JP2000229880A

JP2000229880A - 骨形成促進剤

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Publication number: JP2000229880A
Application number: JP11033262A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Kinosaki; 雅彦木野崎; Masaaki Goto; 雅昭後藤; Kyoji Yamaguchi; 京二山口; Shuji Morita; 修司森田; Nobuaki Nakagawa; 信明中川
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1999-02-10
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2000-08-22

Abstract

(57)【要約】【課題】新規な骨形成促進剤の提供。【解決手段】スタンニオカルシン（ＳＴＣ）を有効成
分とする骨形成促進剤。【効果】骨粗鬆症などの骨量減少性疾患の予防及び／
又は治療剤として有用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、スタンニオカルシ
ン（ＳＴＣ）を有効成分とする骨形成促進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨代謝は、骨形成を担当する骨芽細胞と
骨吸収を担当する破骨細胞の総合された活性に依存して
いる。骨形成と骨吸収の均衡が崩れることにより、骨代
謝異常が発生すると考えられている。骨代謝の異常によ
る疾患としては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ペー
ジェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リューマチ、及
び変形性関節炎などが知られている。これらの骨代謝異
常疾患の代表として知られる骨粗鬆症は、破骨細胞によ
る骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上まわることにより
発生する疾患であり、骨の石灰質と骨基質とが等しく減
少することを特徴とする。この疾患の発生メカニズムに
ついては未だ完全には解明されていない。又、この疾患
は骨の疼痛が発生し、骨の脆弱化による骨折が起こる疾
患である。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり
老人の原因となるこの疾患は社会問題にもなっており、
その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代
謝異常による骨量減少症は、骨吸収の抑制、骨形成の促
進、あるいはこれらのバランスの改善により治療できる
ことが期待される。即ち、骨形成は、骨形成を担当する
骨芽細胞の増殖及び分化機能を促進すること、破骨細胞
前駆細胞からの破骨細胞への分化成熟を抑制すること、
あるいは破骨細胞の骨吸収活性などの機能を抑制するこ
とにより促進されると期待される。このような活性を有
するホルモン、低分子物質、あるいは生理活性蛋白質に
ついて、現在精力的な探索及び開発研究が進められてい
る。

【０００３】骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮
を図る医薬品として、既にカルシトニン製剤、活性型ビ
タミンＤ3 製剤、エストラジオールを含有するホルモン
製剤、イプリフラボン、ビタミンＫ2 、ビスフォスフォ
ネート系化合物などがあり、さらに、より副作用が少な
く、有効性に優れた治療薬の開発を目指して、活性型ビ
タミンＤ3 誘導体、エストラジオール誘導体、第２世代
又は第３世代のビスフォスフォネート系化合物などの臨
床試験が実施されている。

【０００４】しかし、これらの薬剤を用いた治療法は、
その効果並びに治療結果において必ずしも満足出来るも
のではなく、より安全かつ有効性の高い新しい治療薬の
開発が期待されている。又、骨代謝疾患の治療に使用さ
れている薬剤の中には、その副作用により治療可能な疾
患が限定されているものもある。更に現在、骨粗鬆症な
どの骨代謝疾患の治療は、複数の薬剤を同時に使用する
多剤併用療法が主流になってきている。このような観点
から、従来の医薬品とは異なった作用メカニズムを持
ち、しかもより有効性が高くかつ副作用の少ない医薬品
の開発が期待されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
状況に鑑み鋭意研究の結果、ミネラル代謝を調節する蛋
白質として知られているスタンニオカルシン（Stannioc
alcin ；ＳＴＣ：OlsenH.S. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, vol.93, p1972 (1996) ）に、優れた骨芽
細胞増殖促進活性を見出した。即ち本発明は、スタンニ
オカルシン（ＳＴＣ）を有効成分とする骨形成促進剤を
提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、スタンニオカ
ルシン（ＳＴＣ）を有効成分とする骨形成促進剤に関す
る。本発明により、優れた骨芽細胞増殖促進活性を有す
る製剤が提供され、骨粗鬆症などの骨量減少疾患の予防
及び／又は治療剤として有用である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の有効成分であるスタンニ
オカルシンは、Olsen H.S.らの方法（Proc.Natl. Acad.
Sci. USA, vol.93, p1972 (1996)）により得ることが
できる。具体的には、上述の文献あるいはジーンバンク
等を検索することにより、スタンニオカルシンのｃＤＮ
Ａ配列を知ることができ、その配列情報に基づいて、Ｐ
ＣＲ法等を用いてスタンニオカルシンのｃＤＮＡを得る
ことができる。得られたｃＤＮＡを挿入した発現ベクタ
ーを動物細胞等にトランスフェクトして、スタンニオカ
ルシン発現細胞を得ることができる。得られたスタンニ
オカルシン発現細胞を培養した培養液から常法により精
製することにより、スタンニオカルシンを得ることがで
きる。尚、スタンニオカルシンには、同一の遺伝子を発
現した場合でも複数のＮ末端アミノ酸配列が存在するこ
とが知られている（Junli Zhang et al.,PROTEIN EXPRE
SSION AND PURIFICATION, 12, pp390-398 (1998) ）
が、本発明の実施に当たってはＮ末端アミノ酸配列の違
いは何ら影響せず、いずれのＮ末端配列を有するもの、
あるいはそれらの混合物であっても良い。

【０００８】本発明の有効成分であるスタンニオカルシ
ンは、骨粗鬆症などの骨量減少疾患の予防及び／又は治
療を目的とした医薬組成物として、ヒト及び動物に対し
て安全に投与されるものである。スタンニオカルシン
は、製剤化して経口的あるいは非経口的に投与すること
ができる。医薬組成物の形態としては、注射用組成物、
点滴用組成物、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤など
が挙げられる。これらの製剤は、公知の製剤学的製法に
準じ、製剤として薬理学的に許容され得る担体、賦形
剤、安定剤、着色剤、界面活性剤、その他添加剤などを
用いることにより、目的とする製剤とすることができ
る。注射用組成物の場合は、本発明の有効成分であるス
タンニオカルシンの薬理学的有効量及び製剤学的に許容
し得る賦形剤／賦活剤との混合物とし、その中にアミノ
酸、糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機／無機
化合物などの一般的に注射用組成物に添加される賦形剤
／賦活剤を用いても良い。必要に応じてｐＨ調整剤、緩
衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法によって
各種注射剤とすることができる。

【０００９】

【実施例】以下の実施例をもって本発明をより詳細に説
明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明は
これらによって何ら限定されるものではない。

【００１０】

【実施例１】スタンニオカルシンの製造 i) IMR-90細胞からのポリ(A) ⁺RNA の単離ファストトラックmRNAアイソレーションキット（Invitr
ogen社）を用い、そのマニュアルに従って１×10⁸個の
IMR-90細胞より約10μg のポリ(A) ⁺RNA を単離した。

【００１１】ii) ヒトスタンニオカルシン発現ベクター
の構築単離したポリ(A) ⁺RNA 、1 μg を鋳型としてスーパー
スクリプトIIｃＤＮＡ合成キット（ギブコＢＲＬ社) を
用いて、同社のプロトコールに従って一本鎖ｃＤＮＡを
合成し、このｃＤＮＡとプライマーＳＴＣＦ１Ｎ（配列
表配列番号１）及びプライマーＳＴＣＲ１Ｘｈ（配列表
配列番号２）を用いて、ＰＣＲを行い、ＳＴＣｃＤＮＡ
断片を取得した。以下にＰＣＲの条件を示す。

【００１２】 10X Ex Taqバッファー（宝酒造社） 10 μl 2.5 mM dNTP 8 μl cDNA溶液 1 μl Ex Taq (宝酒造社） 0.5 μl 蒸留水 74.5 μl 20μM プライマーSTCF1N 5 μl 100μM プライマーSTCR1Xh 1 μl 上記の溶液を微量遠心チューブ中で混合後、以下の条件
でＰＣＲを行った。95℃で３分前処理後、95℃で30秒
間、55℃で30秒間、72℃で２分間の３段階の反応を30回
繰り返した後、70℃で５分間保温した。反応液の一部を
アガロース電気泳動し約900bp の均一なＤＮＡ断片が得
られたことを確認した。この断片を常法によりシークエ
ンスし、スタンニオカルシンをコードするｃＤＮＡが得
られたことを確認した。ｃＤＮＡ配列を配列表配列番号
３に、アミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。

【００１３】得られた約900bp のＤＮＡ断片を、QIAEXI
I DNA extraction kit（QIAGEN社）によって精製した。
このＤＮＡ断片を制限酵素XhoIおよびNheI（宝酒造社）
で切断し、QIAEXII DNA extraction kitにより精製した
（STC XhoI-NheI 断片）。STC XhoI-NheI 断片をXhoIお
よびNheIで切断した pCEP4（Invitrogen社）に、ligati
on kit ver.2（宝酒造社）により結合させてpCEPSTC を
得た。このプラスミドは、スタンニオカルシンをコード
するＤＮＡを含んでいる。このプラスミドを含む大腸菌
（ＤＨ５α；ギブコＢＲＬ社）は、 DH5α/pCEP-STC と
して平成１０年８月１１日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１６９３３
として寄託されている。尚、PCR 由来のＤＮＡ部分に、
ＤＮＡ合成時における塩基の誤った取り込みがない事
を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。

【００１４】iii) ヒトスタンニオカルシンの生産実施例１−ii）で得られたpCEPSTC を持つ大腸菌ＤＨ５
αを、50μg/mlのアンピシリン（シグマ社）を含むＬＢ
培地（１％バクト−トリプトン、0.5 ％バクト−イース
トエクストラクト、１％NaCl）５００ml中で37℃一晩振
盪培養し、菌体からプラスミドＤＮＡをQIAGEN Plasmid
Mega kit （QIAGEN社）により精製した。293-EBNA細胞
（Invitrogen社）を10％牛胎児血清を含むIMDM（ライフ
テクノロジーズ社）中１×１０⁶／20mlとなるように75
cm²Ｔ−フラスコに播種し、37℃一晩、CO₂インキュベ
ーター（5% CO₂) 中で培養した。pCEPSTC をFuGENE6
（ベーリンガーマンハイム社) を用いて、293-EBNA細胞
にトランスフェクトした。ＤＮＡは各７μg 、FuGENE6
は20μl 用いた。トランスフェクションした293-EBNA細
胞を37℃で１日間CO₂インキュベーター（5% CO₂) 中で
培養した後、無血清培地に交換しさらに２日間培養し、
スタンニオカルシンを含む培養液を得た。得られた培養
液からスタンニオカルシンを精製し、精製標品がスタン
ニオカルシンであることを、プロテインシークエンサー
（プロサイス４９２型、パーキンエルマー社）で確認し
た。

【００１５】

【実施例２】スタンニオカルシンの骨芽細胞系細胞増殖
活性骨芽細胞系細胞の増殖活性は以下の方法により測定し
た。即ち、マウス骨芽細胞様細胞であるMC3T3-E1細胞
（RIKEN CELL BANK RCB1126 ）及びヒト骨肉腫由来細胞
であるHOS 細胞（ATCC CRL-1543 ）をそれぞれ10％牛胎
児血清を含むα-MEM（GIBCO BRL 社製）中、２×10³個
/100μl/ウェルで96ウェルプレートにまき、37℃で一晩
培養した。その後各ウェルを血清を含まないα-MEMで洗
った後、そのウェルに100 μl の血清を含まないα-MEM
を加え、さらに２日間培養した。２日後、各ウェルの培
地を0.2 ％牛血清アルブミンを含むα-MEMに交換し、そ
こに0.2 ％牛血清アルブミンを含むα-MEMで希釈した実
施例１で得られたスタンニオカルシンを添加し、さらに
22時間培養を続けた。22時間後、³H−チミジン（Amersh
am社製）を１μCi/ ウェルとなるように添加し、さらに
２時間培養した。２時間後、細胞をPBS で洗った後、0.
5 ％トリプシンで細胞をはがし、セルハーべスター（パ
ッカード社）を使い細胞をガラスフィルターに回収し
た。各ウェル中の細胞に取り込まれた放射能を、マトリ
ックス96（パッカード社）を用い測定し、その値をDNA
合成量とした。結果を図１及び図２に示す。

【００１６】この結果、スタンニオカルシンを添加する
ことにより、濃度依存的に各細胞への³H−チミジンの取
り込みが上昇し、ＤＮＡ合成が上昇していることが確認
された。従って、スタンニオカルシンを用いることによ
り、骨芽細胞を増殖させることができる。

【００１７】

【発明の効果】本発明により、スタンニオカルシン（Ｓ
ＴＣ）を有効成分とする骨形成促進剤が提供される。本
発明製剤は、骨粗鬆症などの骨量減少性疾患の予防及び
／又は治療剤として有用である。

【００１８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 雪印乳業株式会社 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. <120> 骨形成促進剤 <130> YTP98024 <160> 4 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 1 GGGGCTAGCC AACAACTTAG CGGAAACTT 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized DNA <400> 2 CCCCTCGAGT GTGTCAACAC CCCTAAAAT 29 <210> 3 <211> 741 <212> DNA <213> Homo Sapiens <300> <301> Olsen H. S. et al. <302> Human stanniocalcin : a possible hormonal regulator of mineral met abolism. <303> Proc. Natl. Acad. Sci. USA <304> 93 <305> 5 <306> 1792 <307> 1996-03-05 <308> GenBank, U46768 <309> 1996-02-22 <400> 3 atgctccaaa actcagcagt gcttctggtg ctggtgatca gtgcttctgc aacccatgag 60 gcggagcaga atgactctgt gagccccagg aaatcccgag tggcggccca aaactcagct 120 gaagtggttc gttgcctcaa cagtgctcta caggtcggct gcggggcttt tgcatgcctg 180 gaaaactcca cctgtgacac agatgggatg tatgacatct gtaaatcctt cttgtacagc 240 gctgctaaat ttgacactca gggaaaagca ttcgtcaaag agagcttaaa atgcatcgcc 300 aacggggtca cctccaaggt cttcctcgcc attcggaggt gctccacttt ccaaaggatg 360 attgctgagg tgcaggaaga gtgctacagc aagctgaatg tgtgcagcat cgccaagcgg 420 aaccctgaag ccatcactga ggtcgtccag ctgcccaatc acttctccaa cagatactat 480 aacagacttg tccgaagcct gctggaatgt gatgaagaca cagtcagcac aatcagagac 540 agcctgatgg agaaaattgg gcctaacatg gccagcctct tccacatcct gcagacagac 600 cactgtgccc aaacacaccc acgagctgac ttcaacagga gacgcaccaa tgagccgcag 660 aagctgaaag tcctcctcag gaacctccga ggtgaggagg actctccctc ccacatcaaa 720 cgcacatccc atgagagtgc a 741 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Homo Sapiens <300> <301> Olsen H. S. et al. <302> Human stanniocalcin : a possible hormonal regulator of mineral met abolism. <303> Proc. Natl. Acad. Sci. USA <304> 93 <305> 5 <306> 1792 <307> 1996-03-05 <400> 4 Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Val Leu Val Ile Ser Ala Ser 5 10 15 Ala Thr His Glu Ala Glu Gln Asn Asp Ser Val Ser Pro Arg Lys Ser 20 25 30 Arg Val Ala Ala Gln Asn Ser Ala Glu Val Val Arg Cys Leu Asn Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Gly Cys Gly Ala Phe Ala Cys Leu Glu Asn Ser Thr 50 55 60 Cys Asp Thr Asp Gly Met Tyr Asp Ile Cys Lys Ser Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ala Lys Phe Asp Thr Gln Gly Lys Ala Phe Val Lys Glu Ser Leu 85 90 95 Lys Cys Ile Ala Asn Gly Val Thr Ser Lys Val Phe Leu Ala Ile Arg 100 105 110 Arg Cys Ser Thr Phe Gln Arg Met Ile Ala Glu Val Gln Glu Glu Cys 115 120 125 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Cys Ser Ile Ala Lys Arg Asn Pro Glu Ala 130 135 140 Ile Thr Glu Val Val Gln Leu Pro Asn His Phe Ser Asn Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Asn Arg Leu Val Arg Ser Leu Leu Glu Cys Asp Glu Asp Thr Val Ser 165 170 175 Thr Ile Arg Asp Ser Leu Met Glu Lys Ile Gly Pro Asn Met Ala Ser 180 185 190 Leu Phe His Ile Leu Gln Thr Asp His Cys Ala Gln Thr His Pro Arg 195 200 205 Ala Asp Phe Asn Arg Arg Arg Thr Asn Glu Pro Gln Lys Leu Lys Val 210 215 220 Leu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Glu Glu Asp Ser Pro Ser His Ile Lys 225 230 235 240 Arg Thr Ser His Glu Ser Ala 245

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２における、スタンニオカルシン（Ｓ
ＴＣ）を添加した時のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＤＮＡ合
成量を示す。

【図２】実施例２における、スタンニオカルシン（Ｓ
ＴＣ）を添加した時のＨＯＳ細胞のＤＮＡ合成量を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者中川信明栃木県下都賀郡石橋町石橋578−15 西浦ハイツ２−４Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA44 CA53 DB01 MA31 MA52 MA57 MA59 MA63 MA66 NA05 NA06 ZA962 ZA972 4H045 AA30 BA10 CA40 EA27 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スタンニオカルシン（ＳＴＣ）を有効成
分とする骨形成促進剤。