JP2000298129A - ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物の安定化法 - Google Patents
ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物の安定化法Info
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Abstract
ーゼ及び生物活性分子のような他の分子に結合したペル
オキシダーゼの安定化方法の提供。 【解決手段】ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化
合物の安定化法であって、置換されていないか、又はア
ルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる
置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミ
ン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオ
ール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホ
ネート、ホスホネート、及びトリメチルシリルよりなる
群から選択される1つ又はそれ以上の置換基で置換され
た、少なくとも1種のアリールボロン酸化物を、当該免
疫活性化合物を安定化するのに有効な量で、ペルオキシ
ターゼ活性を有する化合物を添加する上記方法。
Description
ための、ペルオキシダーゼ、および生物活性分子のよう
な他の分子に結合したペルオキシダーゼを安定化するた
めの方法に関する。
キシダーゼ(HRP)は、免疫測定法を含む分析法で一
般的に使用される酵素である。多くのフォーマットが知
られており、抗原、抗体、ハプテン、および他のアナラ
イトの測定のために広く使用されている。いくつかの例
は競合法及び免疫測定法である。競合的免疫測定法の場
合、標識アナライトは、固定化されたアナライト結合分
子種への結合について試料中のアナライトと競合する。
すなわち試料中のアナライトの濃度を増加させると、固
定化される標識アナライトが減少する。免疫測定法の場
合、標識アナライト結合物質は、試料中のアナライトお
よび固定化アナライト結合物質と複合体を形成する。こ
のタイプの測定法では、試料中のアナライトの濃度を上
昇させると、固定化される標識アナライト結合物質が増
加する。どちらのタイプの免疫測定法でも、固定化標識
アナライトを非結合標識アナライトから分離し、固定化
または非結合HRP活性を測定する。
る試薬は、製造、出荷、および保存期間後活性を維持し
なければならない。この期間、これらは、活性に影響を
与える比較的高温度または低温度にさらされることがあ
る。従ってペルオキシダーゼ標識物質または他の活性な
生物学的成分を含有する安定な試薬を提供することは商
業的に有利である。これは、多くの生物学的物質では容
易には達成されない。例えば酵素標識分子および他の複
雑な生物学的分子は、免疫測定法に広く使用されてお
り、酵素または活性分子の活性(特に、免疫測定法で使
用される低濃度では)は時間とともに低下することがあ
る。保存温度が上昇すると、生物活性は一層急速に低下
することがわかっている。酵素または活性分子に結合し
た酵素の活性の低下を遅らせるか防止する1つの方法
は、安定化を達成するのに充分な量で溶液中の酵素に安
定剤を添加することである。
には、ポリエチレングリコールおよびカルシウム塩の添
加(米国特許第4,728,023号);8−アニリノ
−l−ナフタレンスルホン酸の添加(FRG特許第3,
100,076号);フェノールおよびC1 −C3 低級
アルキル、塩素および臭素からの1つまたはそれ以上の
置換基を有する置換フェノールの添加(米国特許第4,
764,468号);4−アミノアンチピリンの添加
(ヨーロッパ特許第070,992号);III 族および
IV族の多価イオンの添加(米国特許第4,169,01
2号)および4−ヒドロキシまたは4−アルコキシアリ
ールアセトアミドの添加(米国特許第5,372,93
2号)がある。HRPおよび他の生物学的分子の両方の
安定化は、少なくとも1つのヒドロキシル基およびハメ
ット(Hammett )シグマ値(σp)−0.20≦x≧+
0.24の基またはアミドで置換されたベンゼン環を有
する化合物の添加(米国特許第5,516,672号)
により達成される。
よび他の生物学的分子の安定性を改良するが、さらなる
改良に対するニーズがある。特に試薬の輸送の間に遭遇
する室温および高温での安定性が改良された試薬調製物
が好ましい。既知の添加物のあるものは、分析試薬調製
物でしばしば使用され、かつ免疫測定法で使用される免
疫反応に影響を与えることがあるタンパク質および他の
成分と相互作用し得る。調製物の活性成分を安定化し、
他の成分に対して有害な作用を有さない添加物もまた好
ましい。
子と強く相互作用する。多くの異なる機構による相互作
用は、種々の物質の精製に使用されている。例えば固体
支持体に結合した3−アミノフェニルボロン酸は、糖タ
ンパク質の分画で使用される。有機ホウ酸塩は、多くの
酵素を阻害し、動物の代謝に影響を与えることがあり、
そして認識された静菌剤である(総合的な総説について
は、生物学的分離におけるボロン酸塩リガンド(Borona
te Ligands in Biochemical Separations )、アミコン
・コーポレーション(Amicon Corporation)、Danvers
、刊行物507、1981、を参照されたい)。有機
ホウ素化合物はまた、単独でまたはフェノール性もしく
は芳香族アミンエンハンサー(PCT公報WO93/2
3060)と組合せたHRP(PCT公報WO93/1
6195)により触媒される化学発光反応からの光の出
力を増加させることもわかっている。
使用されている(PCT公報WO85/02861)。
アリールボロン酸は、有機ホウ素群内の化合物のファミ
リーである。アリールボロン酸は、タンパク質分解酵素
を含有する液体界面活性剤の調製物で使用されている
(PCT公報WO92/19707)。高濃度のアリー
ルボロン酸では、タンパク質分解酵素は、界面活性剤調
製物の他のタンパク質成分を分解することが妨害され
る。洗浄水での以後の希釈において、タンパク質分解酵
素は再度活性になる。
化合物は、免疫測定法で使用するための、ペルオキシダ
ーゼ、または別の分子に結合したペルオキシダーゼ(以
後ペルオキシダーゼ標識結合体または結合体と呼ぶ)、
特にHRPまたはHRP−結合体の活性の低下を遅らせ
るかまたは防止する安定剤として添加することができる
ことを発見した。
は、少なくとも1種のアリールボロン酸化合物を含む安
定なペルオキシダーゼ組成物を提供することである。本
発明の第2の目的は、ペルオキシダーゼ(特にHRP)
に少なくとも1種のアリールボロン酸化合物を添加する
ことを含む、ペルオキシダーゼ(特にHRP)の安定化
法を提供することである。本発明の第3の目的は、結合
体試薬に少なくとも1種のアリールボロン酸化合物を添
加することによりペルオキシダーゼ標識結合体の安定化
法を提供することである。安定化組成物は、分析法で有
用である。これらは、酵素免疫測定法で特に有用であ
る。
は、ペルオキシダーゼと、置換されていないか、または
アルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによ
る置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換ア
ミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チ
オール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スル
ホネート、ホスホネート、トリメチルシリルよりなる群
から選択される1つまたはそれ以上の置換基で置換され
た、少なくとも1種のアリールボロン酸化合物とを含ん
でなる、安定化ペルオキシダーゼ試薬である。本発明の
別の実施態様は、ペルオキシダーゼに、置換されていな
いか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒド
ロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、ア
ミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、
チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エ
ステル、スルホネート、ホスホネート、およびトリメチ
ルシリルよりなる群から選択される1つまたはそれ以上
の置換基で置換された、少なくとも1種のアリールボロ
ン酸化合物を、ペルオキシダーゼを安定化するのに有効
な量で添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ活
性の安定化法である。好適な実施態様は、ペルオキシダ
ーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである上記組成物ま
たは方法である。
のアリールボロン酸化合物の使用に関する。安定剤は、
式ArB(OH)2 (式中、Arはフェニルまたはナフ
チルである)のアリールボロン酸である。アリール構造
は、置換されていないか、またはアルキル、置換アルキ
ル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリ
ール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、
ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデ
ヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネー
ト、およびトリメチルシリルよりなる群から選択される
1つまたはそれ以上の置換基で置換されてよい。置換ま
たは非置換化合物のいくつかの例を以下に示す。
の4−ブロモフェニルボロン酸、3−アセトアミドフェ
ニルボロン酸、およびフェニルボロン酸である。本発明
の好適な実施態様は、ブロモフェニルボロン酸を含む安
定化HRP組成物、またはブロモフェニルボロン酸を使
用するHRPの安定化法である。特に4−ブロモフェニ
ルボロン酸は、好ましい溶解度と適切な安定化作用を示
した。しかし特定の状況に適したアリールボロン酸化合
物の選択法は、当業者に公知であろう。
時点でペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体
に添加することができる。試薬成分、安定剤自体および
ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体、なら
びに種々の他の部分の測定試薬は、固体型または溶解型
で存在してもよい。安定剤は、安定化を達成するのに充
分な量で添加すべきである。好ましくは安定剤は、0.
01%〜0.5%、好ましくは約0.1%(質量/体
積)(%w/v )である量で添加される。
のより均一な分布および従って有効範囲の下限に近い添
加の場合により良好な作用が達成されるため、安定剤
は、以後乾燥される液体試薬に加えることができる。例
えばアリールボロン酸化合物は、凍結乾燥する前かまた
は凍結乾燥物質を水性溶媒で復元後に、ペルオキシダー
ゼまたは結合体溶液に添加することができる。後者の場
合は、もちろん溶媒はまず安定剤と混合し次に凍結乾燥
物質に添加してそれを溶解することができる。例えばも
しペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体が、
乾式分析測定要素(例えば薄膜またはスライド要素)の
成分であるなら、被覆プロセスの前に安定剤を被覆溶液
に加えることが好ましいであろう。しかし被覆プロセス
の完了後に安定剤を加えることも企図される。例えば、
噴霧することにより。
または免疫学的に有効な別の分子に結合してもよい。そ
のような分子は本明細書において、「活性分子」と呼
ぶ。活性分子は、分析法で使用することができる分子で
ある。好ましくは該活性分子は、抗体もしくはその断
片、抗原またはハプテン、タンパク質、糖タンパク質、
ペプチド、タンパク質ミメティック、核酸配列、ステロ
イド、ホルモン、または前記いずれかの誘導体、または
前記の2つ以上または組合せから作成される化合物であ
ろう。
とも好ましいことがある。一般的な保存剤には、例えば
2−ヒドロキシピリジン−N−オキシド、クロロアセト
アミド、N,N−メチレン−ビス−(N−1−ヒドロキ
シルメチル)−2,5−ジオキソ−4−イミダゾリジニ
ル)−尿素、5ブロモ−5−ニトロ−1,3−ジオキサ
ンがある。7.0に近いかまたはこれより低いpHを有
する溶液において、ボロン酸塩は荷電しておらず、疎水
性相互作用および電荷移動相互作用は、多くの分子(特
にタンパク質)に対して強い結合を引き起こす。驚くべ
きことに我々は、この相互作用が生物活性分子に安定化
作用を与えることを見いだした。
識物を含有する試薬に添加されるいくつかの測定法が行
われた。標識リガンドを形成するためにリガンドに結合
されるか、または標識リガンド結合物質を形成するため
にリガンド結合物質に結合されることができる酵素標識
物を使用して、測定を行うことができる。ペルオキシダ
ーゼ(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HR
P))のような酵素は好適な標識物である。好適な実施
態様では、酵素はペルオキシダーゼである。この酵素に
は多様な型がある。HRPは最も好適な型であり、容易
に入手できる。特定の酵素標識物に適した基質を決定す
るのは、当業者の技術の範囲内である。基質は、酵素標
識物により直接作用を受ける物質または標識物の酵素反
応が関与する一連の反応に関与する物質であってよい。
本発明の有効性と利点は、以下の例により例示される。
(チェスター、英国)から得られたスクシニミジル−4
−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カル
ボキシレート(SMCC)とN−スクシニミジルS−ア
セチルチオアセテート(SATA)を使用して、モノク
ローナル抗体(ヒト卵胞刺激ホルモンに対して作成し
た)をHRPに結合した。次にBIOTIN−XX−N
HS(カルビオケム(Calbiochem)、ビーストン(Bees
ton )、英国)を使用して、HRP−抗体結合体をビオ
チン化した。ビオチン化HRP−抗体を、溶出緩衝液と
して300mM塩化ナトリウムを含有する100mMリン酸
カリウム緩衝液(pH6.0)を使用して、製造業者の
プロトコールに従って、PD−10カラム(ファルマシ
アバイオテク(Pharmacia )、セントアルバンス(St.
Albans)、英国)で脱塩した。結合体をUV吸収で定量
し、種々の添加物で試験試薬を希釈し、次に2〜8℃ま
たは37℃で保存した。次に試薬中の結合体の活性を、
VITROS ECiストレプトアビジン被覆マイクロ
ウェル(オーソクリニカルダイアグノスティクス(Orth
o-Clinical Diagnostics)、英国)中の試薬100μl
を、37℃で15分インキュベートして試験した。イン
キュベーション中に、ビオチン化HRP−抗体結合体
は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応によりマイ
クロウェルの表面に固定化された。マイクロウェルを洗
浄後、固定化HRP−抗体複合体の活性を、増強発光反
応(米国特許第5,372,931号)を使用して測定
した。発光性基質(ルミノール誘導体と過酸塩)と電子
移動物質を含有するVITROS ECiシグナル試薬
を、マイクロウェルに加えた。結合した結合体中のHR
Pは、ルミノール誘導体の酸化を触媒して光を放出す
る。電子移動物質(置換アセトアニリド)は産生される
光のレベルを増加させ、その発光を延長させる。マイク
ロウェルからの光シグナルを、AMERLITEアナラ
イザー(オーソクリニカルダイアグノスティクス(Orth
o-Clinical Diagnostics)、英国)を使用して測定し
た。
0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で希釈し
て、10ng/ml の濃度を得た。マグネシウム欠乏KAT
HON(ロームアンドハース(Rohm and Haas )、英
国)を保存剤(1%w/v )として添加し、マイクロウェ
ルの表面への結合体の非特異吸着を防ぐためにウシ血清
アルブミン(1%w/v )を加えた。各アリールボロン酸
安定剤を、ジメチルホルムアミド(DMF)で200mg
/ml 溶液として調製し、結合体溶液に加えて安定剤の所
望のモル濃度を得た。結合体溶液を2〜8℃または37
℃で2時間、24時間、96時間、および9週間保存し
た。結合体中のHRPの活性を前記のように測定した。
結果を表1に示す。
− 2〜8℃で2時間保存)のパーセントとして表さ
れる光の出力である。表1から、安定剤の非存在下では
37℃で保存後にHRPの活性は顕著に低下したことが
わかる。HRP活性は、2〜8℃でまたはアリールボロ
ン酸化合物の存在下で保存すると保持される。安定剤の
存在下では37℃で9週間保存後でも、HRP活性は初
期活性の50%を超えている。
の安定化 ジシクロヘキシルカルボジイミドとN−ヒドロキシスク
シンイミド(アルドリッチケミカル社(Aldrich Chemic
al Co.)、ギリンガム(Gillingham)、英国)とを反応
させて、HRPをテストステロン−3−カルボキシメチ
ルオキシムに化学結合させた。精製結合体を、1.3%
塩化ナトリウム、2%ショ糖、0.5%マグネシウム欠
乏KATHON、0.2%ウシ血清アルブミン、および
ステロイド放出剤としての600μg/l のDANAZO
Lを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.0)中60
ng/ml の濃度に希釈した。結合体溶液を、25℃で種々
の濃度の4−ブロモフェニルボロン酸の存在下で保存
し、次にHRP結合体活性を競合的免疫測定法で測定し
た。
体を、NHS−LC−ビオチン(ピアス・アンド・ワリ
ナー(Pierce and Warriner )、チェスター、英国)を
使用してビオチン化し、1.3%塩化ナトリウム、70
mM EDTA、0.5%マグネシウム欠乏KATHO
N、1%ヒト血漿、0.05%正常マウス血清および6
00μg/l のDANAZOLを含有する50mMリン酸カ
リウム緩衝液(pH7.3)で10mg/Lに希釈した。チ
ャコールストリップしたヒト血漿(25μl)を、VI
TROS ECiストレプトアビジン被覆マイクロウェ
ル(オーソクリニカルダイアグノスティクス(Ortho-Cl
inical Diagnostics)、英国)中の50μlのHRP−
テストステロン結合体溶液と100μlのビオチン化抗
体溶液とともに、37℃で30分インキュベートした。
インキュベーションの間、HRP−テストステロン結合
体はビオチン化抗体に結合し、複合体は、ビオチンとス
トレプトアビジンとの反応により、ストレプトアビジン
被覆マイクロウェルの表面に固定化された。マイクロウ
ェルを洗浄後、HRP活性を、VITROS ECiシ
グナル試薬を使用してVITROS ECiアナライザ
ーで測定した。結果を表2に示す。
セントとして表される光の出力である。安定剤の非存在
下では、HRP−テストステロン結合体の活性は、25
℃で21日間保存後に83.4%まで低下していた。ブ
ロモフェニルボロン酸量の増加とともに、結合体はより
安定になった。安定剤の非存在下で26〜28日間保存
後、HRP−テストステロン結合体の活性は77.1%
まで低下していた。再度ブロモフェニルボロン酸量の増
加とともに、結合体はより安定になった。
定化 スクシニミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロ
ヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)とN−ス
クシニミジルS−アセチルチオアセテート(SATA)
を使用して、B型肝炎コア抗原(HBc)に対するモノ
クローナル抗体にHRPを化学的に結合した。精製HR
P結合体を、2.0%塩化ナトリウム、2.0%マグネ
シウム欠乏KATHON、2.0%ウシ血清アルブミ
ン、および0.065μg/ml組換えHBc(カイロンコ
ーポレーション(Chiron Corporation)、エメリービル
(Emeryville)、カリホルニア州、米国)を含有する2
0mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.2)で0.05
7μg/mlの濃度に希釈した。HRP標識抗HBc抗体は
HBc抗原と結合して、HRP標識抗体/抗原複合体を
形成する。溶液を、25℃または37℃で4−ブロモフ
ェニルボロン酸の存在下または非存在下で保存し、次に
HRP抗体/抗原複合体活性を免疫測定法を使用して測
定した。
BIOTIN−XX−NHS(カルビオケム(Calbioch
em)、ビーストン(Beeston )、英国)を使用してビオ
チン化し、0.5%ウシ血清アルブミンと0.96%マ
グネシウム欠乏KATHONを含有する25mMリン酸カ
リウム/15mMテトラホウ酸ナトリウム緩衝液(pH
8.2)で0.75mg/lに希釈した。HBcに対するI
gM抗体を含有するヒト血漿を、0.9%塩化ナトリウ
ム、5%ウシ血清アルブミンおよび1%BRONIDO
X(ヘンケル・ケー・ジー(Henkel K. G.)、ドイツ)
を含有する100mMリン酸カリウム緩衝液で1/20に
希釈した。25μlの希釈血漿を、VITROS EC
iストレプトアビジン被覆マイクロウェル(オーソクリ
ニカルダイアグノスティクス(Ortho-Clinical Diagnos
tics)、英国)中のビオチン化抗IgM抗体溶液145
μlで37℃で15分インキュベートした。インキュベ
ーション中に、血漿中のIgM抗体は、ビオチン化Ig
Mとの反応およびビオチンとストレプトアビジンとの反
応により、ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表
面に固定化される。マイクロウェルを洗浄後、100μ
lのHRP標識抗体/抗原複合体溶液をマイクロウェル
に加え、37℃でさらに15分インキュベートする。こ
の反応中に、複合体中のHBcは、マイクロウェル上に
固定化されたHBcに対する抗体と反応する。マイクロ
ウェルを洗浄後、マイクロウェルの表面に結合したHR
Pの活性を、VITROS ECiシグナル試薬を使用
してVITROS ECiアナライザーで測定した。結
果を表3に示す。
セントとして表される光の出力である。安定剤の非存在
下では、HRP結合体の活性は1週間保存後に1%未満
まで低下していた。0.01%ブロモフェニルボロン酸
では、結合体は25℃で1週間保存後にその活性の38
%を保持し、0.1%ブロモフェニルボロン酸では、2
5℃で15週間保存後に活性の45%そして37℃で1
週間保存後に活性の15%を保持した。
れるHRP結合体 前記したように上記実施例以外に、本発明は乾式免疫測
定分析要素において有用であることが企図される。従っ
て以下の例は、本発明の有利な性質を有する酵素結合体
を与える本発明の実施態様を記載する。アナライト(例
えば、特に限定されないが、グルコース、トリグリセリ
ド、リパーゼ、グリセロール、コレステロール、コレス
テロールエステル)の存在または量を測定するためのH
RPを含む乾式分析要素は公知である。HRP−結合体
を含む乾式免疫測定分析要素は公知であり、例えばC−
反応性タンパク質(CRP)、ジゴキシン、フェニトイ
ンを測定するための免疫測定要素がある。
は試薬層を含む任意の層またはゾーンに、公知の方法
(例えば、ホッパーおよびグラビア被覆法)を使用して
要素内に導入してもよい。好適な要素では、HRPと安
定剤は一緒に存在する。コレステロール測定のための、
同じ層中にHRPとアリールボロン酸安定剤を含む分析
要素は、以下の組成およびフォーマットを有するであろ
う:
または他の適当な型で維持し、試験すべき条件下で保存
することができる。対照要素(例えば、新鮮な要素)を
使用してコレステロール標準物質で得られた、反射分光
計を使用して測定される反射密度は、試験条件下で保存
した要素と比較することができる。当業者に公知のよう
に、要素中の安定剤の位置および安定剤の量は所望の安
定性が得られるまで容易に変更することができる。
式免疫測定要素 フェニトイン測定のための、同じ層中にフェニトイン−
HRP結合体とアリールボロン酸安定剤を含む免疫測定
分析要素は、以下の組成およびフォーマットを有するで
あろう:
し、ストリップまたは他の適当な型で維持し、試験すべ
き条件下で保存することができる。対照要素(例えば、
新鮮な要素)を使用してフェニトイン標準物質で得られ
た反射密度は、試験条件下で保存された要素と比較する
ことができる。当業者に公知のように、要素中の安定剤
の位置および安定剤の量は、所望の安定性が得られるま
で容易に変更することができる。アリールボロン酸化合
物は、上記コレステロール要素以外にアナライトに対す
るHRPを含む乾式分析要素を安定化し、フェニトイン
について上記したもの以外に免疫測定法に対するHRP
−結合体を含む乾式免疫測定分析要素を安定化するのに
作用するであろう。
は、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
これらのタンパク質の酵素活性は、免疫測定法で使用さ
れており、これらはルミノールと過酸化物との酵素触媒
発光反応により検出されている(GB特許第2,06
3,469号)。ミオグロビンは、急性心筋梗塞の有用
なマーカーであることが証明されている(米国特許第
5,744,358号)。ミオグロビンの標準的参照溶
液は、免疫反応によりこのアナライトの測定において使
用され、これらの溶液の安定性はアリールボロン酸化合
物の添加により改良することができる。
は、ビオスパシフィック・ユーエスエー(BiosPacific,
USA)から得られた。HRPは、ピアス・アンド・ワリ
ナー(Pierce and Warriner )(チェスター、英国)か
ら得られたスクシニミジル−4−(N−マレイミドメチ
ル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−
SMCC)とN−スクシニミジルS−アセチルチオアセ
テート(SATA)を使用して、ミオグロビンモノクロ
ーナル抗体の1つに化学的に結合させた。精製したHR
P結合体を、1.0%マグネシウム欠乏KATHONお
よび0.5%ウシ血清アルブミンを含有する100mMリ
ン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に3μg/mlで希釈し
た。
ビオチン−LC−NHS(ピアス・アンド・ワリナー
(Pierce and Warriner )、チェスター、英国)を使用
してビオチン化し、5.0%ウシ血清アルブミンと1.
0%マグネシウム欠乏KATHONを含有する100mM
リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で3μg/mlに希釈
した。ビオスパシフィック・ユーエスエー(BiosPacifi
c )、エメリービル(Emeryville), USA )から得られ
たヒト心臓ミオグロビンの標準溶液を、1.0%マグネ
シウム欠乏KATHON、5.0%ウシ血清アルブミ
ン、10mM塩化ナトリウムおよび1mM EDTAを含有
する100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で調
製した。
TROS ECiストレプトアビジン被覆マイクロウェ
ル(オーソクリニカルダイアグノスティクス(Ortho-Cl
inical Diagnostics)、英国)中で70μlのビオチン
化モノクローナル抗体溶液および70μlのHRP標識
モノクローナル抗体溶液とともに37℃で8分間インキ
ュベートした。インキュベーションの間に、ビオチン化
抗体は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応により
ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表面に固定化
される。同意に標準溶液中のミオグロビンはビオチン化
抗体に固定化され、またHRP標識モノクローナル抗体
に結合する。マイクロウェルを洗浄後、マイクロウェル
の表面に結合したHRPの活性を、VITROS EC
iアナラーザー中でVITROS ECiシグナル試薬
を使用して測定した。アナライザー中の光出力として測
定したマイクロウェルに結合したHRPの活性は、測定
中に加えたミオグロビンの免疫反応性に比例する。ミオ
グロビンの免疫反応性に対する光出力の応答曲線を、0
〜1757ng/ml の範囲をカバーする一連の標準ミオグ
ロビン溶液を使用して作製した。
ATHON、5.0%ウシ血清アルブミン、10mM塩化
ナトリウムおよび1mM EDTAを含有する100mMリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で350ng/ml の濃
度に溶解した。4−ブロモフェニルボロン酸と3−アセ
トアミドフェニルボロン酸を、それぞれエタノール中の
100mg/ml 溶液として調製し、ミオグロビン溶液に添
加して安定剤の所望の濃度を得た。次にミオグロビン溶
液を25℃または37℃で保存し、1週間および2週間
後免疫反応性ミオグロビンの量を上記の免疫測定法を使
用して測定した。ミオグロビン安定性に及ぼす4−ブロ
モフェニルボロン酸と3−アセトアミドフェニルボロン
酸の影響を表4に示し、4−ブロモフェニルボロン酸の
濃度を変化させることの影響を表5に示す。
の免疫反応性のパーセントとして表される。安定剤の非
存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は25℃で2週
間保存後に49%に低下した。0.12%4−ブロモフ
ェニルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は25
℃で2週間保存後にその活性の79%を保持し、0.1
2%3−アセトアミドフェニルボロン酸では25℃で2
週間保存後に活性の80%を保持した。安定剤の非存在
下では、ミオグロビンの免疫反応性は37℃で2週間保
存後に12%に低下した。0.12%4−ブロモフェニ
ルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は37℃で
2週間保存後にその活性の25%を保持し、0.12%
3−アセトアミドフェニルボロン酸では37℃で2週間
保存後に活性の42%を保持した。
の免疫反応性のパーセントとして表される。安定剤の非
存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は25℃で2週
間保存後に49%に低下し、37℃で2週間保存後に1
2%に低下した。4−ブロモフェニルボロン酸の量を増
加させると、ミオグロビンはより安定であった。0.5
%4−ブロモフェニルボロン酸の存在下では、25℃で
2週間保存後にミオグロビンの免疫反応性の74%が保
持され、37℃で2週間保存後に26%が保持された。
本明細書で引用したすべて材料は、参照することにより
本明細書の一部とする。さらに本発明は、請求の範囲の
範囲内のすべての修飾を包含することに注意されたい。
本発明の範囲と目的を逸脱することなく多くの変更およ
び修飾が可能であることを理解されたい。
Claims (21)
- 【請求項1】 ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性
化合物の安定化法であって、置換されていないか、また
はアルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルに
よる置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換
アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、
チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、ス
ルホネート、ホスホネート、およびトリメチルシリルよ
りなる群から選択される1つまたはそれ以上の置換基で
置換された、少なくとも1種のアリールボロン酸化合物
を、当該免疫活性化合物を安定化するのに有効な量で、
ペルオキシダーゼ活性を有する化合物に添加することを
特徴とする上記方法。 - 【請求項2】 前記アリールボロン酸が4−ブロモフェ
ニルボロン酸である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記アリールボロン酸が3−アセトアミ
ドフェニルボロン酸である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記免疫活性化合物がミオグロビンであ
る、請求項1〜3までのいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項5】 前記免疫活性化合物がペルオキシダーゼ
である、請求項1〜3までのいずれか1項に記載の方
法。 - 【請求項6】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペル
オキシダーゼである、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記ペルオキシダーゼが活性分子に結合
している、請求項5または6に記載の方法。 - 【請求項8】 前記活性分子が、抗体もしくはその断
片;抗原;ハプテン;タンパク質;糖タンパク質;タン
パク質ミメティック;核酸配列;ステロイド;ホルモ
ン;または前記いずれかの誘導体、よりなる群から選択
される、請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 前記アリールボロン酸化合物およびペル
オキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物が一緒に水溶
液中に存在する、請求項1〜8までのいずれか1項に記
載の方法。 - 【請求項10】 前記アリールボロン酸化合物の添加量
が0.01%〜0.5%(質量/体積)である、請求項
9に記載の方法。 - 【請求項11】 ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活
性化合物と、置換されていないか、またはアルキル、置
換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く
置換アリール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、
アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導
体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、
ホスホネート、およびトリメチルシリルよりなる群から
選択される1つまたはそれ以上の置換基で置換された、
少なくとも1種のアリールボロン酸化合物とを含んでな
る、安定化試薬。 - 【請求項12】 前記アリールボロン酸化合物が4−ブ
ロモフェニルボロン酸である、請求項11に記載の安定
化試薬。 - 【請求項13】 前記アリールボロン酸化合物が3−ア
セトアミドフェニルボロン酸である、請求項11に記載
の安定化試薬。 - 【請求項14】 前記試薬がさらに保存剤を含む、請求
項11〜13までのいずれか1項に記載の安定化試薬。 - 【請求項15】 前記免疫活性化合物がミオグロビンで
ある、請求項11〜14までのいずれか1項に記載の安
定化試薬。 - 【請求項16】 前記免疫活性化合物がペルオキシダー
ゼである、請求項11〜14までのいずれか1項に記載
の安定化試薬。 - 【請求項17】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペ
ルオキシダーゼである、請求項16に記載の安定化試
薬。 - 【請求項18】 前記ペルオキシダーゼが活性分子に結
合した、請求項16または17に記載の安定化試薬。 - 【請求項19】 前記活性分子が、抗体もしくはその断
片;抗原;ハプテン;タンパク質;糖タンパク質;タン
パク質ミメティック;核酸配列;ステロイド;ホルモ
ン;または前記いずれかの誘導体、よりなる群から選択
される、請求項18に記載の安定化試薬。 - 【請求項20】 前記アリールボロン酸化合物およびペ
ルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物が一緒に水
溶液中に存在する、請求項11〜19までのいずれか1
項に記載の安定化試薬。 - 【請求項21】 前記アリールボロン酸化合物が0.0
1%〜0.5%(質量/体積)の量で存在する、請求項
20に記載の安定化試薬。
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Cited By (4)
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