JP2000253888A - ペクチン酸リアーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】広く産業界において有用なペクチン酸リアーゼ
を高純度でかつ大量に生産できる遺伝子、組換えベクタ
ー、形質転換体及びポリペプチドを提供すること。 【解決手段】配列番号：１の配列からなるポリペプチド
をコードする塩基配列、配列番号：１の配列中の１個以
上のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有する配列
からなるポリペプチドをコードする塩基配列、配列番
号：２に示す塩基配列、配列番号：２に示す配列中の１
個以上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を有する塩基
配列及び前記いずれかの塩基配列を有するＤＮＡにスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基
配列からなる群より選ばれた塩基配列を含有し、かつペ
クチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子；組換えベクター；形質転換体；該遺伝子を発
現させて得られるポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は洗浄剤、食品加工
剤、繊維処理剤等に有用なペクチン酸リアーゼをコード
する遺伝子等に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペクチンは寒天と比較し酸性でゲル化す
る特性をもち、もろさやゼラチンのような臭味がないこ
とから食品、医薬品、化粧品の原料として広く利用され
ている。一方、原綿の精練や製紙において、繊維に含ま
れるペクチンは天然不純物として除去されている。

【０００３】一般的にペクチンの除去（分解）には、中
性〜酸性域においては、ペクチナーゼ（ペクチン分解酵
素）が利用されており、アルカリ性域では、加熱により
行なわれている。

【０００４】ペクチナーゼと総称されるペクチン分解酵
素のうち、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．
２）は、ペクチン質中のガラクチュロナン (ペクチン
酸) をβ脱離反応により分解する酵素である。前記ペク
チン酸リアーゼは、バチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）とエルビニア・カルトボー
ラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）の培養液
に初めて見い出された酵素で、反応にカルシウムイオン
を必要とする(Starr & Moran, Science, 135, 920-921,
1962)。現在、数多くの細菌、真菌類がペクチン酸リア
ーゼを生産することが知られている(Sakai, et al., Ad
v. Appl. Microbiol. 39, 213-294, 1993)。

【０００５】しかしながら、従来のペクチン酸リアーゼ
は、製品として入手可能であるが、高価、不十分な比活
性、種々の糖質分解酵素の混在等の問題がある。また、
木綿繊維の精練は、より高い精練効果を得る観点から、
高アルカリ性条件下に行うことが望まれている。従っ
て、高アルカリ性条件下において良好に作用しうる高純
度のペクチン酸リアーゼを廉価にかつ大量に生産するこ
とが望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、広く産業界
において有用なペクチン酸リアーゼを高純度でかつ大量
に生産することを可能にする該ペクチン酸リアーゼをコ
ードする遺伝子、組換えベクター、形質転換体及び該遺
伝子を発現させて得られるポリペプチドを提供すること
を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、〔１〕
（Ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする塩基配列、（Ｂ）配列番号：１に示
すアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸の欠失、置換、
挿入又は付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドをコードする塩基配列、（Ｃ）配列番号：２に示す塩
基配列、（Ｄ）配列番号：２に示す塩基配列中の１個以
上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を有する塩基配
列、及び（Ｅ）前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配
列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする核酸の塩基配列、からなる群より選ばれた
塩基配列を含有し、かつペクチン酸リアーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子、〔２〕 前記
〔１〕記載の遺伝子を含有してなる組換えベクター、
〔３〕 前記〔２〕記載の組換えベクターを含む形質転
換体、並びに〔４〕 前記〔１〕記載の遺伝子を発現さ
せて得られるポリペプチド、に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝
子は、土壌から分離したバチルス属等の細菌由来の新規
なペクチン酸リアーゼ遺伝子であり、さらに、以下に述
べるような変異を有する遺伝子をも包含する。

【０００９】ペクチン酸リアーゼ遺伝子としては、例え
ば、バチルス属細菌が産生する、（Ａ）配列番号：１に
示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺
伝子が挙げられる。前記配列番号：１に示すアミノ酸配
列を有するポリペプチドは、６４９アミノ酸からなる約
６９，５５０Ｄａの分子量を有する。

【００１０】また、ペクチン酸リアーゼ活性を示すポリ
ペプチドをコードする遺伝子であれば、（Ｂ）配列番
号：１に示すアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸の欠
失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする遺伝子をも包含する。さら
に、本発明においては、配列番号：１のアミノ酸配列に
おけるＮ末端に、１個以上のアミノ酸の付加を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子であってもよい。前記
「１個以上のアミノ酸の付加を有するポリペプチド」
は、例えば、シグナルペプチドを有するポリペプチドを
含む。

【００１１】本明細書において、「１個以上」の語は、
１個若しくは複数個、又はそれ以上を意味する。また、
本明細書において、「欠失、置換、挿入又は付加」の語
を、「変異」という場合がある。前記「変異」の語は、
天然に生じた変異であってもよく、公知の手法、例え
ば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニ
ュアル第２版（Sambrook et al., 1989)などに記載の部
位特異的変異導入方法等により導入された変異であって
もよい。本明細書において、「ペクチン酸リアーゼ」
は、広義には、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
るペクチン酸リアーゼのみならず、同様の活性を有する
ペクチン酸リアーゼ変異体を含む。

【００１２】配列番号：１のアミノ酸配列について、他
の酵素のアミノ酸配列との相同性は、アミノ酸番号２６
１〜６３７においてエルビニア・クリサンセミ（Ｅｒｗ
ｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来のペクチン
酸リアーゼＰｅｌＬ (Alfanoet al., J. Bacteriol., 1
77, 4553-4556, 1996) のアミノ酸番号４４〜４０５の
間で最も相同性が高いが、３５．２％の相同性があるに
すぎない〔GENETYX-MAC Ver.9.0 （ソフトウェア開発株
式会社製）を用いて解析〕。また、その他の酵素との相
同性は、配列番号：１中のアミノ酸番号２５８〜５７４
において、エルビニア・クリサンセミに由来するエキソ
型のペクチン酸リアーゼ(Brooks et al., J. Bacterio
l., 172, 6950-6958, 1990)のアミノ酸番号３０９〜６
７６の間で最も相同性が高いが、３５．１％の相同性が
あるにすぎない。また、その他の公知のペクチン酸リア
ーゼと配列番号：１に示す酵素との相同性は非常に低
い。従って、配列番号：１のアミノ酸配列からなるペク
チン酸リアーゼは新規な酵素であると解釈される。

【００１３】本発明においては、配列番号：１のアミノ
酸配列中、アミノ酸番号２５８〜６３７について、相当
する配列を適切にアライメントした時、３６％以上の相
同性があるポリペプチドであって、ペクチン酸リアーゼ
活性を有するポリペプチドをも包含される。本発明のペ
クチン酸リアーゼは、配列番号：１におけるアミノ酸番
号２５８〜６３７に対するアミノ酸配列の相同性は、３
６％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０
％以上が特に好ましい。

【００１４】前記配列番号：１に示すアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする遺伝子としては、（Ｃ）
配列番号：２に示す塩基配列を含有する遺伝子が挙げら
れる。

【００１５】本発明においては、（Ｄ）配列番号：２に
示す塩基配列中の１個以上の塩基の欠失、置換、挿入又
は付加を有する塩基配列、又は（Ｅ）前記（Ａ）〜
（Ｄ）のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡにストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列
を含有し、かつペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子であってもよい。

【００１６】ここで、「１個以上」とは、前記（Ｂ）と
同様の意味を示す。

【００１７】前記「ストリンジェントな条件」として
は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラト
リーマニュアル第２版（Sambrook et al., 1989)に記載
の条件等が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳ
Ｃ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０
１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％Ｓ
ＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子
ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに６５℃で一晩保温
するという条件等が挙げられる。

【００１８】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子は、例
えば、バチルス・スピーシーズ・ＫＳＭ−Ｐ１５株から
クローニングすることができる。前記バチルス・スピー
シーズ・ＫＳＭ−Ｐ１５株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．ＫＳＭ−Ｐ１５と表示され、ブダペスト条約のも
と、平成８年１２月６日（原寄託日）より通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城
県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５
６６））に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４１として
寄託されている。クローニング手段としては、前記モレ
キュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第
２版に記載の方法等が挙げられ、例えばショットガン
法、ＰＣＲ法で目的とする遺伝子をクローニングする手
法等が挙げられる。目的遺伝子は、例えば、実施例に記
載の方法等により、確認することができる。

【００１９】本発明の遺伝子の全部又は一部を、例えば
プローブとして用いて、種々の生物から、配列番号：１
におけるアミノ酸番号２５８〜６３７に対する領域が、
３６％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８
０％以上の相同性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子を得ることができる。前記のようにして得られた遺
伝子も本発明に含まれる。

【００２０】本発明の遺伝子によりコードされるペクチ
ン酸リアーゼは、至適ｐＨが１０．５〜１２．０であ
り、なかでもｐＨ１１．５付近で最も高いペクチン酸リ
アーゼ活性を示すことを１つの大きな特徴とする。前記
ペクチン酸リアーゼは、公知のペクチン酸リアーゼと比
較して、至適ｐＨが高いため、食品、医薬品、化粧品、
洗浄剤、繊維処理等の幅広い分野での使用が期待され
る。また、本発明の遺伝子によりコードされるペクチン
酸リアーゼは、プロトペクチンを分解することができる
ため、木綿（植物）繊維の精練への利用が期待される。
また、本発明の遺伝子を用いることにより、前記ペクチ
ン酸リアーゼを高純度かつ大量に生成することができ
る。

【００２１】本発明の遺伝子によりコードされるペクチ
ン酸リアーゼは、ペクチン質中のガラクツロナン (ペク
チン酸) をβ脱離反応により分解する活性を有し、該活
性は、オリゴガラクツロン酸にペクチン酸リアーゼを反
応させて生成した不飽和オリゴガラクツロニド量を定量
することにより求めることができる。下記参考例１に活
性測定法を示す。

【００２２】本発明の組換えベクターは、前記ペクチン
酸リアーゼ遺伝子を含有することを１つの特徴とする。
前記組換えベクターは、目的とする宿主内で遺伝子を発
現するのに適した任意のベクターにペクチン酸リアーゼ
遺伝子を組み込み作成することができる。かかるベクタ
ーとしては、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ３９８等が挙げら
れ、枯草菌を宿主とする場合、ｐＵＢ１１０等が挙げら
れる。

【００２３】本発明の組換えベクターにおいて、用いる
ベクター由来のプロモーターを、使用する宿主、発現の
様式等に応じて、他のプロモーターに置き換えることが
できる。また、ペクチン酸リアーゼを大量に発現させた
場合にも宿主内で組換えベクターを安定化させるため
に、公知のターミネーターを組み込んでもよい。

【００２４】本発明の形質転換体は、前記組換えベクタ
ーを含むことを１つの特徴とする。本発明の形質転換体
は、前記組換えベクターを用いて宿主を形質転換するこ
とにより得ることができる。

【００２５】前記形質転換は、例えばプロトプラスト
法、塩化ルビジウム法、塩化カルシウム法、エレクトロ
ポレーション法、コンピテントセル法等の常法により行
われる。宿主としては、ペクチン酸リアーゼの発現に適
する宿主であればよく、微生物が好ましく、バチルス
属、ストレプトマイセス属等のグラム陽性菌；大腸菌等
のグラム陰性菌；サッカロマイセス属、アスペルギルス
属等の真菌等が挙げられる。

【００２６】得られた形質転換体を同化性の炭素源、窒
素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従
い培養し、得られた培養液中から一般の酵素の採取及び
精製方法により、本発明の遺伝子にコードされるポリペ
プチド（ペクチン酸リアーゼ）を得ることができる。

【００２７】本発明の遺伝子にコードされるペクチン酸
リアーゼは、土壌から分離したバチルス属細菌（例えば
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｐ１５株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５９８７）やこの変異株を培養し、得られた培
養物から採取することによっても製造できる。

【００２８】本発明の遺伝子等を用いて、公知の方法に
より、必要に応じて、遺伝子の取得等に使用可能なプロ
ーブ、プライマー、抗体等を得ることができる。

【００２９】

【実施例】実施例１：ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクロ
ーニング （１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｐ１５株の染
色体ＤＮＡの調製Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｐ１５株を液体培地
〔組成：３．０％ ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．
５％ 酵母エキス（ディフコ）、１％魚肉エキス（和光
純薬）、０．１５％ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．００１％ Ｃ
ａＣｌ₂ 、０．５％ペクタン（シグマ）、０．５％ Ｎ
ａ₂ ＣＯ₃ （別に滅菌したものを添加）ｐＨ９．５〕で
振盪培養した培養液を遠心し、菌体を回収した。得られ
た菌体からSaito とMiura の方法(Biochim. Biophys. A
cta, 72, 619-629, 1963) で染色体ＤＮＡを調製した。

【００３０】（２）ショットガンクローニング 実施例１−（１）で調製したＫＳＭ−Ｐ１５株の染色体
ＤＮＡ約１μｇを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断し、エタ
ノール沈澱にて回収した。回収された切断片と予め同じ
制限酵素で処理し脱リン酸化したプラスミドｐＨＳＧ３
９８（タカラ社製）とを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
を用いて１６℃で一晩反応し、連結させた。得られた組
換えプラスミドを用いて、大腸菌ＨＢ１０１コンピテン
トセル（タカラ社製）を形質転換した。

【００３１】１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを
含むＬＢ寒天培地に形質転換体を塗抹し、目的のペクチ
ン酸リアーゼを生産するコロニーを、Mcvay らの方法
(J. Bacteriol., 72, 284-3239, 1990) に準じて検出し
た。目的遺伝子を含む組換えプラスミドの調製は、１０
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で振
盪培養後、プラスミド調製キット（ベーリンガーマンハ
イム社製）を用いて行った。

【００３２】実施例２：ＫＳＭ−Ｐ１５株由来ペクチン
酸リアーゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例１−（２）で調製したＫＳＭ−Ｐ１５株由来ペク
チン酸リアーゼ遺伝子を含むプラスミド約１μｇを鋳型
として、Smith らの方法により〔Nature，321, 674-679
(1986)〕により、塩基配列に適するプライマー並びにD
ye TerminaterCycle Sequencing Kit （アプライド バ
イオシステム社製）とＤＮＡシークエンサー３７７型
（アプライド バイオシステム社製）を用いてＫＳＭ−
Ｐ１５株由来ペクチン酸リアーゼ遺伝子の塩基配列の決
定を行った。

【００３３】その結果、ＫＳＭ−Ｐ１５株由来ペクチン
酸リアーゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号：２に示すよ
うに２０３１残基の塩基配列によりコードされ、６７７
アミノ酸残基により構成される酵素であることが判明し
た。更に、この配列中には２８個のアミノ酸からなるシ
グナルペプチドを含み、成熟酵素は６４９アミノ酸から
なり、分子量は６９，５５０Ｄａと推定された。

【００３４】実施例３：組換えプラスミドの構築と枯草
菌によるペクチン酸リアーゼの生産 まず、実施例１で調製した染色体ＤＮＡを鋳型にし、上
流側プライマー（プライマー１、図１参照）としては、
記載した配列番号：２のアミノ酸番号１よりも約１５０
ｂｐ上流に位置する３８ｂｐの配列を有するプライマー
を、下流側プライマー（プライマー２、図１参照）とし
て、終始コドン（ＴＡＧ）よりも約１９０ｂｐ下流に位
置する３８ｂｐの配列を有するプライマーを用いてＫＳ
Ｍ−Ｐ１５株のペクチン酸リアーゼ遺伝子の増幅を行っ
た。この際、増幅させた遺伝子が、用いたプラスミドｐ
ＨＳＰ６４(Sumitomo, et al., Biosci. Biotech. Bioc
hem., 56, 872-877, 1992)の高発現誘導領域の下流に正
方向に連結するように、作成したプライマー１にはマル
チクローニングサイトのＳａｌＩ、プライマー２にはＸ
ｂａＩ認識配列を付加させた。増幅したペクチン酸リア
ーゼ遺伝子及びプラスミドｐＨＳＰ６４をそれぞれ制限
酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理した後、混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩反応させた（図
２）。得られた組換えプラスミドをｐＨＳＰ−１５Ｈと
命名した。

【００３５】次にｐＨＳＰ−１５Ｈで枯草菌ＩＳＷ１２
１４を形質転換し、ポリペプトンＳ、マルトースを主成
分とする液体培地中で３０℃、３日間振盪培養したとこ
ろ菌体外に著量のペクチン酸リアーゼを生産した。その
生産量は、８．４Ｕ／ｍｌであった。

【００３６】参考例１：ペクチン酸リアーゼの活性測定
法 試験管に０．２ｍｌの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、０．１ｍｌの４ｍＭ塩化
カルシウム溶液、０．２ｍｌの１％（ｗ／ｖ）オリゴガ
ラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ．１４４８
２、水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ６．８に調整した溶
液）及び１．４ｍｌの脱イオン水を加え、３０℃で５分
間恒温した後、０．１ｍｌの適当に希釈した酵素液（希
釈は１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ７．５により行った）を添加し反応を開始
した。３０℃で１０分間反応させた後、２ｍｌの５０ｍ
Ｍ塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和オリゴガ
ラクツロニド量は２３５ｎｍにおける吸光度を測定し、
不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００Ｍ^-1ｃ
ｍ^-1（Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845,
1996)を用いて求めた。なお、盲検は酵素液を加えずに
処理した反応液に２ｍｌの５０ｍＭ塩酸を加え、その後
に０．１ｍｌの酵素液を添加したものを用いた。酵素１
単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μ
ｍｏｌの不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴガ
ラクツロニドを生成する量とした。

【００３７】

【発明の効果】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子、組
換えベクター及び形質転換体によれば、洗浄剤、食品加
工剤、繊維処理剤等として有用なペクチン酸リアーゼを
高純度かつ大量に生産することができる。また、本発明
の遺伝子を発現させて得られるポリペプチドは、従来困
難であった、高アルカリ性下での木綿（植物）繊維の精
練等に利用できる。

【００３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> A gene for pectate lyase <130> P98-896 <160> 4

【００３９】 <210> 1 <211> 649 <212> PRT <213> Bacillus sp. KSM-P15 <400> 1 Asp Ile Leu Tyr Ala Val Gln Asp Asp Phe Asp Ser Glu Pro Val 5 10 15 Gly Gln Pro Pro Ser Gly Tyr Ile Val Ser Pro Ser Pro Ser Thr 20 25 30 Ala His Asn Gln Val Thr Val Ala Ala Ala Pro Gln Arg Ser Gly 35 40 45 His Ala Leu Tyr Ile Glu Asp Arg Ser Ser Ser Ala Gln Thr Gln 50 55 60 Leu Ile Arg Gln Leu Glu Gln Pro Leu Thr Gly Met Val Thr Val 65 70 75 Gln Phe Asp Trp Tyr His Glu Gly Asn Ala Arg Ala Ser Ser Leu 80 85 90 Arg Pro Met Lys Ile Phe Ser Ser Ala Ser Glu Ser Ser Ser Thr 95 100 105 Thr Ile Val Glu Ile Gln Thr Arg Asp Gly Gly Arg His Leu Ala 110 115 120 Gln Thr Val Asn Gly Thr His His Leu Leu Val Thr Asp Phe Ala 125 130 135 Pro Asp Thr Trp Tyr Arg Phe Asn Ile Val Met Asn Thr Asp Thr 140 145 150 Lys Lys Val Asp Thr Tyr Val Asn Gly Glu Leu Lys Leu Glu Gln 155 160 165 Ala Asn Phe Ala Ser Thr Ser Ala Ala Gln Val Gln Arg Leu Lys 170 175 180 Ile Tyr Ser Gln Asn Ser Pro Thr Ile Gly Gln Tyr Ile Asp Asn 185 190 195 Leu Tyr Val Tyr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Thr Asp Pro Gly Pro 200 205 210 Gly Pro Ser Pro Gly Thr Pro Asp Pro Gly Thr Asp Pro Gly Thr 210 215 220 Gly Pro Asp Pro Asp Pro Gly Ser Pro Asp Pro Gly Thr Asn Pro 225 230 235 Asn Pro Gly His Pro Gln Asp Pro Gly Pro Ala Pro Glu Pro Ala 240 245 250 Glu Gly Asp Leu Ile Val Ala Pro Asn Gly Gln Glu Gly Asn Pro 255 260 265 Gly Thr Leu Asn Gln Pro Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Thr Arg 270 275 280 Ile Gln Pro Gly Arg Thr Ile Tyr Met Arg Gly Gly Thr Tyr Ala 290 295 300 Phe Ser Glu Thr Val Leu Ile Glu Arg Gly Asn Asn Gly Leu Glu 305 310 315 Gly Ala Arg Lys Arg Ile Val Gly Tyr Asn Gly Glu Lys Pro Val 320 325 330 Leu Asp Phe Ser Ala Gln Ala Phe Asp Pro Met Asn Arg Gly Leu 335 340 345 Gln Ile Asn Gly His Tyr Trp His Val Gln Gly Ile Glu Val Lys 350 355 360 Glu Ala Gly Asp Asn Gly Ile Phe Ile Gly Gly Asn Tyr Asn Arg 365 370 375 Ile Glu Asn Val Glu Thr His His Asn Lys Asp Thr Gly Leu Gln 380 385 390 Ile Ser Arg Tyr Ser Ser Ser Ala Thr Arg Asp Glu Trp Pro Ser 395 400 405 Tyr Asn Glu Ile Ile Asn Val Tyr Ser His Asn Asn Tyr Asp Pro 410 415 420 Asp Asp Gly Glu Asp Ala Asp Gly Phe Ala Ala Lys Leu Thr Ser 425 430 435 Gly Pro Gly Asn Val Phe Asp Gly Cys Ile Ala Ala Tyr Asn Val 440 445 450 Asp Asp Gly Trp Asp Leu Tyr Thr Lys Ser Asp Thr Gly Ala Ile 455 460 465 Tyr Pro Val Ile Ile Arg Asn Ser Ile Ala Tyr Asn Asn Gly Ser 470 475 480 Thr Glu Gly Gly His Ser Thr Ser Asn Ser Asp Gly Asn Gly Phe 485 490 495 Lys Leu Gly Gly Ser Asn Ile Pro Val Asn His Ile Val Glu Asn 500 505 510 Asn Met Ala Phe Gly Asn Lys Lys His Gly Phe Thr Tyr Asn Ser 515 520 525 Asn Pro Gly Ser Ile Thr Met Thr Asn Asn Thr Ser Trp Asn Asn 530 535 540 Gly Thr Arg Ser Gly Ser Asn Phe Ala Phe Asp Arg Gly Thr His 545 550 555 Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Phe Glu Ala Ser Ser Ser Asp Lys 560 565 570 Tyr Ala Thr Ser Thr Asp Ile Asp Gly Ser Asn Leu Trp Trp His 575 580 585 Asn Thr Lys Gly Ser Gln Asn Ala Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala 590 595 600 Ser Asp Phe Ile Ser Leu Ile Pro Thr Val Ser Arg Asp Ala Asn 605 610 615 Gly Ala Pro Val Ile Gly Gly Phe Leu Gln Leu Thr Gly Ser Ser 620 625 630 Ser Leu Lys Gly Ala Gly Thr Pro Ala Gly Thr Asp Ile Gly Ala 635 640 645 Arg Phe Pro Arg

【００４０】 <210> 2 <211> 2887 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-P15 <220> <221> CDS <222> (230)...(2260) <400> 2 ttcctgaacg gcttaaaatt tagaatatct aagataatga ttattgtggt tatcctggta 60 tttatgtaaa tttaaggggc gctttcatcg ataacatgaa gtaatgatac tcggtaggaa 120 gaggtgagcg tgcaatatta taagttcggg aggatgatga tggtatgctg atgctaaaga 180 cagaaggtaa cccccttgtc caagaacaag gaaaaggccg aaagtgacg atg ctg tcc 238 Met Leu Ser 1 ctg cta ttg tgt ttg ttg ttg cta att cag acg gga tcc tgg act gcc 286 Leu Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ile Gln Thr Gly Ser Trp Thr Ala 19 5 10 15 ttt ggc tcg acg aat tat gta agc gct gac att ctc tac gca gtg cag 334 Phe Gly Ser Thr Asn Tyr Val Ser Ala Asp Ile Leu Tyr Ala Val Gln 20 25 30 35 gac gat ttc gat tcc gaa cct gtc gga cag ccg cca agc ggc tat atc 382 Asp Asp Phe Asp Ser Glu Pro Val Gly Gln Pro Pro Ser Gly Tyr Ile 40 45 50 gtc tct cca agc cct tcc acc gcc cac aat caa gtg acg gta gca gct 430 Val Ser Pro Ser Pro Ser Thr Ala His Asn Gln Val Thr Val Ala Ala 55 60 65 gct ccc cag cgc agc ggt cac gcg ctt tac atc gag gat cgc tct tct 478 Ala Pro Gln Arg Ser Gly His Ala Leu Tyr Ile Glu Asp Arg Ser Ser 70 75 80 tct gct caa act cag ctc att cgc caa ctg gaa cag ccg ctc aca ggc 526 Ser Ala Gln Thr Gln Leu Ile Arg Gln Leu Glu Gln Pro Leu Thr Gly 85 90 95 atg gta acc gta caa ttt gat tgg tac cac gaa gga aac gcg cgt gct 574 Met Val Thr Val Gln Phe Asp Trp Tyr His Glu Gly Asn Ala Arg Ala 100 105 110 115 agc tcg ctt cgt ccg atg aag att ttc tcc tct gct tcc gag tcc tct 622 Ser Ser Leu Arg Pro Met Lys Ile Phe Ser Ser Ala Ser Glu Ser Ser 120 125 130 tca act acg atc gtc gaa att cag acc cgt gac ggc gga cgg cat cta 670 Ser Thr Thr Ile Val Glu Ile Gln Thr Arg Asp Gly Gly Arg His Leu 135 140 145 gcc caa acc gtt aac ggt aca cat cat ctg ctt gtt acc gac ttt gcc 718 Ala Gln Thr Val Asn Gly Thr His His Leu Leu Val Thr Asp Phe Ala 150 155 160 ccg gac aca tgg tac cgc ttc aat atc gtg atg aat acc gat act aaa 766 Pro Asp Thr Trp Tyr Arg Phe Asn Ile Val Met Asn Thr Asp Thr Lys 165 170 175 aag gtt gat acg tac gtt aac ggt gag ctg aag ctg gaa cag gct aac 814 Lys Val Asp Thr Tyr Val Asn Gly Glu Leu Lys Leu Glu Gln Ala Asn 180 185 190 195 ttt gct tcg acc tcc gca gct cag gtg cag cgc ctg aag atc tat tcc 862 Phe Ala Ser Thr Ser Ala Ala Gln Val Gln Arg Leu Lys Ile Tyr Ser 200 205 210 cag aac agt ccg aca atc ggt caa tac atc gat aat ctg tac gtg tat 910 Gln Asn Ser Pro Thr Ile Gly Gln Tyr Ile Asp Asn Leu Tyr Val Tyr 215 220 225 agc ggc agc aat cca ggc aca gat ccg ggg ccg gga cca agc cca ggc 958 Ser Gly Ser Asn Pro Gly Thr Asp Pro Gly Pro Gly Pro Ser Pro Gly 230 235 240 acc ccc gat ccg gga aca gat cca ggt aca ggt cca gac cca gac cct 1006 Thr Pro Asp Pro Gly Thr Asp Pro Gly Thr Gly Pro Asp Pro Asp Pro 245 250 255 ggc agt cct gat ccg ggc acg aat cct aac ccg ggt cat cca cag gat 1054 Gly Ser Pro Asp Pro Gly Thr Asn Pro Asn Pro Gly His Pro Gln Asp 260 265 270 275 ccc ggt ccg gca cca gag cct gca gaa ggc gat ctt att gtg gca ccg 1102 Pro Gly Pro Ala Pro Glu Pro Ala Glu Gly Asp Leu Ile Val Ala Pro 280 285 290 aac gga cag gag ggt aac ccc ggc acc ctg aat caa ccg acc acg ctg 1150 Asn Gly Gln Glu Gly Asn Pro Gly Thr Leu Asn Gln Pro Thr Thr Leu 295 300 305 aca tcc gcc att acg cgc att cag ccc gga cgg acc atc tat atg cgc 1198 Thr Ser Ala Ile Thr Arg Ile Gln Pro Gly Arg Thr Ile Tyr Met Arg 310 315 320 ggc ggc acc tat gcc ttc agc gag acg gtg ttg atc gag cgt ggc aac 1246 Gly Gly Thr Tyr Ala Phe Ser Glu Thr Val Leu Ile Glu Arg Gly Asn 325 330 335 aac gga ctg gaa gga gcg cgt aaa cgc att gta ggc tac aac ggt gaa 1294 Asn Gly Leu Glu Gly Ala Arg Lys Arg Ile Val Gly Tyr Asn Gly Glu 340 345 350 355 aag cct gtt ctg gac ttc tca gcc caa gcg ttc gat ccg atg aac cgc 1342 Lys Pro Val Leu Asp Phe Ser Ala Gln Ala Phe Asp Pro Met Asn Arg 360 365 370 ggt ctc cag att aac ggc cac tat tgg cat gtt caa gga att gag gtt 1390 Gly Leu Gln Ile Asn Gly His Tyr Trp His Val Gln Gly Ile Glu Val 375 380 385 aag gag gcc ggg gat aac ggc ata ttt atc ggt ggc aat tac aat cga 1438 Lys Glu Ala Gly Asp Asn Gly Ile Phe Ile Gly Gly Asn Tyr Asn Arg 390 395 400 atc gaa aat gtg gaa acc cat cat aac aaa gac acc ggt ctg caa att 1486 Ile Glu Asn Val Glu Thr His His Asn Lys Asp Thr Gly Leu Gln Ile 405 410 415 tcc cgc tat tct tct tcc gcc aca cgc gac gag tgg cct agt tac aac 1534 Ser Arg Tyr Ser Ser Ser Ala Thr Arg Asp Glu Trp Pro Ser Tyr Asn 420 425 430 435 gaa att att aat gtt tac tcc cat aac aac tat gac ccg gac gac gga 1582 Glu Ile Ile Asn Val Tyr Ser His Asn Asn Tyr Asp Pro Asp Asp Gly 440 445 450 gag gac gcc gac ggt ttt gcg gcc aag ctg aca tcc ggt cca ggc aac 1630 Glu Asp Ala Asp Gly Phe Ala Ala Lys Leu Thr Ser Gly Pro Gly Asn 455 460 465 gtg ttc gac ggg tgc att gcc gcc tat aat gtc gat gac ggt tgg gac 1678 Val Phe Asp Gly Cys Ile Ala Ala Tyr Asn Val Asp Asp Gly Trp Asp 470 475 480 ctt tac acc aag agt gac acc ggt gcc atc tac cct gtc att atc cgc 1726 Leu Tyr Thr Lys Ser Asp Thr Gly Ala Ile Tyr Pro Val Ile Ile Arg 485 490 495 aac agc atc gca tac aac aac ggt tcg acc gaa ggc ggc cat tcc acc 1774 Asn Ser Ile Ala Tyr Asn Asn Gly Ser Thr Glu Gly Gly His Ser Thr 500 505 510 515 tcc aac agc gac ggt aac ggg ttc aag ctg ggc ggc tcg aat att cca 1822 Ser Asn Ser Asp Gly Asn Gly Phe Lys Leu Gly Gly Ser Asn Ile Pro 520 525 530 gtc aac cat att gtc gag aac aat atg gcg ttt ggc aac aag aag cat 1870 Val Asn His Ile Val Glu Asn Asn Met Ala Phe Gly Asn Lys Lys His 535 540 545 gga ttc acc tac aac agc aac ccg ggt tcg att acg atg acc aac aat 1918 Gly Phe Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Gly Ser Ile Thr Met Thr Asn Asn 550 555 560 acg agc tgg aat aac ggg acc cga tca ggc agc aat ttc gct ttt gac 1966 Thr Ser Trp Asn Asn Gly Thr Arg Ser Gly Ser Asn Phe Ala Phe Asp 565 570 575 aga ggc acg cat ctg ttc gcg aat aac cta tcg ttc gaa gcc tcg tca 2014 Arg Gly Thr His Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Phe Glu Ala Ser Ser 580 585 590 595 agc gac aag tac gcg acc agc acg gat atc gac ggt tcc aac ctg tgg 2062 Ser Asp Lys Tyr Ala Thr Ser Thr Asp Ile Asp Gly Ser Asn Leu Trp 600 605 610 tgg cac aat acg aaa ggc agt cag aat gcc aaa aac ctg aag gta acc 2110 Trp His Asn Thr Lys Gly Ser Gln Asn Ala Lys Asn Leu Lys Val Thr 615 620 625 gca tcg gat ttt atc agc ctg atc cca acg gtc agc cgc gat gct aac 2158 Ala Ser Asp Phe Ile Ser Leu Ile Pro Thr Val Ser Arg Asp Ala Asn 630 635 640 ggc gct ccc gtc att ggc ggc ttc ctg cag ctg acc ggc agc agc agc 2206 Gly Ala Pro Val Ile Gly Gly Phe Leu Gln Leu Thr Gly Ser Ser Ser 645 650 655 ctg aaa ggt gca gga acg ccg gca ggg aca gat att gga gca cgc ttc 2254 Leu Lys Gly Ala Gly Thr Pro Ala Gly Thr Asp Ile Gly Ala Arg Phe 660 665 670 675 ccg aga tagcgggatg caagtcgggg tccttcccat attatgacga tcgaagaaca 2310 Pro Arg taacgtacac caccggagag tgccactcat ttgtgaaact gggtgctccc ggtggtgttt 2370 ttgtaacatg aggtggcttg tgtgtgtctc aagctcgcga tccccatagc gccctccgca 2430 tttatgtaat gttttataac ataatggttc ggtagataaa ctaagattac tgggaatgac 2490 attgccaact ttttcttata tatactcaaa aacgaatgaa aataatggga tatctctaat 2550 attcttaatt tgaaagcgga ttcccttatt gatgtcaagt ttgtcataat aactgacgtt 2610 aaatacaatg aatttacatt cataccggtt ttcgcgtaat aaaaacttac ataacatcaa 2670 ggagtgagcg tacatgaaga aaagcacaaa acatcctctg gccgtatgga gcacggcagc 2730 cttggcggca ttgatgatct cggtgtcccc tgttggggct tacacggcac aggccgcaac 2890 cgtaacggaa gtgaagggaa cagcaaccgt agtagcgcct ccggcaccag caggcccggt 2950 tcggaatacg accattcctc cgctattgga tgccttc 2887

【００４１】 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tggtcgactg atgctgatgc taaagacaga aggtaacc 38

【００４２】 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 atctagagta atcttagttt atctaccgaa ccattatg 38

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子全
領域を増幅するためのプライマー１とプライマー２を示
す図である。実施例３で示したＰＣＲ増幅用プライマー
で、生成する増幅断片は、ＳａｌＩとＸｂａＩとで消化
された後、ＳａｌＩとＳｍａＩで消化されたｐＨＳＰに
連結される。

【図２】図２は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子の分泌ベク
ター（ｐＨＳＰ６４）への導入の概略と構築されたペク
チン酸リアーゼ発現分泌ベクターｐＨＳＰ−１５Ｈとを
示す図である。図中、Ａｍｐはアンピシリン耐性マーカ
ー遺伝子を、Ｔｅｔはテトラサイクリン耐性マーカー遺
伝子を、ｓｐ６４はＫＳＭ６４株のプロモーターを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 住友 伸行 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606番地 花王株 式会社研究所内 (72)発明者 秦田 勇二 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606番地 花王株 式会社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606番地 花王株 式会社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA07 CA03 DA06 DA07 EA04 GA11 GA19 HA01 HA14 4B050 CC03 DD02 LL02 LL04 LL05 4B065 AA15X AA15Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA27 CA41 CA57

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列
   からなるポリペプチドをコードする塩基配列、（Ｂ）配
   列番号：１に示すアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸
   の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列から
   なるポリペプチドをコードする塩基配列、（Ｃ）配列番
   号：２に示す塩基配列、（Ｄ）配列番号：２に示す塩基
   配列中の１個以上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を
   有する塩基配列、及び（Ｅ）前記（Ａ）〜（Ｄ）のいず
   れかの塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列、からなる群
   より選ばれた塩基配列を含有し、かつペクチン酸リアー
   ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子を含有してなる組
   換えベクター。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
4. 【請求項４】 請求項１記載の遺伝子を発現させて得ら
   れるポリペプチド。