このようにして得られる組換え
プラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、
E.Coli:JM109、HB101、DH5αまたはMC1061/P3等）等の
適当な宿主に導入する。
【００８５】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, seco
nd edition, p.1.74, 1989, Cold Spring Harbor Labor
atory）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウ
ム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が
挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する
方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージン
グした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示され
る。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパ
ッケージングキット（例えば、ストラタジーン製、アマ
シャム製等）を用いることによって簡便に行うことがで
きる。
は、（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, seco
nd edition, p.1.74, 1989, Cold Spring Harbor Labor
atory）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウ
ム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が
挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する
方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージン
グした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示され
る。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパ
ッケージングキット（例えば、ストラタジーン製、アマ
シャム製等）を用いることによって簡便に行うことがで
きる。
【００８６】目的の蛋白をコードするｃＤＮＡは、例え
ば、別個に調製した該目的の蛋白のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡあるいは
該塩基配列と相同性を有するＤＮＡを、32Ｐまたは[α-
32P]dCTP等の放射性同位体で標識してプローブとなし、
公知のコロニーハイブリダイゼーション法（Crunstein
ら、Proc. Natl. Acid. Sci. USA, Vol.72, p.3961, 19
75）またはプラークハイブリダイゼーション法（Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual, second edition,
Vol.2.108, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory）に
よりスクリーニングすることにより得ることができる。
また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λZipL
ox、λgt11ファージベクター）を用いて作製したｃＤＮ
Ａライブラリーを用いる場合には、該目的の蛋白に反応
性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的
のｃＤＮＡクローンを選択することができる。大量にク
ローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリ
ーニング法を用いることが好ましい。
ば、別個に調製した該目的の蛋白のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡあるいは
該塩基配列と相同性を有するＤＮＡを、32Ｐまたは[α-
32P]dCTP等の放射性同位体で標識してプローブとなし、
公知のコロニーハイブリダイゼーション法（Crunstein
ら、Proc. Natl. Acid. Sci. USA, Vol.72, p.3961, 19
75）またはプラークハイブリダイゼーション法（Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual, second edition,
Vol.2.108, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory）に
よりスクリーニングすることにより得ることができる。
また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λZipL
ox、λgt11ファージベクター）を用いて作製したｃＤＮ
Ａライブラリーを用いる場合には、該目的の蛋白に反応
性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的
のｃＤＮＡクローンを選択することができる。大量にク
ローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリ
ーニング法を用いることが好ましい。
【００８７】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列
は、マキサム・ギルバート法（Maxamら、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA., Vol.74, p.560, 1977）、ファージＭ
１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法
（Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.74,
p.5463-5467, 1977）、あるいはダイターミネーターサ
イクルシーケンシング法（Applied Biosysytems社製）
などによって決定することができる。
は、マキサム・ギルバート法（Maxamら、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA., Vol.74, p.560, 1977）、ファージＭ
１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法
（Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.74,
p.5463-5467, 1977）、あるいはダイターミネーターサ
イクルシーケンシング法（Applied Biosysytems社製）
などによって決定することができる。
【００８８】本発明において所望に応じて用いられる
「発現ベクター」は、原核細胞及び／または真核細胞の
各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであ
れば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファー
ジベクターが包含される。例えば、大腸菌由来のプラス
ミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など）、
酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15など）、枯草菌由来
プラスミド（pUB110、pTP5、pC194 など）が例示され
る。また、ファージベクターとしては前述したλファー
ジなどの種々のファージ由来のベクターを用いることが
できる。さらに、レトロウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイ
ルスなどの動物や昆虫のウイルスを用いることができ
る。
「発現ベクター」は、原核細胞及び／または真核細胞の
各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであ
れば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファー
ジベクターが包含される。例えば、大腸菌由来のプラス
ミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など）、
酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15など）、枯草菌由来
プラスミド（pUB110、pTP5、pC194 など）が例示され
る。また、ファージベクターとしては前述したλファー
ジなどの種々のファージ由来のベクターを用いることが
できる。さらに、レトロウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイ
ルスなどの動物や昆虫のウイルスを用いることができ
る。
【００８９】細菌、特に大腸菌中で所望の蛋白を発現さ
せる場合には、一般に発現ベクターは、少なくともプロ
モーター−オペレーター領域、開始コドン、該所望の蛋
白をコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領
域および複製可能単位から構成される。宿主として酵
母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクタ
ーは、少なくともプロモーター、開始コドン、所望の蛋
白をコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが
好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、
エンハンサー配列、該所望の蛋白をコードする遺伝子の
５'側および３'側の非翻訳領域、スプライシング接合
部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー遺伝子ま
たは複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的
に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）
を含んでいてもよい。
せる場合には、一般に発現ベクターは、少なくともプロ
モーター−オペレーター領域、開始コドン、該所望の蛋
白をコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領
域および複製可能単位から構成される。宿主として酵
母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクタ
ーは、少なくともプロモーター、開始コドン、所望の蛋
白をコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが
好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、
エンハンサー配列、該所望の蛋白をコードする遺伝子の
５'側および３'側の非翻訳領域、スプライシング接合
部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー遺伝子ま
たは複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的
に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）
を含んでいてもよい。
【００９０】細菌中で所望の蛋白を発現させるためのプ
ロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペ
レーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、Ａ
ＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリ
キア属菌の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプ
ロモーター、tacプロモーターなどを含むものが例示さ
れる。酵母中で所望の蛋白を発現させるためのプロモー
ターとしては、PH05プロモーター、PGKプロモーター、G
APプロモーター、ADHプロモーターが挙げられ、宿主が
バチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモ
ーター、penPプロモーターなどが挙げられる。また、宿
主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、SV40由来の
プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒート
ショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、
SV40プロモーター、レトロウイルスのプロモーターであ
る。しかし、特にこれらに限定されるものではない。ま
た、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であ
る。好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（AT
G）が例示される。終止コドンとしては、常用の終止コ
ドン（例えば、TAG、TGA、TAA）が例示される。
ロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペ
レーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、Ａ
ＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリ
キア属菌の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプ
ロモーター、tacプロモーターなどを含むものが例示さ
れる。酵母中で所望の蛋白を発現させるためのプロモー
ターとしては、PH05プロモーター、PGKプロモーター、G
APプロモーター、ADHプロモーターが挙げられ、宿主が
バチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモ
ーター、penPプロモーターなどが挙げられる。また、宿
主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、SV40由来の
プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒート
ショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、
SV40プロモーター、レトロウイルスのプロモーターであ
る。しかし、特にこれらに限定されるものではない。ま
た、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であ
る。好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（AT
G）が例示される。終止コドンとしては、常用の終止コ
ドン（例えば、TAG、TGA、TAA）が例示される。
【００９１】ターミネーター領域としては、通常用いら
れる天然または合成のターミネーターを用いることがで
きる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配
列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天
然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然
のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）およ
び合成プラスミド等が含まれる。例えば、E.Coliではプ
ラスミドｐBR322、もしくはその人工的修飾物（ｐBR322
を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメン
ト）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染
色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVne
o（ATCC 37198）、 プラスミドpSV2dhfr（ATCC 3714
5）、プラスミドpdBPV-MMTneo（ATCC 37224）、プラス
ミドpSV2neo（ATCC 37149）等が例示される。エンハン
サー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシ
ング接合部位については、例えばそれぞれSV40に由来す
るもの等、当業者において通常使用されるものを用いる
ことができる。選択マーカーとしては、前記に例示した
種々の抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子な
ど）や種々の遺伝子増幅遺伝子を用いることができる。
れる天然または合成のターミネーターを用いることがで
きる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配
列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天
然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然
のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）およ
び合成プラスミド等が含まれる。例えば、E.Coliではプ
ラスミドｐBR322、もしくはその人工的修飾物（ｐBR322
を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメン
ト）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染
色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVne
o（ATCC 37198）、 プラスミドpSV2dhfr（ATCC 3714
5）、プラスミドpdBPV-MMTneo（ATCC 37224）、プラス
ミドpSV2neo（ATCC 37149）等が例示される。エンハン
サー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシ
ング接合部位については、例えばそれぞれSV40に由来す
るもの等、当業者において通常使用されるものを用いる
ことができる。選択マーカーとしては、前記に例示した
種々の抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子な
ど）や種々の遺伝子増幅遺伝子を用いることができる。
【００９２】本発明において所望に応じて用いられる発
現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始
コドン、所望の蛋白をコードするＤＮＡ、終止コドンお
よびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製
可能単位に連結することによって調製することができ
る。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4DNA
リガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当な
ＤＮＡフラグメント（例えば、所望のリンカーDNA配
列、所望の制限酵素による切断末端DNA配列など）を用
いることができる。
現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始
コドン、所望の蛋白をコードするＤＮＡ、終止コドンお
よびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製
可能単位に連結することによって調製することができ
る。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4DNA
リガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当な
ＤＮＡフラグメント（例えば、所望のリンカーDNA配
列、所望の制限酵素による切断末端DNA配列など）を用
いることができる。
【００９３】本発明おいて所望に応じて使用され得る
「形質転換細胞」は、上述の種々のＤＮＡまたは発現ベ
クター等で形質転換された細胞であり、宿主細胞として
の原核細胞あるいは真核細胞を形質転換することにより
調製することができる。また、本発明のターゲティング
ＤＮＡで形質転換された細胞（例えば、哺乳動物のＥＳ
細胞など）も形質転換細胞と称される。宿主細胞へのＤ
ＮＡ、本発明のターゲティングＤＮＡ、あるいは発現ベ
クターの導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方
法を用いて行うことができる。例えば、細菌（E.coli、
Bacillus subtilis 等）の場合は、例えばCohenらの方
法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1
972）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., Vol.16
8, p.111, 1979）やコンピテント法（J. Mol.Biol., Vo
l.56, p.209, 1971）によって、Saccharomyces cerevis
iaeの場合は、例えばHinnenらの方法（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978）やリチウム法
（J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983）によって、
動物細胞の場合は、例えばエレクトロポレーション法や
Grahamの方法（Virology, Vol.52, p.456, 1973）、昆
虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法（Mol. Cell.
Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983）によってそれぞれ
形質転換することができる。形質転換細胞は、所望の栄
養培地中で培養することにより維持生存させることがで
きる。
「形質転換細胞」は、上述の種々のＤＮＡまたは発現ベ
クター等で形質転換された細胞であり、宿主細胞として
の原核細胞あるいは真核細胞を形質転換することにより
調製することができる。また、本発明のターゲティング
ＤＮＡで形質転換された細胞（例えば、哺乳動物のＥＳ
細胞など）も形質転換細胞と称される。宿主細胞へのＤ
ＮＡ、本発明のターゲティングＤＮＡ、あるいは発現ベ
クターの導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方
法を用いて行うことができる。例えば、細菌（E.coli、
Bacillus subtilis 等）の場合は、例えばCohenらの方
法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1
972）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., Vol.16
8, p.111, 1979）やコンピテント法（J. Mol.Biol., Vo
l.56, p.209, 1971）によって、Saccharomyces cerevis
iaeの場合は、例えばHinnenらの方法（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978）やリチウム法
（J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983）によって、
動物細胞の場合は、例えばエレクトロポレーション法や
Grahamの方法（Virology, Vol.52, p.456, 1973）、昆
虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法（Mol. Cell.
Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983）によってそれぞれ
形質転換することができる。形質転換細胞は、所望の栄
養培地中で培養することにより維持生存させることがで
きる。
【００９４】栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生
育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含
でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコ
ース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、
無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモ
ニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養
素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二
水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗
生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アン
ピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよ
い。培養条件（例えば温度、培地のｐＨおよび培養時
間）は、培養する細胞の特徴に応じて適宜調整すること
ができる。なお、下記にその一例を示すがこれらに限定
されるものではない。
育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含
でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコ
ース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、
無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモ
ニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養
素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二
水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗
生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アン
ピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよ
い。培養条件（例えば温度、培地のｐＨおよび培養時
間）は、培養する細胞の特徴に応じて適宜調整すること
ができる。なお、下記にその一例を示すがこれらに限定
されるものではない。
【００９５】宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である
場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当であ
る。好ましくは、pHが５〜８である培地である。宿主が
E.coliの場合、好ましい培地としてLB培地、M9培地（Mi
llerら、 Exp.Mol. Genet, Cold Spring Harbor Labora
tory, p.431, 1972）等が例示される。かかる場合、培
養は、必要により通気、撹拌しながら、通常14〜43℃、
約３〜24時間行うことができる。
場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当であ
る。好ましくは、pHが５〜８である培地である。宿主が
E.coliの場合、好ましい培地としてLB培地、M9培地（Mi
llerら、 Exp.Mol. Genet, Cold Spring Harbor Labora
tory, p.431, 1972）等が例示される。かかる場合、培
養は、必要により通気、撹拌しながら、通常14〜43℃、
約３〜24時間行うことができる。
【００９６】宿主がBacillus属菌の場合、必要により通
気、撹拌をしながら、通常30〜40℃、約16〜96時間行う
ことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例
えばBurkholder最小培地（Bostian, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980）が挙げられ、ｐHは
５〜８であることが望ましい。培養は通常約20〜35℃で
約14〜144時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行う
こともできる。
気、撹拌をしながら、通常30〜40℃、約16〜96時間行う
ことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例
えばBurkholder最小培地（Bostian, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980）が挙げられ、ｐHは
５〜８であることが望ましい。培養は通常約20〜35℃で
約14〜144時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行う
こともできる。
【００９７】宿主が動物細胞の場合、培地として例えば
約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地（Science, Vol.
122, p.501, 1952）、DMEM培地（Virology, Vol.8, p.3
96,1959）、RPMI1640培地（J. Am. Med. Assoc., Vol.1
99, p.519, 1967）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Bio
l. Med., Vol.73, p.1, 1950） 等を用いることができ
る。培地のｐHは約６〜８であるのが好ましく、培養は
通常約30〜40℃で約15〜72時間行なわれ、必要により通
気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、
例えば胎児牛血清を含むGrace's 培地（Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985）等が挙げられ、
そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約
20〜40℃で15〜100時間行なわれ、必要により通気や撹
拌を行うこともできる。
約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地（Science, Vol.
122, p.501, 1952）、DMEM培地（Virology, Vol.8, p.3
96,1959）、RPMI1640培地（J. Am. Med. Assoc., Vol.1
99, p.519, 1967）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Bio
l. Med., Vol.73, p.1, 1950） 等を用いることができ
る。培地のｐHは約６〜８であるのが好ましく、培養は
通常約30〜40℃で約15〜72時間行なわれ、必要により通
気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、
例えば胎児牛血清を含むGrace's 培地（Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985）等が挙げられ、
そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約
20〜40℃で15〜100時間行なわれ、必要により通気や撹
拌を行うこともできる。
【００９８】
【実施例】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限
定されるものではないことは言うまでもない。
明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限
定されるものではないことは言うまでもない。
【００９９】実施例１ HPRT遺伝子ノックアウトマウス
の作製 <1-1> HPRT遺伝子を含むマウスゲノムBACクローンの取
得 マウスHPRT（Hypoxanthine phosphoribosyl transferas
e）をコードする遺伝子を保持するマウスゲノムDNA断片
を、市販のマウスゲノムDNAのBAC（BacterialArtificia
l Chromosome）ライブラリーであるDOWN TO THE WELL M
OUSE ES BACDNA POOL（Genome Systems社製）を、該ラ
イブラリーに添付の実験操作手順書に記載された３D-PC
R法に準じた方法に従ってスクリーニングすることによ
り得た。このライブラリーは、大腸菌に保持された約9
2,160個のBACクローンの各々が、384穴マイクロプレー
トの各ウェルに保存された合計240枚のプレートからな
り、このライブラリーはGenome Systems社で保管されて
いる。また、3D-PCRによるスクリーニングを実施するた
めに、該ライブラリーとは別に、該ライブラリー中のBA
CクローンのDNAが、種々の規則的組み合わせで混合され
た混合サンプルのチューブが作製されている。該ライブ
ラリープレートの各ウェルには、各々異なる番号が付さ
れているため、各チューブに混合されているBACクロー
ンの種類は明白である。該ライブラリーをスクリーニン
グし、目的のBACクローンを取得しようとする者は、該
種々のBACクローンのDNAの混合サンプルが保存されてい
るチューブの一式を購入し、実験操作説明書に従って3D
-PCRによるスクリーニングを行い、目的のゲノムＤＮＡ
断片がクローニングされているBACクローンが保存され
ているウェルの番号を特定する。そのようにして特定さ
れた番号のウェルに保存されているBACクローンを、Gen
ome Systems社から購入できる。
の作製 <1-1> HPRT遺伝子を含むマウスゲノムBACクローンの取
得 マウスHPRT（Hypoxanthine phosphoribosyl transferas
e）をコードする遺伝子を保持するマウスゲノムDNA断片
を、市販のマウスゲノムDNAのBAC（BacterialArtificia
l Chromosome）ライブラリーであるDOWN TO THE WELL M
OUSE ES BACDNA POOL（Genome Systems社製）を、該ラ
イブラリーに添付の実験操作手順書に記載された３D-PC
R法に準じた方法に従ってスクリーニングすることによ
り得た。このライブラリーは、大腸菌に保持された約9
2,160個のBACクローンの各々が、384穴マイクロプレー
トの各ウェルに保存された合計240枚のプレートからな
り、このライブラリーはGenome Systems社で保管されて
いる。また、3D-PCRによるスクリーニングを実施するた
めに、該ライブラリーとは別に、該ライブラリー中のBA
CクローンのDNAが、種々の規則的組み合わせで混合され
た混合サンプルのチューブが作製されている。該ライブ
ラリープレートの各ウェルには、各々異なる番号が付さ
れているため、各チューブに混合されているBACクロー
ンの種類は明白である。該ライブラリーをスクリーニン
グし、目的のBACクローンを取得しようとする者は、該
種々のBACクローンのDNAの混合サンプルが保存されてい
るチューブの一式を購入し、実験操作説明書に従って3D
-PCRによるスクリーニングを行い、目的のゲノムＤＮＡ
断片がクローニングされているBACクローンが保存され
ているウェルの番号を特定する。そのようにして特定さ
れた番号のウェルに保存されているBACクローンを、Gen
ome Systems社から購入できる。
【０１００】マウスHPRT遺伝子は、８つのイントロンで
分断された９つのエクソンから構成され、全体で33kbに
も及ぶ（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol.81, p.214
7, 1984）。マウスHPRT遺伝子のエクソン３の塩基配列
を基に、各々塩基配列の一部に相補的な一対のPCRプラ
イマー、p3A（配列番号１）及びp3B（配列番号２）を調
製した。購入した全ての混合サンプルチューブの各々に
ついて、下記条件でPCR行った。
分断された９つのエクソンから構成され、全体で33kbに
も及ぶ（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol.81, p.214
7, 1984）。マウスHPRT遺伝子のエクソン３の塩基配列
を基に、各々塩基配列の一部に相補的な一対のPCRプラ
イマー、p3A（配列番号１）及びp3B（配列番号２）を調
製した。購入した全ての混合サンプルチューブの各々に
ついて、下記条件でPCR行った。
【０１０１】（反応混合物組成）0.5UのTaqポリメラー
ゼ、2.5mMのMgCl2、0.4mMのdNTP、4μMのp3A、及び4μM
のp3B。 （反応サイクル）94℃で3分の反応を1サイクル；50℃で
2分の反応を1サイクル；及び72℃で1分、94℃で1分及び
50℃で1分の反応を30サイクル。得られたPCR産物を、常
法に従ってゲル電気泳動に供し、ゲル上に現れるバンド
の大きさから、期待される塩基長を有するDNAの増幅が
見られる混合サンプルチューブを同定した。本PCRによ
る増幅が期待されるDNAの塩基長は、197bpである。その
結果、各々64N20、118E2及び131H17という番号が付され
たウェル中のBACクローン中にマウスHPRT遺伝子を含む
ゲノムDNA断片がクローニングされていることが判明し
た。当該３つのBACクローンを、Genome Systems社より
購入した。
ゼ、2.5mMのMgCl2、0.4mMのdNTP、4μMのp3A、及び4μM
のp3B。 （反応サイクル）94℃で3分の反応を1サイクル；50℃で
2分の反応を1サイクル；及び72℃で1分、94℃で1分及び
50℃で1分の反応を30サイクル。得られたPCR産物を、常
法に従ってゲル電気泳動に供し、ゲル上に現れるバンド
の大きさから、期待される塩基長を有するDNAの増幅が
見られる混合サンプルチューブを同定した。本PCRによ
る増幅が期待されるDNAの塩基長は、197bpである。その
結果、各々64N20、118E2及び131H17という番号が付され
たウェル中のBACクローン中にマウスHPRT遺伝子を含む
ゲノムDNA断片がクローニングされていることが判明し
た。当該３つのBACクローンを、Genome Systems社より
購入した。
【０１０２】<1-2> マウスゲノムBAC DNAの制限酵素に
よる切断、及び環状化 Genome Systems社より購入したBACクローン64N20のDNA
を、アルカリを用いて常法に従って精製した（Nucl. Ac
ids Res., Vol.7, p.1513-1523, 1979）。7種の制限酵
素（EcoRI, HindIII, BamHI, XhoI, PstI, PvuI, PvuII
及びXmnI）について、マウスHPRT遺伝子のゲノムDNAの
制限酵素地図が作製されており、EcoRI、HindIIIまたは
BamHIで切断すると相同組換え用ターゲティングDNAに必
要な相同領域として適した大きさのゲノムDNA断片が得
られるものと予測された（Proc. Natl. Acad. Sci., US
A, Vol.81, p.2147, 1984）。
よる切断、及び環状化 Genome Systems社より購入したBACクローン64N20のDNA
を、アルカリを用いて常法に従って精製した（Nucl. Ac
ids Res., Vol.7, p.1513-1523, 1979）。7種の制限酵
素（EcoRI, HindIII, BamHI, XhoI, PstI, PvuI, PvuII
及びXmnI）について、マウスHPRT遺伝子のゲノムDNAの
制限酵素地図が作製されており、EcoRI、HindIIIまたは
BamHIで切断すると相同組換え用ターゲティングDNAに必
要な相同領域として適した大きさのゲノムDNA断片が得
られるものと予測された（Proc. Natl. Acad. Sci., US
A, Vol.81, p.2147, 1984）。
【０１０３】精製BAC DNA（各２μg）を、BamHI, HindI
II及びEcoRIの各々で切断した。次いで、生成物（各0.5
μg）を、１UのT4リガーゼを含むTris-HCl緩衝液（840
μｌ；<組成>66mMのTris-HCl(pH7.6)、6.6mMのMgCl2、1
0mMのDithiothreitol、66μMのATP）中で16℃で一晩保
温することにより、分子内連結させ環状化させた（自己
環状化）。得られた環状DNAをエタノール沈殿させ、20
μlのＴＥ溶液（10mMのTris-HCl(pH7.5)、1mMのEDTA）
中に溶解させた。
II及びEcoRIの各々で切断した。次いで、生成物（各0.5
μg）を、１UのT4リガーゼを含むTris-HCl緩衝液（840
μｌ；<組成>66mMのTris-HCl(pH7.6)、6.6mMのMgCl2、1
0mMのDithiothreitol、66μMのATP）中で16℃で一晩保
温することにより、分子内連結させ環状化させた（自己
環状化）。得られた環状DNAをエタノール沈殿させ、20
μlのＴＥ溶液（10mMのTris-HCl(pH7.5)、1mMのEDTA）
中に溶解させた。
【０１０４】<1-3> 環状DNAを鋳型とした逆PCR 前記実施例で調製した環状DNA（各１μl）： （１）EcoRIで切断後環状化した環状化DNA； （２）HindIIIで切断後環状化した環状DNA；及び （３）BamHIで切断後環状化した環状DNA、の各々を下記
2組のＰＣＲプライマーの各々の組み合せを用いた逆PCR
反応（inverse PCR；inside-out PCR）により増幅させ
た。 Ａ）マウスHPRT遺伝子のエクソン２の塩基配列に相補的
な一対のプライマー pr2-1（配列番号３）及びpr2-2（配列番号４）。 Ｂ）マウスHPRT遺伝子のエクソン３の塩基配列に相補的
な一対のプライマー pr3-1（配列番号５）及びpr3-2（配列番号６）。PCR産
物のクローニングの効率を上げるために、プライマーpr
2-1及びpr3-1の5'末端近傍には、制限酵素PacI認識DNA
配列（TTAATTAA）を付加した。また、同様にプライマー
pr2-2及びpr3-2の5'末端近傍には、制限酵素NotI認識DN
A配列（GCGGCCGC）を付加した。
2組のＰＣＲプライマーの各々の組み合せを用いた逆PCR
反応（inverse PCR；inside-out PCR）により増幅させ
た。 Ａ）マウスHPRT遺伝子のエクソン２の塩基配列に相補的
な一対のプライマー pr2-1（配列番号３）及びpr2-2（配列番号４）。 Ｂ）マウスHPRT遺伝子のエクソン３の塩基配列に相補的
な一対のプライマー pr3-1（配列番号５）及びpr3-2（配列番号６）。PCR産
物のクローニングの効率を上げるために、プライマーpr
2-1及びpr3-1の5'末端近傍には、制限酵素PacI認識DNA
配列（TTAATTAA）を付加した。また、同様にプライマー
pr2-2及びpr3-2の5'末端近傍には、制限酵素NotI認識DN
A配列（GCGGCCGC）を付加した。
【０１０５】PCRは下記の反応条件で行った。 （反応混合物組成）0.5UのLA Taqポリメラーゼ（宝酒造
製）、2.5mMのMgCl2、0.4mMのdNTP、上記一対のプライ
マー（各4μM）。全量：50μl。 （反応サイクル）94℃で１分の反応を1サイクル；及び9
8℃で20秒及び68℃で10分の反応を30サイクル。得られ
たPCR産物を常法に従ってゲル電気泳動に供した。結果
を図１（分図1(a)、1(b)、及び1(c)）に示す。
製）、2.5mMのMgCl2、0.4mMのdNTP、上記一対のプライ
マー（各4μM）。全量：50μl。 （反応サイクル）94℃で１分の反応を1サイクル；及び9
8℃で20秒及び68℃で10分の反応を30サイクル。得られ
たPCR産物を常法に従ってゲル電気泳動に供した。結果
を図１（分図1(a)、1(b)、及び1(c)）に示す。
【０１０６】図1(a)に示すとおり、前記(A)に記載の一
対のプライマーを用いたPCRで増幅が期待されるDNAの大
きさは下記のとおりである。 （１）EcoRIで切断後環状化した環状DNA： 約5.5kb
（I) （２）HindIIIで切断後環状化した環状DNA： 約4.5kb
（II) （３）BamHIで切断後環状化した環状DNA： 約7.0kb（I
II) 図1(b)に示されるとおり、EcoRIで切断後環状化した環
状DNA及びHindIIIで切断後環状化した環状DNAにおいて
は共に期待される大きさ（各々約5.5kb及び約4.5kb）の
DNAの増幅が認められたが、BamHIで切断後環状化した環
状DNAにおいては期待される大きさのDNAの増幅が認めら
れなかった。
対のプライマーを用いたPCRで増幅が期待されるDNAの大
きさは下記のとおりである。 （１）EcoRIで切断後環状化した環状DNA： 約5.5kb
（I) （２）HindIIIで切断後環状化した環状DNA： 約4.5kb
（II) （３）BamHIで切断後環状化した環状DNA： 約7.0kb（I
II) 図1(b)に示されるとおり、EcoRIで切断後環状化した環
状DNA及びHindIIIで切断後環状化した環状DNAにおいて
は共に期待される大きさ（各々約5.5kb及び約4.5kb）の
DNAの増幅が認められたが、BamHIで切断後環状化した環
状DNAにおいては期待される大きさのDNAの増幅が認めら
れなかった。
【０１０７】一方、前記(B)に記載の一対のプライマー
を用いたPCRで増幅が期待されるDNAの大きさは下記のと
おりである。 （１）EcoRIで切断後環状化した環状DNA： 約1.3kb（I
V) （２）HindIIIで切断後環状化した環状DNA： 約7.1kb
（V) （３）BamHIで切断後環状化した環状DNA： 約7.0kb（V
I) 図1(c)に示されるとおり、EcoRIで切断後環状化した環
状DNA、HindIIIで切断後環状化した環状DNA、及びBamHI
で切断後環状化した環状DNAの各々においては共に期待
される大きさ（各々約1.3kb、約7.1kb、及び約7.0kb）
のDNAの増幅が認められた。
を用いたPCRで増幅が期待されるDNAの大きさは下記のと
おりである。 （１）EcoRIで切断後環状化した環状DNA： 約1.3kb（I
V) （２）HindIIIで切断後環状化した環状DNA： 約7.1kb
（V) （３）BamHIで切断後環状化した環状DNA： 約7.0kb（V
I) 図1(c)に示されるとおり、EcoRIで切断後環状化した環
状DNA、HindIIIで切断後環状化した環状DNA、及びBamHI
で切断後環状化した環状DNAの各々においては共に期待
される大きさ（各々約1.3kb、約7.1kb、及び約7.0kb）
のDNAの増幅が認められた。
【０１０８】<1-4> HPRT遺伝子を含むマウスゲノムDNA
断片のクローニング 前記実施例の結果から、BamHIで切断後環状化した環状D
NAを鋳型とした前記(B)に記載の一対のプライマーDNAを
用いたPCRにより増幅されるPCR産物を回収することとし
た。該PCR産物を、制限酵素PacI及びNotIで切断した
後、0.7％アガロースゲル電気泳動に供し、約7.0kbの大
きさを有するバンドを含むゲルを切り出した。該ゲル
を、DNA CELL（第一化学社製）を用いた電気溶出に供
し、ゲルから、目的のHPRT遺伝子を含むマウスゲノムDN
A断片を回収した。該DNA断片を、T4リガーゼ（東洋紡
製）を用いて、プラスミドp1108を制限酵素PacI及びNot
Iで切断して調製した線状化プラスミドDNAと連結させ、
組換えプラスミドp1207を作製した（図２）。該組換え
プラスミドp1207で、大腸菌JM109（宝酒造製）を形質転
換した。なお、該プラスミドp1108は、常法に従って、
プラスミドpBlueScript(SK+)（Stratagene製）に、制限
酵素処理によりプラスミドpMAMneo-CAT（Stratagene
製）から切り出したネオマシン耐性遺伝子を含むDNA断
片を挿入し、またリンカーを介して制限酵素PacI認識DN
A配列を挿入することにより作製した。該形質転換され
た大腸菌から、アルカリ法により組換えプラスミドp120
7を回収した。該プラスミドの制限酵素地図を、7種類の
制限酵素（BamHI, HindIII, EcoRI, PstI, BglII, EcoR
V及びXbaI）について作製した（図3(a)）
断片のクローニング 前記実施例の結果から、BamHIで切断後環状化した環状D
NAを鋳型とした前記(B)に記載の一対のプライマーDNAを
用いたPCRにより増幅されるPCR産物を回収することとし
た。該PCR産物を、制限酵素PacI及びNotIで切断した
後、0.7％アガロースゲル電気泳動に供し、約7.0kbの大
きさを有するバンドを含むゲルを切り出した。該ゲル
を、DNA CELL（第一化学社製）を用いた電気溶出に供
し、ゲルから、目的のHPRT遺伝子を含むマウスゲノムDN
A断片を回収した。該DNA断片を、T4リガーゼ（東洋紡
製）を用いて、プラスミドp1108を制限酵素PacI及びNot
Iで切断して調製した線状化プラスミドDNAと連結させ、
組換えプラスミドp1207を作製した（図２）。該組換え
プラスミドp1207で、大腸菌JM109（宝酒造製）を形質転
換した。なお、該プラスミドp1108は、常法に従って、
プラスミドpBlueScript(SK+)（Stratagene製）に、制限
酵素処理によりプラスミドpMAMneo-CAT（Stratagene
製）から切り出したネオマシン耐性遺伝子を含むDNA断
片を挿入し、またリンカーを介して制限酵素PacI認識DN
A配列を挿入することにより作製した。該形質転換され
た大腸菌から、アルカリ法により組換えプラスミドp120
7を回収した。該プラスミドの制限酵素地図を、7種類の
制限酵素（BamHI, HindIII, EcoRI, PstI, BglII, EcoR
V及びXbaI）について作製した（図3(a)）
【０１０９】<1-5> ターゲティングＤＮＡの調製 組換えプラスミドp1207を制限酵素BamHIで切断した。得
られた線状化DNAを以下の試験で用いるターゲティングD
NAとして回収した。
られた線状化DNAを以下の試験で用いるターゲティングD
NAとして回収した。
【０１１０】<1-6> ターゲティングＤＮＡのＥＳ細胞
への導入及び相同組換え GENE Pulser（Bio-Rad社製）を用いたエレクトロポレー
ション（200V、360μF、0.4cm gap）により、マウスES
細胞（2×10７個；Rouxs Arch. Dev. Biol., Vol.198,
p.48, 1989））に、前記で調製したターゲティングＤＮ
Ａ（100μg）を導入した。該ES細胞を、0.1％ゼラチン
をコーティングした15％FBS（牛胎児血清）含有DMEM培
地を含むシャーレ（10cm、10枚）に蒔き２４時間培養し
た。次いで、培地を250μg/mlのG418を含む選択培地に
交換しさらに培養した。７乃至10日間の培養により、35
0個のG418耐性コロニーの生育が観察された。各々のコ
ロニーを回収し、各々個別に、250μg/mlのG418及び５
μg/mlの6-TG（6-Thioguanin）を含む栄養培地中で１０
日間培養した。6-TGは、正常なHPRT遺伝子を保持する細
胞においては、該薬剤が核酸合成系に取り込まれること
により、細胞死に至る。この薬剤を用いることにより、
正常な相同組換えにより内在性HPRT遺伝子が不活性化さ
れた細胞のみを選択することができる。この結果、２つ
のクローン（1207-1及び1207-2）の生育が認められた。
への導入及び相同組換え GENE Pulser（Bio-Rad社製）を用いたエレクトロポレー
ション（200V、360μF、0.4cm gap）により、マウスES
細胞（2×10７個；Rouxs Arch. Dev. Biol., Vol.198,
p.48, 1989））に、前記で調製したターゲティングＤＮ
Ａ（100μg）を導入した。該ES細胞を、0.1％ゼラチン
をコーティングした15％FBS（牛胎児血清）含有DMEM培
地を含むシャーレ（10cm、10枚）に蒔き２４時間培養し
た。次いで、培地を250μg/mlのG418を含む選択培地に
交換しさらに培養した。７乃至10日間の培養により、35
0個のG418耐性コロニーの生育が観察された。各々のコ
ロニーを回収し、各々個別に、250μg/mlのG418及び５
μg/mlの6-TG（6-Thioguanin）を含む栄養培地中で１０
日間培養した。6-TGは、正常なHPRT遺伝子を保持する細
胞においては、該薬剤が核酸合成系に取り込まれること
により、細胞死に至る。この薬剤を用いることにより、
正常な相同組換えにより内在性HPRT遺伝子が不活性化さ
れた細胞のみを選択することができる。この結果、２つ
のクローン（1207-1及び1207-2）の生育が認められた。
【０１１１】<1-7> 正常な相同組換えの確認 ターゲティングDNAと内在性ゲノムとの間での正常な相
同組換えによるHPRT遺伝子の破壊が起こっていることを
確認するために、該２つの組換えES細胞（1207-1及び12
07-2）の各々について、染色体サザンハイブリダイゼー
ションを行った。各々の細胞のゲノムDNAを、既報に従
って精製した（Am. J. Hum. Genet., Vol.36, p.546, 1
984）。該精製ゲノムDNAを、６種類の制限酵素（BamHI,
HindIII,EcoRI, BglII, EcoRV及びXbaI）で切断して得
られるゲノムDNA断片（5μg）を、0.7％アガロースゲル
電気泳動に供し、ナイロンメンブレン（GeneScreen Plu
s、DuponT社製）に転写した。ターゲティングDNAに含ま
れるアンピシリン耐性遺伝子（Amp）と大腸菌の複製開
始点領域（Ori）を含むDNA断片を、ランダムプライム法
により(α-32P)dCTPで放射性標識してハイブリダイゼー
ションプローブとした。ハイブリダイゼーションは、該
メンブレンを、プローブ（1×105cpm/ml）を加えたラピ
ッドハイブリダイゼーションバッファー（Amersham製）
中で65℃で2時間保温することにより行った。次いで、
メンブレンを、2×SSC（standard salinecitrate; 0.15
M NaCl, 0.015M Na-Citrate）/0.1％SDSで１５分間、同
緩衝液で室温で2回、及び0.2×SSC/0.1%SDSで65℃で2回
洗浄した。次いで、メンブレンを、−80℃で一晩、Ｘ線
フィルム（XAR-5、Kodak製）に感光させた後、現像した
（図3(b)及び3(c)）。
同組換えによるHPRT遺伝子の破壊が起こっていることを
確認するために、該２つの組換えES細胞（1207-1及び12
07-2）の各々について、染色体サザンハイブリダイゼー
ションを行った。各々の細胞のゲノムDNAを、既報に従
って精製した（Am. J. Hum. Genet., Vol.36, p.546, 1
984）。該精製ゲノムDNAを、６種類の制限酵素（BamHI,
HindIII,EcoRI, BglII, EcoRV及びXbaI）で切断して得
られるゲノムDNA断片（5μg）を、0.7％アガロースゲル
電気泳動に供し、ナイロンメンブレン（GeneScreen Plu
s、DuponT社製）に転写した。ターゲティングDNAに含ま
れるアンピシリン耐性遺伝子（Amp）と大腸菌の複製開
始点領域（Ori）を含むDNA断片を、ランダムプライム法
により(α-32P)dCTPで放射性標識してハイブリダイゼー
ションプローブとした。ハイブリダイゼーションは、該
メンブレンを、プローブ（1×105cpm/ml）を加えたラピ
ッドハイブリダイゼーションバッファー（Amersham製）
中で65℃で2時間保温することにより行った。次いで、
メンブレンを、2×SSC（standard salinecitrate; 0.15
M NaCl, 0.015M Na-Citrate）/0.1％SDSで１５分間、同
緩衝液で室温で2回、及び0.2×SSC/0.1%SDSで65℃で2回
洗浄した。次いで、メンブレンを、−80℃で一晩、Ｘ線
フィルム（XAR-5、Kodak製）に感光させた後、現像した
（図3(b)及び3(c)）。
【０１１２】正常な相同組換えによるジーンタゲティン
グが起こっていれば、本サザンハイブリダイゼションで
観察が期待されるDNAの大きさは下記のとおりである
（図3(a)）。 （１）BamHIで切断したゲノムDNA断片： 約12.5kb （２）BglIIで切断したゲノムDNA断片： 約8.6kb （３）EcoRIで切断したゲノムDNA断片： 約6.8kb （４）EcoRVで切断したゲノムDNA断片： 約12.0kb （５）HindIIIで切断したゲノムDNA断片： 約12.6kb （６）XbaIで切断したゲノムDNA断片： 約7.8kb 図3(b)及び3(c)に示されるとおり、２つのいずれの組換
えES細胞においても期待される大きさのDNAのバンドが
検出された。この結果から、本実施例で作製された相同
組換え用ターゲティングDNAが、内在性ゲノムとの正常
な相同組換えにより、マウスES細胞中の内在性HPRT遺伝
子を破壊したことが確認された。また、本発明の方法に
よる相同組換えの頻度は、約0.6％であり、従来の方法
により作製されるターゲティングDNAによる相同組換え
の平均的値と同等であった。
グが起こっていれば、本サザンハイブリダイゼションで
観察が期待されるDNAの大きさは下記のとおりである
（図3(a)）。 （１）BamHIで切断したゲノムDNA断片： 約12.5kb （２）BglIIで切断したゲノムDNA断片： 約8.6kb （３）EcoRIで切断したゲノムDNA断片： 約6.8kb （４）EcoRVで切断したゲノムDNA断片： 約12.0kb （５）HindIIIで切断したゲノムDNA断片： 約12.6kb （６）XbaIで切断したゲノムDNA断片： 約7.8kb 図3(b)及び3(c)に示されるとおり、２つのいずれの組換
えES細胞においても期待される大きさのDNAのバンドが
検出された。この結果から、本実施例で作製された相同
組換え用ターゲティングDNAが、内在性ゲノムとの正常
な相同組換えにより、マウスES細胞中の内在性HPRT遺伝
子を破壊したことが確認された。また、本発明の方法に
よる相同組換えの頻度は、約0.6％であり、従来の方法
により作製されるターゲティングDNAによる相同組換え
の平均的値と同等であった。
【０１１３】実施例２ EPO受容体遺伝子ノックアウト
マウスの作製 <2-1> EPO受容体遺伝子を含むマウスゲノムBACクロー
ンの取得 マウスEPO受容体（Erythropietin receptor；Cell, Vo
l.57, p.277, 1989； J. Mol. Biol., Vol.216, p.567,
1990; Mol. Cel. Biol., Vol.10, p.3675, 1990）をコ
ードする遺伝子を保持するマウスゲノムDNA断片を、実
施例<1-1>と同様にして市販のマウスゲノムDNAのBACラ
イブラリーであるDOWN TO THE WELL MOUSEES BAC DNA P
OOL（Genome Systems社製）をスクリーニングすること
により得た。マウスEPO受容体遺伝子のエクソン２の塩
基配列を基に、各々塩基配列の一部に相補的な一対のPC
Rプライマー、EpoR11（配列番号７）及びEpoR21（配列
番号８）を調製した。購入した全ての混合サンプルチュ
ーブの各々について、下記条件でPCR行った。
マウスの作製 <2-1> EPO受容体遺伝子を含むマウスゲノムBACクロー
ンの取得 マウスEPO受容体（Erythropietin receptor；Cell, Vo
l.57, p.277, 1989； J. Mol. Biol., Vol.216, p.567,
1990; Mol. Cel. Biol., Vol.10, p.3675, 1990）をコ
ードする遺伝子を保持するマウスゲノムDNA断片を、実
施例<1-1>と同様にして市販のマウスゲノムDNAのBACラ
イブラリーであるDOWN TO THE WELL MOUSEES BAC DNA P
OOL（Genome Systems社製）をスクリーニングすること
により得た。マウスEPO受容体遺伝子のエクソン２の塩
基配列を基に、各々塩基配列の一部に相補的な一対のPC
Rプライマー、EpoR11（配列番号７）及びEpoR21（配列
番号８）を調製した。購入した全ての混合サンプルチュ
ーブの各々について、下記条件でPCR行った。
【０１１４】（反応混合物組成）１UのTaqポリメラー
ゼ、１.5mMのMgCl2、0.25mMのdNTP、0.4μMのEpoR11、
及び0.4μMのEpoR21。 （反応サイクル）92℃で3分の反応を1サイクル；92℃で
30秒、55℃で30秒及び72℃で1分の反応を30サイクル；
及び、72℃で５分。得られたPCR産物を、常法に従って
ゲル電気泳動に供し、ゲル上に現れるバンドの大きさか
ら、期待される塩基長を有するDNAの増幅が見られる混
合サンプルチューブを同定した。本PCRによる増幅が期
待されるDNAの塩基長は、112bpである。その結果、174M
2という番号が付されたウェル中のBACクローン中にマウ
スEPO受容体遺伝子を含むゲノムDNA断片がクローニング
されていることが判明した。当該BACクローンを、Genom
e Systems社より購入した。
ゼ、１.5mMのMgCl2、0.25mMのdNTP、0.4μMのEpoR11、
及び0.4μMのEpoR21。 （反応サイクル）92℃で3分の反応を1サイクル；92℃で
30秒、55℃で30秒及び72℃で1分の反応を30サイクル；
及び、72℃で５分。得られたPCR産物を、常法に従って
ゲル電気泳動に供し、ゲル上に現れるバンドの大きさか
ら、期待される塩基長を有するDNAの増幅が見られる混
合サンプルチューブを同定した。本PCRによる増幅が期
待されるDNAの塩基長は、112bpである。その結果、174M
2という番号が付されたウェル中のBACクローン中にマウ
スEPO受容体遺伝子を含むゲノムDNA断片がクローニング
されていることが判明した。当該BACクローンを、Genom
e Systems社より購入した。
【０１１５】<2-2> マウスゲノムBAC DNAの制限酵素に
よる切断、及び環状化 Genome Systems社より購入したBACクローン174M2を、標
準的なアルカリ法により精製した（Nucl. Acids Res.,
Vol.7, p.1513-1523, 1979）。パルスフィールドゲル電
気泳動にて、該BACクローンには約120kbのDNAが挿入さ
れていることを確認した。マウスEPO受容体遺伝子のゲ
ノムDNAの制限酵素地図が作製されており、制限酵素Bam
HI、EcoRV、EcoRI、HindIII、XbaI、XhoI、ScaI、PvuI
I、PstIまたはBglIIで切断すると相同組換え用ターゲテ
ィングDNAに必要な相同領域として適した大きさのゲノ
ムDNA断片が得られるものと予測された（Mol. Cel. Bio
l., Vol.10,p.3675, 1990）。精製BAC DNA（２μg）
を、上記１０種類の制限酵素の各々で切断し、フェノー
ル・クロロホルム抽出並びにエタノール沈殿の操作の
後、DNAを15μlのＴＥ溶液（10mMのTris-HCl(pH7.5)、1
mMのEDTA）に溶解した。次いで、生成物（0.2μl）を、
１UのT4リガーゼを含むTris-HCl緩衝液（810μlまたは2
70μl；<組成>66mMのTris-HCl(pH7.6)、6.6mMのMgCl2、
10mMのDithiothreitol、66μMのATP）中で16℃で一晩保
温することにより、分子内連結させ環状化させた（自己
環状化）。得られた環状DNAをエタノール沈殿させ、20
μlのＴＥ溶液（10mMのTris-HCl(pH7.5)、1mMのEDTA）
中に溶解させた。
よる切断、及び環状化 Genome Systems社より購入したBACクローン174M2を、標
準的なアルカリ法により精製した（Nucl. Acids Res.,
Vol.7, p.1513-1523, 1979）。パルスフィールドゲル電
気泳動にて、該BACクローンには約120kbのDNAが挿入さ
れていることを確認した。マウスEPO受容体遺伝子のゲ
ノムDNAの制限酵素地図が作製されており、制限酵素Bam
HI、EcoRV、EcoRI、HindIII、XbaI、XhoI、ScaI、PvuI
I、PstIまたはBglIIで切断すると相同組換え用ターゲテ
ィングDNAに必要な相同領域として適した大きさのゲノ
ムDNA断片が得られるものと予測された（Mol. Cel. Bio
l., Vol.10,p.3675, 1990）。精製BAC DNA（２μg）
を、上記１０種類の制限酵素の各々で切断し、フェノー
ル・クロロホルム抽出並びにエタノール沈殿の操作の
後、DNAを15μlのＴＥ溶液（10mMのTris-HCl(pH7.5)、1
mMのEDTA）に溶解した。次いで、生成物（0.2μl）を、
１UのT4リガーゼを含むTris-HCl緩衝液（810μlまたは2
70μl；<組成>66mMのTris-HCl(pH7.6)、6.6mMのMgCl2、
10mMのDithiothreitol、66μMのATP）中で16℃で一晩保
温することにより、分子内連結させ環状化させた（自己
環状化）。得られた環状DNAをエタノール沈殿させ、20
μlのＴＥ溶液（10mMのTris-HCl(pH7.5)、1mMのEDTA）
中に溶解させた。
【０１１６】<2-3> 環状DNAを鋳型とした逆PCR 前記実施例で調製した環状DNA（各１μl）： （１）BamHIで切断後環状化した環状化DNA； （２）EcoRVで切断後環状化した環状化DNA； （３）EcoRIで切断後環状化した環状化DNA； （４）HindIIIで切断後環状化した環状化DNA； （５）XbaIで切断後環状化した環状化DNA； （６）XhoIで切断後環状化した環状化DNA； （７）ScaIで切断後環状化した環状化DNA； （８）PvuIIで切断後環状化した環状化DNA； （９）PstIで切断後環状化した環状化DNA；及び （10）BglIIで切断後環状化した環状化DNA、の各々をマ
ウスEPO受容体遺伝子のエクソン１の塩基配列に相補的
な一対のプライマーEpoR14（配列番号９）及びEpoR24
（配列番号10）を用いた逆PCR反応（inverse PCR；insi
de-out PCR）により増幅させた。PCR産物のクローニン
グの効率を上げるために、プライマーEpoR14の5'末端近
傍には、制限酵素PacI認識DNA配列（TTAATTAA）を付加
した。また、同様にプライマーEpoR24の5'末端近傍に
は、制限酵素NotI認識DNA配列（GCGGCCGC）を付加し
た。
ウスEPO受容体遺伝子のエクソン１の塩基配列に相補的
な一対のプライマーEpoR14（配列番号９）及びEpoR24
（配列番号10）を用いた逆PCR反応（inverse PCR；insi
de-out PCR）により増幅させた。PCR産物のクローニン
グの効率を上げるために、プライマーEpoR14の5'末端近
傍には、制限酵素PacI認識DNA配列（TTAATTAA）を付加
した。また、同様にプライマーEpoR24の5'末端近傍に
は、制限酵素NotI認識DNA配列（GCGGCCGC）を付加し
た。
【０１１７】PCRは下記の反応条件で行った。 （反応混合物組成）0.5UのLA Taqポリメラーゼ（宝酒造
製）、2.5mMのMgCl2、0.4mMのdNTP、上記一対のプライ
マー（各4μM）。全量：50μl。 （反応サイクル）94℃で１分の反応を1サイクル；94℃
で20秒及び66℃で15分の反応を14サイクル；及び94℃で
20秒及び66℃で15分（1サイクル毎に15秒の増加）の反
応を16サイクル得られたPCR産物を常法に従ってゲル電
気泳動に供した。結果を図４に示す。図４に示されると
おり、XhoIで切断後環状化した環状DNAにおいて約8kbの
DNAの増幅が認められた。さらに、該約8kbのバンドを含
むゲルからDNAを抽出し、得られたDNAをさらにXhoIで切
断して、ゲル電気泳動に供したところ、約7kbと約1kbの
２つのバンドが現れた。
製）、2.5mMのMgCl2、0.4mMのdNTP、上記一対のプライ
マー（各4μM）。全量：50μl。 （反応サイクル）94℃で１分の反応を1サイクル；94℃
で20秒及び66℃で15分の反応を14サイクル；及び94℃で
20秒及び66℃で15分（1サイクル毎に15秒の増加）の反
応を16サイクル得られたPCR産物を常法に従ってゲル電
気泳動に供した。結果を図４に示す。図４に示されると
おり、XhoIで切断後環状化した環状DNAにおいて約8kbの
DNAの増幅が認められた。さらに、該約8kbのバンドを含
むゲルからDNAを抽出し、得られたDNAをさらにXhoIで切
断して、ゲル電気泳動に供したところ、約7kbと約1kbの
２つのバンドが現れた。
【０１１８】<2-4> EPO受容体遺伝子を含むマウスゲノ
ムDNA断片のクローニング 前記実施例の結果から、XhoIで切断後環状化した環状DN
Aを鋳型としたPCRにより増幅されるPCR産物を回収する
こととした。該PCR産物を、制限酵素PacI及びNotIで切
断した後、0.7％アガロースゲル電気泳動に供し、約8.0
kbの大きさを有するバンドを含むゲルを切り出した。該
ゲルを、DNA CELL（第一化学社製）を用いた電気溶出に
供し、ゲルから、目的のEPO受容体遺伝子を含むマウス
ゲノムDNA断片を回収した。
ムDNA断片のクローニング 前記実施例の結果から、XhoIで切断後環状化した環状DN
Aを鋳型としたPCRにより増幅されるPCR産物を回収する
こととした。該PCR産物を、制限酵素PacI及びNotIで切
断した後、0.7％アガロースゲル電気泳動に供し、約8.0
kbの大きさを有するバンドを含むゲルを切り出した。該
ゲルを、DNA CELL（第一化学社製）を用いた電気溶出に
供し、ゲルから、目的のEPO受容体遺伝子を含むマウス
ゲノムDNA断片を回収した。
【０１１９】該DNA断片を、T4リガーゼを用いて、プラ
スミドp1108-Lucを制限酵素PacI及びNotIで切断して調
製した線状プラスミドDNAと連結させ、組換えプラスミ
ドpEpoRK/Iを作製した（図５）。該組換えプラスミドpE
poR K/Iで、大腸菌JM109（宝酒造製）を形質転換した。
該プラスミドp1108-Lucは、前述のプラスミドp1108（実
施例<1-4>）を制限酵素SacIで切断し、該切断部位に、
プラスミドpGL3-Basic（Promega製）から制限酵素BamHI
及びHindIIIで切り出したルシフェラーゼ遺伝子を含むD
NA断片を挿入することにより作製した（図６）。該形質
転換された大腸菌から、QUIAGEN Plasmid Maxi Kit（QU
IAGEN製）を用いて組換えプラスミドpEpoR K/Iを回収し
た。
スミドp1108-Lucを制限酵素PacI及びNotIで切断して調
製した線状プラスミドDNAと連結させ、組換えプラスミ
ドpEpoRK/Iを作製した（図５）。該組換えプラスミドpE
poR K/Iで、大腸菌JM109（宝酒造製）を形質転換した。
該プラスミドp1108-Lucは、前述のプラスミドp1108（実
施例<1-4>）を制限酵素SacIで切断し、該切断部位に、
プラスミドpGL3-Basic（Promega製）から制限酵素BamHI
及びHindIIIで切り出したルシフェラーゼ遺伝子を含むD
NA断片を挿入することにより作製した（図６）。該形質
転換された大腸菌から、QUIAGEN Plasmid Maxi Kit（QU
IAGEN製）を用いて組換えプラスミドpEpoR K/Iを回収し
た。
【０１２０】<２-5> ターゲティングＤＮＡの調製 組換えプラスミドpEpoR K/Iを制限酵素XhoIで切断し
た。得られた線状化DNAを以下の試験で用いるターゲテ
ィングDNAとして回収した。
た。得られた線状化DNAを以下の試験で用いるターゲテ
ィングDNAとして回収した。
【０１２１】<２-6> ターゲティングＤＮＡのＥＳ細胞
への導入及び相同組換え GENE Pulser（Bio-Rad社製）を用いたエレクトロポレー
ション（250V、960μF、0.4cm gap）により、マウスES
細胞（6.4×10７個；Rouxs Arch. Dev. Biol.,Vol.198,
p.48, 1989）に、前記で調製したターゲティングＤＮ
Ａ（80μg）を導入した。該ES細胞を、マイトマイシン
処理したネオマイシン耐性フィーダー細胞を蒔いてある
シャーレ（15%牛胎児血清含有D-MEM培地、10cm、10枚）
に蒔き２４時間培養した。次いで、培地を250μg/mlのG
418を含む選択培地に交換しさらに培養した。10日間の
培養により、204個のG418耐性コロニーの生育が観察さ
れた。各々のコロニーを回収し、各々個別に、D-MEM培
地（15%牛胎児血清含有）中でさらに５日間培養した。
への導入及び相同組換え GENE Pulser（Bio-Rad社製）を用いたエレクトロポレー
ション（250V、960μF、0.4cm gap）により、マウスES
細胞（6.4×10７個；Rouxs Arch. Dev. Biol.,Vol.198,
p.48, 1989）に、前記で調製したターゲティングＤＮ
Ａ（80μg）を導入した。該ES細胞を、マイトマイシン
処理したネオマイシン耐性フィーダー細胞を蒔いてある
シャーレ（15%牛胎児血清含有D-MEM培地、10cm、10枚）
に蒔き２４時間培養した。次いで、培地を250μg/mlのG
418を含む選択培地に交換しさらに培養した。10日間の
培養により、204個のG418耐性コロニーの生育が観察さ
れた。各々のコロニーを回収し、各々個別に、D-MEM培
地（15%牛胎児血清含有）中でさらに５日間培養した。
【０１２２】一部のクローンは、ゲノムDNA回収用とし
て別の96穴マイクロプレート（0.1%ゼラチン溶液で10分
間処理済み）に移しさらに３日間培養した。該96穴マイ
クロプレートから培地を除去し、プレートをリン酸緩衝
液で洗浄した。各ウェルにDNAzol（100μl；GIBCO製）
を加え十分にピペッティングした。各ウェル中のDNAサ
ンプルの各々を、0.2ml容量のPCR用マイクロチューブに
移し、エタノール（50μl）を加え、室温下で5分間静置
した。次いで、各チューブを遠心分離（3,000rpm、30分
間）にかけ、ペレットを回収した。各ペレットを、95％
エタノールで2回洗浄した後、8mMのNaOH（50μl）に溶
解した。このゲノムDNAサンプルを、後述のPCRによるス
クリーニングでの鋳型として用いた。
て別の96穴マイクロプレート（0.1%ゼラチン溶液で10分
間処理済み）に移しさらに３日間培養した。該96穴マイ
クロプレートから培地を除去し、プレートをリン酸緩衝
液で洗浄した。各ウェルにDNAzol（100μl；GIBCO製）
を加え十分にピペッティングした。各ウェル中のDNAサ
ンプルの各々を、0.2ml容量のPCR用マイクロチューブに
移し、エタノール（50μl）を加え、室温下で5分間静置
した。次いで、各チューブを遠心分離（3,000rpm、30分
間）にかけ、ペレットを回収した。各ペレットを、95％
エタノールで2回洗浄した後、8mMのNaOH（50μl）に溶
解した。このゲノムDNAサンプルを、後述のPCRによるス
クリーニングでの鋳型として用いた。
【０１２３】<1-7> 正常な相同組換えが起こった細胞
の選別 ターゲティングDNAと内在性ゲノムとの間での正常な相
同組換えによるEPO受容体遺伝子の破壊が起こっている
細胞をPCRにより選別するために、下記の一対のプライ
マーを調製した（図７）。 （１）ターゲティングDNA中に含まれるネオマイシン耐
性遺伝子の一部に相補的なプライマー：neo24（配列番
号11）。 （２）該ターゲティングDNAが正常な相同組換えにより
内在性ゲノムに組み込まれた場合の該ターゲティングDN
Aの末端のさらに外側の内在性ゲノムの一部の塩基配列
に相補的なプライマー：EpoR27（配列番号12）。該プラ
イマーを用いたPCRにより増幅が期待されるDNAの大きさ
は、1,357bpである。各々の組換えES細胞クローンにつ
いて、下記条件でPCRを行った。
の選別 ターゲティングDNAと内在性ゲノムとの間での正常な相
同組換えによるEPO受容体遺伝子の破壊が起こっている
細胞をPCRにより選別するために、下記の一対のプライ
マーを調製した（図７）。 （１）ターゲティングDNA中に含まれるネオマイシン耐
性遺伝子の一部に相補的なプライマー：neo24（配列番
号11）。 （２）該ターゲティングDNAが正常な相同組換えにより
内在性ゲノムに組み込まれた場合の該ターゲティングDN
Aの末端のさらに外側の内在性ゲノムの一部の塩基配列
に相補的なプライマー：EpoR27（配列番号12）。該プラ
イマーを用いたPCRにより増幅が期待されるDNAの大きさ
は、1,357bpである。各々の組換えES細胞クローンにつ
いて、下記条件でPCRを行った。
【０１２４】（反応混合物組成）１UのTaqポリメラー
ゼ、1.5mMのMgCl2、0.25mMのdNTP、上記一対のプライマ
ー（各0.4μM）。全量：25μl。 （反応サイクル）94℃で５分の反応を1サイクル；94℃
で30秒、55℃で30秒、及び72℃で3分の反応を35サイク
ル；及び72℃で10分を1サイクル。得られたPCR産物を常
法に従ってゲル電気泳動に供した。その結果204クロー
ン中、１つのES細胞クローン（No.20）で、期待される
1,357bpの大きさのバンドが認められた。
ゼ、1.5mMのMgCl2、0.25mMのdNTP、上記一対のプライマ
ー（各0.4μM）。全量：25μl。 （反応サイクル）94℃で５分の反応を1サイクル；94℃
で30秒、55℃で30秒、及び72℃で3分の反応を35サイク
ル；及び72℃で10分を1サイクル。得られたPCR産物を常
法に従ってゲル電気泳動に供した。その結果204クロー
ン中、１つのES細胞クローン（No.20）で、期待される
1,357bpの大きさのバンドが認められた。
【０１２５】<2-8> 正常な相同組換えの確認 該組換えES細胞（No.20）について、染色体サザンハイ
ブリダイゼーションを行った。なお、対照としてターゲ
ティングDNAを導入していない野生型ES細胞を用いた。
各々の細胞のゲノムDNAを、既報に従って精製した（Am.
J. Hum. Genet., Vol.36, p.546, 1984）。該精製ゲノ
ムDNAを、５種類の制限酵素（BamHI、BglII、HindIII及
びPvuII）で切断して得られるゲノムDNA断片（10μg）
を、0.8％アガロースゲル電気泳動に供し、アルカリ
（0.25MのHCl及び0.4MのNaOH）で処理した後、Hybond N
+membrane（Amersham社製）に転写した。ハイブリダイ
ゼーションプローブ作製のために、該ターゲティングDN
AのDNA配列を基に設計した一対のプライマーEpoR16（配
列番号13）及びEpoR28（配列番号14）を用いて該ターゲ
ティングDNAを鋳型としてPCRを行った。該PCRにより得
られた約1kbpのDNA断片をランダムプライム法より(α-
32P)dCTPで放射性標識してハイブリダイゼーションプロ
ーブとした。
ブリダイゼーションを行った。なお、対照としてターゲ
ティングDNAを導入していない野生型ES細胞を用いた。
各々の細胞のゲノムDNAを、既報に従って精製した（Am.
J. Hum. Genet., Vol.36, p.546, 1984）。該精製ゲノ
ムDNAを、５種類の制限酵素（BamHI、BglII、HindIII及
びPvuII）で切断して得られるゲノムDNA断片（10μg）
を、0.8％アガロースゲル電気泳動に供し、アルカリ
（0.25MのHCl及び0.4MのNaOH）で処理した後、Hybond N
+membrane（Amersham社製）に転写した。ハイブリダイ
ゼーションプローブ作製のために、該ターゲティングDN
AのDNA配列を基に設計した一対のプライマーEpoR16（配
列番号13）及びEpoR28（配列番号14）を用いて該ターゲ
ティングDNAを鋳型としてPCRを行った。該PCRにより得
られた約1kbpのDNA断片をランダムプライム法より(α-
32P)dCTPで放射性標識してハイブリダイゼーションプロ
ーブとした。
【０１２６】ハイブリダイゼーションは、該メンブレン
を、プローブ（0.5ng/ml）を加えたハイブリダイゼーシ
ョンバッファー（6×SSC、５×Denhardt溶液、0.5％SD
S、100μg/mlのSalmon sperm DNA）中で65℃で一晩保温
することにより行った。なお、プレハイブリダイゼーシ
ョンは、同バッファー中で65℃で2時間行った。次い
で、メンブレンを、65℃で、2×SSC（standard salinec
itrate; 0.15M NaCl, 0.015M Na-Citrate）/0.1％SDSで
20分、1×SSC/0.1%SDSで20分、及び0.1×SSC/0.1%SDSで
20分の操作で各々2回づつ洗浄した。次いで、メンブレ
ンを、Imaging plate（富士写真フィルム社製）に露出
させた。解析はBAS2000（富士写真フィルム社製）で行
った。結果を図８に示す。組換えES細胞（No.20)で正常
な相同組換えによるジーンタゲティングが起こっていれ
ば、本サザンハイブリダイゼションで観察が期待される
DNAの大きさは下記のとおりである（図８(a)）。 （１）BamHIで切断したゲノムDNA断片： 約7.2kb （２）BglIIで切断したゲノムDNA断片： 約3.0kb （３）HindIIIで切断したゲノムDNA断片： 約11.8kb （４）PvuIIで切断したゲノムDNA断片： 約4.2kb 野生型ES細胞の場合には、下記とおりである。 （１）BamHIで切断したゲノムDNA断片： 約3.5kb （２）BglIIで切断したゲノムDNA断片： 約3.5kb （３）HindIIIで切断したゲノムDNA断片： 約4.3kb （４）PvuIIで切断したゲノムDNA断片： 約3.8kb 図８(b)に示されるとおり、組換えES細胞（No.20)にお
いては、いずれの制限酵素で切断した場合にも期待され
る大きさのDNAのバンドが検出された。この結果から、
本実施例で作製された相同組換え用ターゲティングDNA
が、内在性ゲノムとの正常な相同組換えにより、マウス
ES細胞中の内在性EPO受容体遺伝子を破壊したことが確
認された。
を、プローブ（0.5ng/ml）を加えたハイブリダイゼーシ
ョンバッファー（6×SSC、５×Denhardt溶液、0.5％SD
S、100μg/mlのSalmon sperm DNA）中で65℃で一晩保温
することにより行った。なお、プレハイブリダイゼーシ
ョンは、同バッファー中で65℃で2時間行った。次い
で、メンブレンを、65℃で、2×SSC（standard salinec
itrate; 0.15M NaCl, 0.015M Na-Citrate）/0.1％SDSで
20分、1×SSC/0.1%SDSで20分、及び0.1×SSC/0.1%SDSで
20分の操作で各々2回づつ洗浄した。次いで、メンブレ
ンを、Imaging plate（富士写真フィルム社製）に露出
させた。解析はBAS2000（富士写真フィルム社製）で行
った。結果を図８に示す。組換えES細胞（No.20)で正常
な相同組換えによるジーンタゲティングが起こっていれ
ば、本サザンハイブリダイゼションで観察が期待される
DNAの大きさは下記のとおりである（図８(a)）。 （１）BamHIで切断したゲノムDNA断片： 約7.2kb （２）BglIIで切断したゲノムDNA断片： 約3.0kb （３）HindIIIで切断したゲノムDNA断片： 約11.8kb （４）PvuIIで切断したゲノムDNA断片： 約4.2kb 野生型ES細胞の場合には、下記とおりである。 （１）BamHIで切断したゲノムDNA断片： 約3.5kb （２）BglIIで切断したゲノムDNA断片： 約3.5kb （３）HindIIIで切断したゲノムDNA断片： 約4.3kb （４）PvuIIで切断したゲノムDNA断片： 約3.8kb 図８(b)に示されるとおり、組換えES細胞（No.20)にお
いては、いずれの制限酵素で切断した場合にも期待され
る大きさのDNAのバンドが検出された。この結果から、
本実施例で作製された相同組換え用ターゲティングDNA
が、内在性ゲノムとの正常な相同組換えにより、マウス
ES細胞中の内在性EPO受容体遺伝子を破壊したことが確
認された。
【０１２７】<2-9> 正常な相同組換えが起こった細胞
の選別 ターゲティングDNAと内在性ゲノムとの間での正常な相
同組換えによるEPO受容体遺伝子の破壊が起こっている
細胞をPCRにより選別方法を、前記実施例<2-7>に記載し
た。下記に示す選別方法は、下記の実験的事実に着目し
た別の有用な選別方法である。ターゲティングＤＮＡが
正しい相同組換えにより標的ＤＮＡ配列中に組み込まれ
た場合には、該ターゲティングＤＮＡは末端配列を欠落
することなく組み込まれている。しかしながら、ランダ
ムインテグレーション（random integration）のよう
に、ターゲティングＤＮＡが、標的ＤＮＡ配列以外の部
位あるいは誤った形で内在性ゲノムＤＮＡに組み込まれ
た場合には、組み込まれたターゲティングＤＮＡは、か
なり高い確率でその末端配列を欠落している。従って、
組換え細胞の内在性ゲノムＤＮＡ中に組み込まれたター
ゲティングＤＮＡの末端配列の有無をPCRにより解析す
ることにより極めて高い精度で正常な相同組換えが起こ
った組換え細胞の選別が可能である。本方法による選別
の結果を下記に示す。
の選別 ターゲティングDNAと内在性ゲノムとの間での正常な相
同組換えによるEPO受容体遺伝子の破壊が起こっている
細胞をPCRにより選別方法を、前記実施例<2-7>に記載し
た。下記に示す選別方法は、下記の実験的事実に着目し
た別の有用な選別方法である。ターゲティングＤＮＡが
正しい相同組換えにより標的ＤＮＡ配列中に組み込まれ
た場合には、該ターゲティングＤＮＡは末端配列を欠落
することなく組み込まれている。しかしながら、ランダ
ムインテグレーション（random integration）のよう
に、ターゲティングＤＮＡが、標的ＤＮＡ配列以外の部
位あるいは誤った形で内在性ゲノムＤＮＡに組み込まれ
た場合には、組み込まれたターゲティングＤＮＡは、か
なり高い確率でその末端配列を欠落している。従って、
組換え細胞の内在性ゲノムＤＮＡ中に組み込まれたター
ゲティングＤＮＡの末端配列の有無をPCRにより解析す
ることにより極めて高い精度で正常な相同組換えが起こ
った組換え細胞の選別が可能である。本方法による選別
の結果を下記に示す。
【０１２８】下記の一対のPCR用プライマーを調製し
た。 （１）ターゲティングDNA中に含まれるネオマイシン耐
性遺伝子の一部に相補的なプライマー：neo24（配列番
号11）。 （２）該ターゲティングDNAの一方の末端配列（XhoIに
よる切断末端DNA配列を含む）に相補的なプライマー：E
poR21（配列番号８）。該プライマーを用いたPCRにより
増幅が期待されるDNAの大きさは、1,146bpである。各々
の組換えES細胞クローン（実施例<2-6>）について、下
記条件でPCRを行った。
た。 （１）ターゲティングDNA中に含まれるネオマイシン耐
性遺伝子の一部に相補的なプライマー：neo24（配列番
号11）。 （２）該ターゲティングDNAの一方の末端配列（XhoIに
よる切断末端DNA配列を含む）に相補的なプライマー：E
poR21（配列番号８）。該プライマーを用いたPCRにより
増幅が期待されるDNAの大きさは、1,146bpである。各々
の組換えES細胞クローン（実施例<2-6>）について、下
記条件でPCRを行った。
【０１２９】（反応混合物組成）0.5UのTaqポリメラー
ゼ、0.25mMのdNTP、上記一対のプライマー（各0.4μ
M）。全量：25μl。 （反応サイクル）95℃で2分の反応を1サイクル；95℃で
30秒、55℃で30秒、及び72℃で２分の反応を35サイク
ル；及び72℃で10分を1サイクル。得られたPCR産物を常
法に従ってゲル電気泳動に供した。その結果192クロー
ン中、28個のES細胞クローンで、期待される1,146bpの
大きさのバンドが認められた。ターゲティングDNAの片
方の末端配列を保持するクローンは、約14％であった。
前記（２）に記載のプライマーEpoR-21の代わりに該タ
ーゲティングDNAのもう一方の末端配列に相補的なプラ
イマーを用いて上記と同様にPCRを行った場合にも、同
様の陽性率になることが予想される。従って、内在性ゲ
ノムに組み込まれた該ターゲティングDNAが、導入され
たターゲティングDNAの両方の末端配列を有することをP
CRで確認することにより、正常な相同組換えが起こった
細胞を約100倍（0.14×0.14=約0.02、即ち2％）に濃縮
可能である。
ゼ、0.25mMのdNTP、上記一対のプライマー（各0.4μ
M）。全量：25μl。 （反応サイクル）95℃で2分の反応を1サイクル；95℃で
30秒、55℃で30秒、及び72℃で２分の反応を35サイク
ル；及び72℃で10分を1サイクル。得られたPCR産物を常
法に従ってゲル電気泳動に供した。その結果192クロー
ン中、28個のES細胞クローンで、期待される1,146bpの
大きさのバンドが認められた。ターゲティングDNAの片
方の末端配列を保持するクローンは、約14％であった。
前記（２）に記載のプライマーEpoR-21の代わりに該タ
ーゲティングDNAのもう一方の末端配列に相補的なプラ
イマーを用いて上記と同様にPCRを行った場合にも、同
様の陽性率になることが予想される。従って、内在性ゲ
ノムに組み込まれた該ターゲティングDNAが、導入され
たターゲティングDNAの両方の末端配列を有することをP
CRで確認することにより、正常な相同組換えが起こった
細胞を約100倍（0.14×0.14=約0.02、即ち2％）に濃縮
可能である。
【０１３０】<2-10> EPO受容体ノックインマウスの作
製 実施例<2-8>で得た内在性EPO受容体遺伝子がされたES細
胞（ノックアウトES細胞）を、C57BL/6マウス（チャー
ルズリバー製）の雄雌を交配して得た胚盤胞に１胚あた
り10乃至15個ずつ注入（マイクロインジェクション）し
た。注入直後に、偽妊娠処理してから3.5日目の仮親ICR
マウス（19匹；チャールズリバー製）の子宮に子宮の片
側あたり約10個ずつの胚盤胞を移植した。その結果、合
計40匹の産児を得、その内の25匹が目的のキメラマウス
でった。毛色への貢献度が70％以上のキメラマウスは、
18匹であった。次いで得られたキメラマウス（雄）を正
常C57BL/6マウス（雌）と交配し、ES細胞由来の毛色遺
伝子によるアグーチ（agouti）色のマウス（一対の染色
体内の一方の染色体上のEPO受容体遺伝子が破壊された
ヘテロノックアウトマウス）を得た。得られた雌雄のヘ
テロマウスを交配し、一対の染色体の両方に存在するEP
O受容体遺伝子が破壊されたホモノックアウトマウスを
得た。
製 実施例<2-8>で得た内在性EPO受容体遺伝子がされたES細
胞（ノックアウトES細胞）を、C57BL/6マウス（チャー
ルズリバー製）の雄雌を交配して得た胚盤胞に１胚あた
り10乃至15個ずつ注入（マイクロインジェクション）し
た。注入直後に、偽妊娠処理してから3.5日目の仮親ICR
マウス（19匹；チャールズリバー製）の子宮に子宮の片
側あたり約10個ずつの胚盤胞を移植した。その結果、合
計40匹の産児を得、その内の25匹が目的のキメラマウス
でった。毛色への貢献度が70％以上のキメラマウスは、
18匹であった。次いで得られたキメラマウス（雄）を正
常C57BL/6マウス（雌）と交配し、ES細胞由来の毛色遺
伝子によるアグーチ（agouti）色のマウス（一対の染色
体内の一方の染色体上のEPO受容体遺伝子が破壊された
ヘテロノックアウトマウス）を得た。得られた雌雄のヘ
テロマウスを交配し、一対の染色体の両方に存在するEP
O受容体遺伝子が破壊されたホモノックアウトマウスを
得た。
【０１３１】実施例３ ＧＮ遺伝子ノックアウトマウス
の作製 <3-1> マウスゲノムDNAライブラリーの作製 実施例<1-1>及び実施例<2-1>と同様に、マウスＧＮ蛋白
（cDNA：配列番号15；アミノ酸配列：配列番号16）をコ
ードする遺伝子を保持するマウスゲノムＤＮＡ断片を、
市販のマウスゲノムDNAのBACライブラリーであるDOWN T
O THE WELL MOUSE ES BAC DNA POOL（Genome Systems社
製）をスクリーニングすることにより得た。該マウスＧ
Ｎ蛋白をコードするの塩基配列を基に作製した該塩基配
列の一部に相補的な一対のPCRプライマーを用いて、全
ての混合サンプルチューブの各々について実施例<1-1>
及び実施例<2-1>と同様の条件ででPCR行った。得られた
PCR産物を、常法に従ってゲル電気泳動に供し、ゲル上
に現れるバンドの大きさから、期待される塩基長を有す
るDNAの増幅が見られる混合サンプルチューブを同定し
た。その結果、221H03、231G13、及び41D14という番号
が付されたウェル中の3つのBACクローン中にマウスGN遺
伝子を含むゲノムDNA断片がクローニングされているこ
とが判明した。当該BACクローンを、Genome Systems社
より購入した。
の作製 <3-1> マウスゲノムDNAライブラリーの作製 実施例<1-1>及び実施例<2-1>と同様に、マウスＧＮ蛋白
（cDNA：配列番号15；アミノ酸配列：配列番号16）をコ
ードする遺伝子を保持するマウスゲノムＤＮＡ断片を、
市販のマウスゲノムDNAのBACライブラリーであるDOWN T
O THE WELL MOUSE ES BAC DNA POOL（Genome Systems社
製）をスクリーニングすることにより得た。該マウスＧ
Ｎ蛋白をコードするの塩基配列を基に作製した該塩基配
列の一部に相補的な一対のPCRプライマーを用いて、全
ての混合サンプルチューブの各々について実施例<1-1>
及び実施例<2-1>と同様の条件ででPCR行った。得られた
PCR産物を、常法に従ってゲル電気泳動に供し、ゲル上
に現れるバンドの大きさから、期待される塩基長を有す
るDNAの増幅が見られる混合サンプルチューブを同定し
た。その結果、221H03、231G13、及び41D14という番号
が付されたウェル中の3つのBACクローン中にマウスGN遺
伝子を含むゲノムDNA断片がクローニングされているこ
とが判明した。当該BACクローンを、Genome Systems社
より購入した。
【０１３２】Genome Systems社より購入した３つのBAC
クローン（221H03、231G13、及び41D14）を、４塩基認
識制限酵素HaeIII、AluI及びRsaIの各々で部分消化して
マウスゲノムDNA断片を調製した。該ゲノムDNA断片を、
アガロースゲル電気泳動に供して、約６乃至８Kbの塩基
長を有する複数のゲノムDNA断片を回収した。該ゲノムD
NA断片の各々を、制限酵素EcoRVで処理して線状化した
プラスミドp1511-1とT4リガーゼを用いて連結した。得
られたマウスゲノムDNA断片挿入プラスミドp1511-1の各
々で大腸菌JM109を形質転換し、アガロースプレートに
蒔きコロニーを形成させた。各々のクローンを96穴マイ
クロプレート（2枚）の各ウェルに移して、マウスゲノ
ムDNAライブラリーとした。
クローン（221H03、231G13、及び41D14）を、４塩基認
識制限酵素HaeIII、AluI及びRsaIの各々で部分消化して
マウスゲノムDNA断片を調製した。該ゲノムDNA断片を、
アガロースゲル電気泳動に供して、約６乃至８Kbの塩基
長を有する複数のゲノムDNA断片を回収した。該ゲノムD
NA断片の各々を、制限酵素EcoRVで処理して線状化した
プラスミドp1511-1とT4リガーゼを用いて連結した。得
られたマウスゲノムDNA断片挿入プラスミドp1511-1の各
々で大腸菌JM109を形質転換し、アガロースプレートに
蒔きコロニーを形成させた。各々のクローンを96穴マイ
クロプレート（2枚）の各ウェルに移して、マウスゲノ
ムDNAライブラリーとした。
【０１３３】<3-2> マウスGN遺伝子を含むプラスミド
クローンの同定、選別 実施例<1-1>及び実施例<2-1>の方法と同様にして、前記
実施例で調製したマウスゲノムDNAライブラリーである
各々のウェルにセットされた各々の環状DNA（プラスミ
ドマウスゲノムDNA）を、マウスGN遺伝子の塩基配列に
相補的な一対のプライマーNY-C-F2（フォーワードプラ
イマー：配列番号17）及びNY-S-R4（リバースプライマ
ー：配列番号18）を用いたPCR反応（通常の内向きのPC
R）により増幅させた。得られたPCR産物を常法に従って
ゲル電気泳動に供した。その結果、マウスGN遺伝子を含
むマウスゲノムDNAを保持するクローンとして下記10個
のクローンが選別された（図17）。 ＜クローン名＞ ＜BACの由来＞ ＜４塩基認識制限酵素＞ (1)p1561 231G13 AluI (2)p1562 231G13 RsaI (3)p1563 231G13 HaeIII (4)p1564 231G13 HaeIII (5)p1565 221H03 HaeIII (6)p1566 221H03 RsaI (7)p1567 221H03 AluI (8)p1568 41D14 AluI (9)p1569 41D14 AluI (10)p1570 41D14 AluI
クローンの同定、選別 実施例<1-1>及び実施例<2-1>の方法と同様にして、前記
実施例で調製したマウスゲノムDNAライブラリーである
各々のウェルにセットされた各々の環状DNA（プラスミ
ドマウスゲノムDNA）を、マウスGN遺伝子の塩基配列に
相補的な一対のプライマーNY-C-F2（フォーワードプラ
イマー：配列番号17）及びNY-S-R4（リバースプライマ
ー：配列番号18）を用いたPCR反応（通常の内向きのPC
R）により増幅させた。得られたPCR産物を常法に従って
ゲル電気泳動に供した。その結果、マウスGN遺伝子を含
むマウスゲノムDNAを保持するクローンとして下記10個
のクローンが選別された（図17）。 ＜クローン名＞ ＜BACの由来＞ ＜４塩基認識制限酵素＞ (1)p1561 231G13 AluI (2)p1562 231G13 RsaI (3)p1563 231G13 HaeIII (4)p1564 231G13 HaeIII (5)p1565 221H03 HaeIII (6)p1566 221H03 RsaI (7)p1567 221H03 AluI (8)p1568 41D14 AluI (9)p1569 41D14 AluI (10)p1570 41D14 AluI
【０１３４】<3-3> 環状プラスミドマウスゲノムDNAを
鋳型とした逆ＰＣＲ 前記で選別されたマウスGN遺伝子を含むマウスゲノムDN
Aを保持する環状プラスミドDNAの各々を鋳型として、マ
ウスGN遺伝子の塩基配列に相補的な一対のプライマーNY
-5'-PF3（フォーワードプライマー：配列番号19）及びN
Y-5'-PR3（リバースプライマー：配列番号20）を用いた
逆PCR反応（Inverse PCR; Inverted PCR; inside-out P
CR）により増幅させた。なお、PCR産物のクローニング
の効率を上げるために、上記各々のプライマーの5'末端
側近傍には制限酵素PacI認識DNA配列（TTAATTAA）を付
加した。また、PCRは下記の反応条件で行った。 （反応混合物組成）2.5UのLA Taqポリメラーゼ（宝酒造
製）、400μM−15μMのdNTP、上記一対のプライマー
（各15mM）、X2GC緩衝液。 （反応サイクル）95℃で１分、95℃で30秒及び65℃で10
分の反応を５サイクル。得られた各々のPCR産物を制限
酵素PacIで処理した後、常法に従ってゲル電気泳動で分
画し、各々のDNA断片を回収した。
鋳型とした逆ＰＣＲ 前記で選別されたマウスGN遺伝子を含むマウスゲノムDN
Aを保持する環状プラスミドDNAの各々を鋳型として、マ
ウスGN遺伝子の塩基配列に相補的な一対のプライマーNY
-5'-PF3（フォーワードプライマー：配列番号19）及びN
Y-5'-PR3（リバースプライマー：配列番号20）を用いた
逆PCR反応（Inverse PCR; Inverted PCR; inside-out P
CR）により増幅させた。なお、PCR産物のクローニング
の効率を上げるために、上記各々のプライマーの5'末端
側近傍には制限酵素PacI認識DNA配列（TTAATTAA）を付
加した。また、PCRは下記の反応条件で行った。 （反応混合物組成）2.5UのLA Taqポリメラーゼ（宝酒造
製）、400μM−15μMのdNTP、上記一対のプライマー
（各15mM）、X2GC緩衝液。 （反応サイクル）95℃で１分、95℃で30秒及び65℃で10
分の反応を５サイクル。得られた各々のPCR産物を制限
酵素PacIで処理した後、常法に従ってゲル電気泳動で分
画し、各々のDNA断片を回収した。
【０１３５】<3-4> DNA断片の大腸菌内での増幅 前記実施例で回収した各々のDNA断片（マウスGN遺伝子
を含むマウスゲノムDNAを保持する各々の線状化プラス
ミドDNA）を、T4リガーゼを用いて自己環状化（分子内
連結）した後、該各々のDNA断片により大腸菌JM109を形
質転換した後、アガロースプレートに蒔いて培養しコロ
ニーを形成させた。生育した各々のコロニーから各々の
プラスミドDNAを回収した。各々のプラスミドDNAを制限
酵素（KpnI、SalI、XhoI、PvuI）で消化した後常法に従
って電気泳動に供して制限酵素地図を作製した。実施例
<3-2>で得た10種類のDNA断片の内の６種類のDNA断片（p
1571, p1572, p1573, p1574, p1575, p1576）に由来す
るプラスミドDNA（各々p1561, p1562, p1564, p1565, p
1566, p1568と命名）についての結果を、図18に示す。
を含むマウスゲノムDNAを保持する各々の線状化プラス
ミドDNA）を、T4リガーゼを用いて自己環状化（分子内
連結）した後、該各々のDNA断片により大腸菌JM109を形
質転換した後、アガロースプレートに蒔いて培養しコロ
ニーを形成させた。生育した各々のコロニーから各々の
プラスミドDNAを回収した。各々のプラスミドDNAを制限
酵素（KpnI、SalI、XhoI、PvuI）で消化した後常法に従
って電気泳動に供して制限酵素地図を作製した。実施例
<3-2>で得た10種類のDNA断片の内の６種類のDNA断片（p
1571, p1572, p1573, p1574, p1575, p1576）に由来す
るプラスミドDNA（各々p1561, p1562, p1564, p1565, p
1566, p1568と命名）についての結果を、図18に示す。
【０１３６】<3-5> プラスミドDNAへの外来性遺伝子の
挿入 前記で得た６種類のプラスミドDNAの各々を制限酵素Pac
Iで切断し後BAP処理した線状化プラスミドDNAの各々
に、ルシフェラーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子
を有するDNAカセットをT4リガーゼを用いて連結し再環
状化しプラスミドDNAを調製した。該各々のプラスミド
で大腸菌JM109を形質転換し、アガロースプレートに蒔
きコロニーを形成させた。生育した各々のコロニーから
各々のプラスミドDNAを回収した。各々のプラスミドDNA
を制限酵素（SpeI, EcoRI, MluI）またはRNaseで消化し
た後常法に従って電気泳動に供して制限酵素地図を作製
した。実施例<3-4>で得た10種類のプラスミドDNAの内の
４種類のDNA断片（p1572, p1574, p1575, p1576）に由
来するプラスミドDNA（各々p1577, p1578, p1580, p157
9と命名）についての結果を、図19に示す。各々のプラ
スミドDNA（p1577, p1578, p1580, p1579）をベクターD
NA中の制限酵素部位（プラスミドp1511-1中の制限酵素
部位）で切断して線状化することによりマウスGN遺伝子
のターゲティングDNAを得た。このターゲティングDNA
を、以下の試験で用いるマウスGN遺伝子のターゲティン
グDNAとして用いた。
挿入 前記で得た６種類のプラスミドDNAの各々を制限酵素Pac
Iで切断し後BAP処理した線状化プラスミドDNAの各々
に、ルシフェラーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子
を有するDNAカセットをT4リガーゼを用いて連結し再環
状化しプラスミドDNAを調製した。該各々のプラスミド
で大腸菌JM109を形質転換し、アガロースプレートに蒔
きコロニーを形成させた。生育した各々のコロニーから
各々のプラスミドDNAを回収した。各々のプラスミドDNA
を制限酵素（SpeI, EcoRI, MluI）またはRNaseで消化し
た後常法に従って電気泳動に供して制限酵素地図を作製
した。実施例<3-4>で得た10種類のプラスミドDNAの内の
４種類のDNA断片（p1572, p1574, p1575, p1576）に由
来するプラスミドDNA（各々p1577, p1578, p1580, p157
9と命名）についての結果を、図19に示す。各々のプラ
スミドDNA（p1577, p1578, p1580, p1579）をベクターD
NA中の制限酵素部位（プラスミドp1511-1中の制限酵素
部位）で切断して線状化することによりマウスGN遺伝子
のターゲティングDNAを得た。このターゲティングDNA
を、以下の試験で用いるマウスGN遺伝子のターゲティン
グDNAとして用いた。
【０１３７】実施例４ マウスHE4全長をコードするｃD
NAの単離 ヒトのHE4タンパク（Human epididymis-specific prote
in; Biol. Reprod., Vol.45, No.2, p.350-357, 1991）
のホモログと推定される新規なマウスHE4タンパクの全
長をコードするｃDNAを単離し、その塩基配列及びアミ
ノ酸配列を決定した。ヒトHE4タンパクをコードするDNA
の塩基配列の相同性を有するマウスEST（expressed seq
uence tag）を得た（配列番号21）。市販のマウス腎臓c
DNAライブラリー（TaKaRa製）に含まれるcDNAクローン
を原料として、１つのウェルにつき約5,000種類のcDNA
クローンを48穴マイクロプレートの各々のウェルにセッ
トして新たなマウス腎臓cDNAライブラリーを作製した。
このcDNAライブラリーの各々のウェルにセットされたcD
NAクローンを鋳型として、前記のマウスESTの塩基配列
に相補的な一対のプライマーHE4-F2（フォーワードプラ
イマー：配列番号22）及びHE4-R2（リバースプライマ
ー：配列番号23）を用いた逆PCR反応（Inverse PCR; In
verted PCR; inside-out PCR）により遺伝子増幅を行っ
た。
NAの単離 ヒトのHE4タンパク（Human epididymis-specific prote
in; Biol. Reprod., Vol.45, No.2, p.350-357, 1991）
のホモログと推定される新規なマウスHE4タンパクの全
長をコードするｃDNAを単離し、その塩基配列及びアミ
ノ酸配列を決定した。ヒトHE4タンパクをコードするDNA
の塩基配列の相同性を有するマウスEST（expressed seq
uence tag）を得た（配列番号21）。市販のマウス腎臓c
DNAライブラリー（TaKaRa製）に含まれるcDNAクローン
を原料として、１つのウェルにつき約5,000種類のcDNA
クローンを48穴マイクロプレートの各々のウェルにセッ
トして新たなマウス腎臓cDNAライブラリーを作製した。
このcDNAライブラリーの各々のウェルにセットされたcD
NAクローンを鋳型として、前記のマウスESTの塩基配列
に相補的な一対のプライマーHE4-F2（フォーワードプラ
イマー：配列番号22）及びHE4-R2（リバースプライマ
ー：配列番号23）を用いた逆PCR反応（Inverse PCR; In
verted PCR; inside-out PCR）により遺伝子増幅を行っ
た。
【０１３８】PCRは下記の反応条件で行った。 （反応混合物組成）2.5UのLA Taqポリメラーゼ（宝酒造
製）、0.4mMのdNTP、上記一対のプライマー（各50m
M）、X2GC緩衝液。 （反応サイクル）95℃で１分、95℃で30秒及び65℃で12
分の反応を16サイクル；95℃で30秒、65℃で12分（1サ
イクル毎に15秒の増加）の反応を13サイクル；及び、72
℃で10分の反応を１サイクル。得られた各々のPCR産物
を常法に従ってゲル電気泳動に供した。その結果、複数
のウェルのcDNAクローンで約６KbのDNAの増幅が認めら
れた（図20）。特に顕著な遺伝子増幅が認められた３つ
のクローン（A1、C5及びD5)のPCR産物を回収し、S-400
スピンカラムを用いて精製した後、各々のcDNAクローン
の塩基配列を決定し、マウスHE4の全長をコードするcDN
A（ORFを含む）を得た（cDNA配列：配列番号24、アミノ
酸配列：配列番号25）。
製）、0.4mMのdNTP、上記一対のプライマー（各50m
M）、X2GC緩衝液。 （反応サイクル）95℃で１分、95℃で30秒及び65℃で12
分の反応を16サイクル；95℃で30秒、65℃で12分（1サ
イクル毎に15秒の増加）の反応を13サイクル；及び、72
℃で10分の反応を１サイクル。得られた各々のPCR産物
を常法に従ってゲル電気泳動に供した。その結果、複数
のウェルのcDNAクローンで約６KbのDNAの増幅が認めら
れた（図20）。特に顕著な遺伝子増幅が認められた３つ
のクローン（A1、C5及びD5)のPCR産物を回収し、S-400
スピンカラムを用いて精製した後、各々のcDNAクローン
の塩基配列を決定し、マウスHE4の全長をコードするcDN
A（ORFを含む）を得た（cDNA配列：配列番号24、アミノ
酸配列：配列番号25）。
【０１３９】
【発明の効果】本発明は、種々生物（マウス等の非ヒト
哺乳動物、植物、細菌またはウイルスなど）の内在性ゲ
ノム中の標的DNA配列（例えば、特定の蛋白をコードす
る遺伝子など）を相同組換えにより修飾（置換、欠失あ
るいは挿入など）に用いられるターゲティングDNAの新
規且つ有用な製造方法、該製造方法を用いて作製される
ターゲティングDNA、該ターゲティングDNAを用いること
を特徴とする組換え細胞（ノックアウト細胞あるいはノ
ックイン細胞など）、該ターゲティングDNAを用いるこ
とを特徴とする組換え生物（ノックアウトマウスやノッ
クインマウスに代表されるような組換え非ヒト哺乳動
物、組換え細菌及び組換えウイルスなど）の製造方法、
該ターゲティングＤＮＡの製造において有用なゲノムＤ
ＮＡライブラリー、並びにｃＤＮＡライブラリーから所
望のｃＤＮＡを保持するクローンを同定し取得する方法
（スクリーニング方法）に関する。
哺乳動物、植物、細菌またはウイルスなど）の内在性ゲ
ノム中の標的DNA配列（例えば、特定の蛋白をコードす
る遺伝子など）を相同組換えにより修飾（置換、欠失あ
るいは挿入など）に用いられるターゲティングDNAの新
規且つ有用な製造方法、該製造方法を用いて作製される
ターゲティングDNA、該ターゲティングDNAを用いること
を特徴とする組換え細胞（ノックアウト細胞あるいはノ
ックイン細胞など）、該ターゲティングDNAを用いるこ
とを特徴とする組換え生物（ノックアウトマウスやノッ
クインマウスに代表されるような組換え非ヒト哺乳動
物、組換え細菌及び組換えウイルスなど）の製造方法、
該ターゲティングＤＮＡの製造において有用なゲノムＤ
ＮＡライブラリー、並びにｃＤＮＡライブラリーから所
望のｃＤＮＡを保持するクローンを同定し取得する方法
（スクリーニング方法）に関する。
【０１４０】本発明のターゲティングDNAの製造方法を
用いれば、従来のターゲティングDNAの製造方法が有し
ていた前述のような種々の問題点を改善し、相同組換え
用ターゲティングDNAの作製に必要な時間及び労力を大
幅に低減することが可能であり、極めて簡便にターゲテ
ィングDNAを作製することができる。またその結果とし
て、ターゲティングベクターの製造に必要なコストを大
幅に低減することができる。即ち、本発明の方法を用い
れば、下記のような簡便性を有する結果、従来法による
ターゲティングＤＮＡの製造に要していた約３ヶ月とい
う製造期間を最短で約２週間に短縮することが可能であ
る。： （１）標的ＤＮＡ配列を含む内在性ゲノムＤＮＡ断片の
取得に、時間と労力を要するプラークハイブリダイゼー
ション法を行う必要がない。 （２）プラークハイブリダーゼーションの実施に必須で
ある放射性物質とＲＩ（放射性同位体）管理施設等の特
殊な試薬及び施設の使用を必要としない。 （３）多大な時間と労力を必要とする内在性ゲノムＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図の作成を行う必要がない。
用いれば、従来のターゲティングDNAの製造方法が有し
ていた前述のような種々の問題点を改善し、相同組換え
用ターゲティングDNAの作製に必要な時間及び労力を大
幅に低減することが可能であり、極めて簡便にターゲテ
ィングDNAを作製することができる。またその結果とし
て、ターゲティングベクターの製造に必要なコストを大
幅に低減することができる。即ち、本発明の方法を用い
れば、下記のような簡便性を有する結果、従来法による
ターゲティングＤＮＡの製造に要していた約３ヶ月とい
う製造期間を最短で約２週間に短縮することが可能であ
る。： （１）標的ＤＮＡ配列を含む内在性ゲノムＤＮＡ断片の
取得に、時間と労力を要するプラークハイブリダイゼー
ション法を行う必要がない。 （２）プラークハイブリダーゼーションの実施に必須で
ある放射性物質とＲＩ（放射性同位体）管理施設等の特
殊な試薬及び施設の使用を必要としない。 （３）多大な時間と労力を必要とする内在性ゲノムＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図の作成を行う必要がない。
【０１４１】また、本発明の方法を用いれば、その簡便
性により、一人で複数種類のターゲティングＤＮＡの製
造を同時に行うことが可能である。前記期間の短縮の効
果との相加効果により、本発明の製造方法を用いれば、
一種類のターゲティングベクターの製造のための期間
を、最短で約１週間に短縮できる。また、この製造期間
の飛躍的な短縮により、ターゲティングベクターの製造
に要するコストを大幅に低減することが可能となる。
性により、一人で複数種類のターゲティングＤＮＡの製
造を同時に行うことが可能である。前記期間の短縮の効
果との相加効果により、本発明の製造方法を用いれば、
一種類のターゲティングベクターの製造のための期間
を、最短で約１週間に短縮できる。また、この製造期間
の飛躍的な短縮により、ターゲティングベクターの製造
に要するコストを大幅に低減することが可能となる。
【０１４２】さらに、従来法においてはプラークハイブ
リダイゼーション用のプローブの作製のために200bp以
上の塩基配列が既知である必要であったが、本発明の製
造方法においては、標的ＤＮＡ配列の一部に相補的な２
種類のＰＣＲ用プライマーＤＮＡを設計することが可能
な最低約70bpの塩基配列が決定されていれば十分である
ことから、従来法では不可能であった塩基長が200bpに
満たないＥＳＴのような短いＤＮＡ配列を標的としたタ
ーゲティングＤＮＡの製造が可能である。本発明の他の
一つは、ターゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡと
の相同組換えにより該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮ
Ａ配列が修飾された組換え細胞または組換え生物の新規
且つ有用な選別方法である。
リダイゼーション用のプローブの作製のために200bp以
上の塩基配列が既知である必要であったが、本発明の製
造方法においては、標的ＤＮＡ配列の一部に相補的な２
種類のＰＣＲ用プライマーＤＮＡを設計することが可能
な最低約70bpの塩基配列が決定されていれば十分である
ことから、従来法では不可能であった塩基長が200bpに
満たないＥＳＴのような短いＤＮＡ配列を標的としたタ
ーゲティングＤＮＡの製造が可能である。本発明の他の
一つは、ターゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡと
の相同組換えにより該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮ
Ａ配列が修飾された組換え細胞または組換え生物の新規
且つ有用な選別方法である。
【０１４３】本発明の選別方法を用いれば、煩雑な操作
を労力を要するサザンハイブリダイゼーションによる選
別を行う必要がなく、ターゲティングＤＮＡと内在性ゲ
ノムＤＮＡとの相同組換えにより該内在性ゲノムＤＮＡ
中の標的ＤＮＡ配列が修飾された該組換え細胞または組
換え生物の選別を極めて簡便に且つ極めて高い精度で選
別することが可能である。
を労力を要するサザンハイブリダイゼーションによる選
別を行う必要がなく、ターゲティングＤＮＡと内在性ゲ
ノムＤＮＡとの相同組換えにより該内在性ゲノムＤＮＡ
中の標的ＤＮＡ配列が修飾された該組換え細胞または組
換え生物の選別を極めて簡便に且つ極めて高い精度で選
別することが可能である。
【０１４４】上述した本発明のターゲティングDNAの製
造方法並びに組換え細胞の選別方法を用いれば、医薬品
の研究開発のツールとして極めて有用なモデル動物であ
るノックアウトマウスやノックインマウスなどのトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物の製造に要する期間、労力
及びコストを大幅に低減することが可能である。また、
同様に、遺伝子治療分野において使用される治療用生理
活性蛋白をコードする遺伝子等の運搬体としての組換え
ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベ
クター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）の製造に要
する期間、労力及びコストを大幅に低減することが可能
である。
造方法並びに組換え細胞の選別方法を用いれば、医薬品
の研究開発のツールとして極めて有用なモデル動物であ
るノックアウトマウスやノックインマウスなどのトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物の製造に要する期間、労力
及びコストを大幅に低減することが可能である。また、
同様に、遺伝子治療分野において使用される治療用生理
活性蛋白をコードする遺伝子等の運搬体としての組換え
ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベ
クター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）の製造に要
する期間、労力及びコストを大幅に低減することが可能
である。
【０１４５】また、本発明のゲノムＤＮＡライブラリー
を用いることにより、前述のようなターゲティングＤＮ
Ａの作製において必須なゲノムＤＮＡ断片を極めて容易
且つ短期間で所得することが可能である。
を用いることにより、前述のようなターゲティングＤＮ
Ａの作製において必須なゲノムＤＮＡ断片を極めて容易
且つ短期間で所得することが可能である。
【０１４６】また本発明のｃＤＮＡのスクリーニング方
法を用いれば、従来の方法において必要とされた複数回
のＰＣＲによる陽性クローンのスクリーニングなどの煩
雑で時間のかかる操作が不要となり、ｃＤＮＡライブラ
リーから簡便且つ迅速に所望のｃＤＮＡクローンを同
定、取得することが可能である。
法を用いれば、従来の方法において必要とされた複数回
のＰＣＲによる陽性クローンのスクリーニングなどの煩
雑で時間のかかる操作が不要となり、ｃＤＮＡライブラ
リーから簡便且つ迅速に所望のｃＤＮＡクローンを同
定、取得することが可能である。
【０１４７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco, Inc. <120> Method for Preparing Gene Targeting DNA for Homologous Recombination And Method for Screening cDNA Library <130> J1-007DP1 <140> <141> <150> JP11-071390 <151> 1999-03-17 <160> 25 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "p3A" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 1 ctataggact gaaagacttg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "p3B" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 2 tacttacaca gtagctcttc 20 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "pr2-1" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(43) <400> 3 acgcgttaat taacaaatct aggtcataac ctggttcatc atc 43 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "pr2-2" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(44) <400> 4 acgcgtgcgg ccgcgtgttt attcctcatg gactgattat ggac 44 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "pr3-1" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(44) <400> 5 acgcgtttaa ttaacttcat gacatctcga gcaagtcttt gagt 44 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "pr3-2" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(44) <400> 6 acgcgtgcgg ccgcgctgac ctgctggatt acattaaagc actg 44 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "EpoR11" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 7 gctccgaaca agttatgtac 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "EpoR21" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 8 tcgagctggt atgagaagct g 21 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "EpoR14" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(45) <400> 9 gtgttaatta agagagcaaa ggtaagaact gtacatgggc aatgc 45 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "EpoR24" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(44) <400> 10 gcggcggccg catgcagccc tagcttcagg aagctcaggg ctcc 44 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "neo24" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 11 actgacacac attccacagc c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "EpoR27" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <400> 12 ggtagtgccc taattccaac g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "EpoR16" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 13 gtgtctgaac tcgatgaggc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "EpoR28" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <400> 14 gcacagaagt tcttcggagc 20 <210> 15 <211> 1199 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(155) <220> <221> CDS <222> (156)..(1031) <220> <221> 3'UTR <222> (1032)..(1199) <400> 15 gcacaccggc cccggcgggc cccggcagag aagcccgcac aggtcccagg aaggtggcgt 60 cagcatctgc agccgcgtcg acgttgtctg agcctccgcg gaggacccag gagagtcgga 120 ctaggaccag ggccccgggc ctccccacgc tccct atg gaa aag cca gct gcc 173 Met Glu Lys Pro Ala Ala 1 5 tca aca gaa ccc caa ggg tct cgg ccc gcc ttg ggc cgt gaa agt gtc 221 Ser Thr Glu Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ala Leu Gly Arg Glu Ser Val 10 15 20 cag gtg ccc gat gac cag gac ttc cgc agt ttc cgg tca gag tgt gag 269 Gln Val Pro Asp Asp Gln Asp Phe Arg Ser Phe Arg Ser Glu Cys Glu 25 30 35 gcc gag gtg ggc tgg aac ctg acc tac agc aag gcc ggc gtg tct gtg 317 Ala Glu Val Gly Trp Asn Leu Thr Tyr Ser Lys Ala Gly Val Ser Val 40 45 50 tgg gtg cag gct gtg gag atg gat cga act ctg cac aag atc aag tgt 365 Trp Val Gln Ala Val Glu Met Asp Arg Thr Leu His Lys Ile Lys Cys 55 60 65 70 cgg atg gaa tgc tgt gac gtg cca gct gag acg ctc tac gat gtc ctg 413 Arg Met Glu Cys Cys Asp Val Pro Ala Glu Thr Leu Tyr Asp Val Leu 75 80 85 cat gac ata gaa tac aga aag aag tgg gac agt aat gtc att gag act 461 His Asp Ile Glu Tyr Arg Lys Lys Trp Asp Ser Asn Val Ile Glu Thr 90 95 100 ttc gac atc gcc cgc ttg act gtc aac gct gac gta gga tat tat tcc 509 Phe Asp Ile Ala Arg Leu Thr Val Asn Ala Asp Val Gly Tyr Tyr Ser 105 110 115 tgg agg tgt ccc aag ccc ctg aag aac cgt gat gtc atc acc ctc cgc 557 Trp Arg Cys Pro Lys Pro Leu Lys Asn Arg Asp Val Ile Thr Leu Arg 120 125 130 tcc tgg ctc ccc atg ggc gct gat tac atc att atg aac tac tca gtg 605 Ser Trp Leu Pro Met Gly Ala Asp Tyr Ile Ile Met Asn Tyr Ser Val 135 140 145 150 aaa cac cct aaa tac cca cct cgg aaa gac ttg gtc cga gct gtg tcc 653 Lys His Pro Lys Tyr Pro Pro Arg Lys Asp Leu Val Arg Ala Val Ser 155 160 165 atc cag acg ggc tac ctc atc cag agc acg ggg ccc aag agc tgc gtc 701 Ile Gln Thr Gly Tyr Leu Ile Gln Ser Thr Gly Pro Lys Ser Cys Val 170 175 180 atc acc tac ctg gcc caa gtg gac ccc aaa ggc tcc tta ccc aag tgg 749 Ile Thr Tyr Leu Ala Gln Val Asp Pro Lys Gly Ser Leu Pro Lys Trp 185 190 195 gtg gtg aat aag tca tct cag ttc ctg gcc ccc aag gcc atg aag aag 797 Val Val Asn Lys Ser Ser Gln Phe Leu Ala Pro Lys Ala Met Lys Lys 200 205 210 atg tac aag gcc tgc atc aag tac ccc gag tgg aag cag aaa cac cag 845 Met Tyr Lys Ala Cys Ile Lys Tyr Pro Glu Trp Lys Gln Lys His Gln 215 220 225 230 cct cat ttc aag cca tgg ctg cac ccg gag cag agc cca ttg ccc agc 893 Pro His Phe Lys Pro Trp Leu His Pro Glu Gln Ser Pro Leu Pro Ser 235 240 245 ctg gcg ctg tca gag ttg tcg gtg caa cat gca gac tca ctg gag aac 941 Leu Ala Leu Ser Glu Leu Ser Val Gln His Ala Asp Ser Leu Glu Asn 250 255 260 atc gat gag agt gca gtg aca gag agc cgc gag gag cgg gca ggc ggt 989 Ile Asp Glu Ser Ala Val Thr Glu Ser Arg Glu Glu Arg Ala Gly Gly 265 270 275 gcg gga gga gag ggc agc gac gat gac acc tcg ctc acc tga 1031 Ala Gly Gly Glu Gly Ser Asp Asp Asp Thr Ser Leu Thr 280 285 290 gtgaccggct ctctgcaagg accaagacca gactggggtg gaaccctggg gcactgagcc 1091 ttcctgcact tcctcccttc ccccacctgc ttctgggggg gcactgggct cctgcccagg 1151 tggctgcggc atggctggac atggccccaa taaatgaacc acacagcc 1199 <210> 16 <211> 291 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Met Glu Lys Pro Ala Ala Ser Thr Glu Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ala 1 5 10 15 Leu Gly Arg Glu Ser Val Gln Val Pro Asp Asp Gln Asp Phe Arg Ser 20 25 30 Phe Arg Ser Glu Cys Glu Ala Glu Val Gly Trp Asn Leu Thr Tyr Ser 35 40 45 Lys Ala Gly Val Ser Val Trp Val Gln Ala Val Glu Met Asp Arg Thr 50 55 60 Leu His Lys Ile Lys Cys Arg Met Glu Cys Cys Asp Val Pro Ala Glu 65 70 75 80 Thr Leu Tyr Asp Val Leu His Asp Ile Glu Tyr Arg Lys Lys Trp Asp 85 90 95 Ser Asn Val Ile Glu Thr Phe Asp Ile Ala Arg Leu Thr Val Asn Ala 100 105 110 Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Cys Pro Lys Pro Leu Lys Asn Arg 115 120 125 Asp Val Ile Thr Leu Arg Ser Trp Leu Pro Met Gly Ala Asp Tyr Ile 130 135 140 Ile Met Asn Tyr Ser Val Lys His Pro Lys Tyr Pro Pro Arg Lys Asp 145 150 155 160 Leu Val Arg Ala Val Ser Ile Gln Thr Gly Tyr Leu Ile Gln Ser Thr 165 170 175 Gly Pro Lys Ser Cys Val Ile Thr Tyr Leu Ala Gln Val Asp Pro Lys 180 185 190 Gly Ser Leu Pro Lys Trp Val Val Asn Lys Ser Ser Gln Phe Leu Ala 195 200 205 Pro Lys Ala Met Lys Lys Met Tyr Lys Ala Cys Ile Lys Tyr Pro Glu 210 215 220 Trp Lys Gln Lys His Gln Pro His Phe Lys Pro Trp Leu His Pro Glu 225 230 235 240 Gln Ser Pro Leu Pro Ser Leu Ala Leu Ser Glu Leu Ser Val Gln His 245 250 255 Ala Asp Ser Leu Glu Asn Ile Asp Glu Ser Ala Val Thr Glu Ser Arg 260 265 270 Glu Glu Arg Ala Gly Gly Ala Gly Gly Glu Gly Ser Asp Asp Asp Thr 275 280 285 Ser Leu Thr 290 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "NY-C-F2" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(37) <400> 17 agccgcgtcg acgttgtctg agcctccgcg gaggacc 37 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "NY-S-R4" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(30) <400> 18 ccagcccacc tcggcctcac actctgaccg 30 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially sunthesized primer sequence, "NY-5'-PF3" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(43) <400> 19 gctcgttaat taagccagct gcctcaacag aaccccaagg gtc 43 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "NY-5'-PR3" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(43) <400> 20 caagcttaat taactcagac aacgtcgacg cggctgcaga tgc 43 <210> 21 <211> 842 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 aaatggcgtg aggtggcagg gcgcccgccg tgcccgctgt gcttccttcc cgcctcctgc 60 tcccctcact cggcccctcc ccctccccgc gcgagtgctt aaatcccccc catcctggct 120 gcaggtcata ttcggatcca tgatgcctgc ctgtcgcctc tgcttgctgg ccgctgctcc 180 tactagggtt gctactgttc acccccatct cagccacagg caccgatgca gagaaacccg 240 gcgagtgccc ccagctcgaa ccaattacgg actgtgtgtt ggagtgcact ttggacaagg 300 actgtgcgga caaccgcaag tgctgccagg cgggctgcag ctctgtctgc tccaagccta 360 atggaccgag cgaaggagag ctctcaggga cagatactaa actctcagag actgggacta 420 ctactcaatc agcgggcctt gaccacacta ctaaaccacc gggaggtcaa gtctccacga 480 agccaccggt gtgaccaggg aaggcttagg tgtccgagaa aagcagggca cctgccccag 540 cgtggacata cccaagctcg gcctctgtga ggaccagtgt caggtggaca gccagtgttc 600 tggcaacatg aaatgctgcc gcaatggatg tgggaagatg gcctgcacca cacccaaatt 660 ctgagcttca gcctccagca gcctgaggaa tggagagagg ttgtttctgc cggactgtgc 720 atctggagtc gttcctgtgg cctcctttct ctctggtctt tgcatttctt cctggtccga 780 tgaaagcatc tcctttttct aaccaataaa gtgatcgctt tcagcaatgg agaagctata 840 ac 842 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "HE4-F2" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(32) <400> 22 gggctgcagc tctgtctgct ccaagcctaa tg 32 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, "HE4-R2" <220> <221> primer_bind <222> (1)..(30) <400> 23 ctcagccaca ggaccgatgc agagaaaccc 30 <210> 24 <211> 705 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(2) <220> <221> CDS <222> (3)..(527) <220> <221> 3'UTR <222> (528)..(705) <400> 24 cc atg cct gcc tgt cgc ctc tgc ttg ctg gcc gct ggc ctc cta cta 47 Met Pro Ala Cys Arg Leu Cys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Leu Leu 1 5 10 15 ggg ttg cta ctg ttc acc ccc atc tca gcc aca ggc acc gat gca gag 95 Gly Leu Leu Leu Phe Thr Pro Ile Ser Ala Thr Gly Thr Asp Ala Glu 20 25 30 aaa ccc ggc gag tgc ccc cag ctc gaa cca att acg gac tgt gtg ttg 143 Lys Pro Gly Glu Cys Pro Gln Leu Glu Pro Ile Thr Asp Cys Val Leu 35 40 45 gag tgc act ttg gac aag gac tgt gcg gac aac cgc aag tgc tgc cag 191 Glu Cys Thr Leu Asp Lys Asp Cys Ala Asp Asn Arg Lys Cys Cys Gln 50 55 60 gcg ggc tgc agc tct gtc tgc tcc aag cct aat gga ccg agc gaa gga 239 Ala Gly Cys Ser Ser Val Cys Ser Lys Pro Asn Gly Pro Ser Glu Gly 65 70 75 gag ctc tca ggg aca gat act aaa ctc tca gag act ggg act act act 287 Glu Leu Ser Gly Thr Asp Thr Lys Leu Ser Glu Thr Gly Thr Thr Thr 80 85 90 95 caa tca gcg ggc ctt gac cac act act aaa cca ccg gga ggt caa gtc 335 Gln Ser Ala Gly Leu Asp His Thr Thr Lys Pro Pro Gly Gly Gln Val 100 105 110 tcc acg aag cca ccg gct gtg acc agg gaa ggc tta ggt gtc cga gaa 383 Ser Thr Lys Pro Pro Ala Val Thr Arg Glu Gly Leu Gly Val Arg Glu 115 120 125 aag cag ggc acc tgc ccc agc gtg gac ata ccc aag ctc ggc ctc tgt 431 Lys Gln Gly Thr Cys Pro Ser Val Asp Ile Pro Lys Leu Gly Leu Cys 130 135 140 gag gac cag tgt cag gtg gac agc cag tgt tct ggc aac atg aaa tgc 479 Glu Asp Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Ser Gly Asn Met Lys Cys 145 150 155 tgc cgc aat gga tgt ggg aag atg gcc tgc acc aca ccc aaa ttc tga 527 Cys Arg Asn Gly Cys Gly Lys Met Ala Cys Thr Thr Pro Lys Phe 160 165 170 175 gcttcagcct ccagcagcct gaggaacgga gagaggttgt ttctgccgga ctgtgcatct 587 ggagtcgttc ctgtggcctc ctttctctct ggtctttgca tttcttcctg gtccgacgaa 647 agcatctcct ttttctaacc aataaagtga tcgttttcag caatggagaa gctataac 705 <210> 25 <211> 174 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Met Pro Ala Cys Arg Leu Cys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Phe Thr Pro Ile Ser Ala Thr Gly Thr Asp Ala Glu Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Cys Pro Gln Leu Glu Pro Ile Thr Asp Cys Val Leu Glu 35 40 45 Cys Thr Leu Asp Lys Asp Cys Ala Asp Asn Arg Lys Cys Cys Gln Ala 50 55 60 Gly Cys Ser Ser Val Cys Ser Lys Pro Asn Gly Pro Ser Glu Gly Glu 65 70 75 80 Leu Ser Gly Thr Asp Thr Lys Leu Ser Glu Thr Gly Thr Thr Thr Gln 85 90 95 Ser Ala Gly Leu Asp His Thr Thr Lys Pro Pro Gly Gly Gln Val Ser 100 105 110 Thr Lys Pro Pro Ala Val Thr Arg Glu Gly Leu Gly Val Arg Glu Lys 115 120 125 Gln Gly Thr Cys Pro Ser Val Asp Ile Pro Lys Leu Gly Leu Cys Glu 130 135 140 Asp Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Ser Gly Asn Met Lys Cys Cys 145 150 155 160 Arg Asn Gly Cys Gly Lys Met Ala Cys Thr Thr Pro Lys Phe 165 170
【０１４８】「配列表フリーテキスト」 配列番号：１ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列p3A。 配列番号：２ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列p3B。 配列番号：３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr2-1。 配列番号：４ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr2-1。 配列番号：５ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr3-1。 配列番号：６ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr3-2。 配列番号：７ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR11。 配列番号：８ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR21。 配列番号：９ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR14。 配列番号：１０ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR24。 配列番号：１１ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列neo24。 配列番号：１２ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR27。 配列番号：１３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR16。 配列番号：１４ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR28。 配列番号：１７ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-C-F2。 配列番号：１８ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-S-R4。 配列番号：１９ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-5'-PF3。 配列番号：２０ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-5'-PR3。 配列番号：２２ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列HE4-F2。 配列番号：２３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列HE4-R2。
プライマー配列p3A。 配列番号：２ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列p3B。 配列番号：３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr2-1。 配列番号：４ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr2-1。 配列番号：５ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr3-1。 配列番号：６ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列pr3-2。 配列番号：７ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR11。 配列番号：８ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR21。 配列番号：９ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR14。 配列番号：１０ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR24。 配列番号：１１ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列neo24。 配列番号：１２ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR27。 配列番号：１３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR16。 配列番号：１４ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列EpoR28。 配列番号：１７ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-C-F2。 配列番号：１８ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-S-R4。 配列番号：１９ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-5'-PF3。 配列番号：２０ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列NY-5'-PR3。 配列番号：２２ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列HE4-F2。 配列番号：２３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列HE4-R2。
【０１４９】
【図１】（１）マウスHPRTをコードするゲノム遺伝子の
制限酵素地図、並びに（２）マウスHPRT遺伝子のエクソ
ン２またはエクソン３の塩基配列を基に設計したプライ
マーを用いて種々の環状化マウスゲノムDNAを鋳型とし
て逆PCRを行うことにより増幅されるDNAのゲル電気泳動
像を各々示す図。分図１(a)は、マウスHPRTをコードす
るゲノム遺伝子の制限酵素地図、並びに該制限酵素によ
り切断して得られるゲノムDNA断片のおおよその大きさ
を模式的に示す。分図１(b)は、マウスHPRT遺伝子を含
むマウスゲノムDNAを保持するBAC DNAをEcoRI、HindIII
またはBamHIで切断して得られるゲノムDNA断片を環状化
した環状ゲノムDNAを鋳型とし、マウスHPRT遺伝子のエ
クソン２の塩基配列を基に設計した一対のプライマーを
用いた逆PCRにより増幅されるDNAのゲル電気泳動像を示
す。分図１(c) 、マウスHPRT遺伝子を含むマウスゲノム
DNAを保持するBAC DNAをEcoRI、HindIIIまたはBamHIで
切断して得られるゲノムDNA断片を環状化した環状ゲノ
ムDNAを鋳型とし、マウスHPRT遺伝子のエクソン３の塩
基配列を基に設計した一対のプライマーを用いた逆PCR
により増幅されるDNAのゲル電気泳動像を示す。
制限酵素地図、並びに（２）マウスHPRT遺伝子のエクソ
ン２またはエクソン３の塩基配列を基に設計したプライ
マーを用いて種々の環状化マウスゲノムDNAを鋳型とし
て逆PCRを行うことにより増幅されるDNAのゲル電気泳動
像を各々示す図。分図１(a)は、マウスHPRTをコードす
るゲノム遺伝子の制限酵素地図、並びに該制限酵素によ
り切断して得られるゲノムDNA断片のおおよその大きさ
を模式的に示す。分図１(b)は、マウスHPRT遺伝子を含
むマウスゲノムDNAを保持するBAC DNAをEcoRI、HindIII
またはBamHIで切断して得られるゲノムDNA断片を環状化
した環状ゲノムDNAを鋳型とし、マウスHPRT遺伝子のエ
クソン２の塩基配列を基に設計した一対のプライマーを
用いた逆PCRにより増幅されるDNAのゲル電気泳動像を示
す。分図１(c) 、マウスHPRT遺伝子を含むマウスゲノム
DNAを保持するBAC DNAをEcoRI、HindIIIまたはBamHIで
切断して得られるゲノムDNA断片を環状化した環状ゲノ
ムDNAを鋳型とし、マウスHPRT遺伝子のエクソン３の塩
基配列を基に設計した一対のプライマーを用いた逆PCR
により増幅されるDNAのゲル電気泳動像を示す。
【図２】プラスミドp1108及びp1207の各々の制限酵素地
図を示す図。
図を示す図。
【図３】（１）マウスの内在性ゲノムDNAとターゲティ
ングDNAとの間の正常な相同組換えの結果、マウスHPRT
遺伝子のエクソン３中に該ターゲティングDNAが組み込
まれた組換えES細胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素地
図、並びに（２）該組換えES細胞のゲノムDNAを種々の
制限酵素で切断して得られるゲノムDNA断片に対する、
ターゲティングDNA中の一部の塩基配列を基に設計され
たプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにお
けるオートラジオグラフを各々示す図。分図３(a)は、
マウスの内在性ゲノムDNAとターゲティングDNAとの間の
正常な相同組換えの結果、マウスHPRT遺伝子のエクソン
３中に該ターゲティングDNAが組み込まれた組換えES細
胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素地図、並びに該制限酵
素により切断して得られるゲノムDNA断片のおおよその
大きさを模式的に示す。分図３(b)は、組換えES細胞120
7-1のゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション
でのオートラジオグラフを示す。分図３(c)は、組換えE
S細胞1207-２のゲノムDNAに対するサザンハイブリダイ
ゼーションでのオートラジオグラフを示す。
ングDNAとの間の正常な相同組換えの結果、マウスHPRT
遺伝子のエクソン３中に該ターゲティングDNAが組み込
まれた組換えES細胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素地
図、並びに（２）該組換えES細胞のゲノムDNAを種々の
制限酵素で切断して得られるゲノムDNA断片に対する、
ターゲティングDNA中の一部の塩基配列を基に設計され
たプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにお
けるオートラジオグラフを各々示す図。分図３(a)は、
マウスの内在性ゲノムDNAとターゲティングDNAとの間の
正常な相同組換えの結果、マウスHPRT遺伝子のエクソン
３中に該ターゲティングDNAが組み込まれた組換えES細
胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素地図、並びに該制限酵
素により切断して得られるゲノムDNA断片のおおよその
大きさを模式的に示す。分図３(b)は、組換えES細胞120
7-1のゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション
でのオートラジオグラフを示す。分図３(c)は、組換えE
S細胞1207-２のゲノムDNAに対するサザンハイブリダイ
ゼーションでのオートラジオグラフを示す。
【図４】マウスEPO受容体遺伝子を含むマウスゲノムDNA
を保持するBAC DNAをXhoIで切断して得られるゲノムDNA
断片を環状化した環状ゲノムDNAを鋳型とし、マウスEPO
受容体遺伝子のエクソン１の塩基配列を基に設計した一
対のプライマーを用いた逆PCRにより増幅されるDNAのゲ
ル電気泳動像を示す図。右レーンは、マウスEPO受容体
遺伝子を含むマウスゲノムDNAを保持するBAC DNAをXhoI
で切断して得られるゲノムDNA断片を環状化した環状ゲ
ノムDNAを鋳型とした場合のPCRにより得られたPCR産物
を制限酵素XhoIで再切断して得られたDNAの結果を示
す。矢印で示した部分に期待される大きさのDNAの増幅
を示すバンドが認められる。真中のレーンは、マウスEP
O受容体遺伝子を含むマウスゲノムDNAを保持するBAC DN
AをXhoIで切断して得られるゲノムDNA断片を環状化した
環状ゲノムDNAを鋳型とした場合の結果を示す。矢印で
示した部分に期待される大きさのDNAの増幅を示すバン
ドが認められる。左レーンは、λファージDNAを制限酵
素HindIIIで切断して得たサイズマーカーの電気泳動の
状態を示す。
を保持するBAC DNAをXhoIで切断して得られるゲノムDNA
断片を環状化した環状ゲノムDNAを鋳型とし、マウスEPO
受容体遺伝子のエクソン１の塩基配列を基に設計した一
対のプライマーを用いた逆PCRにより増幅されるDNAのゲ
ル電気泳動像を示す図。右レーンは、マウスEPO受容体
遺伝子を含むマウスゲノムDNAを保持するBAC DNAをXhoI
で切断して得られるゲノムDNA断片を環状化した環状ゲ
ノムDNAを鋳型とした場合のPCRにより得られたPCR産物
を制限酵素XhoIで再切断して得られたDNAの結果を示
す。矢印で示した部分に期待される大きさのDNAの増幅
を示すバンドが認められる。真中のレーンは、マウスEP
O受容体遺伝子を含むマウスゲノムDNAを保持するBAC DN
AをXhoIで切断して得られるゲノムDNA断片を環状化した
環状ゲノムDNAを鋳型とした場合の結果を示す。矢印で
示した部分に期待される大きさのDNAの増幅を示すバン
ドが認められる。左レーンは、λファージDNAを制限酵
素HindIIIで切断して得たサイズマーカーの電気泳動の
状態を示す。
【図５】プラスミドｐEpoR K/Iの調製方法を模式的に示
す図。
す図。
【図６】プラスミドp1108-Lucの制限酵素地図を示す
図。
図。
【図７】マウスの内在性ゲノムDNAとターゲティングDNA
との間の正常な相同組換えの結果、マウスEPO受容体遺
伝子のエクソン１中に該ターゲティングDNAが組み込ま
れた組換えES細胞のPCRによるスクリーニングの手法を
模式的に示す図。
との間の正常な相同組換えの結果、マウスEPO受容体遺
伝子のエクソン１中に該ターゲティングDNAが組み込ま
れた組換えES細胞のPCRによるスクリーニングの手法を
模式的に示す図。
【図８】（１）マウスの内在性ゲノムDNAとターゲティ
ングDNAとの間の正常な相同組換えの結果、マウスEPO受
容体遺伝子のエクソン１中に該ターゲティングDNAが組
み込まれた組換えES細胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素
地図、並びに（２）該組換えES細胞のゲノムDNAを種々
の制限酵素で切断して得られるゲノムDNA断片に対す
る、ターゲティングDNA中の一部の塩基配列を基に設計
されたプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション
におけるオートラジオグラフを各々示す図。分図８(a)
は、マウスの内在性ゲノムDNAとターゲティングDNAとの
間の正常な相同組換えの結果、マウスEPO受容体遺伝子
のエクソン１中に該ターゲティングDNAが組み込まれた
組換えES細胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素地図、並び
に該制限酵素により切断して得られるゲノムDNA断片の
おおよその大きさを模式的に示す。分図８(b)は、組換
えES細胞（No.20）及び野生型マウスES細胞の各々のゲ
ノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーションでのオ
ートラジオグラフを示す。
ングDNAとの間の正常な相同組換えの結果、マウスEPO受
容体遺伝子のエクソン１中に該ターゲティングDNAが組
み込まれた組換えES細胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素
地図、並びに（２）該組換えES細胞のゲノムDNAを種々
の制限酵素で切断して得られるゲノムDNA断片に対す
る、ターゲティングDNA中の一部の塩基配列を基に設計
されたプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション
におけるオートラジオグラフを各々示す図。分図８(a)
は、マウスの内在性ゲノムDNAとターゲティングDNAとの
間の正常な相同組換えの結果、マウスEPO受容体遺伝子
のエクソン１中に該ターゲティングDNAが組み込まれた
組換えES細胞の内在性ゲノムDNAの制限酵素地図、並び
に該制限酵素により切断して得られるゲノムDNA断片の
おおよその大きさを模式的に示す。分図８(b)は、組換
えES細胞（No.20）及び野生型マウスES細胞の各々のゲ
ノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーションでのオ
ートラジオグラフを示す。
【図９】前述した「課題を解決するための手段」の段落
番号３４に記載した本発明の(1)乃至(12)の構成を例示
的に示す図。
番号３４に記載した本発明の(1)乃至(12)の構成を例示
的に示す図。
【図１０】前述した「課題を解決するための手段」の段
落番号３４に記載した本発明の(13)乃至(24)の構成を例
示的に示す図。
落番号３４に記載した本発明の(13)乃至(24)の構成を例
示的に示す図。
【図１１】前述した「課題を解決するための手段」の段
落番号３４に記載した本発明の(25)乃至(36)の構成を例
示的に示す図。
落番号３４に記載した本発明の(25)乃至(36)の構成を例
示的に示す図。
【図１２】前述した「課題を解決するための手段」の段
落番号３４に記載した本発明の（56）の構成を例示的に
示す図。
落番号３４に記載した本発明の（56）の構成を例示的に
示す図。
【図１３】前述した「課題を解決するための手段」の段
落番号３４に記載した本発明の（57）の構成を例示的に
示す図。
落番号３４に記載した本発明の（57）の構成を例示的に
示す図。
【図１４】前述した「課題を解決するための手段」の段
落番号３４に記載した本発明の（58）の構成を例示的に
示す図。
落番号３４に記載した本発明の（58）の構成を例示的に
示す図。
【図１５】前述した「課題を解決するための手段」の段
落番号３４に記載した本発明の（37）乃至（50）の構成
を例示的に示す図。
落番号３４に記載した本発明の（37）乃至（50）の構成
を例示的に示す図。
【図１６】前述した「課題を解決するための手段」の段
落番号３４に記載した本発明の（75）乃至（81）の構成
を例示的に示す図。
落番号３４に記載した本発明の（75）乃至（81）の構成
を例示的に示す図。
【図１７】マウスGN遺伝子を含むプラスミドクローンの
同定、選別マウスゲノムDNAライブラリーである各々の
ウェルにセットされた各々の環状DNA（プラスミドマウ
スゲノムDNA）を鋳型として、マウスGN遺伝子の塩基配
列に相補的な一対のプライマーNY-C-F2及びNY-S-R4を用
いたPCR反応（通常の内向きのPCR）により増幅されるDN
Aのゲル電気泳動像を示す図。図面の下段は、クローン
の名称を示す。マーカーの大きさは、最上部から、10、
8.0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.75、1.5、及び1.0（Kb)を
示す。
同定、選別マウスゲノムDNAライブラリーである各々の
ウェルにセットされた各々の環状DNA（プラスミドマウ
スゲノムDNA）を鋳型として、マウスGN遺伝子の塩基配
列に相補的な一対のプライマーNY-C-F2及びNY-S-R4を用
いたPCR反応（通常の内向きのPCR）により増幅されるDN
Aのゲル電気泳動像を示す図。図面の下段は、クローン
の名称を示す。マーカーの大きさは、最上部から、10、
8.0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.75、1.5、及び1.0（Kb)を
示す。
【図１８】マウスGN遺伝子を含むマウスゲノムDNAを保
持する環状プラスミドDNAの各々を鋳型として、マウスG
N遺伝子の塩基配列に相補的な一対のプライマーNY-5'-P
F3及びNY-5'-PR3を用いた逆PCR反応により増幅して得ら
れるPCR産物を大腸菌内でさらに増幅して得たプラスミ
ドDNAを制限酵素（KpnI、SalI、XhoI、PvuI）で消化し
て生成されるDNA断片の電気泳動像を示す図。図面の下
段は、クローンの名称を示す。マーカーの大きさは、最
上部から、10、8.0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.75、1.5、
及び1.0（Kb)を示す。
持する環状プラスミドDNAの各々を鋳型として、マウスG
N遺伝子の塩基配列に相補的な一対のプライマーNY-5'-P
F3及びNY-5'-PR3を用いた逆PCR反応により増幅して得ら
れるPCR産物を大腸菌内でさらに増幅して得たプラスミ
ドDNAを制限酵素（KpnI、SalI、XhoI、PvuI）で消化し
て生成されるDNA断片の電気泳動像を示す図。図面の下
段は、クローンの名称を示す。マーカーの大きさは、最
上部から、10、8.0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.75、1.5、
及び1.0（Kb)を示す。
【図１９】制限酵素PacIで切断したマウスGN遺伝子を含
むマウスゲノムDNAを保持するプラスミドDNAをルシフェ
ラーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を有するDNA
カセットと連結して再環状化したDNAを大腸菌JM109内で
さらに増幅して得られるプラスミドDNAを制限酵素（Spe
I, EcoRI, MluI）またはRNaseで消化して生成されるDNA
断片の電気泳動像を示す図。図面の下段は、クローンの
名称を示す。マーカーの大きさは、最上部から、10、8.
0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.75、1.5、及び1.0（Kb)を示
す。
むマウスゲノムDNAを保持するプラスミドDNAをルシフェ
ラーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を有するDNA
カセットと連結して再環状化したDNAを大腸菌JM109内で
さらに増幅して得られるプラスミドDNAを制限酵素（Spe
I, EcoRI, MluI）またはRNaseで消化して生成されるDNA
断片の電気泳動像を示す図。図面の下段は、クローンの
名称を示す。マーカーの大きさは、最上部から、10、8.
0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.75、1.5、及び1.0（Kb)を示
す。
【図２０】マウス腎臓cDNAライブラリーの各々のウェル
にセットされたcDNAクローンを鋳型として、マウスEST
の塩基配列に相補的な一対のプライマーHE4-F2及びHE4-
R2を用いた逆PCR反応により増幅されるDNAのゲル電気泳
動像を示す図。
にセットされたcDNAクローンを鋳型として、マウスEST
の塩基配列に相補的な一対のプライマーHE4-F2及びHE4-
R2を用いた逆PCR反応により増幅されるDNAのゲル電気泳
動像を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年３月３１日（２０００．３．３
１）
１）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
Claims (87)
- 【請求項１】 生物の内在性ゲノムDNA中のDNA配列の一
部を、相同組換えにより修飾するためのターゲティング
ＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃至（ｅ）
の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]を該切断末端ＤＮＡ配列で
分子内連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を調
製する工程； （ｃ）該環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型とし、
下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E1]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[X]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。 - 【請求項２】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子から
なるＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の製
造方法。 - 【請求項３】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及び
レポーター遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴とす
る請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項４】 該レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ
またはβラクタマーゼをコードする遺伝子であることを
特徴とする請求項３に記載の製造方法。 - 【請求項５】 該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性
遺伝子であることを特徴とする請求項２乃至請求項４の
いずれかに記載の製造方法。 - 【請求項６】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一の
制限酵素であることを特徴とする請求項１乃至請求項５
のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項７】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々異
なる制限酵素であることを特徴とする請求項１乃至請求
項５のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項８】 該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動物、
植物、細菌またはウイルスであることを特徴とする請求
項１乃至請求項７のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項９】 該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物であるこ
とを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 【請求項１０】 該非ヒト哺乳動物が、マウスであるこ
とを特徴とする請求項９に記載の製造方法。 - 【請求項１１】 該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮ
Ａ断片をバクテリア人工染色体（BAC）または酵母人工
染色体（YAC）中にクローン化してなるマウスゲノムＤ
ＮＡ断片のライブラリーから選別されるものであること
を特徴とする請求項１０に記載の製造方法。 - 【請求項１２】 該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへ
の転写を不能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可
能たらしめるものであることを特徴とする請求項１乃至
請求項１１のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項１３】 生物の内在性ゲノムDNA中のDNA配列の
一部を、相同組換えにより修飾するためのターゲティン
グＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃至
（ｆ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]を該切断末端ＤＮＡ配列で
分子内連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を調
製する工程； （ｃ）該環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型とし、
下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムDNA[C2]を、制限酵素[E1]により切
断し、該制限酵素切断部位に制限酵素[E4]により切断可
能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]を含むリンカーＤＮＡ
を挿入することにより、該制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]
及び該標的ＤＮＡ配列[T]を含む組換え環状ゲノムＤＮ
Ａ[C3]を調製する工程； （ｆ）該環状ゲノムＤＮＡ[C3]を制限酵素[E4]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。 - 【請求項１４】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子か
らなるＤＮＡであることを特徴とする請求項１３に記載
の製造方法。 - 【請求項１５】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及
びレポーター遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴と
する請求項１３に記載の製造方法。 - 【請求項１６】 該レポーター遺伝子が、ルシフェラー
ゼまたはβラクタマーゼをコードする遺伝子であること
を特徴とする請求項１５に記載の製造方法。 - 【請求項１７】 該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐
性遺伝子であることを特徴とする請求項１４乃至請求項
１６のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項１８】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一
の制限酵素であることを特徴とする請求項１３乃至請求
項１７のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項１９】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々
異なる制限酵素であることを特徴とする請求項１３乃至
請求項１７のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項２０】 該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動
物、植物、細菌またはウイルスであることを特徴とする
請求項１３乃至請求項１９のいずれかに記載の製造方
法。 - 【請求項２１】 該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物である
ことを特徴とする請求項２０に記載の製造方法。 - 【請求項２２】 該非ヒト哺乳動物が、マウスであるこ
とを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。 - 【請求項２３】 該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮ
Ａ断片をバクテリア人工染色体（BAC）または酵母人工
染色体（YAC）中にクローン化してなるマウスゲノムＤ
ＮＡ断片のライブラリーから選別されるものであること
を特徴とする請求項２２に記載の製造方法。 - 【請求項２４】 該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへ
の転写を不能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可
能たらしめるものであることを特徴とする請求項１３乃
至請求項２３のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項２５】 生物の内在性ゲノムDNA中のDNA配列の
一部を、相同組換えにより修飾するためのターゲティン
グＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃至
（ｅ）の工程： （ａ）該生物のゲノムDNA断片であって該ＤＮＡ配列[T]
を含むゲノムＤＮＡ断片を含むＤＮＡ[CL]を、制限酵素
[E1]により、該ＤＮＡ配列[T]の外側に各々存在する制
限酵素[E1]により切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列
[X]で切断し、該制限酵素[E1]による切断末端ＤＮＡ配
列を両端に有し且つ該ＤＮＡ配列[T]を含むゲノムDNA断
片[L1]を調製する工程； （ｂ）該ゲノムDNA断片[L1]と、制限酵素[E4]により切
断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]を含むリンカーＤ
ＮＡとを連結させることにより、制限酵素認識ＤＮＡ配
列[Y]及び該ＤＮＡ配列[T]を含む環状ゲノムDNA[C1]を
調製する工程； （ｃ）該組換え環状ゲノムDNA[C1]の各々のDNA鎖を鋳型
とし、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ
[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のDNA配列[T]の5'末端側のDNA配列に相補的なＤＮＡ配
列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤ
ＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]の5'末
端側にアニーリングし得るように設計されたプライマー
ＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングし得るように設計された
プライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応に
よるＤＮＡ増幅により、下記のDNA鎖[III]及びDNA鎖[I
V]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマーＤＮＡ[P1]に相補的なＤ
ＮＡ配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配
列の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列
[Y]を含むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマーＤＮＡ[P1]と同一のＤＮＡ
配列及び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列
の各々を末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]
を含むＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムDNA断片[L2]
を調製する工程； （ｄ）該組換えゲノムDNA断片[L2]の末端を制限酵素[E
2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断片
[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限酵
素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]によ
る切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有し、且つ該生物
にとって外来である外来性ＤＮＡを該外来性ＤＮＡが細
胞中で発現できるような配置で含む線状化発現ベクター
ＤＮＡと連結させることにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を
調製する工程；及び （ｅ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E4]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[Y]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。 - 【請求項２６】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子か
らなるＤＮＡであることを特徴とする請求項２５に記載
の製造方法。 - 【請求項２７】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及
びレポーター遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴と
する請求項２５に記載の製造方法。 - 【請求項２８】 該レポーター遺伝子が、ルシフェラー
ゼまたはβラクタマーゼをコードする遺伝子であること
を特徴とする請求項２７に記載の製造方法。 - 【請求項２９】 該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐
性遺伝子であることを特徴とする請求項２５乃至請求項
２８のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項３０】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一
の制限酵素であることを特徴とする請求項２５乃至請求
項２９のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項３１】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々
異なる制限酵素であることを特徴とする請求項２５乃至
請求項２９のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項３２】 該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動
物、植物、細菌またはウイルスであることを特徴とする
請求項２５乃至請求項３１のいずれかに記載の製造方
法。 - 【請求項３３】 該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物である
ことを特徴とする請求項３２に記載の製造方法。 - 【請求項３４】 該非ヒト哺乳動物が、マウスであるこ
とを特徴とする請求項３３に記載の製造方法。 - 【請求項３５】 該ＤＮＡ[CL]が、マウスのゲノムＤＮ
Ａ断片をバクテリア人工染色体（BAC）または酵母人工
染色体（YAC）中にクローン化してなるマウスゲノムＤ
ＮＡ断片のBACライブラリーから選別されるものである
ことを特徴とする請求項３４に記載の製造方法。 - 【請求項３６】 該修飾が、該ＤＮＡ配列[T]のmRNAへ
の転写を不能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可
能たらしめるものであることを特徴とする請求項２５乃
至請求項３５のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項３７】 生物の内在性ゲノムＤＮＡ中のＤＮＡ
配列の一部を、相同組換えにより修飾するためのターゲ
ティングＤＮＡの製造方法であって、下記工程（ａ）乃
至（ｃ）の工程： （ａ）該生物のゲノムＤＮＡ断片であって該ＤＮＡ配列
[T]を含むゲノムＤＮＡ断片[L1]と制限酵素[E1]で切断
可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を有する発現ベクタ
ーＤＮＡとからなる環状ゲノムＤＮＡ[C1]の各々のＤＮ
Ａ鎖を鋳型とし、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライ
マーＤＮＡ[P2]： プライマーＤＮＡ[P1]：5'末端近傍に制限酵素[E2]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の一方のＤＮＡ鎖[I]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]中のＤＮＡ配列[T]
の5'末端側にアニーリングするように設計されたプライ
マーＤＮＡ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：5'末端近傍に制限酵素[E3]によ
り切断可能な制限酵素認識ＤＮＡ配列を有し、且つその
下流に該環状ゲノムＤＮＡ[C1]の他方のＤＮＡ鎖[II]中
のＤＮＡ配列[T]の5'末端側のＤＮＡ配列に相補的なＤ
ＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡであって、該プライ
マーＤＮＡの3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]中のＤＮＡ配列
[T]の5'末端側にアニーリングするように設計されたプ
ライマーＤＮＡ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応によ
るＤＮＡ増幅により、下記ＤＮＡ鎖[III]及びＤＮＡ鎖
[IV]： ＤＮＡ鎖[III]：該プライマー[P1]に相補的なＤＮＡ配
列及び該プライマーＤＮＡ[P2]と同一のＤＮＡ配列を各
々の末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を含
むＤＮＡ鎖；及び ＤＮＡ鎖[IV]：該プライマー[P1]と同一のＤＮＡ配列及
び該プライマーＤＮＡ[P2]に相補的なＤＮＡ配列を各々
の末端に有し、且つ制限酵素認識ＤＮＡ配列[X]を含む
ＤＮＡ鎖、とからなる組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]を調
製する工程； （ｂ）該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]の末端を制限酵素
[E2]及び制限酵素[E3]で消化して組換えゲノムＤＮＡ断
片[L2']を得、該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2']を、制限
酵素[E2]による切断末端ＤＮＡ配列及び制限酵素[E3]に
よる切断末端ＤＮＡ配列を各々の末端に有する該生物に
とって外来である外来性ＤＮＡと連結させることにより
環状ゲノムＤＮＡ[C3]を調製する工程；及び （ｃ）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E1]により制
限酵素認識ＤＮＡ配列[X]で切断して得られる組換えゲ
ノムＤＮＡ断片[L3]をターゲティングＤＮＡとして回収
する工程、を含むことを特徴とするターゲティングＤＮ
Ａの製造方法。 - 【請求項３８】 下記工程（ａ2）乃至（ａ4）： （ａ2）工程（ａ）で得た組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]
を分子内連結することにより環状ゲノムＤＮＡ[C2]を調
製する工程； （ａ3）宿主を該環状ゲノムＤＮＡ[C2]で形質転換する
ことにより得られる形質転換宿主を培養することにより
該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を増幅する工程；及び （ａ4）該環状ゲノムＤＮＡ[C2]を制限酵素[E2]及び／
または制限酵素[E3]により該分子内連結部位で切断し
て、所望の量の該組換えゲノムＤＮＡ断片[L2]を調製す
る工程、をさらに含むことを特徴とする請求項３７に記
載の製造方法。 - 【請求項３９】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子か
らなるＤＮＡであることを特徴とする請求項３７または
請求項３８に記載の製造方法。 - 【請求項４０】 該外来性ＤＮＡが、マーカー遺伝子及
びレポーター遺伝子からなるＤＮＡであることを特徴と
する請求項３７または請求項３８に記載の製造方法。 - 【請求項４１】 該レポーター遺伝子が、ルシフェラー
ゼまたはβラクタマーゼをコードする遺伝子であること
を特徴とする請求項４０に記載の製造方法。 - 【請求項４２】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が同一
の酵素であることを特徴とする請求項３７乃至請求項４
１のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項４３】 該制限酵素[E2]と制限酵素[E3]が各々
異なる酵素であることを特徴とする請求項３７乃至請求
項４１のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項４４】 該生物が、脊椎動物、昆虫、原生動
物、植物、細菌またはウイルスであることを特徴とする
請求項３７乃至請求項４３のいずれかに記載の製造方
法。 - 【請求項４５】 該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物である
ことを特徴とする請求項４４に記載の製造方法。 - 【請求項４６】 該非ヒト哺乳動物が、マウスであるこ
とを特徴とする請求項４５に記載の製造方法。 - 【請求項４７】 該ゲノムＤＮＡ断片[L1]が、マウスの
ゲノムＤＮＡ断片をバクテリア人工染色体（BAC）また
は酵母人工染色体（YAC）中にクローン化してなるマウ
スゲノムＤＮＡ断片のライブラリーから選別されたクロ
ーン中に含まれるマウスゲノムＤＮＡ断片に由来するも
のであることを特徴とする請求項４６に記載の製造方
法。 - 【請求項４８】 該環状ゲノムＤＮＡ[C1]が、該生物の
ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化して得られる任意のゲノ
ムＤＮＡ断片の各々と制限酵素[E1]で切断可能な制限酵
素認識ＤＮＡ配列[X]を有する発現ベクターＤＮＡとか
らなる複数種類の環状ゲノムＤＮＡからなるゲノムＤＮ
Ａライブラリー中に含まれていることを特徴とする請求
項３７乃至請求項４７のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項４９】 該ゲノムＤＮＡライブラリーが、該環
状ゲノムＤＮＡを複数のウェルを有するマイクロプレー
トに配備してなるゲノムＤＮＡライブラリーであること
を特徴とする請求項４８に記載の製造方法。 - 【請求項５０】 該環状ゲノムＤＮＡ中に含まれる該ゲ
ノムＤＮＡ断片の大きさが、約５乃至約12Kbであること
を特徴とする請求項４８または請求項４９に記載の製造
方法。 - 【請求項５１】 約５乃至約12Kbの大きさの生物のゲノ
ムＤＮＡ断片を発現ベクターにクローン化してなる複数
種類のクローンからなるゲノムＤＮＡ断片ライブラリ
ー。 - 【請求項５２】 該ゲノムＤＮＡライブラリーが、該ク
ローンの各々を多数のウェルを有するマイクロプレート
に配備してなることを特徴とする請求項５１に記載のゲ
ノムＤＮＡライブラリー。 - 【請求項５３】 請求項１乃至請求項５０のいずれかに
記載の製造方法により得られるターゲティングＤＮＡ。 - 【請求項５４】 内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列が
修飾された組換え細胞、組換え細菌または組換えウイル
スの製造方法であって、生物の細胞、細菌またはウイル
スを請求項１乃至請求項１２または請求項３７乃至請求
項５０のいずれかに記載の製造方法により製造されるタ
ーゲティングベクターＤＮＡで形質転換し、該ターゲテ
ィングＤＮＡと該内在性ゲノムＤＮＡとの間の相同組換
えの結果、該内在性ゲノムＤＮＡに該ターゲティングベ
クターＤＮＡが組込まれている細胞、細菌またはウイル
スを選別し、取得することからなる製造方法。 - 【請求項５５】 内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列が
修飾された組換え細胞、組換え細菌または組換えウイル
スの製造方法であって、生物の細胞、細菌またはウイル
スを請求項１３乃至請求項３６のいずれかに記載の製造
方法により製造されるターゲティングベクターＤＮＡで
形質転換し、該ターゲティングＤＮＡと該内在性ゲノム
ＤＮＡとの間の相同組換えの結果、該内在性ゲノムＤＮ
Ａに該ターゲティングベクターＤＮＡが組込まれている
細胞、細菌またはウイルスを選別し、取得することから
なる製造方法。 - 【請求項５６】 該細胞、細菌またはウイルスの選別
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程；及び ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程、を含
むことを特徴とする請求項５５に記載の製造方法。 - 【請求項５７】 該細胞、細菌またはウイルスの選別
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]：プライマーＤＮＡ[P
3]：該ターゲティングベクターＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖
[I]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来のＤＮＡ配列及
びそれに隣接する制限酵素[E4]による切断末端ＤＮＡ配
列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤＮ
Ａ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖[II]に含まれる該外来性ＤＮＡの一
部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマ
ーＤＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ
増幅を行う工程； ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｃ）工程ｂ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記
のプライマーＤＮＡ[P5]及びプライマーＤＮＡ[P6]： プライマーＤＮＡ[P5]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P6]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[I]に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程；及び ｄ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程、を含
むことを特徴とする請求項５５に記載の製造方法。 - 【請求項５８】 該細胞、細菌またはウイルスの選別
が、下記の工程： ａ）該細胞、細菌またはウイルスの内在性ゲノムＤＮＡ
の各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡ
[P3]及びプライマーＤＮＡ[P4]： プライマーＤＮＡ[P3]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの一方のＤＮＡ鎖[I]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ
由来のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]によ
る切断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P4]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの他方のＤＮＡ鎖[II]に含まれる該外来性ＤＮＡの一
部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマ
ーＤＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ
増幅を行う工程； ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｃ）工程ｂ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、下記
のプライマーＤＮＡ[P5]及びプライマーＤＮＡ[P6]： プライマーＤＮＡ[P5]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側の該リンカーＤＮＡ由来
のＤＮＡ配列及びそれに隣接する制限酵素[E4]による切
断末端ＤＮＡ配列の一部に相補的なＤＮＡ配列を有する
プライマーＤＮＡ；及び、 プライマーＤＮＡ[P6]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[I]に含まれる該外来性ＤＮＡの一部の
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤ
ＮＡ、を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を行う工程； ｄ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められない細
胞、細菌またはウイルスを同定する工程； ｅ）該ターゲティングＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型と
し、該プライマーＤＮＡ[Ｐ3]及びプライマーＤＮＡ[P
5]を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を行
う工程； ｆ）増幅されたＤＮＡの各々の末端側に存在する制限酵
素認識ＤＮＡ配列[X]に隣接する内側のＤＮＡ配列を決
定する工程； ｇ）工程ｄ）で同定された細胞、細菌またはウイルスの
内在性ゲノムＤＮＡの各々のＤＮＡ鎖を鋳型とし、工程
ｆ）で決定されたＤＮＡ配列を基に下記のプライマーＤ
ＮＡ[P7]及びプライマーＤＮＡ[P8]： プライマーＤＮＡ[P7]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[I]の3'末端側に存在する制限酵素認識
ＤＮＡ配列[X]及びそれに隣接する内側のＤＮＡ配列の
一部に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡ；
及び、 プライマーＤＮＡ[P8]：該ターゲティングベクターＤＮ
Ａの該ＤＮＡ鎖[II]の3'末端側に存在する制限酵素認識
ＤＮＡ配列[X]及びそれに隣接する内側のＤＮＡ配列の
一部に相補的なＤＮＡ配列を有するプライマーＤＮＡ、
を用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅を行う
工程；及び、 ｈ）ゲル電気泳動によりＤＮＡの増幅が認められる細
胞、細菌またはウイルスを同定し、回収する工程；を含
むことを特徴とする請求項５５に記載の製造方法。 - 【請求項５９】 該生物の細胞が、脊椎動物、昆虫、原
生動物、及び植物からなる群から選ばれるいずれかの生
物の細胞であることを特徴とする請求項５４乃至請求項
５８のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項６０】 該脊椎動物が、非ヒト哺乳動物である
ことを特徴とする請求項５９に記載の製造方法。 - 【請求項６１】 該非ヒト哺乳動物が、マウスであるこ
とを特徴とする請求項６０に記載の方法。 - 【請求項６２】 該ターゲティングベクターＤＮＡが、
請求項１１、請求項２３、請求項３５または請求項４７
のいずれかに記載の製造方法により製造されるターゲテ
ィングベクターＤＮＡであることを特徴とする請求項６
１に記載の製造方法。 - 【請求項６３】 該細胞が、胚性幹細胞であることを特
徴とする請求項６０乃至請求項６２のいずれかに記載の
製造方法。 - 【請求項６４】 該修飾が、該ＤＮＡ配列のmRNAへの転
写を不能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能た
らしめるものであることを特徴とする請求項５４乃至請
求項６３のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項６５】 請求項５４乃至請求項６４のいずれか
に記載の製造方法により得られる組換え細胞、組換え細
菌または組換えウイルス。 - 【請求項６６】 請求項６３に記載の製造方法により得
られる組換え胚性幹細胞。 - 【請求項６７】 内在性ゲノムDNA中の一部のDNA配列が
修飾された組換え非ヒト哺乳動物の製造方法であって、
下記（ａ）乃至（ｅ）の工程： （ａ）雌性非ヒト哺乳動物[A]の受精卵に、請求項６３
に記載の製造方法により得られる組換え胚性幹細胞を注
入し組換え受精卵を得る工程； （ｂ）該組換え受精卵を、雌性非ヒト哺乳動物[B]の子
宮に移植する工程；及び、 （ｃ）該雌性非ヒト哺乳動物[B]が出産する雄性または
雌性の胎児[P]を得る工程、 （ｄ）下記（１）または（２）のいずれかの工程： （１）該胎児[P]が成長してなる雄性非ヒト哺乳動物[C]
を雌性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[D]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る工
程；または、 （２）該胎児[P]が成長してなる雌性非ヒト哺乳動物[C]
を雄性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト哺乳
動物[C]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る工
程； （ｅ）該胎児[Q]が成長してなる雄性または雌性の非ヒ
ト哺乳動物[E]から、該組換え胚性幹細胞のゲノムＤＮ
Ａ中の修飾に由来する修飾を、一対の染色体の一方に有
する雄性または雌性の該非ヒト哺乳動物[E]を選別し、
組換え非ヒト哺乳動物として得る工程、からなることを
特徴とする製造方法。 - 【請求項６８】 該雌性非ヒト哺乳動物[A]と該雌性非
ヒト哺乳動物[B]とが同一の個体であることを特徴とす
る請求項６７に記載の製造方法。 - 【請求項６９】 該雌性非ヒト哺乳動物[A]と該雌性非
ヒト哺乳動物[B]とが各々異なる個体であることを特徴
とする請求項６７に記載の製造方法。 - 【請求項７０】 請求項６７乃至請求項６９のいずれか
に記載の製造方法であって、さらに下記の工程（ｆ）及
び（ｇ）： （ｆ）下記（１）または（２）のいずれかの工程： （１）工程（ｅ）で得られた雄性組換え非ヒト哺乳動物
[E]を雌性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺
乳動物[F]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工
程；または、 （２）工程（ｅ）で得られた雌性組換え非ヒト哺乳動物
[E]を雄性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非ヒト哺
乳動物[E]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を得る工
程；及び、 （ｇ）該胎児[R]が成長してなる雄性または雌性の非ヒ
ト哺乳動物[G]から、該組換え胚性幹細胞のゲノムＤＮ
Ａ中の修飾に由来する修飾を、一対の染色体の両方に有
する雄性または雌性の該非ヒト哺乳動物[G]を選別し、
組換え非ヒト哺乳動物として得る工程、からなることを
特徴とする製造方法。 - 【請求項７１】 該工程（ｄ）が、雄性非ヒト哺乳動物
[C]を雌性非ヒト哺乳動物[D]と交配させ該雌性非ヒト哺
乳動物[C]が出産する雄性または雌性の胎児[Q]を得る工
程からなることを特徴とする請求項６７乃至請求項７０
のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項７２】 該工程（ｆ）が、雄性組換え非ヒト哺
乳動物[E]を雌性非ヒト哺乳動物[F]と交配させ該雌性非
ヒト哺乳動物[F]が出産する雄性または雌性の胎児[R]を
得る工程からなることを特徴とする請求項７０または請
求項７１に記載の製造方法。 - 【請求項７３】 該修飾が、該ＤＮＡ配列のmRNAへの転
写を不能たらしめ、且つ該外来性ＤＮＡの発現を可能た
らしめるものであることを特徴とする請求項６７乃至請
求項７２のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項７４】 該非ヒト哺乳動物が、マウスであるこ
とを特徴とする請求項６７乃至請求項７３のいずれかに
記載の製造方法。 - 【請求項７５】 ｃＤＮＡライブラリーに含まれる所望
のｃＤＮＡを保持するクローンを同定し取得する方法で
あって、下記工程（ａ）乃至（ｃ）： （ａ）該ｃＤＮＡライブラリーの各々のクローンに対し
て、下記プライマーＤＮＡ[P1]及びプライマーＤＮＡ[P
2]： プライマーＤＮＡ[P1]：該所望のｃＤＮＡの一方のＤＮ
Ａ鎖[I]の一部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤＮＡの
3'末端が該ＤＮＡ鎖[I]の一部のＤＮＡ配列の5'末端側
にアニーリングするように設計されたプライマーＤＮ
Ａ；及び プライマーＤＮＡ[P2]：該所望のｃＤＮＡの他方のＤＮ
Ａ鎖[II]の一部のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を有
するプライマーＤＮＡであって、該プライマーＤＮＡの
3'末端が該ＤＮＡ鎖[II]の一部のＤＮＡ配列の5'末端側
にアニーリングするように設計されたプライマーＤＮ
Ａ、を用いた逆ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅
を施す工程； （ｂ）ゲル電気泳動によりＤＮＡ増幅が認められるクロ
ーンを同定する工程；及び （ｃ）該同定したクローンを取得する工程、からなる方
法。 - 【請求項７６】 該ｃＤＮＡライブラリーが、各々のク
ローンを多数のウェルを有するマイクロプレートに配備
してなるｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする
請求項７５に記載の方法。 - 【請求項７７】 該所望のｃＤＮＡが、オープンリーデ
ィングフレーム（ORF）を含むことを特徴とする請求項
７５または請求項７６に記載の方法。 - 【請求項７８】 該所望のｃＤＮＡが、3'UTR、ORF及び
5'UTRを含むことを特徴とする請求項７５乃至請求項７
７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７９】 該プライマー[P1]及びプライマー[P2]
の各々が、下記のいずれか： （ａ）該所望のｃＤＮＡのＯＲＦにアニーリングする； （ｂ）一方が該所望のｃＤＮＡのORFにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの5'UTRにアニーリン
グする； （ｃ）一方が該所望のｃＤＮＡのORFにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの3'UTRにアニーリン
グする；または （ｄ）一方が該所望のｃＤＮＡの5'UTRにアニーリング
し、及び他方が該所望のｃＤＮＡの3'UTRにアニーリン
グする、の特徴を有するものであることを特徴とする請
求項７５乃至請求項７８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８０】 該ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳動物
のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡのライブラリーであるこ
とを特徴とする請求項７５乃至請求項７９のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項８１】 該哺乳動物が、マウス、ラットまたは
ヒトであることを特徴とする請求項８０に記載の方法。 - 【請求項８２】 配列番号２５に記載されるアミノ酸配
列を有するタンパクをコードするＤＮＡまたはその断
片。 - 【請求項８３】 配列番号２４に記載される塩基配列を
含むＤＮＡまたはその断片。 - 【請求項８４】 配列番号２４に記載される塩基配列の
塩基番号３乃至524の塩基を含むＤＮＡまたはその断
片。 - 【請求項８５】 配列番号２５に記載されるアミノ酸配
列を有するタンパクまたはその断片。 - 【請求項８６】 請求項８２乃至請求項８４のいずれか
に記載のＤＮＡ若しくはその断片を含む発現ベクター。 - 【請求項８７】 請求項８６に記載の発現ベクターで形
質転換された形質転換細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000081795A JP2000325091A (ja) | 1999-03-17 | 2000-03-17 | 相同組換え用ジーンターゲティングＤＮＡの製造方法及びｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7139099 | 1999-03-17 | ||
| JP11-71390 | 1999-03-17 | ||
| JP2000081795A JP2000325091A (ja) | 1999-03-17 | 2000-03-17 | 相同組換え用ジーンターゲティングＤＮＡの製造方法及びｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=26412493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2000081795A Pending JP2000325091A (ja) | 1999-03-17 | 2000-03-17 | 相同組換え用ジーンターゲティングＤＮＡの製造方法及びｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000325091A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111462823A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-28 | 西安交通大学 | 一种基于dna测序数据的同源重组缺陷判定方法 |
-
2000
- 2000-03-17 JP JP2000081795A patent/JP2000325091A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111462823A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-28 | 西安交通大学 | 一种基于dna测序数据的同源重组缺陷判定方法 |
| CN111462823B (zh) * | 2020-04-08 | 2022-07-12 | 西安交通大学 | 一种基于dna测序数据的同源重组缺陷判定方法 |
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