JP2000317436A - 汚染環境の生物学的浄化方法 - Google Patents
汚染環境の生物学的浄化方法Info
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- JP2000317436A JP2000317436A JP11125706A JP12570699A JP2000317436A JP 2000317436 A JP2000317436 A JP 2000317436A JP 11125706 A JP11125706 A JP 11125706A JP 12570699 A JP12570699 A JP 12570699A JP 2000317436 A JP2000317436 A JP 2000317436A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 添加した微生物の捕食を簡単な操作で効果的
に防止して、汚染環境を効率よく浄化することができる
汚染環境の生物学的浄化方法を提案する。 【解決手段】 過酸化水素水を汚染地下水路１７に注入
し、汚染地下水路１７および汚染土壌１６中に生息して
いる原生動物およびその他の微生物を殺菌したのち、培
養槽１中の培養液を汚染地下水路１７に注入し、微生物
２の作用により汚染環境中の汚染物質を分解する。
に防止して、汚染環境を効率よく浄化することができる
汚染環境の生物学的浄化方法を提案する。 【解決手段】 過酸化水素水を汚染地下水路１７に注入
し、汚染地下水路１７および汚染土壌１６中に生息して
いる原生動物およびその他の微生物を殺菌したのち、培
養槽１中の培養液を汚染地下水路１７に注入し、微生物
２の作用により汚染環境中の汚染物質を分解する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有害物質で汚染さ
れた土壌または地下水等の汚染環境を生物学的に浄化す
る汚染環境の生物学的浄化方法に関するものである。
れた土壌または地下水等の汚染環境を生物学的に浄化す
る汚染環境の生物学的浄化方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】有機塩素化合物等の化学物質その他の有
害物質により土壌または地下水等の環境が汚染される
と、その汚染は長期にわたって続き、また汚染が広範囲
に拡散するので、汚染環境の浄化が必要になる。このよ
うな有害物質で汚染された土壌または地下水を浄化する
場合、汚染から年数が経過していない、比較的範囲の狭
い高濃度の汚染に対しては物理化学的な処理が有効であ
るが、ある程度の時間が経過し、拡散や地下水の流れに
よって汚染物質が広範囲に広がった後の低濃度汚染に対
しては生物学的な浄化が効果的であると言われている。
害物質により土壌または地下水等の環境が汚染される
と、その汚染は長期にわたって続き、また汚染が広範囲
に拡散するので、汚染環境の浄化が必要になる。このよ
うな有害物質で汚染された土壌または地下水を浄化する
場合、汚染から年数が経過していない、比較的範囲の狭
い高濃度の汚染に対しては物理化学的な処理が有効であ
るが、ある程度の時間が経過し、拡散や地下水の流れに
よって汚染物質が広範囲に広がった後の低濃度汚染に対
しては生物学的な浄化が効果的であると言われている。
【０００３】土壌または地下水中の有害物質を生物学的
に浄化するには、有機物や栄養塩および酸素などを汚染
サイトに添加し、対象汚染物質を分解できる微生物を現
場に生育させることが必要であり、また場合によっては
温度やｐＨ等の環境条件の制御が必要な場合もある。そ
して対象汚染物質が生物易分解性であり、その分解微生
物が現場サイトにある一定量以上存在する場合は、特定
の微生物を外部から添加せず、現場に土着する微生物を
処理に利用するのが一般的である。しかし、現場サイト
に分解菌がほとんど存在しない場合や、汚染物質が生物
難分解性であり、汚染物質を基質とした増殖だけでは高
い分解効率が得られない場合や、その汚染物質をエネル
ギー源や炭素源として増殖できる微生物が地球上に存在
しない場合などは、外部から特定の分解微生物を添加
し、処理の効率化を図ることが必要である。
に浄化するには、有機物や栄養塩および酸素などを汚染
サイトに添加し、対象汚染物質を分解できる微生物を現
場に生育させることが必要であり、また場合によっては
温度やｐＨ等の環境条件の制御が必要な場合もある。そ
して対象汚染物質が生物易分解性であり、その分解微生
物が現場サイトにある一定量以上存在する場合は、特定
の微生物を外部から添加せず、現場に土着する微生物を
処理に利用するのが一般的である。しかし、現場サイト
に分解菌がほとんど存在しない場合や、汚染物質が生物
難分解性であり、汚染物質を基質とした増殖だけでは高
い分解効率が得られない場合や、その汚染物質をエネル
ギー源や炭素源として増殖できる微生物が地球上に存在
しない場合などは、外部から特定の分解微生物を添加
し、処理の効率化を図ることが必要である。
【０００４】ところで特定の微生物を汚染サイトに注入
する場合、対象とする土壌または地下水中にはもともと
他の様々な生物が存在するため、これらが添加した微生
物の機能や生育を阻害する場合がある。中でも原生動物
による添加微生物の捕食は大きな問題であり、特にｆｌ
ａｇｅｌｌａｔｅやｃｉｌｉａｔｅと呼ばれる原生動物
は微生物を捕食しながら急速に増殖するため、数時間の
内に添加した微生物のほとんどを食べ尽くしてしまう場
合がある（Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｍｉｃｒｏ．Ｅｃｏｌ．，３０，ｐ６７−７
８）。
する場合、対象とする土壌または地下水中にはもともと
他の様々な生物が存在するため、これらが添加した微生
物の機能や生育を阻害する場合がある。中でも原生動物
による添加微生物の捕食は大きな問題であり、特にｆｌ
ａｇｅｌｌａｔｅやｃｉｌｉａｔｅと呼ばれる原生動物
は微生物を捕食しながら急速に増殖するため、数時間の
内に添加した微生物のほとんどを食べ尽くしてしまう場
合がある（Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｍｉｃｒｏ．Ｅｃｏｌ．，３０，ｐ６７−７
８）。
【０００５】現場環境下にもともと存在する微生物は、
増殖と原生動物による捕食が均衡を保っているか、ある
いは生物膜を形成したり、糸状性になったりすることに
よって原生動物による捕食を防ぎながら（Ｍ．Ｗ．Ｈａ
ｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，ｐ１９１０−１９１８）生育
していると考えられる。しかし、汚染サイトとは異なる
環境で培養された後に現場へ注入される微生物の場合、
原生動物の捕食に対する備えを持たないため、添加後速
やかに原生動物の餌食になってしまう可能性が高い。
増殖と原生動物による捕食が均衡を保っているか、ある
いは生物膜を形成したり、糸状性になったりすることに
よって原生動物による捕食を防ぎながら（Ｍ．Ｗ．Ｈａ
ｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，ｐ１９１０−１９１８）生育
していると考えられる。しかし、汚染サイトとは異なる
環境で培養された後に現場へ注入される微生物の場合、
原生動物の捕食に対する備えを持たないため、添加後速
やかに原生動物の餌食になってしまう可能性が高い。
【０００６】現場にて増殖可能なタイプの微生物であっ
ても、増殖速度よりも捕食される速度が大きければ、菌
数は時間と共に減少してしまう。増殖速度の方が捕食速
度より大きい場合でも、捕食される分、見かけの増殖速
度は低下する。いずれにしろ、汚染物質の処理効果は原
生動物の捕食によって大幅に低下してしまうことにな
る。さらに、もともと現場の環境下では増殖することが
できない、使い捨てタイプの分解微生物の場合、本来の
機能を十分に発揮する前に原生動物に捕食されて、添加
菌体量当たりの処理効果が著しく低下してしまう結果に
なる。
ても、増殖速度よりも捕食される速度が大きければ、菌
数は時間と共に減少してしまう。増殖速度の方が捕食速
度より大きい場合でも、捕食される分、見かけの増殖速
度は低下する。いずれにしろ、汚染物質の処理効果は原
生動物の捕食によって大幅に低下してしまうことにな
る。さらに、もともと現場の環境下では増殖することが
できない、使い捨てタイプの分解微生物の場合、本来の
機能を十分に発揮する前に原生動物に捕食されて、添加
菌体量当たりの処理効果が著しく低下してしまう結果に
なる。
【０００７】このような、原生動物の捕食を防ぐ方法と
して、微生物をポリビニルアルコールやポリアクリルア
ミド等の高分子化合物を用いて包括固定化する方法（例
えば特開平７−９７６７３号）、微生物を吸水性ポリマ
ーに保持させて汚染環境に注入して浄化する方法（例え
ば特開平７−１２４５４３号）が提案されている。しか
し、これら従来の方法はコスト高になるほか、微生物を
固定化または保持させる操作が複雑で熟練を要するなど
の問題点がある。
して、微生物をポリビニルアルコールやポリアクリルア
ミド等の高分子化合物を用いて包括固定化する方法（例
えば特開平７−９７６７３号）、微生物を吸水性ポリマ
ーに保持させて汚染環境に注入して浄化する方法（例え
ば特開平７−１２４５４３号）が提案されている。しか
し、これら従来の方法はコスト高になるほか、微生物を
固定化または保持させる操作が複雑で熟練を要するなど
の問題点がある。
【０００８】また捕食微生物排除剤を用いて捕食生物を
浄化対象領域から排除し、微生物を捕食から守る方法
（例えば特開平７−８８４６５号）も提案されている。
この方法は、捕食微生物に対して負の化学走性を誘起す
る物質を浄化対象領域に添加するか、または正の化学走
性を誘起する物質を浄化対象領域に隣接する領域に添加
し、化学走性を誘起する物質の濃度勾配を形成させるこ
とにより捕食微生物を浄化対象領域外に移動させ、これ
により汚染物質を分解する微生物を捕食から守る方法で
ある。しかし、上記従来の方法では、すべての捕食微生
物に対して有効に作用する化学走性誘起物質は知られて
いないので、浄化する場所の違いにより捕食防止効果が
変動するほか、化学走性誘起物質の選択が難しいという
問題点がある。また添加した化学走性誘起物質により微
生物の活性が低下する恐れもある。
浄化対象領域から排除し、微生物を捕食から守る方法
（例えば特開平７−８８４６５号）も提案されている。
この方法は、捕食微生物に対して負の化学走性を誘起す
る物質を浄化対象領域に添加するか、または正の化学走
性を誘起する物質を浄化対象領域に隣接する領域に添加
し、化学走性を誘起する物質の濃度勾配を形成させるこ
とにより捕食微生物を浄化対象領域外に移動させ、これ
により汚染物質を分解する微生物を捕食から守る方法で
ある。しかし、上記従来の方法では、すべての捕食微生
物に対して有効に作用する化学走性誘起物質は知られて
いないので、浄化する場所の違いにより捕食防止効果が
変動するほか、化学走性誘起物質の選択が難しいという
問題点がある。また添加した化学走性誘起物質により微
生物の活性が低下する恐れもある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、添加
した微生物の捕食を簡単な操作で効果的に防止して、汚
染環境を効率よく浄化することができる汚染環境の生物
学的浄化方法を提案することである。
した微生物の捕食を簡単な操作で効果的に防止して、汚
染環境を効率よく浄化することができる汚染環境の生物
学的浄化方法を提案することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は次の汚染環境の
生物学的浄化方法である。 （１）汚染物質浄化能を有する微生物を汚染環境に注入
して浄化する方法において、微生物を注入する前に注入
地点を薬剤または熱処理により殺菌処理することを特徴
とする汚染環境の生物学的浄化方法。 （２）薬剤が過酸化水素である上記（１）記載の方法。 （３）熱処理がスチームの吹き込みまたは生石灰の添加
である上記（１）記載の方法。
生物学的浄化方法である。 （１）汚染物質浄化能を有する微生物を汚染環境に注入
して浄化する方法において、微生物を注入する前に注入
地点を薬剤または熱処理により殺菌処理することを特徴
とする汚染環境の生物学的浄化方法。 （２）薬剤が過酸化水素である上記（１）記載の方法。 （３）熱処理がスチームの吹き込みまたは生石灰の添加
である上記（１）記載の方法。
【００１１】汚染物質浄化能を有する微生物を有害物質
により汚染された土壌または地下水などの環境に注入
（添加）し続けると、注入された微生物を好んで捕食す
る原生動物がその地点でどんどん増殖してしまう。この
ため、微生物による環境浄化の効果は注入初期に比べて
時間の経過とともに減少する。従って、注入した微生物
の機能を有効に発揮させるためには、注入地点での原生
動物の個体数ができるだけ少ない時点で微生物の注入を
開始するのが効果的である。
により汚染された土壌または地下水などの環境に注入
（添加）し続けると、注入された微生物を好んで捕食す
る原生動物がその地点でどんどん増殖してしまう。この
ため、微生物による環境浄化の効果は注入初期に比べて
時間の経過とともに減少する。従って、注入した微生物
の機能を有効に発揮させるためには、注入地点での原生
動物の個体数ができるだけ少ない時点で微生物の注入を
開始するのが効果的である。
【００１２】そこで、本発明の方法においては、微生物
を添加する前に、注入地点を薬剤または熱処理により殺
菌処理することにより、できるだけ多くの、好ましくは
すべての種類の原生動物の個体数を減少させ、捕食を防
止する。なお殺菌する地点には、微生物が拡散する領域
が含まれる。殺菌処理により原生動物以外の他の微生物
も大幅に減少することになるが、他の微生物は原生動物
の餌になるものであるため、これらが減少することは、
殺菌処理後に原生動物が再び増加する時間を遅らせるこ
とになるので好ましい。
を添加する前に、注入地点を薬剤または熱処理により殺
菌処理することにより、できるだけ多くの、好ましくは
すべての種類の原生動物の個体数を減少させ、捕食を防
止する。なお殺菌する地点には、微生物が拡散する領域
が含まれる。殺菌処理により原生動物以外の他の微生物
も大幅に減少することになるが、他の微生物は原生動物
の餌になるものであるため、これらが減少することは、
殺菌処理後に原生動物が再び増加する時間を遅らせるこ
とになるので好ましい。
【００１３】殺菌処理により原生動物が減少したのち直
ちに微生物の注入を開始するのが効果的であるので、実
施する殺菌処理は残留効果が低いものが好ましい。従っ
て、殺菌処理に使用する薬剤としては土壌または地下水
などの環境に注入した場合に、原生動物を容易に殺すこ
とができるとともに、速やかに分解して無害な水と酸素
とに変化する過酸化水素が適している。
ちに微生物の注入を開始するのが効果的であるので、実
施する殺菌処理は残留効果が低いものが好ましい。従っ
て、殺菌処理に使用する薬剤としては土壌または地下水
などの環境に注入した場合に、原生動物を容易に殺すこ
とができるとともに、速やかに分解して無害な水と酸素
とに変化する過酸化水素が適している。
【００１４】過酸化水素以外の薬剤としては、塩素ガ
ス、サラシ粉、高度サラシ粉、次亜塩素酸ナトリウム、
二酸化塩素、クロラミンＢ、クロラミンＴ、パラゾー
ン、ジクロロジメチルヒダントイン、塩素化イソシアヌ
ル酸およびその塩等の塩素系殺菌剤；ヨードチンキ、ヨ
ードホルム、ヨードフォール等のヨウ素系殺菌剤；エタ
ノール、メタノール、イソプロパノール等のアルコール
系殺菌剤；フェノール、クレゾール、パラクロロメタキ
シレノール等のフェノール系殺菌剤；ホルムアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド系殺菌剤；アル
キルポリアミノエチルグリシン、アルキルジグリシン塩
酸塩等の両性界面活性剤；塩化ベンザルコニウム、塩化
ベンゼトニウム等のカチオン系界面活性剤；グルコン酸
クロルヘキシジン、ポリヘキサメチレンビグアニジン塩
酸塩等のグアニジン系殺菌剤などがあげられる。
ス、サラシ粉、高度サラシ粉、次亜塩素酸ナトリウム、
二酸化塩素、クロラミンＢ、クロラミンＴ、パラゾー
ン、ジクロロジメチルヒダントイン、塩素化イソシアヌ
ル酸およびその塩等の塩素系殺菌剤；ヨードチンキ、ヨ
ードホルム、ヨードフォール等のヨウ素系殺菌剤；エタ
ノール、メタノール、イソプロパノール等のアルコール
系殺菌剤；フェノール、クレゾール、パラクロロメタキ
シレノール等のフェノール系殺菌剤；ホルムアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド系殺菌剤；アル
キルポリアミノエチルグリシン、アルキルジグリシン塩
酸塩等の両性界面活性剤；塩化ベンザルコニウム、塩化
ベンゼトニウム等のカチオン系界面活性剤；グルコン酸
クロルヘキシジン、ポリヘキサメチレンビグアニジン塩
酸塩等のグアニジン系殺菌剤などがあげられる。
【００１５】また熱処理による殺菌処理も、処理終了後
は土壌や水で速やかに冷却されるので好ましい。具体的
な熱処理としては、スチームを吹き込む方法；石灰石を
添加し、添加した地点の水と反応させることにより発熱
させて殺菌する方法などがあげられる。これらの殺菌方
法は簡便で好ましいが、他の殺菌方法を採用することも
できる。
は土壌や水で速やかに冷却されるので好ましい。具体的
な熱処理としては、スチームを吹き込む方法；石灰石を
添加し、添加した地点の水と反応させることにより発熱
させて殺菌する方法などがあげられる。これらの殺菌方
法は簡便で好ましいが、他の殺菌方法を採用することも
できる。
【００１６】殺菌処理は繰り返して行うことができ、例
えば原生動物の個体数が増加した時点で再び殺菌処理す
ることもできる。このように、殺菌処理することによ
り、原生動物による微生物の捕食を抑制して、汚染物質
の浄化を効率よく行うことができる。
えば原生動物の個体数が増加した時点で再び殺菌処理す
ることもできる。このように、殺菌処理することによ
り、原生動物による微生物の捕食を抑制して、汚染物質
の浄化を効率よく行うことができる。
【００１７】本発明において浄化の対象となる汚染環境
は、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン（ＴＣ
Ｅ）、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン、ｔｒａｎｓ
−１，２−ジクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレ
ン、ビニルクロリド、塩化メチル、ジクロロメタン、ク
ロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、
１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタ
ン、１，１，２−トリクロロエタン、１，３−ジクロロ
プロペン、１，２−ジクロロプロパン、クロロベンゼ
ン、ジクロロベンゼン、ＰＣＢ、ダイオキシン類等の有
機塩素化合物；ベンゼン、エチルベンゼン、トルエン、
キシレン、多環芳香族化合物、重金属などの有害物質に
より汚染された土壌または地下水などの環境である。こ
のような環境には汚染源が河川や湖沼である場合には、
これらの河川や湖沼も含まれる。
は、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン（ＴＣ
Ｅ）、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン、ｔｒａｎｓ
−１，２−ジクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレ
ン、ビニルクロリド、塩化メチル、ジクロロメタン、ク
ロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、
１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタ
ン、１，１，２−トリクロロエタン、１，３−ジクロロ
プロペン、１，２−ジクロロプロパン、クロロベンゼ
ン、ジクロロベンゼン、ＰＣＢ、ダイオキシン類等の有
機塩素化合物；ベンゼン、エチルベンゼン、トルエン、
キシレン、多環芳香族化合物、重金属などの有害物質に
より汚染された土壌または地下水などの環境である。こ
のような環境には汚染源が河川や湖沼である場合には、
これらの河川や湖沼も含まれる。
【００１８】このような汚染環境を浄化するために添加
する微生物は、汚染環境に含まれる汚染有害物質を分解
または無害化して浄化する汚染物質浄化能を有する微生
物である。このような微生物はその後の効果の持続性の
観点から次の２つのタイプに分けることができる。その
一つは、現場にて増殖でき、一度注入すれば処理効果が
継続するタイプのものである。それに対し、他の一つは
現場では増殖できず、添加した微生物が一定の機能を発
揮した後、やがてはその機能を失う使い捨てタイプのも
のである。
する微生物は、汚染環境に含まれる汚染有害物質を分解
または無害化して浄化する汚染物質浄化能を有する微生
物である。このような微生物はその後の効果の持続性の
観点から次の２つのタイプに分けることができる。その
一つは、現場にて増殖でき、一度注入すれば処理効果が
継続するタイプのものである。それに対し、他の一つは
現場では増殖できず、添加した微生物が一定の機能を発
揮した後、やがてはその機能を失う使い捨てタイプのも
のである。
【００１９】本発明で使用する微生物は、上記二つのい
ずれのタイプのものでもよく、自然界から単離された純
粋培養菌、純粋培養菌の数種類を混合した微生物群、対
象汚染物質に対する高い分解活性を示すような条件で集
積された混合微生物、自然界に存在する微生物よりも高
い分解能を示すように遺伝子組換え操作によって改良さ
れた遺伝子組換え体、およびこれらの混合物などが使用
できる。
ずれのタイプのものでもよく、自然界から単離された純
粋培養菌、純粋培養菌の数種類を混合した微生物群、対
象汚染物質に対する高い分解活性を示すような条件で集
積された混合微生物、自然界に存在する微生物よりも高
い分解能を示すように遺伝子組換え操作によって改良さ
れた遺伝子組換え体、およびこれらの混合物などが使用
できる。
【００２０】上記遺伝子組換え体としては、例えばトリ
クロロエチレン（ＴＣＥ）を分解できるように改変され
た遺伝子組換え体であるPseudomonas putida KN1-10A
（環境工学研究論文集、Ｖｏｌ．３３、ｐ１６５−１７
５、１９９６）、Ralstonia sp. KN1-200A（Pseudomona
s putida KN1-200Aが改名されたものであり、Pseudomon
as putida KN1-200Aについては特開平１１−１８７７３
号に詳しく記載されている）、Ralstonia sp. KN1-210A
（Pseudomonas putida KN1-210Aが改名されたものであ
り、Pseudomonas putida KN1-210Aについては特開平１
１−１８７７４号に詳しく記載されている）などがあげ
られる。これらの組換え体は、ＴＣＥを酸化分解できる
酵素フェノールヒドロキシラーゼをコードする遺伝子
が、フェノール誘導なしに発現するように改変された遺
伝子組換え体である。その他にも、塩素化エチレン分解
能を有するEscherichia coli KWI-10（通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９６６の微生物受託番号で寄託されており、その菌株的
性質および培養方法等については特開平７−１４３８８
２号に記載されている）などがあげられる。これらの組
換え体はＴＣＥを基質として増殖することはできないた
め、土壌または地下水に添加した菌体は一定量のＴＣＥ
を分解した後、死滅する。
クロロエチレン（ＴＣＥ）を分解できるように改変され
た遺伝子組換え体であるPseudomonas putida KN1-10A
（環境工学研究論文集、Ｖｏｌ．３３、ｐ１６５−１７
５、１９９６）、Ralstonia sp. KN1-200A（Pseudomona
s putida KN1-200Aが改名されたものであり、Pseudomon
as putida KN1-200Aについては特開平１１−１８７７３
号に詳しく記載されている）、Ralstonia sp. KN1-210A
（Pseudomonas putida KN1-210Aが改名されたものであ
り、Pseudomonas putida KN1-210Aについては特開平１
１−１８７７４号に詳しく記載されている）などがあげ
られる。これらの組換え体は、ＴＣＥを酸化分解できる
酵素フェノールヒドロキシラーゼをコードする遺伝子
が、フェノール誘導なしに発現するように改変された遺
伝子組換え体である。その他にも、塩素化エチレン分解
能を有するEscherichia coli KWI-10（通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９６６の微生物受託番号で寄託されており、その菌株的
性質および培養方法等については特開平７−１４３８８
２号に記載されている）などがあげられる。これらの組
換え体はＴＣＥを基質として増殖することはできないた
め、土壌または地下水に添加した菌体は一定量のＴＣＥ
を分解した後、死滅する。
【００２１】このような有用な機能を持った特定の微生
物を自然環境に添加する際、それらを捕食し効果を減少
させてしまうのは原生動物であり、その中で特に問題と
なるのはｆｌａｇｅｌｌａｔｅやｃｉｌｉａｔｅなどで
ある。これらは微生物を捕食することによって急速に増
殖していく。このため、殺菌処理により、これらの原生
動物の個体数を減少させ、注入した微生物の捕食を防止
する。
物を自然環境に添加する際、それらを捕食し効果を減少
させてしまうのは原生動物であり、その中で特に問題と
なるのはｆｌａｇｅｌｌａｔｅやｃｉｌｉａｔｅなどで
ある。これらは微生物を捕食することによって急速に増
殖していく。このため、殺菌処理により、これらの原生
動物の個体数を減少させ、注入した微生物の捕食を防止
する。
【００２２】微生物の注入の方法は、微生物を汚染され
た土壌表面に散布する方法、注入管から土壌中に注入す
る方法、地下水源に注入する方法などがある。浄化の方
法はこれらの微生物を注入するだけでよい場合もある
が、微生物の種類によっては水、酸素、栄養源等を供給
することもできる。
た土壌表面に散布する方法、注入管から土壌中に注入す
る方法、地下水源に注入する方法などがある。浄化の方
法はこれらの微生物を注入するだけでよい場合もある
が、微生物の種類によっては水、酸素、栄養源等を供給
することもできる。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば、殺菌処理したのち汚染
物質浄化能を有する微生物を汚染環境に注入して浄化す
るようにしたので、添加した微生物の捕食を簡単な操作
で効果的に防止して、汚染環境を効率よく浄化すること
ができる。
物質浄化能を有する微生物を汚染環境に注入して浄化す
るようにしたので、添加した微生物の捕食を簡単な操作
で効果的に防止して、汚染環境を効率よく浄化すること
ができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】本発明の方法を図面を用いて説明
する。図１は微生物を汚染地下水に注入して浄化する例
を示す実施例の模式的断面図であり、１は培養槽、２は
微生物、３は注入井、１５は表面土壌、１６は汚染土
壌、１７は汚染地下水路、１８は不透水層である。注入
井３は表面土壌１５からその下端が汚染地下水路１７に
到達するように形成されている。
する。図１は微生物を汚染地下水に注入して浄化する例
を示す実施例の模式的断面図であり、１は培養槽、２は
微生物、３は注入井、１５は表面土壌、１６は汚染土
壌、１７は汚染地下水路、１８は不透水層である。注入
井３は表面土壌１５からその下端が汚染地下水路１７に
到達するように形成されている。
【００２５】図１の方法では、培養槽１に微生物供給路
５から植種用微生物を添加した後、培養する微生物が資
化できる有機物および栄養塩類を栄養素供給路６から添
加し、必要により送気路７から空気または酸素を送気す
るとともに、撹拌機８で撹拌しながら培養し、注入用の
培養液を準備する。培養は微生物２の増殖に最適な温度
に制御しながら行うのが好ましい。
５から植種用微生物を添加した後、培養する微生物が資
化できる有機物および栄養塩類を栄養素供給路６から添
加し、必要により送気路７から空気または酸素を送気す
るとともに、撹拌機８で撹拌しながら培養し、注入用の
培養液を準備する。培養は微生物２の増殖に最適な温度
に制御しながら行うのが好ましい。
【００２６】培養液の準備ができた時点で、ポンプ１２
を駆動し、過酸化水素水を薬注路１３を通して注入井３
に導入し、注入井３の下端から汚染地下水路１７に注入
する。このようにして汚染地下水路１７中に注入された
過酸化水素水は、地下水の流れ（図１では、左から右）
に乗って下流に拡散するとともに、汚染土壌１６中にも
入り込み、これらの領域に生息している原生動物および
その他の微生物が殺菌される。
を駆動し、過酸化水素水を薬注路１３を通して注入井３
に導入し、注入井３の下端から汚染地下水路１７に注入
する。このようにして汚染地下水路１７中に注入された
過酸化水素水は、地下水の流れ（図１では、左から右）
に乗って下流に拡散するとともに、汚染土壌１６中にも
入り込み、これらの領域に生息している原生動物および
その他の微生物が殺菌される。
【００２７】次に培養槽１中の培養液を、ポンプ１０に
より注入井路１１を通して注入井３に導入し、注入井３
の下端から汚染地下水路１７に注入する。このようにし
て汚染地下水路１７中に注入された微生物２は、地下水
の流れに乗って下流に拡散するとともに、汚染土壌１６
中にも入り込む。このようにして汚染地下水路１７およ
び汚染土壌１６に注入された微生物２の作用により、汚
染環境中の汚染物質が分解される。この場合、注入され
た微生物２が拡散する領域に生息している原生動物の個
体数は少ないので捕食される微生物２の数も少なく、こ
のため効率よく汚染環境を浄化することができる。
より注入井路１１を通して注入井３に導入し、注入井３
の下端から汚染地下水路１７に注入する。このようにし
て汚染地下水路１７中に注入された微生物２は、地下水
の流れに乗って下流に拡散するとともに、汚染土壌１６
中にも入り込む。このようにして汚染地下水路１７およ
び汚染土壌１６に注入された微生物２の作用により、汚
染環境中の汚染物質が分解される。この場合、注入され
た微生物２が拡散する領域に生息している原生動物の個
体数は少ないので捕食される微生物２の数も少なく、こ
のため効率よく汚染環境を浄化することができる。
【００２８】時間の経過とともに原生動物の個体数は増
加してくるが、この場合は再度過酸化水素水を注入して
殺菌処理を行うことができる。また過酸化水素水の代わ
りに生石灰を添加し、汚染地下水路１７中の水と反応さ
せて発熱させることにより加熱処理することもできる。
またスチームを吹き込んで加熱殺菌することもできる。
加してくるが、この場合は再度過酸化水素水を注入して
殺菌処理を行うことができる。また過酸化水素水の代わ
りに生石灰を添加し、汚染地下水路１７中の水と反応さ
せて発熱させることにより加熱処理することもできる。
またスチームを吹き込んで加熱殺菌することもできる。
【００２９】なお、薬剤による殺菌処理を実施したの
ち、薬剤たとえば過酸化水素が注入微生物に害を与えな
い程度の濃度まで過酸化水素が分解するのに要する十分
な時間を空けてから、微生物を注入するのが好ましい。
また加熱処理の場合は、害を与えない温度まで冷却され
るのに要する時間を空けてから、微生物を注入するのが
好ましい。
ち、薬剤たとえば過酸化水素が注入微生物に害を与えな
い程度の濃度まで過酸化水素が分解するのに要する十分
な時間を空けてから、微生物を注入するのが好ましい。
また加熱処理の場合は、害を与えない温度まで冷却され
るのに要する時間を空けてから、微生物を注入するのが
好ましい。
【００３０】
【実施例】次に本発明の実施例について説明する。製造
例で使用したプラスミドおよび微生物は次の通りであ
る。
例で使用したプラスミドおよび微生物は次の通りであ
る。
【００３１】《ラルストニア ｓｐ． ＫＷＩ−９（Ra
lstonia sp. KWI-9）》フェノール資化能を有し、トル
エン資化能を有さない塩素化エチレン分解性菌株であ
る。塩素化エチレン分解性はフェノールの共存により著
しく阻害される。ラルストニア ｓｐ． ＫＷＩ−９
は、シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９（Pseudomona
s putida KWI-9）が改名されたものであり、シュードモ
ナス プチダＫＷＩ−９菌株は通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭＢＰ−６３５６（微
工研菌寄第Ｐ−１３１０９号より移管）の微生物受託番
号で寄託されており、その菌株的性質および培養方法等
については特開平６−７０７５３号に記載されている。 《E. coli S17-1株》IncP系プラスミドＲＰ４を染色体
上に内在する大腸菌であって、作成方法はBIO/TECHNOLO
GY 1, 784-791(1983)に記載されており、またUS. Depar
tment of Agriculture, Northern Regional Research C
enterに寄託されている（Accession No. B-15483, US.
Patent 4,680,264)。 《pTrc99A》タンパク質の発現ベクターpKK233-2（ファ
ルマシア社の製品コード番号27-4935-01）の誘導体。こ
のプラスミドはファルマシア社から市販されており、製
品コード番号は27-5007-01である。
lstonia sp. KWI-9）》フェノール資化能を有し、トル
エン資化能を有さない塩素化エチレン分解性菌株であ
る。塩素化エチレン分解性はフェノールの共存により著
しく阻害される。ラルストニア ｓｐ． ＫＷＩ−９
は、シュードモナス プチダ ＫＷＩ−９（Pseudomona
s putida KWI-9）が改名されたものであり、シュードモ
ナス プチダＫＷＩ−９菌株は通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭＢＰ−６３５６（微
工研菌寄第Ｐ−１３１０９号より移管）の微生物受託番
号で寄託されており、その菌株的性質および培養方法等
については特開平６−７０７５３号に記載されている。 《E. coli S17-1株》IncP系プラスミドＲＰ４を染色体
上に内在する大腸菌であって、作成方法はBIO/TECHNOLO
GY 1, 784-791(1983)に記載されており、またUS. Depar
tment of Agriculture, Northern Regional Research C
enterに寄託されている（Accession No. B-15483, US.
Patent 4,680,264)。 《pTrc99A》タンパク質の発現ベクターpKK233-2（ファ
ルマシア社の製品コード番号27-4935-01）の誘導体。こ
のプラスミドはファルマシア社から市販されており、製
品コード番号は27-5007-01である。
【００３２】製造例１ 《１．Ralstonia sp. KN1-200Aの作製》Ralstonia sp.
KWI-9の染色体上にコードされている塩素化エチレン分
解能を有するフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群を、
図２に示す。塩素化エチレン分解のための必須遺伝子
は、pheAからpheEまでの５つの遺伝子群（塩素化エチレ
ン分解遺伝子群）である。またpheA上流のpheZは塩素化
エチレン分解促進遺伝子である。pheZの上流に、下記方
法によりtacプロモーターを導入した。そしてRalstonia
sp. KN1-200Aを、以下に示すように相同的組換えによ
って作製した（図２参照）。
KWI-9の染色体上にコードされている塩素化エチレン分
解能を有するフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群を、
図２に示す。塩素化エチレン分解のための必須遺伝子
は、pheAからpheEまでの５つの遺伝子群（塩素化エチレ
ン分解遺伝子群）である。またpheA上流のpheZは塩素化
エチレン分解促進遺伝子である。pheZの上流に、下記方
法によりtacプロモーターを導入した。そしてRalstonia
sp. KN1-200Aを、以下に示すように相同的組換えによ
って作製した（図２参照）。
【００３３】１）相同的組換えに必要なpheZ上流の相同
部分の取得pheZ 上流の１．１ｋｂをＰＣＲで合成するために、以下
のプライマーペアを用い、Ralstonia sp. KWI-9の染色
体をテンプレートとした。 Upper Primer: 5'-GGG GAA TTC GGG GGA GGG GGT AAG G
GG GTG GTG-3' Lower Primer: 5'-GGG CCC GGG AAG AGC GTG CCA GCT G
GC GCA AAC-3' (Upper PrimerのアンダーラインはEcoRIサイト、Lower
PrimerのアンダーラインはSmaIサイトを示す。)
部分の取得pheZ 上流の１．１ｋｂをＰＣＲで合成するために、以下
のプライマーペアを用い、Ralstonia sp. KWI-9の染色
体をテンプレートとした。 Upper Primer: 5'-GGG GAA TTC GGG GGA GGG GGT AAG G
GG GTG GTG-3' Lower Primer: 5'-GGG CCC GGG AAG AGC GTG CCA GCT G
GC GCA AAC-3' (Upper PrimerのアンダーラインはEcoRIサイト、Lower
PrimerのアンダーラインはSmaIサイトを示す。)
【００３４】２）ＰＣＲ合成された相同部分の１．１ｋ
ｂの EcoRI-SmaI 断片のpKNA82（図３参照）への挿入 ＰＣＲ合成された相同部分の１．１ｋｂの EcoRI-SmaI
断片（図２においてＦ１で示されている断片）は、左右
にPacIサイトを有するプラスミドベクターpKNA82のEcoR
I-SmaIの部分に挿入した。
ｂの EcoRI-SmaI 断片のpKNA82（図３参照）への挿入 ＰＣＲ合成された相同部分の１．１ｋｂの EcoRI-SmaI
断片（図２においてＦ１で示されている断片）は、左右
にPacIサイトを有するプラスミドベクターpKNA82のEcoR
I-SmaIの部分に挿入した。
【００３５】３）相同的組換えに必要なpheZおよびpheA
の一部分を有する相同部分の取得pheZ およびpheAをＰＣＲ合成により取得するため、以下
のプライマーペアーを用いて、Ralstonia sp. KWI-9の
染色体をテンプレートとした。 Upper Primer: 5'-GGG GGA TCC CGC AAT AGA GGC CAT A
CC GCC CA-3' Lower Primer: 5'-CGC GGA TCC GGC GGT TTC CTC AGG C
GG CAA GGC-3' (Upper PrimerおよびLower PrimerのアンダーラインはB
amHIサイトを示す。)
の一部分を有する相同部分の取得pheZ およびpheAをＰＣＲ合成により取得するため、以下
のプライマーペアーを用いて、Ralstonia sp. KWI-9の
染色体をテンプレートとした。 Upper Primer: 5'-GGG GGA TCC CGC AAT AGA GGC CAT A
CC GCC CA-3' Lower Primer: 5'-CGC GGA TCC GGC GGT TTC CTC AGG C
GG CAA GGC-3' (Upper PrimerおよびLower PrimerのアンダーラインはB
amHIサイトを示す。)
【００３６】合成されたDNA断片は、BamHIとSalIで消化
し、pheZの開始点からpheA中のSalIサイトまでの１ｋｂ
の BamHI-SalI 断片（図２においてＦ２で示されている
断片）をもう一つの相同部分とした。
し、pheZの開始点からpheA中のSalIサイトまでの１ｋｂ
の BamHI-SalI 断片（図２においてＦ２で示されている
断片）をもう一つの相同部分とした。
【００３７】４）ＰＣＲ合成された相同部分の１ｋｂの
BamHI-SalI 断片のpKNA82への挿入 ＰＣＲ合成された相同部分の１ｋｂの BamHI-SalI 断片
（Ｆ２）は、前記２）ですでに挿入されたEcoRI-SmaI
断片（Ｆ１）に続いてpKNA82の BamHI-SalIに挿入し
た。
BamHI-SalI 断片のpKNA82への挿入 ＰＣＲ合成された相同部分の１ｋｂの BamHI-SalI 断片
（Ｆ２）は、前記２）ですでに挿入されたEcoRI-SmaI
断片（Ｆ１）に続いてpKNA82の BamHI-SalIに挿入し
た。
【００３８】５）相同な断片に挟まれたSmaI-BamHIサイ
トへのtacプロモーターの挿入 Ｆ１およびＦ２の２個の断片が挿入されたpKNA82におい
て、まず左側（Ｆ１）の相同部分の右端のSmaIサイトに
HindIIIリンカー（d(pCAAGCTTG)）を挿入した。次に、
このプラスミドをHindIIIおよびBamHIで切断し、この部
分に以下のtacプロモーター（二本鎖ＤＮＡ、表示は一
本鎖ＤＮＡ）をHindIIIおよびBamHIで切断後挿入した。 5'-AAG CTT ACT CCC CAT CCC CCT GTT GAC AAT TAA TCA
TCG GCT CGT ATA ATG TGT GGA ATT GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC AC
A GGA AAC AGG ATC C-3' （アンダーライン部はHindIIIおよびBamHIサイトを示
す。）
トへのtacプロモーターの挿入 Ｆ１およびＦ２の２個の断片が挿入されたpKNA82におい
て、まず左側（Ｆ１）の相同部分の右端のSmaIサイトに
HindIIIリンカー（d(pCAAGCTTG)）を挿入した。次に、
このプラスミドをHindIIIおよびBamHIで切断し、この部
分に以下のtacプロモーター（二本鎖ＤＮＡ、表示は一
本鎖ＤＮＡ）をHindIIIおよびBamHIで切断後挿入した。 5'-AAG CTT ACT CCC CAT CCC CCT GTT GAC AAT TAA TCA
TCG GCT CGT ATA ATG TGT GGA ATT GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC AC
A GGA AAC AGG ATC C-3' （アンダーライン部はHindIIIおよびBamHIサイトを示
す。）
【００３９】６）tacプロモーターを含む相同部分のpMO
K180への挿入tac プロモーターを含む相同部分は、PacIで切り出し、
図２に示すpMOK180のPacIサイトに挿入した。作製され
たプラスミドは、E. coli S17-1株に導入した後、下記
のようにしてRalstonia sp. KWI-9と接合し、相同的組
換えによってtacプロモーターが染色体上のpheZ上流に
組み込まれた組換え体Ralstonia sp. KN1-200Aを選出し
た。
K180への挿入tac プロモーターを含む相同部分は、PacIで切り出し、
図２に示すpMOK180のPacIサイトに挿入した。作製され
たプラスミドは、E. coli S17-1株に導入した後、下記
のようにしてRalstonia sp. KWI-9と接合し、相同的組
換えによってtacプロモーターが染色体上のpheZ上流に
組み込まれた組換え体Ralstonia sp. KN1-200Aを選出し
た。
【００４０】７）染色体上への挿入 相同的組換えを行う際には、供与菌のE. coli S17-1に
上記６）のtacプロモーターを含むpMOK180プラスミドを
導入後、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス
５ｇおよびＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１ literに溶解）
で、３７℃で一晩培養し、同時に受容菌であるRalstoni
a sp. KWI-9株を３０℃で、ＬＢ培地で一晩培養し、各
々の培養液０．５ｍＬから菌体を遠心分離で集菌した。
これらの菌体は、生理食塩水（０．８％ＮａＣｌ）１ｍ
Ｌで懸濁、混合した上で、再び遠心分離で集菌、上澄み
を捨て、生理食塩水１ｍＬで洗浄した。この洗浄操作を
再び繰り返し、沈殿させた後、混合菌体は５０μＬの生
理食塩水に懸濁させ、ＬＢ培地上の直径２５ｍｍ、孔径
０．２２μｍの滅菌ミリポアフィルター上に滴下させ、
３０℃で１０時間接合させた。その後、フィルター上の
菌体を１ｍＬの生理食塩水に懸濁させ、希釈液を無機塩
類、フルクトース２０ｍＭおよびカナマイシン１００μ
ｇ／ｍＬを含む寒天培地に塗布し、３０℃で３〜４日間
培養し、前記プラスミドすべてが染色体に挿入された菌
株を選出した。
上記６）のtacプロモーターを含むpMOK180プラスミドを
導入後、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス
５ｇおよびＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１ literに溶解）
で、３７℃で一晩培養し、同時に受容菌であるRalstoni
a sp. KWI-9株を３０℃で、ＬＢ培地で一晩培養し、各
々の培養液０．５ｍＬから菌体を遠心分離で集菌した。
これらの菌体は、生理食塩水（０．８％ＮａＣｌ）１ｍ
Ｌで懸濁、混合した上で、再び遠心分離で集菌、上澄み
を捨て、生理食塩水１ｍＬで洗浄した。この洗浄操作を
再び繰り返し、沈殿させた後、混合菌体は５０μＬの生
理食塩水に懸濁させ、ＬＢ培地上の直径２５ｍｍ、孔径
０．２２μｍの滅菌ミリポアフィルター上に滴下させ、
３０℃で１０時間接合させた。その後、フィルター上の
菌体を１ｍＬの生理食塩水に懸濁させ、希釈液を無機塩
類、フルクトース２０ｍＭおよびカナマイシン１００μ
ｇ／ｍＬを含む寒天培地に塗布し、３０℃で３〜４日間
培養し、前記プラスミドすべてが染色体に挿入された菌
株を選出した。
【００４１】８）Ralstonia sp. KN1-200Aの選出 上記７）で作製された菌株をＬＢ液体培地で一晩培養
後、希釈液を２０μｇ／ｍＬのＸガル（すなわち５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクト
シド）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、青いコロニーに混
じって観察された白いコロニーをpMOK180が抜け落ちた
菌株として選出した。この中から、０．１Ｍのカテコー
ルをスプレーすることによって黄変する菌株（tacプロ
モーターの働きによってカテコール−２，３−オキシゲ
ナーゼをコードするpheFが発現するため）を、tacプロ
モーターがpheZ上流に挿入されたRalstonia sp. KN1-20
0Aとして選出した。
後、希釈液を２０μｇ／ｍＬのＸガル（すなわち５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクト
シド）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、青いコロニーに混
じって観察された白いコロニーをpMOK180が抜け落ちた
菌株として選出した。この中から、０．１Ｍのカテコー
ルをスプレーすることによって黄変する菌株（tacプロ
モーターの働きによってカテコール−２，３−オキシゲ
ナーゼをコードするpheFが発現するため）を、tacプロ
モーターがpheZ上流に挿入されたRalstonia sp. KN1-20
0Aとして選出した。
【００４２】９）pKNA82の作製（図３参照） ファルマシア製のpTrc99AのlacIqおよびtrcプロモータ
ー部分を、EcoT22IおよびNcoIで切断、削除し、得られ
た断片をＴ４ポリメラーゼで両端を平滑化した後、PacI
リンカー(d(pTTAATTAA))を挿入した。上記プラスミドの
マルチクローニングサイト内のHindIIIサイトをHindIII
で切断、Ｔ４ポリメラーゼで平滑化処理し、ここにもう
一つのPacIリンカー(d(pGTTAATTAAC))を挿入した。この
プラスミドをpKNA82とした。
ー部分を、EcoT22IおよびNcoIで切断、削除し、得られ
た断片をＴ４ポリメラーゼで両端を平滑化した後、PacI
リンカー(d(pTTAATTAA))を挿入した。上記プラスミドの
マルチクローニングサイト内のHindIIIサイトをHindIII
で切断、Ｔ４ポリメラーゼで平滑化処理し、ここにもう
一つのPacIリンカー(d(pGTTAATTAAC))を挿入した。この
プラスミドをpKNA82とした。
【００４３】１０）pMOK180の作製 pMOK180は、環境工学研究論文集 Vol. 33, pp165-175
(1996)に記載された方法により作製した。pMOK180はpBR
322由来のori遺伝子を使用し、可動化に必要な遺伝子は
pKT240のmobA、mobB、oriTを使用した。またマーカーと
しては、pCH110由来のgptプロモーターおよびlacZを含
む断片を利用した。
(1996)に記載された方法により作製した。pMOK180はpBR
322由来のori遺伝子を使用し、可動化に必要な遺伝子は
pKT240のmobA、mobB、oriTを使用した。またマーカーと
しては、pCH110由来のgptプロモーターおよびlacZを含
む断片を利用した。
【００４４】実施例１、２および比較例１ 図４は実施例において用いた浄化装置の試験装置を示す
フロー図である。図４において、２１は処理槽（内径４
０ｍｍ、高さ７５０ｍｍ、有効容積９４２ｍＬ）であ
り、内部に平均粒径０．３５ｍｍ、比重２．６ｇ／ｃｍ
3、空隙率０．４２の土壌２２が充填されている。処理
槽２１の下部には原水路２３およびこれに合流する菌体
注入路２４が連絡するとともに薬注路２５が連絡し、上
部に処理水路２６が連絡している。この装置を、下記浄
化試験に使用した。
フロー図である。図４において、２１は処理槽（内径４
０ｍｍ、高さ７５０ｍｍ、有効容積９４２ｍＬ）であ
り、内部に平均粒径０．３５ｍｍ、比重２．６ｇ／ｃｍ
3、空隙率０．４２の土壌２２が充填されている。処理
槽２１の下部には原水路２３およびこれに合流する菌体
注入路２４が連絡するとともに薬注路２５が連絡し、上
部に処理水路２６が連絡している。この装置を、下記浄
化試験に使用した。
【００４５】汚染物質をトリクロロエチレン（ＴＣＥ）
とし、前述の製造例１で得た遺伝子組換え体Ralstonia
sp. KN1-200A株を用いて以下の浄化試験を行った。
とし、前述の製造例１で得た遺伝子組換え体Ralstonia
sp. KN1-200A株を用いて以下の浄化試験を行った。
【００４６】１）菌体懸濁液の調製 ＬＢ培地で培養したRalstonia sp. KN1-200A株をリン酸
緩衝液（５ｍＭ ＰＯ 4、ｐＨ７．０）で遠心洗浄した
後、再び新鮮なリン酸緩衝液に懸濁させた。これを菌体
懸濁液（菌体濃度＝１５００ｍｇ／Ｌ）とした。
緩衝液（５ｍＭ ＰＯ 4、ｐＨ７．０）で遠心洗浄した
後、再び新鮮なリン酸緩衝液に懸濁させた。これを菌体
懸濁液（菌体濃度＝１５００ｍｇ／Ｌ）とした。
【００４７】２）土カラム中でのＴＣＥ分解実験 図４の試験装置に川砂（粒径０．３５ｍｍ）を充填した
後、ＴＣＥを約５００μｇ／Ｌの濃度で含んだ脱塩素水
道水（原水）を４０ｍＬ／ｄ、ＨＲＴ＝１０日の条件で
通水した。約３０日間、予備通水を行った後、上記１）
で得た菌体懸濁液を３〜４日に一度、液中の平均濃度が
２．５ｍｇ／Ｌとなるように菌体注入路２４から注入し
た。処理槽２１としてのカラムは６本同じものを用意
し、次のような操作を約１６０日間行った。結果を図５
および図６に示す。
後、ＴＣＥを約５００μｇ／Ｌの濃度で含んだ脱塩素水
道水（原水）を４０ｍＬ／ｄ、ＨＲＴ＝１０日の条件で
通水した。約３０日間、予備通水を行った後、上記１）
で得た菌体懸濁液を３〜４日に一度、液中の平均濃度が
２．５ｍｇ／Ｌとなるように菌体注入路２４から注入し
た。処理槽２１としてのカラムは６本同じものを用意
し、次のような操作を約１６０日間行った。結果を図５
および図６に示す。
【００４８】カラムＡ：比較例１、菌体懸濁液を注入す
る前に殺菌処理は行わなかった。 カラムＢ：実施例１、菌体懸濁液を注入する２時間前
に、３０重量％の過酸化水素水１ｍＬを薬注路２５から
通液して殺菌処理を行った。 カラムＣ：実施例２、菌体懸濁液を注入する３時間前
に、ヒーターでカラム中の水温が６０℃になるように約
１時間加熱し、殺菌処理を行った。 カラムＤ：コントロール、菌体懸濁液の注入および殺菌
処理のいずれも行わなかった。 カラムＥ：コントロール、３０重量％の過酸化水素水１
ｍＬを通液して殺菌処理を行ったが、菌体懸濁液の注入
は行わなかった。。 カラムＦ：コントロール、ヒーターでカラム中の水温が
６０℃になるように約１時間加熱して殺菌処理を行った
が、菌体懸濁液の注入は行わなかった。
る前に殺菌処理は行わなかった。 カラムＢ：実施例１、菌体懸濁液を注入する２時間前
に、３０重量％の過酸化水素水１ｍＬを薬注路２５から
通液して殺菌処理を行った。 カラムＣ：実施例２、菌体懸濁液を注入する３時間前
に、ヒーターでカラム中の水温が６０℃になるように約
１時間加熱し、殺菌処理を行った。 カラムＤ：コントロール、菌体懸濁液の注入および殺菌
処理のいずれも行わなかった。 カラムＥ：コントロール、３０重量％の過酸化水素水１
ｍＬを通液して殺菌処理を行ったが、菌体懸濁液の注入
は行わなかった。。 カラムＦ：コントロール、ヒーターでカラム中の水温が
６０℃になるように約１時間加熱して殺菌処理を行った
が、菌体懸濁液の注入は行わなかった。
【００４９】３）結果 土カラム中でのＴＣＥ分解実験 図５の結果からわかるように、カラムＤ〜Ｆの３本のコ
ントロールカラムでは、過酸化水素水を添加したカラム
Ｅのみ平均２８μｇ／Ｌ程度のＴＣＥの分解が見られた
が、カラムＤおよびＦではＴＣＥの減少はほとんど見ら
れなかった。図６の結果からわかるように、カラムＡ
（比較例１）では、定常状態では約１６４μｇ／ＬのＴ
ＣＥが分解され、この値はほぼ安定していた。カラムＢ
（実施例１）では、定常状態でのＴＣＥ分解量は約２４
７μｇ／Ｌであり、過酸化水素自身の反応によるＴＣＥ
分解分を差し引いても、殺菌処理しなかったカラムＡよ
りもＴＣＥの分解量が１．３倍増加したことになる。カ
ラムＣ（実施例２）では、定常状態で約３４６μｇ／Ｌ
のＴＣＥが分解され、この値は殺菌処理しなかったカラ
ムＡの約２．１倍であった。カラムＣの場合、実際に菌
体懸濁液を注入した時点での水温は常に３０℃以下であ
った。これらの結果から、微生物を注入する前に殺菌処
理を行うことが、微生物の機能を十分に発揮させること
に有効であることを確認することができた。
ントロールカラムでは、過酸化水素水を添加したカラム
Ｅのみ平均２８μｇ／Ｌ程度のＴＣＥの分解が見られた
が、カラムＤおよびＦではＴＣＥの減少はほとんど見ら
れなかった。図６の結果からわかるように、カラムＡ
（比較例１）では、定常状態では約１６４μｇ／ＬのＴ
ＣＥが分解され、この値はほぼ安定していた。カラムＢ
（実施例１）では、定常状態でのＴＣＥ分解量は約２４
７μｇ／Ｌであり、過酸化水素自身の反応によるＴＣＥ
分解分を差し引いても、殺菌処理しなかったカラムＡよ
りもＴＣＥの分解量が１．３倍増加したことになる。カ
ラムＣ（実施例２）では、定常状態で約３４６μｇ／Ｌ
のＴＣＥが分解され、この値は殺菌処理しなかったカラ
ムＡの約２．１倍であった。カラムＣの場合、実際に菌
体懸濁液を注入した時点での水温は常に３０℃以下であ
った。これらの結果から、微生物を注入する前に殺菌処
理を行うことが、微生物の機能を十分に発揮させること
に有効であることを確認することができた。
【００５０】
【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：EcoRIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 GGGGAATTCG GGGGAGGGGG TAAGGGGGTG GTG 33
【００５１】 配列番号：2 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：SmaIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 GGGCCCGGGA AGAGCGTGCC AGCTGGCGCA AAC 33
【００５２】 配列番号：3 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：BamHIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 GGGGGATCCC GCAATAGAGG CCATACCGCC CA 32
【００５３】 配列番号：4 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プライマーDNA 配列の特徴 存在位置：4..9 他の情報：BamHIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 CGCGGATCCG GCGGTTTCCT CAGGCGGCAA GGC 33
【００５４】 配列番号：5 配列の長さ：97 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プロモーターDNA 配列の特徴 存在位置：1..6 他の情報：HindIIIサイト 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：promoter 存在位置：7..91 特徴を決定した方法：S 存在位置：92..97 他の情報：BamHIサイト 特徴を決定した方法：S 配列 AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT 60 GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCC 97
【図１】微生物を汚染地下水に注入して浄化する例を示
す実施例の模式的断面図である。
す実施例の模式的断面図である。
【図２】フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群（pheR〜
pheG）およびtacプロモーター挿入に必要な相同部分のp
KNA82への挿入過程を示す概略図である。
pheG）およびtacプロモーター挿入に必要な相同部分のp
KNA82への挿入過程を示す概略図である。
【図３】プラスミドpKNA82の制限酵素切断位置を示す概
略図である。
略図である。
【図４】実施例で用いた浄化装置の試験装置を示すフロ
ー図である。
ー図である。
【図５】菌体懸濁液を注入しないコントロールカラム
（カラムＤ、ＥおよびＦ）の結果を示すグラフである。
（カラムＤ、ＥおよびＦ）の結果を示すグラフである。
【図６】実施例１、２および比較例１の結果を示すグラ
フである。
フである。
１ 培養槽 ２ 微生物 ３ 注入井 ５ 微生物供給路 ６ 栄養素供給路 ７ 送気路 ８ 撹拌機 １０、１２ ポンプ １１ 注入井路 １３、２５ 薬注路 １５ 表面土壌 １６ 汚染土壌 １７ 汚染地下水路 １８ 不透水層 ２１ 処理槽 ２２ 土壌 ２３ 原水路 ２４ 菌体注入路 ２６ 処理水路pheA 、pheB、pheC、pheD、pheE 塩素化エチレン分解遺
伝子pheZ 塩素化エチレン分解促進遺伝子pheF 機能不明な遺伝子pheG カテコール−２，３−オキシゲナーゼ遺伝子pheR フェノールによって誘導される調節遺伝子tac tacプロモーター Amp アンピシリン耐性遺伝子 Km カナマイシン耐性遺伝子lacZ β−ガラクトシダーゼ遺伝子
伝子pheZ 塩素化エチレン分解促進遺伝子pheF 機能不明な遺伝子pheG カテコール−２，３−オキシゲナーゼ遺伝子pheR フェノールによって誘導される調節遺伝子tac tacプロモーター Amp アンピシリン耐性遺伝子 Km カナマイシン耐性遺伝子lacZ β−ガラクトシダーゼ遺伝子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０２Ｆ 1/02 Ｃ０２Ｆ 1/50 ５４０Ｂ ４Ｄ０２７ 1/50 ５１０ ５６０Ｈ ４Ｄ０３４ ５３１ 1/72 Ｚ ４Ｄ０５０ ５４０ 3/00 Ｃ ５６０ Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｈ 1/72 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｚ 3/00 Ｂ０９Ｂ 3/00 ３０３Ｐ Ｃ１２Ｍ 1/00 ３０４Ｋ Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 2E191 BA12 BA13 BA15 BB01 BC01 BD11 BD20 4B024 AA17 BA08 CA04 DA05 EA04 FA02 GA11 HA01 4B029 AA02 DA04 DB01 DC07 DF05 DF06 DG06 4B065 AA01X AA01Y AB01 AC20 BA02 BD08 BD13 BD22 CA56 4D004 AA41 AB03 AB05 AB06 AB07 AC07 CA18 CA22 CA46 CC07 4D027 AC02 4D034 AA11 CA06 CA18 4D050 AA20 AB06 BB09 BD02 BD08
Claims (3)
- 【請求項１】 汚染物質浄化能を有する微生物を汚染環
境に注入して浄化する方法において、微生物を注入する
前に注入地点を薬剤または熱処理により殺菌処理するこ
とを特徴とする汚染環境の生物学的浄化方法。 - 【請求項２】 薬剤が過酸化水素である請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 熱処理がスチームの吹き込みまたは生石
灰の添加である請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11125706A JP2000317436A (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 汚染環境の生物学的浄化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11125706A JP2000317436A (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 汚染環境の生物学的浄化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000317436A true JP2000317436A (ja) | 2000-11-21 |
Family
ID=14916724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11125706A Pending JP2000317436A (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 汚染環境の生物学的浄化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000317436A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001034315A1 (fr) * | 1999-11-11 | 2001-05-17 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Procede de degradation de matiere nocive difficilement degradable |
| JP2003024926A (ja) * | 2001-07-17 | 2003-01-28 | Hazama Gumi Ltd | 土壌浄化方法 |
| JP2005152733A (ja) * | 2003-11-21 | 2005-06-16 | Raito Kogyo Co Ltd | 第二種特定有害物質の原位置抽出方法、原位置抽出システム及び原位置浄化システム |
| JP2006231222A (ja) * | 2005-02-25 | 2006-09-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 土壌の浄化システムおよび土壌の浄化監視装置 |
| JP2009208077A (ja) * | 2009-06-16 | 2009-09-17 | Hitachi Constr Mach Co Ltd | 汚染対策方法 |
| CN110170142A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-27 | 生态环境部华南环境科学研究所 | 一种用于降解农田土壤中有机氯的方法 |
-
1999
- 1999-05-06 JP JP11125706A patent/JP2000317436A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP4561402B2 (ja) * | 2005-02-25 | 2010-10-13 | パナソニック株式会社 | 土壌の浄化システムおよび土壌の浄化監視装置 |
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