JP2000247991A - 新規二糖、甘味剤、該二糖の製法および酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 口腔細菌による酸の産生がなく、胃で加水分
解されず、ノンカロリーであるかカロリーがゼロに近
く、ショ糖に近い味質を示す新規二糖およびそれを含有
する甘味剤、該二糖の製法、およびその製造に使用する
酵素の提供。 【解決手段】 １−Ｏ−β−Ｄ−フラクトピラノシル−
Ｄ−フラクトース（以下、ＦｐＦという）、ＦｐＦを有
効成分として含有する甘味剤、ジヘテロレブロサンＩＩ
にジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結
合を加水分解する酵素を作用させることを特徴とするＦ
ｐＦの製造方法、およびジヘテロレブロサンＩＩのα−
フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特に食品分野にお
いて利用することができ、医薬分野への利用も考えられ
る、β−フラクトピラノシド結合を有する新しいタイプ
の果糖の二量体（二糖）、それを含有する甘味剤、該二
糖の製法、およびその製造に使用する酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】果糖を構成単位として含有するヘテロビ
オースとしては非還元性のショ糖（１−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−２−β−Ｄ−フラクトフラノシド）等、還
元性のマルツロース（４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−Ｄ−フラクトース）、ラクツロース（４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−フラクトース）等が知ら
れている。果糖を構成単位として含有するホモビオース
としては還元性のイヌロビオース（１−Ｏ−β−Ｄ−フ
ラクトフラノシル−Ｄ−フラクトース）等が知られてい
る。果糖を構成単位として含有する二糖の味質について
は、ショ糖、イヌロビオースが甘味を有することが知ら
れている。また、果糖を構成単位として含有するホモビ
オースが新たな環を形成するように脱水縮合した形態の
ジフラクトースジアンヒドリド（以下、ＤＦＡという）
類が知られている（科学と工業、７０（８），３２０〜
３３１（１９９６）。ＤＦＡ類の味質については、イヌ
リンから酵素的に生成させることができるＤＦＡＩ（α
−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース
１，２´：２，１´ジアンヒドリド）およびＤＦＡＩＩ
Ｉ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラ
ノース１，２´：２，３´ジアンヒドリド）が甘味を有
することが知られている（特開昭６３−２６９９６
２）。

【０００３】また、β−フラクトピラノシド結合はＤＦ
Ａ中の、ジヘテロレブロサンＩ（α−Ｄ−フラクトピラ
ノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´
ジアンヒドリド）、ジヘテロレブロサンＩＩ（α−Ｄ−
フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２
´：２，１´ジアンヒドリド）、ジヘテロレブロサンＩ
ＩＩ（β−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトピ
ラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）、ジヘテ
ロレブロサンＩＶ（β−Ｄ−フラクトピラノースβ−Ｄ
−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリ
ド）（Ｎｉｐｐｏｎ Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ Ｋａｉ
ｓｈｉ Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１３６〜１
１４０，１９８９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，１３６（１９８５），５３〜６５）等に認
められるが、単量体と単量体とが１カ所でβ−フラクト
ピラノシド結合で結合した重合体は二量体についてもそ
れ以上の重合体についても報告されていない。β−フラ
クトピラノシド結合結合を有する物質の性質については
ｎ−ペンチル−β−Ｄ−フラクトピラノシド（化学合
成）のＩｇＥ抗体生成抑制能が報告されている（Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．２５，ｐ１４９５〜１４９９（１９８
２））。

【０００４】また、現在知られているノンカロリーの糖
質としては糖アルコールの一種であるエリスリトールだ
けである。この糖質はそのほとんどすべてが体内に吸収
された後、代謝されずにそのまま尿中に排泄されるた
め、ノンカロリーとされている。しかし、エリスリトー
ルは溶解するとき高い吸熱作用を示すので、食した際に
口の中で冷涼感を感じる。このため、冷涼感が好ましく
ない製品には使用し難い場合があった。また、エリスリ
トールは四炭糖の単糖であるため、氷菓に使用する際、
氷点降下が大きすぎる問題もあった。マルチトールなど
の二糖類の糖アルコールは消化酵素で分解されないが、
腸内細菌により有機酸に変換され、体内に吸収されると
して、２ｋｃａｌ／ｇ扱いとなっており、二糖類以上の
ノンカロリー糖質は現在知られていない。

【０００５】また、α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ
−フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリ
ド（ＤＦＡＩ）およびα−Ｄ−フラクトフラノースβ−
Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒド
リド（ＤＦＡＩＩＩ）については、そのα−フラクトフ
ラノシド結合を加水分解してイヌロビオースを生成する
酵素が知られている（澱粉科学 第３５巻 第２号 ｐ
１１３〜ｐ１２０（１９８８）。しかしながら、ジヘテ
ロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水
分解する酵素は知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は口腔細菌によ
る酸の産生がなく、胃で加水分解されず、ノンカロリー
であるかカロリーがゼロに近く、ショ糖に近い味質を示
す新規二糖およびそれを含有する甘味剤、該二糖の製
法、およびその製造に使用する酵素を提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の化学式
で表される１−Ｏ−β−Ｄ−フラクトピラノシル−Ｄ−
フラクトース（以下、ＦｐＦという）に関する。

【０００８】

【化１】

【０００９】本発明はまた、ＦｐＦを有効成分として含
有する甘味剤に関する。本発明はさらに、ジヘテロレブ
ロサンＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラ
クトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）に
ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合
を加水分解する酵素を作用させることを特徴とするＦｐ
Ｆの製造方法、およびジヘテロレブロサンＩＩのα−フ
ラクトフラノシド結合を加水分解する酵素に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明のＦｐＦの製造方法については後述する。Ｆ
ｐＦの比旋光度は［α］²⁰ _D（ｃ＝９．７）：−１３１
である。ＦｐＦの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１に示
す。ＦｐＦの甘味度を他の二糖類と比較して表１に示
す。甘味度は５ｗ／ｖ％または１０ｗ／ｖ％のショ糖溶
液を標準として、２０℃で１０人のパネラーで判定し
た。判定方法は澱粉糖技術研究会報、第１４号、ｐ４４
（１９５６）に準じた。

【００１１】

【表１】

【００１２】また、ＦｐＦの味質は次のようにして評価
した。すなわち、５ｗ／ｖ％ショ糖、１２．５ｗ／ｖ％
ＦｐＦおよび１２．５ｗ／ｖ％マルトースをそれぞれ調
製し、これらの２０℃における甘味度が一致しているこ
とを確認した上で、１０人のパネラーにより表２に示し
た項目についてショ糖と同程度であれば０、やや強けれ
ば＋１、強ければ＋２、やや弱ければ−１、弱ければ−
２で評価し、平均点を算出した。その結果、表２に示し
たようにショ糖に近い味質を示すことが判明した。

【００１３】

【表２】

【００１４】また、ＦｐＦの酸安定性は、ｐＨ２．０、
１．５または１．０に設定した１００ｍＭＫＣｌ−ＨＣ
ｌ緩衝液で１ｗ／ｖ％溶液を調製し、これを３７℃で１
時間保持し、残存した各二糖類の残存率を測定すること
で評価した。対照としてイヌロビオース、ショ糖、マル
トースについても同様に調べた。結果を図２に示す。図
２から明らかなごとく、ＦｐＦの酸安定性はイヌロビオ
ースより高く、ショ糖と同等で、マルトースより低かっ
た。

【００１５】ＦｐＦは口腔細菌により利用されなかった
（実施例３）。また、各種消化酵素によるＦｐＦの消化
性について調べたところ、まったく分解されなかった
（実施例４）。さらに、ＦｐＦは大腸における腸内細菌
にもほとんと資化されない。通常、難消化性糖質である
マルチトールなどは腸内細菌で発酵を受け有機酸を生
じ、これが体内に吸収されてカロリーになる。しかし、
ＦｐＦは消化酵素でも分解されず、腸内細菌にもほとん
ど資化されないので、通常の難消化性糖質とは異なり、
ノンカロリーであるかカロリーがほとんどゼロに近い糖
質であると理解される。上記の資化性や消化性はβ−フ
ラクトピラノシド結合のみで結合した、ＦｐＦ以外の果
糖の重合体（すなわちオリゴ糖および多糖）も共通して
有する性質であると考えられる。したがって、例えばＦ
ｐＦ以外のβ−フラクトピラノシル−Ｄ−フラクトース
もノンカロリー性糖質であると考えられる。

【００１６】上述したＦｐＦの性質を利用して、本発明
はまた、ＦｐＦを有効成分として含有する甘味剤に関す
る。この甘味剤はＦｐＦのみからなっていても良く、補
助成分または他の活性成分、例えば他の甘味成分と混合
された形態にあっても良い。

【００１７】補助成分としては、水、常用される賦形剤
・結合剤等を用いることができる。賦形剤としては甘味
成分としても用いられるショ糖、乳糖、果糖、ソルビト
ール、マルチトール等の他、可溶性デンプン、デキスト
リン、ガム質マンナン、ペクチン、アルギン酸等の多糖
類、ゼラチン、低分子量ポリペプチド等のタンパク質、
炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等の塩、クエン酸、
リンゴ酸、フマル酸等の酸等から適宜選択して用いるこ
とができる。結合剤としてはグアーガム、アラビアガ
ム、デキストリン等を必要に応じ適宜選択して用いるこ
とができる。その他、フレーバー、エッセンス、ビタミ
ン、調味料等を必要に応じ適宜選択して用いることがで
きる。他の甘味成分としてはショ糖、ブドウ糖、果糖、
ソルビトール、マルチトール、アスパルテーム、ステビ
オサイド、サッカリン等を用いることができる。また、
他の呈味成分として酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味
などを与える成分が挙げられる。

【００１８】本発明の甘味剤は、種々の形状で、例えば
粉末、顆粒、シロップ等として用いることができる。

【００１９】本甘味剤は、人および他の動物によって摂
取あるいは投与される飲食品または薬品の甘味付与およ
び／または糖含量上昇のために広く使用することができ
る。該飲食品類の例としては、各種調味料（例えば、醤
油、味噌、マヨネーズ、ドレッシング、天つゆ、ケチャ
ップ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープ
の素、ダシの素等）、各種和菓子（例えば、煎餅、あら
れ、餅類、饅頭、ういろう、羊羮、ゼリー、カステラ、
飴玉等）、各種洋菓子（例えば、ビスケット、クラッカ
ー、クッキー、パイ、プリン、シュークリーム、スポン
ジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム
等）、パン類、氷菓子（例えば、アイスクリーム、シャ
ーベット等）、シロップ類（例えば、果実のシロップ漬
等）、ペースト類（例えば、フルーツペースト、ピーナ
ツペースト等）、ジャム、マーマレード、漬物類（例え
ば、福神漬、千枚漬、らっきょう漬等）、畜肉練り製品
（例えば、ハム、ソーセージ等）、魚肉練り製品（例え
ば、かまぼこ、竹輪等）、各種珍味類、佃煮類、アルコ
ール飲料、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、ス
タミナドリンク、乳酸飲料、乳酸菌飲料、インスタント
飲食品（例えば、インスタントジュース、インスタント
コーヒー等）等が挙げられる。また、該薬品の例として
は、散剤、錠剤、水剤、シロップ剤などのほか、歯みが
き、含嗽剤等が挙げられる。

【００２０】本甘味剤の使用量については、対象の飲食
品類または薬品類にとって甘味付与のための必要な程度
まで任意に使用することができる。具体的な使用量は飲
食品類または薬品類によって異なるが、通常、本甘味剤
が対象品中においてＦｐＦとして約０．５〜７０ｗ／ｗ
％、さらには約５〜３０ｗ／ｗ％となるような範囲から
選択するのが好ましい。

【００２１】甘味付与および／または糖含量上昇のため
の対象品への本甘味剤の使用方法は通常の甘味剤と同様
に行えば良い。例えば、飲食品類または薬品類の製造時
においてあるいはこれらの摂取時において、混和、混
捏、溶解、浸漬、浸透、散布、噴霧、注入などの適宜の
方法を採用して対象品類に含有せしめることができる。

【００２２】次にＦｐＦの製法について説明する。Ｆｐ
ＦはジヘテロレブロサンＩＩにジヘテロレブロサンＩＩ
のα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素（以
下、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素という）を作用さ
せることにより製造することができる。この酵素は、ま
ず （１）作用として、ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラ
クトフラノシド結合を加水分解する作用を有する。

【００２３】上記酵素は詳しくはさらに以下の酵素学的
性質を有する。 （２）基質特異性 ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合
を加水分解することに加え、ＤＦＡＩ（α−Ｄ−フラク
トフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：
２，１´ジアンヒドリドのα−フラクトフラノシド結合
を加水分解し、イヌロビオースを生成する。また、Ｆｐ
Ｆを分子内縮合させてジヘテロレブロサンＩＩを生成
し、イヌロビオースを分子内縮合させてＤＦＡＩを生成
する。ＤＦＡＩＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−
Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒド
リドには作用しない。 （３）至適ｐＨ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．５）を
用いて反応を行い、相対活性を調べたところ、至適ｐＨ
は７．５であった（図３）。 （４）安定ｐＨ範囲 ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．５）を
用いて５０℃で１時間インキュベートし、残存活性を測
定したところ、本酵素はｐＨ６．０〜８．０で安定であ
った（図３）。

【００２４】（５）至適温度 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で種々
の温度（３０〜６５℃）で反応を行い、相対活性を調べ
たところ、至適温度は５０℃であった（図４）。 （６）温度安定性 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で種々
の温度（３０〜６５℃）で１時間インキュベートし、残
存活性を測定したところ、１００％の活性を保持する温
度は５０℃までであった（図４）。

【００２５】（７）分子量 Ｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動により各
種標準タンパク質との相対移動度から求めた分子量は約
２００，０００であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動により各種標準タンパク質との相対移動度から
求めた分子量は約５０，０００であった。上記電気泳動
の結果から、本酵素は４量体を形成しているものと考え
られる。 （８）等電点 本酵素をＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ電気泳動システム（フ
ァルマシア バイオテク（株））で、等電点測定用のゲ
ルとしてＡｍｐｈｏｌｉｎｅ ＰＡＧｐｌａｔｅ（ファ
ルマシア バイオテク（株））を用いて等電点電気泳動
を行い、染色すると共に、ゲルを５ｍｍ間隔で切り出
し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で抽
出し、活性を測定した。活性が検出された位置と染色さ
れた染色バンドの位置は一致し、等電点は約５．０と測
定された。

【００２６】なお、上記酵素学的性質の決定に当り、本
発明のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の活性は以下の
ようにして測定した。本酵素はジヘテロレブロサンＩＩ
分解活性を有するが、酵素反応の平衡がジヘテロレブロ
サンＩＩに大きく傾いているため、感度の良い測定法と
してＤＦＡＩを基質に以下のように活性測定を行った。
１ｗ／ｖ％ＤＦＡＩ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）中）０．５ｍｌと酵素液０．５ｍｌとを
混合し、４０℃で３０分反応させた後、沸騰水浴中で３
分間処理して反応を停止した。この溶液をＨＰＬＣで分
析して、ＤＦＡＩの分解量を測定した。酵素１単位は１
分間に１μｍｏｌのＤＦＡＩを加水分解する酵素量とし
た。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。 （ＨＰＬＣ条件） カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＱ（４．６×２５
０ｍｍ）（（株）ワイエムシイ製） 移動相：蒸留水 流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出：ＲＩ

【００２７】本発明のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素
は、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能を有するバ
チルス属細菌を栄養培地に培養し、培養物から生成した
ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素を採取することにより
製造することができる。

【００２８】製造に使用される微生物としてはバチルス
属に属し、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能を有
する微生物であればいずれの微生物でもよい。具体的に
は本発明者らが土壌より分離した５６−７株が挙げられ
る。この菌株の菌学的性質は表３に示す通りである。一
方、菌体の脂肪酸組成を調べたところＢａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓに最も近いが、一致とは言えなか
った。また１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を調べたところＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘと９１．４％の相同性を示した
が、種の同定では９７％以上で一致と言えるので、これ
も相同性が低い。したがって、５６−７株はＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｐ．（バチルス・エスピー）５６−７と命名
した。５６−７株は、通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１７０９０として寄託され
ている。本発明で使用する微生物は野生株に限らず、野
生株例えば上記野生株を紫外線、エックス線、放射線、
薬品［ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル メタンスルホネー
ト）等］等を用いる既知の人工的変異手段で変異した変
異株も、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素遺伝子を導入
した微生物も、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能
を有する限り使用できる。

【００２９】

【表３】

【００３０】ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能を
有する微生物を培養するための栄養培地としては、炭素
源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要
とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然
培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマル
トース、グルコース、フラクトース、乳糖、デンプン、
デキストリン、グリセリン等の炭水化物等が用いられ
る。なお、本酵素は誘導酵素であるため、炭素源の一部
として培地に０．０１〜１ｗ／ｖ％となるようにジヘテ
ロレブロサンＩＩまたはＤＦＡＩを加えることが好まし
い。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタ
ミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物
が用いられる。窒素源としてはペプトン、ポリペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大
豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジ
タブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用できる。無
機物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム等が用いられる。その他にビオチン、チアミン等の
微量栄養素を必要に応じ使用する。

【００３１】培養法としては液体培養法（振盪培養法も
しくは通気攪拌培養法）が良く、工業的には通気攪拌培
養法がもっとも適している。培養温度は２０〜４０℃の
範囲で行うことができる。ｐＨは６．５〜７．５が好適
である。培養時間は培養条件によって変ってくるが、通
常１５〜４８時間程度であり、ジヘテロレブロサンＩＩ
分解酵素の生成が確認されたとき、好ましくは生成が最
大に達したときに培養を停止する。

【００３２】このようにして得られた培養物から本発明
のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素を採取するには、ま
ず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と
菌体画分に分ける。ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素は
前述の両画分に検出されるが、主に菌体画分から得られ
るので、菌体を超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレン
チプレスなどの物理的処理やリゾチームなどの酵素処理
により破壊し、菌体抽出液を得て、これをさらに限外ろ
過、塩析、透析、溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフ
ィー等の周知の単離・精製方法の単独或いは組合せに付
すことにより、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の濃縮
或いは精製標品を得ることができる。本発明のジヘテロ
レブロサンＩＩ分解酵素の単離・精製の具体例を実施例
１に示す。

【００３３】ジヘテロレブロサンＩＩに、上記ジヘテロ
レブロサンＩＩ分解酵素を作用させることによりＦｐＦ
を製造することができる。さらに詳しくは、ジヘテロレ
ブロサンＩＩに、上記ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素
を、水性媒体中で、３０〜５５℃、ｐＨ６．０〜８．５
で作用させることによりＦｐＦを製造することができ
る。

【００３４】このＦｐＦの製造に利用する該ジヘテロレ
ブロサンＩＩ分解酵素としては、精製酵素であっても、
ＦｐＦの製造に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有して
いても良い粗酵素であっても良い。粗酵素としては上記
培養液画分等のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素含有画
分から塩析または溶媒沈殿により沈殿させた粗酵素、ま
たはこれをさらに前記のような精製手段で精製した精製
途中段階の粗酵素が挙げられる。さらにこれらの酵素を
常法により担体に固定化した固定化酵素を用いることも
可能である。

【００３５】出発原料として用いるジヘテロレブロサン
ＩＩは化学名はα−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フ
ラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリドで
あり、下記の式で示される。

【００３６】

【化２】

【００３７】ジヘテロレブロサンＩＩは公知物質で、種
々の、果糖やイヌリンの酸処理物から単離されている
（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３
６（１９８５），５３−６５）。通常、７０〜９０重量
％の高濃度果糖水溶液をｐＨ２．５〜３．５、温度１１
０〜１５０℃、好ましくは１３０〜１４０℃、大気圧下
で１〜１８０分、好ましくは２０〜６０分保持して反応
させると、５０％以上の生成率でジフラクトースジアン
ヒドリド（ＤＦＡ）類が得られ、そのうち約２０重量％
がジヘテロレブロサンＩＩである。反応混合物をｐＨ２
に調整し、沸騰水浴中で３０〜６０分保持してＤＦＡ以
外の縮合物を果糖に分解し、ついでＮａ型陽イオン交換
樹脂カラムでＤＦＡ類と果糖に分離し、さらに逆相クロ
マトグラフィー用カラムでジヘテロレブロサンＩＩを単
離する。ジヘテロレブロサンＩＩの具体的製造例を参考
例１に示す。

【００３８】ＦｐＦ製造における水性媒体としては水、
緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リ
ン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハ
ク酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液当を用いることができ
る。酵素の使用量については、特に制限ないが、ジヘテ
ロレブロサンＩＩ１ｇに対し、０．３〜３０単位、好ま
しくは０．５〜１０単位使用するのが適当である。上記
条件下で十分なＦｐＦの生成が見られた時点で反応を終
了するが、反応は通常１０〜３０時間で終了する。

【００３９】反応終了後、反応液の加熱による酵素の失
活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活
等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせて、
ＦｐＦを得ることができる。ジヘテロレブロサンＩＩの
加水分解によるＦｐＦの製造の具体例を実施例２に示
す。

【００４０】

【実施例】次に実施例および参考例により本発明を具体
的に説明する。 実施例１ ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の製造 ０．３ｗ／ｖ％ＤＦＡＩ、０．１ｗ／ｖ％ポリペプト
ン、０．２ｗ／ｖ％酵母エキス、０．２ｗ／ｖ％硫酸ア
ンモニウム、硝酸ナトリウム、０．０５ｗ／ｖ％塩化ナ
トリウム、０．０５ｗ／ｖ％リン酸１カリウム、０．０
２ｗ／ｖ％硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０の培地を１２
１℃、２０分オートクレーブ処理後、バチルス・スピー
シーズ５６−７（ＦＥＲＭ−Ｐ１７０９０）を植菌し、
３０℃、２０時間振盪培養した。培養後、超音波処理で
菌体を破砕し、菌体抽出液を得た。これを硫安分画５０
〜７０ｗ／ｖ％飽和、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（東
ソー（株）製）による陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア・バイ
オテク（株））によるゲル濾過、ｍｏｎｏＱ５／５（フ
ァルマシア・バイオテク（株））による陰イオン交換ク
ロマトグラフィーに付して、電気泳動的に単一に精製し
た。得られた精製ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の酵
素学的性質は既述の通りである。

【００４１】実施例２ ジヘテロレブロサンＩＩの加水
分解によるＦｐＦの製造 参考例１のようにして調製したジヘテロレブロサンＩＩ
７０ｇを５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００ｍｌ
に溶解し、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素２８単位を
添加し、４５℃で３０時間反応させた。反応液をイオン
精製し、逆相クロマトグラフィー用カラム（（株）ワイ
エムシイ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ、１０×１
００ｃｍ×２本）により分画分取し、ＦｐＦ画分を減圧
濃縮したところ純度９７ｗ／ｗ％のＦｐＦ７５ｗ／ｗ％
溶液１．９ｇが得られた。これをさらに８０ｗ／ｗ％ま
で濃縮し、室温で静置することで結晶化させ、９９ｗ／
ｗ％以上の結晶ＦｐＦ０．７ｇを得た。

【００４２】実施例３ 口腔細菌による酸産生性試験法 水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した１０ｗ／ｖ％
ＦｐＦ溶液０．３ｍｌにｐＨ７．０に調整した培地２．
７ｍｌを加えて調製した試験液に、１×１０個／ｍｌの
菌体懸濁液０．１ｍｌを加え、３７℃で７２時間静置培
養し、ｐＨを測定した。対照としてショ糖とマルチトー
ルを用いた。う蝕菌は代表としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｍｕｔａｎｓＭＴ８１４８およびＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ６７１５を用いた。
その結果、どちらの菌株においてもショ糖はｐＨ４．２
に低下したが、ＦｐＦおよびマルチトールはｐＨ７．５
であり、ＦｐＦの口腔細菌による利用は認められなかっ
た。

【００４３】実施例４ ＦｐＦの各種消化酵素による分
解性 １．α−アミラーゼ １ｗ／ｖ％ＦｐＦ（１ｍＭ ＣａＣｌを含有する５０ｍ
Ｍマレイン酸緩衝液；唾液アミラーゼ試験ではｐＨ６．
０、膵液アミラーゼ試験ではｐＨ６．９）ｍｌにヒト唾
液アミラーゼ（シグマ社製）、ブタ膵液アミラーゼ（シ
グマ社製）をそれぞれ１単位^*添加し、３７℃で２時間
反応させた後、残存ＦｐＦをＨＰＬＣで分析した（ＨＰ
ＬＣ条件はジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の活性の測
定で既述したＨＰＬＣ条件と同じ）。どちらの酵素を使
用した場合にもＦｐＦは１００％残存していた。 ＊１単位は１ｗ／ｖ％可溶性デンプンを基質として３７
℃で反応させたとき、１分間に１μｍｏｌのグルコース
相当の還元力を生成する酵素量を意味する。

【００４４】２．小腸粘膜局在酵素 ラット小腸アセトン粉末（シグマ社製）を生理食塩水に
懸濁（１００ｍｇ／ｍｌ）し、ホモズナイズ後、遠心分
離した上清を酵素液として使用した。１ｗ／ｖ％ＦｐＦ
（２５ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に酵素液を
１単位^*添加し、３７℃で４時間反応させた。ＦｐＦは
１００％残存していた。 ＊１単位は１ｗ／ｖ％マルトースを基質として３７℃で
反応させたとき、１分間に１μｍｏｌのマルトースを分
解する酵素量を意味する。

【００４５】実施例５ 甘味剤製剤例１ 実施例２の方法で調製したＦｐＦシロップ（水分２５ｗ
／ｗ％）５０ｇとマルチトールシロップ（水分２５ｗ／
ｗ％）５０ｇとを混合して液状甘味剤を調製する。本甘
味剤は甘味度約６０で味質はショ糖に近いものである。 実施例６ 甘味剤製剤例２ 実施例２の方法で調製した結晶ＦｐＦ１０ｇとキシリト
ール１０ｇとを粉砕混合して粉末甘味剤を調製する。本
甘味剤は甘味度約７５で味質はショ糖に近いものであ
る。

【００４６】実施例７ 飲食品への添加例１ 実施例５に示した甘味剤５０ｇ、α−グルコシルステビ
ア甘味剤０．１ｇ、クエン酸０．１ｇ、リンゴ酸０．２
５ｇ、フマル酸ナトリウム０．０５ｇおよびライムフレ
ーバー０．５ｍｌを水５００ｍｌに添加し、ミキサーで
十分攪拌した後、ミクロフィルターで濾過し、６５℃で
３０分殺菌後、ガス充填、瓶詰めを行う。本品はショ糖
を使用したと同様な味質のサイダーでありながら、カロ
リーが低く押さえられたものである。 実施例８ 飲食品への添加例２ 水２５２．１ｇ、リンゴ果汁１７５ｇ、実施例５に示し
た甘味剤７０ｇ、アスパルテーム０．２ｇ、アルギン酸
ナトリウム１ｇ、カラギーナン０．５ｇ、ペクチン０．
７ｇおよびゼラチン０．５ｇを混合し、６５℃で３０分
殺菌後、冷却し、−２０℃でフリージングして製品とす
る。本品はショ糖を使用したと同様に風味が良いシャー
ベットでありながら、カロリーが低く押さえられたもの
である。

【００４７】実施例９ 薬品への添加例 リン酸カルシウム２水和物５０ｇ、グリセリン１３ｇ、
実施例６で調製した甘味剤１０ｇ、ラウリル硫酸ナトリ
ウム２．５ｇ、スペアミントオイル１．５ｇ、トラガカ
ントガム１．０ｇおよび水２２ｇを混合して製品とす
る。本品はミントフレーバーとやさしい甘味がマッチし
た歯磨き剤である。

【００４８】参考例１ ジヘテロレブロサンＩＩの製造
例 果糖１５０ｇを水に溶解し、１０ｗ／ｖ％クエン酸水溶
液０．６ｍｌを添加した。これをミキサーで攪拌しなが
ら、電熱器で加熱し、水分を蒸発させながら１３０℃〜
１４０℃で２０分反応させた。反応物を糖濃度５０ｗ／
ｗ％程度になるように水で希釈し、塩酸でｐＨ２に調整
した後、沸騰水中で３０分処理してジフラクトースジア
ンヒドリド以外の縮合物を分解した。これをＮａ型強酸
性陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＵＢＫ−５３
０、樹脂量１１．８Ｌ）により分離し、ジヘテロレブロ
サンＩＩ高含有（４０ｗ／ｗ％）画分を固形分として３
５ｇ得た。ついで、この溶液を５０ｗ／ｗ％濃度に濃縮
し、５ｇずつ逆相クロマトグラフィー用カラム（（株）
ワイエムシイ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ、１０
×１００ｃｍ×２本）に負荷し、移動相としての脱塩水
を２５０ｍｌ／分の流速で通液して分画分取を行い、得
られた水溶液を減圧濃縮して９８％純度のジヘテロレブ
ロサンＩＩの７５ｗ／ｗ％水溶液１３ｇを得た。さら
に、この溶液を８０ｗ／ｗ％程度に濃縮後、４℃静置す
ることで結晶化させ、９９％以上の純度のジヘテロレブ
ロサンＩＩの結晶４ｇを得ることができた。

【００４９】

【発明の効果】本発明のＦｐＦは、口腔細菌による酸の
産生がなく、胃で加水分解されず、ノンカロリーである
かカロリーがゼロに近く、ショ糖に近い甘味を有する果
糖のホモビオースであり、虫歯予防、カロリー制限等の
見地から好都合である。また本発明によって、ジヘテロ
レブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分
解する酵素およびそれを用いるＦｐＦの工業的製法が提
供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦｐＦの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図２】ＦｐＦの酸安定性を、イヌロビオース、ショ糖
およびマルトースと比較して示す。

【図３】本発明で得られたジヘテロレブロサンＩＩ分解
酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲を示す。

【図４】本発明で得られたジヘテロレブロサンＩＩ分解
酵素の至適温度および温度安定性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 弥武 経也 茨城県鹿島郡神栖町東深芝６昭和産業株式 会社鹿島事業所内 Ｆターム(参考） 4B047 LB06 LB08 LG23 LP18 4B050 DD02 EE02 EE03 FF11E FF13E LL02 4C057 AA19 BB03

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １−Ｏ−β−Ｄ−フラクトピラノシル−
   Ｄ−フラクトース（以下、特許請求の範囲の記載におい
   てＦｐＦという）。
2. 【請求項２】 ＦｐＦを有効成分として含有する甘味
   剤。
3. 【請求項３】 ジヘテロレブロサンＩＩ（α−Ｄ−フラ
   クトフラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：
   ２，１´ジアンヒドリド）にジヘテロレブロサンＩＩの
   α−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素を作用
   させることを特徴とするＦｐＦの製造方法。
4. 【請求項４】 ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクト
   フラノシド結合を加水分解する酵素。
5. 【請求項５】 さらに以下の酵素学的性質を有する請求
   項４記載の酵素：基質特異性 ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合
   を加水分解することに加え、ＤＦＡＩ（α−Ｄ−フラク
   トフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：
   ２，１´ジアンヒドリド）のα−フラクトフラノシド結
   合を分解し、イヌロビオースを生成する。また、ＦｐＦ
   を分子内縮合させてジヘテロレブロサンＩＩを生成し、
   イヌロビオースを分子内縮合させてＤＦＡＩを生成す
   る。ＤＦＡＩＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ
   −フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒドリ
   ド）には作用しない。 至適ｐＨ ７．５ 安定ｐＨ範囲 ５０℃、１時間の処理で６．０〜８．
   ０である。 至適温度 ５０℃ 温度安定性 ｐＨ７．５、１時間の処理で１００％の活性を保持する
   温度は５０℃までである。 分子量 Ｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定し
   た値は約２００，０００であり、ＳＤＳポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動で測定した値は約５０，０００であ
   る。 等電点 約５．０