JP2000125883A - フルクトキナーゼ及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なフルクトキナーゼ、それを産生する微
生物、当該酵素の遺伝子などを提供する。 【解決手段】 土壌中よりフルクトースに特異的に作用
するフルクトキナーゼを産生する細菌を発見し、その酵
素タンパク質を抽出・精製を行い電気泳動的に単一な標
品を調製した。当該酵素標品のアミノ酸配列の一部より
ＤＮＡプローブを作成し、上記細菌由来のゲノムＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングし、フルクトキナーゼを
コードする遺伝子を単離した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なフルクトキ
ナーゼ、その遺伝子並びに当該フルクトキナーゼを産生
する微生物及び産生されたフルクトキナーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】フルク
トース（果糖）は生化学・生理学的に重要な物質であ
り、血漿中のフルクトースは遺伝性果糖不耐症、本態性
果糖尿症などの診断の指標となることが知られている。
しかし、フルクトースに特異的に作用する酵素がないこ
とや酵素の安定性が悪いことなどから、従来はフルクト
ースを正確かつ簡便に測定することは非常に困難であっ
た。例えば、Leuconostoc mesenteroides由来のフルク
トキナーゼ（EC 2.7.1.4）はマンノースに対してもフル
クトースと同程度の作用活性を示す。また他の生物種由
来のフルクトキナーゼも特異性・安定性等の問題から、
実用的とは言い難いのが現状であった。従って、基質特
異性の高いフルクトキナーゼは産業上非常に有用であ
り、その応用は食品・農業・医療など様々な分野にわた
るので、係る性状を有するフルクトキナーゼが切望され
ていた。

【０００３】

【課題を解決するための手段】上記の従来技術の問題点
から、本発明者等は、フルクトースに対する基質特異性
が高く、安定性が高いフルクトース資化酵素を見出すべ
く鋭意検討したところ、土壌中よりフルクトースに特異
的に作用するキナーゼ（フルクトキナーゼ）を産生する
新種の微生物を見出した。次いで、当該酵素を抽出・精
製し酵素標品を調製し、そのＮ末端アミノ酸配列を全自
動アミノ酸シークエンサにより決定し、その一部から合
成オリゴヌクレオチドＮＤＡプライマーを作製した。作
製したプライマーを用いて、前記微生物より抽出したゲ
ノムＮＤＡを試料としてスクリーニングを行い、フルク
トキナーゼをコードする遺伝子を単離することに成功し
た。本発明は係る知見に基づいてなされたもので、本発
明は新規フルクトキナーゼ、当該フルクトキナーゼを産
生する微生物、フルクトキナーゼをコードする遺伝子な
どを提供するものである。

【０００４】

【発明の実施の形態】本発明に係る微生物は、ブルクホ
ルデリア属に属し、フルクトースに特異的に作用するフ
ルクトキナーゼを産生する微生物であり、当該酵素はフ
ルクトースの測定に有用である。

【０００５】本発明の微生物の具体例であるブルクホル
デリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１(Burkholderia sp.
KNIRC-211)株の菌学的性質は表１に示されるとおりで
ある。なお、表１には、ブルクホルデリア セパシア(B.
cepacia)の標準種の菌学的性質も併せて示した。ま
た、表１中の文献１〜３とは以下の文献である。 1) N.R.Krieg et al. : Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology, Vol.1(1984), Williams & Wilkins 2) J.G.Holt et al. : Bergey's Manual of Determinat
ive Bacteriology, 9thedition (1994), Williams & Wi
lkins 3) E.Yabuuchi et al. : Microbiol. Immunol., 36, 12
51 (1992)

【０００６】

【表１】

【０００７】以上の菌学的性質から、前掲のBergey's M
anual of Determinative Bacteriology (9th Edition)
に基づいて検索したところ、本菌株はブルクホルデリア
属の細菌、特にブルクホルデリア セパシアに比較的類
似しているが、上記の諸性質と一致するものは見出され
なかった。特に、菌体内ＤＮＡのＧＣ含量が明らかに異
なっていた。そこで、本発明菌はブルクホルデリア属に
属する新種の菌株と判断し、ブルクホルデリア エスピ
ー ＫＮＩＲＣ-２１１(Burkholderia sp. KNIRC-211)と
命名した。また、この菌株は工業技術院生命工学工業技
術研究所に「受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６８３８」とし
て寄託されている。

【０００８】本発明菌の培養は、当該菌株が良好に生育
できるものであれば、いかなる培地及び培養条件であっ
てもよく、かかる培養により増殖させて必要量の菌体を
得ることができる。上記の培地は、適当な炭素源、窒素
源、無機イオン及びその他必要な成分を含有させること
ができる。培地の炭素源としては、フルクトース、グル
コース、キシロースなどが利用できる。また、窒素源と
しては、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒
素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機
窒素源が利用できる。更に、無機イオンとしては、リン
酸イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネ
シウムイオン、鉄イオン、銅イオン、マンガンイオンな
どが利用できる。また、必要に応じて、培地には、ビタ
ミン類、細胞増殖因子などの成分を添加することもでき
る。

【０００９】本発明菌の培養方法としては、常法に準
じ、振盪培養法などの液体培地を用いる培養方法、寒天
培地などの固体培地を用いる培養方法が利用でき、好気
的条件下に行われる。培養温度は２５〜４０℃、好まし
くは３０℃付近、培養途中のｐＨは６〜８、好ましくは
７付近にて行われる。培養日数としては、菌体量、培地
組成などに応じて適宜設定できるが、通常１〜２日、好
ましくは１日である。

【００１０】本発明のフルクトキナーゼ酵素は、本発明
の微生物の破砕物の水溶性画分から得ることができる。
即ち、本発明の酵素は、培養した本発明の微生物を適当
な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等、ｐＨ６程度）中で
慣用の方法（例えば、フレンチプレス、超音波破砕等）
で破砕し、次いで遠心分離して夾雑物を除去した水溶性
画分に含まれている。上記の水溶性画分からの本発明の
フルクトキナーゼの分離・精製は慣用の蛋白質精製法
（例えば塩析、透析、遠心分離、電気泳動、ゲル濾過、
イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグ
ラフィ、逆相クロマトグラフィ等）に準じて行うことが
できる。より具体的には、上記の水溶性画分を、ゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマ
トグラフィを適宜組み合わせて精製することにより、精
製された本発明のフルクトキナーゼを得ることができ
る。

【００１１】かくして得られた本発明のフルクトキナー
ゼは、下記の理化学的性質及び生化学的性質を有してい
た。 フルクトースに特異的に作用する； 分子量が、ゲル濾過法で約７６，０００であり、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで約３７，０００である； 陰イオン交換体に吸着する； 熱安定性：４０℃以下で安定； ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜８．５。

【００１２】上記で精製された酵素を用いて、本発明の
フルクトキナーゼのＮ末端アミノ酸配列を全自動アミノ
酸シークエンサにより決定した。得られたＮ末端のアミ
ノ酸配列に基づき、当該アミノ酸配列をコードするオリ
ゴヌクレオチドを合成し、それをプローブとして用い
て、ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１由
来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによ
り、本発明のフルクトキナーゼをコードする遺伝子を得
ることができる。即ち、ブルクホルデリア エスピー Ｋ
ＮＩＲＣ-２１１よりゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離
し、常法に従ってゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する。ついで、前記の合成オリゴ
ヌクレオチドをプローブとして用いて、上記のゲノムＤ
ＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーのスクリー
ニングを行い、単離されたクローンより目的とするフル
クトキナーゼのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを抽出する。
また、本発明によって明らかにされたＤＮＡ配列又はフ
ルクトキナーゼのアミノ酸配列に基づいて合成されたオ
リゴヌクレオチドや本発明により得られたフルクトキナ
ーゼゲノムＤＮＡやフルクトキナーゼｃＤＮＡなどをプ
ローブに用い、またフルクトキナーゼに対する抗体を用
いて、ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１
由来のＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、単
離されたクローンより目的とするフルクトキナーゼのＤ
ＮＡを抽出することもできる。

【００１３】以下、本発明の各工程について概略的に説
明する。 (1)ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡの単離とＤＮＡライブラ
リーの調製：ゲノムＤＮＡは、ブルクホルデリア エス
ピー ＫＮＩＲＣ-２１１の菌体破砕物から常法に準じ
て、フェノール抽出法などにより行うことができ、また
市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いて、ゲノムＤＮＡ
を抽出することもできる。全ＲＮＡは、ブルクホルデリ
ア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１の菌体破砕物から常法
に準じて、グアニジウムチオシアネート法、フェノール
法、リチウム塩を用いる方法などにより調製することが
可能である。

【００１４】これらのゲノムＤＮＡや全ＲＮＡを鋳型と
して、慣用のポリメラーゼ・チェーン・リアクション法
（ＰＣＲ）や逆転写酵素を用いて、ＤＮＡの増幅を行
い、得られたＤＮＡをプラスミドやファージなどに組み
込むことによりＤＮＡライブラリーを調製することがで
きる。ＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとしては、
大腸菌由来のｐＢＲ３２２（東洋紡績）、ｐＵＣ１８お
よびｐＵＣ１９（東洋紡績）、枯草菌由来のｐＵＢ１１
０（シグマ社）などがある。またＤＮＡを組み込むファ
ージベクターとしては、λｇｔ１０およびλｇｔ１１
（東洋紡績）などがある。これらのベクターは、宿主細
胞内に保持されて複製、増幅されるものであれば、ここ
に例示したものに限定されるものではない。

【００１５】(2)ＤＮＡライブラリーのクローニング：
ＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファー
ジなどの組換えベクターは、大腸菌のような適切な宿主
細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては、例
えば、Escherichia coli ＮＭ５１４、Ｃ６００（スト
ラタジーン社）、ＮＭ５２２、ＪＭ１０１(ファルマシ
ア社)などを例示することができる。ＤＮＡのベクター
がプラスミドの場合、塩化カルシウム法、塩化カルシウ
ム・塩化ルビジウム法などを用いて、またＤＮＡのベク
ターがファージの場合、市販のインビトロパッケージン
グキットなどを用いてあらかじめ増殖させた宿主細胞に
保持させることができる。フルクトキナーゼの部分アミ
ノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、こ
のオリゴヌクレオチドを³²Ｐやビオチンで標識してプロ
ーブとして用い、上記で得られた形質転換体からコロニ
ーハイブリダイゼーション法(Gene, 10, 63, 1980)、プ
ラークハイブリダイゼーション法(Scienc, 196, 180, 1
977)などによってＤＮＡクローンを釣り上げることがで
きる。ここで用いられるハイブリダイゼーションの方法
及び条件は、例えば、Molecular Cloning-A Laboratory
Manual 2ed. Cold Spring Harbor Press, 1989等に記
載の方法及び条件を参照することができる。また、目的
とするポリペプチドに対する抗体を用いて、標識抗体法
(DNA Cloning: A Practical Approach, 1, 49, 1985)に
よって、ＤＮＡクローンをクローニングすることも可能
である。このようにしてクローン化された形質転換体
は、フルクトキナーゼの全アミノ酸配列あるいはその部
分のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
を含有している。

【００１６】次に該形質転換体から常法(Molecular Clo
ning-A Laboratory Manual 2ed. Cold Spring Harbor P
ress, 1989)に従ってプラスミドやファージなどの組換
えＤＮＡを単離し、そのまま、あるいは制限酵素で消化
してからＤＮＡ塩基配列が決定される。なお、最初に得
られたフルクトキナーゼＤＮＡ又はその部分ＤＮＡをプ
ローブとして、同様の方法によってブルクホルデリア
エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１から調製されたＤＮＡライ
ブラリーのクローニングを行うことができる。ここで用
いられるハイブリダイゼーションの方法及び条件は、前
記と同様に、MolecularCloning-A Laboratory Manual 2
ed. Cold Spring Harbor Press, 1989等に記載の方法及
び条件を参照することができる。得られたフルクトキナ
ーゼのＤＮＡの塩基配列は、マクサムとギルバートの化
学法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977)や
サンガーのジデオキシ法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 5463, 1977)などによって決定される。また、市販
のオートシークエンサーを用いて塩基配列を決定するこ
ともできる。

【００１７】かくして決定された本発明のフルクトキナ
ーゼの遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有し
ていた。また、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配
列を配列番号２に示した。なお、本発明のフルクトキナ
ーゼ遺伝子は、フルクトキナーゼ活性を有するならば配
列番号１に示した塩基配列に限定されるものではなく、
当該塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠
失及び／又は付加された塩基配列を有するＤＮＡであっ
てもよい。同様に配列番号２に示したアミノ酸配列に関
しても、フルクトキナーゼ活性を有する限り、当該アミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失及び／又は付加されていてもよい。上記のアミノ酸配
列の置換、欠失及び／又は付加は、本願出願日前に周知
の技術である部位特異的突然変異誘発法等により実施す
ることができ、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81, 4662-5666, 1984; Nucleic Acid Res. 10, 6487-65
00, 1982; WO85/00817; Nature 316, 601-605, 1985な
どに記載の方法に準じて行うことができる。なお、１若
しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加と
は、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により置
換、欠失及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置
換、欠失及び／又は付加されることを意味する。このよ
うな置換、欠失及び／又は付加により得られるものは、
例えば、慣用のフルクトキナーゼ活性測定方法によって
容易に評価できる。

【００１８】なお、上記で得られたフルクトキナーゼを
コードするＤＮＡを、常法に準じて、適当な発現用ベク
ターに組み込み、得られた組換え発現ベクターにより宿
主細胞を形質転換して形質転換体を作製し、この形質転
換細胞を培養して、その培養物から組換えフルクトキナ
ーゼを採取・製造することができる。上記の方法は慣用
の遺伝子工学的手法を用いて行うことができ、係る遺伝
子工学的手法は既に周知である。

【００１９】また、本発明のフルクトキナーゼ遺伝子又
はその一部からなるＤＮＡをプローブ又はプライマーと
して用いることにより、前述の方法に準じて、任意のＤ
ＮＡライブラリーからフルクトキナーゼ遺伝子又はその
部分ＤＮＡを単離することができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例１ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１由来フ
ルクトキナーゼの単離・精製 フルクトキナーゼ生産菌のスクリーニング・同定 土壌約１ｇを滅菌水に懸濁し、上清の一部をフルクトー
ス含有寒天培地（０．１％フルクトース、１％ポリペプ
トン、０．１％酵母エキス、０．３％リン酸カリウム、
１．２％寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃で３〜５日間平
板培養を行い、生じたコロニーを８ｍｌフルクトース含
有培地（０．１％フルクトース、１％ポリペプトン、
０．１％酵母エキス、０．３％リン酸カリウム、ｐＨ
７．３）で３０℃で３日間振盪培養を行い、培養液から
遠心分離（３，０００ｘｇ、１０分）で集菌を行った。
得られた菌体を約３倍の滅菌水に懸濁後、超音波破砕に
より菌体抽出液を調製し、その遠心上清（１０，０００
ｘｇ、５分）の糖類資化能を測定した。以後、常法のス
クリーニング手段を用いて、数度のスクリーニングを行
い、最終的にフルクトースに特異的なキナーゼ活性を有
する細菌を得た。該当菌株同定の結果、Burkholderia c
epaciaに非常に近い性状を示したが、Burkholderia cep
aciaの標準種とは菌体内ＤＮＡのＧＣ含量が異なってお
り、別種の新規な細菌と推定された（表１参照）。そこ
で該当細菌をブルクホルデリアエスピー ＫＮＩＲＣ-２
１１(Burkholderia sp. KNIRC-211)と命名した。この菌
株は工業技術院生命工学工業技術研究所に「受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１６８３８」として寄託されている。

【００２１】ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ
-２１１由来フルクトキナーゼの精製 ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１をフル
クトース含有ＬＢ培地（１％フルクトース、１％ポリペ
プトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ７．４）で３０℃で１２時間振盪培養を行い、菌体破
砕上清よりフルクトキナーゼを精製した。精製は、Q Se
pharose FF(Amersham Pharmacia Biotech社製、陰イオ
ン交換担体）、Blue Sepharose 6FF（同社製、アフィニ
ティー担体）、Superdex 200pg（同社製、ゲル濾過担
体）カラムクロマトグラフィーにより精製した。より詳
細には、菌体を２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
に懸濁し、超音波破砕した後、氷冷した。ついで、２０
ｍＭ トリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したQ Seph
arose FFカラムにかけ、０〜５００ｍＭ ＫＣｌグラジ
ェントで溶出し、約２００ｍＭ ＫＣｌにて溶出した画
分を分離した。当該画分は、２０ｍＭ トリス-酢酸（ｐ
Ｈ６．５）にて３回透析した後、２０ｍＭ トリス-酢酸
（ｐＨ６．６）にて平衡化したBlue Sepharose 6FFカラ
ムにかけ、素通り画分を分離した。当該画分を、０．２
Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
にて３回透析した後、０．２Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ト
リス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて平衡化したSuperdex 20
0pgカラムにてゲル濾過を行い、更に限外濾過膜にて30,
000以下をカットすることにより精製した。かくして、
精製された本発明のフルクトキナーゼを得た。

【００２２】ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ
-２１１由来フルクトキナーゼの性質 上記で得られた本発明のフルクトキナーゼについて、そ
の性質を調べた。その結果を表２に示す。

【００２３】ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ
-２１１由来フルクトキナーゼのＮ末端アミノ酸配列決
定 上記で精製された酵素をミニゲル電気泳動装置(BIO-RAD
社製、Mini-PROTEAN^TMII）を用いてNative-PAGEで分離
後、活性染色を行い活性バンドから酵素を抽出し、さら
にSDS-PAGEを行い、PVDF膜（BIO-RAD社製、Trans-Blot
^TM、Transfer Medium、PVDF Membrane 0.2μｍ）上にエ
レクトロブロッティングを行い、クマシーブリリアント
染色にて蛋白画分を切り出した。切り出したPVDF膜を、
全自動アミノ酸シークエンサー（島津製作所製、PPSQ-1
0）にてＮ末端アミノ酸配列を決定した。そのアミノ酸
配列を図１の上段に示した。

【００２４】実施例２本発明のフルクトキナーゼの基質特異性 Ａ．本発明のフルクトキナーゼの糖に対する基質特異性
を、種々の糖を基質として調べた。測定法などは以下の
とおりである。 測定原理 以下に反応式を示す。

【００２５】 測定用試薬 (a)反応液 １００ ｍＭ トリエタノールアミン-塩酸緩衝液（ｐＨ７．６） １０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １３７ ｍＭ 塩化カリウム １２．５ ｍＭ ＡＴＰ ０．２３ｍＭ ＮＡＤＨ １．１４ｍＭ ＰＥＰ ０．１ ％ ＢＳＡ ２０ Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ（ブタ心臓由来） １４ Ｕ／ｍｌ ＰＫ（ウサギ筋肉由来） 以上の試薬を溶解後、１規定水酸化ナトリウム又は１規
定塩酸を用いてｐＨ７．６±０．０５（２５℃におい
て）に調整する。 (b)１００ｍＭ基質液 各種基質を基質濃度が１００ｍＭになるように１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを含む１００ｍＭトリエタノール
アミン-塩酸緩衝液(ｐＨ７．６)に溶解する。

【００２６】操作法 (a)反応液０．８ｍｌに基質液０．１ｍｌを加え混和
し、３７℃で５分間予備加温する。 (b)フルクトキナーゼ試料液０．１ｍｌを加え混和後、
波長３４０ｎｍにおける１分間当りの吸光度変化を量を
求める（Ａｓ）。 (c)空試験として、試料液の代りに酵素希釈用液（０．
１％ ＢＳＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを含む１０
０ｍＭトリエタノールアミン-塩酸緩衝液(ｐＨ７．
６)）を用い、同様に操作する（Ａｂ）。

【００２７】計算方法 以下の計算式に基づき、活性を計算する。 活性(Ｕ／ｍｌ）＝［（Ａｓ−Ａｂ）×１．０］／（ε
×０．１）×Ｄ ε：β−ＮＡＤＨの波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係
数 Ｄ：希釈率 フルクトースでの活性を１００％として、それぞれの基
質を用いたときの相対活性を求めた。

【００２８】結果 その結果、Ｄ−フルクトースに対する活性を１００％と
した場合、Ｄ−フルクトース−６リン酸、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、
Ｄ−ガラクトサミン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、
Ｄ−リボース、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−フコース、マン
ニトール、Ｄ−マンノサミン、Ｄ−アセチル−Ｄ−マン
ノサミン、シュークロースに対する活性は０％であっ
た。従って、本発明のフルクトキナーゼはフルクトース
に特異的に作用することが判明した。

【００２９】Ｂ．ついで、本発明のフルクトキナーゼの
リン酸基供与体に対する特異性を、種々のリン酸基供与
体を基質として調べた。測定法などは以下のとおりであ
る。 測定原理 以下に反応式を示す。

【００３０】 測定用試薬 (a)反応液 １００ ｍＭ トリエタノールアミン-塩酸緩衝液（ｐＨ７．６） １０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １２．５ ｍＭ フルクトース ０．５ ｍＭ ＮＡＤＰ⁺ ０．２５Ｕ／ｍｌ ＰＧＩ（イースト由来） １０ Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ（L.mesenteroides由来） ０．１ ％ ＢＳＡ 以上の試薬を溶解後、１規定水酸化ナトリウム又は１規
定塩酸を用いてｐＨ７．６±０．０５（２５℃におい
て）に調整する。 (b)１００ｍＭリン酸基供与体液 各種リン酸基供与体をリン酸基供与体濃度が１００ｍＭ
になるように１０ｍＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを含む１００
ｍＭトリエタノールアミン-塩酸緩衝液(ｐＨ７．６)に
溶解する。

【００３１】操作法 (a)反応液０．８ｍｌにリン酸基供与体液０．１ｍｌを
加え混和し、３７℃で５分間予備加温する。 (b)フルクトキナーゼ試料液０．１ｍｌを加え混和後、
波長３４０ｎｍにおける１分間当りの吸光度変化を量を
求める（Ａｓ）。 (c)空試験として、試料液の代りに酵素希釈用液（０．
１％ ＢＳＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを含む１０
０ｍＭトリエタノールアミン-塩酸緩衝液(ｐＨ７．
６)）を用い、同様に操作する（Ａｂ）。

【００３２】計算方法 以下の計算式に基づき、活性を計算する。 活性(Ｕ／ｍｌ）＝［（Ａｓ−Ａｂ）×１．０］／（ε
×０．１）×Ｄ ε：β−ＮＡＤＰＨの波長３４０ｎｍにおけるモル吸光
係数 Ｄ：希釈率 ＡＴＰでの活性を１００％として、それぞれの基質を用
いたときの相対活性を求めた。

【００３３】結果 その結果、ＡＴＰに対する活性を１００％とした場合、
ｄＡＴＰは９０％、ＵＴＰは８０％、ＩＴＰは２５％、
ＧＴＰは３０％、ＣＴＰは４０％、ＰＰｉは０％の活性
であり、本発明のフルクトキナーゼはＡＴＰに対する特
異性が高いことが判明した。

【００３４】実施例３ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１由来フ
ルクトキナーゼ遺伝子のクローニング ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１ゲノ
ムＤＮＡの調製 ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１を、５
ｍｌ ＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキ
ス、１％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で３０℃で１２
時間振盪培養を行い、菌体よりゲノムＤＮＡ抽出キット
(Invitrogen社製、Easy-DNA^TM Kit)を用いてゲノムＤＮ
Ａを単離した。具体的な実験操作・試薬・条件等は添付
マニュアルに従った。

【００３５】ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ
-２１１由来フルクトキナーゼ遺伝子のＮ末端塩基配列
の決定 実施例１のに記載の方法で決定されたアミノ酸配列か
らフルクトキナーゼ遺伝子のＤＮＡが増幅されるよう
に、ＰＣＲ用センスプライマーＮＦ-２０１〜ＮＦ-２０
４及び、アンチセンスプライマーＮＲ-２０５〜ＮＲ-２
０７（図１中段参照）を、全自動ＤＮＡ合成装置（PERK
IN ELMER社製、Model 381A DNA Synthesizer）にて合成
した。合成オリゴヌクレオチドはMolecular Cloning-A
Laboratory Manual 2ed. Cold Spring Harbor Press, 1
989に記載の方法に従い、簡易逆相カラム（MILLIPORE社
製、Sep-PakC18）にて精製を行った。上記に記載の方
法で調製したブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-
２１１ゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／チューブを鋳型としてＰ
ＣＲを行った。ＰＣＲはサーマルサイクラー(PERKIN EL
MER社製、Gene Amp^TM PCR System9600)・TaKaRa TaqPol
ymerase（宝酒造社製）を用いて、前述の合成プライマ
ーを組み合わせ、９６℃３０秒、５１℃３０秒、７２℃
６０秒の増幅サイクルを２５回行い、反応液１０μｌを
１２％ポリアクリルアミド電気泳動にて解析を行った。
その結果、ＮＦ-２０３とＮＲ-２０５の組み合わせで、
鎖長６８塩基の増幅ＤＮＡ断片が確認された。

【００３６】そこで、残りの反応液を試料として、DNA
Blunting Kit（宝酒造社製）でＤＮＡ末端の平滑化処理
後、T4 Polynucleotide Kinase（宝酒造社製）でリン酸
化処理を行い、pBluescript II SK⁺（Stratagene社製)
ファージミドベクターのＥｃｏＲＶ部位にDNA Ligation
Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いてサブクローニングを
行った。得られた組換えＤＮＡをE.coli JM109株（東洋
紡績社製、Competenthigh E.coli JM109）に遺伝子導入
を行い、β−ガラクトシダーゼα相補性を利用した青白
選択法でスクリーニングを行った。その後、非ＲＩサイ
クルシークエンシングキット（東洋紡績社製、Sequenci
ng high -Cycle-、発色法)で挿入ＤＮＡ断片の塩基配列
を決定した。決定された塩基配列は図１の下段に下線を
付して示される配列であった。なお、具体的な実験操作
・試薬・条件等は各キット添付マニュアルに従った。

【００３７】ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ
-２１１由来ゲノムＤＮＡライブラリーの作製 上記に記載の方法で調製したブルクホルデリア エス
ピー ＫＮＩＲＣ-２１１ゲノムＤＮＡ２０μｇを制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化を行い、λ−
ファージ由来のＤＮＡ（Novagen社製、λ BlueSTAR Bam
HI Arm Kit）にDNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）
を用いてクローンニング行った。得られた組換え直鎖状
λ BlueSTAR DNAをパッケージングキット(Stratagene社
製、GIGAPACK II XL Packaging Extracts)を用いて、感
染ファージ粒子内にインビトロパッケージングを行っ
た。

【００３８】ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ
-２１１由来ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ スクリーニングはMolecular Cloning-A Laboratory Man
ual 2ed. Cold SpringHarbor Press, 1989)又は実験医
学別冊遺伝子工学ハンドブック（村松正実、岡山博人
編、羊土社、1991）に記載の方法に従い行った。上記
に記載の方法で決定された塩基配列中から、前述の全自
動ＤＮＡ合成装置を用いてオリゴヌクレオチドプローブ
（図１下段下線部の配列の一部である５’−ＣＣＧＣＡ
ＡＴＴＣＧＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣ−
３’）を合成・精製し、５’末端のビオチン標識を行っ
た（Amersham社製、Oligonucleotide biotin labelling
kit)。

【００３９】上記に記載の方法で作製したブルクホル
デリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１ゲノムＤＮＡライ
ブラリーを上記のビオチン化プローブを用いて、プラー
クハイブリダイゼーション法にてスクリーニングを行っ
た。ライブラリーを１０枚のシャーレにプレーティング
し（３００〜５００プラーク／シャーレ・直径９ｃｍ）
ナイロンメンブラン（Dupon/NEN社製、Colony/Plaque S
creen^TM）に転写後ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションの操作・条件は以下のとおりで
ある。７５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１
×デンハルト液、１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡ及び２ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）か
らなるハイブリダイゼーション溶液中にて、５ｎｇ／ｍ
ｌのビオチン化プローブを用いて５２℃、１５時間ハイ
ブリダイゼーションを行った。反応後、メンブランは
０．１％ＳＤＳを含む４×ＳＳＣ溶液にて室温下５分間
の洗浄を２回行い、更に０．１％ＳＤＳを含む４×ＳＳ
Ｃ溶液にて３７〜４０℃で２０分間のプローブ除去を２
回行った。ついで、２×ＳＳＣ溶液で室温下５分間の洗
浄を２回行った後、風乾し、化学発光検出に供した。検
出は化学発光法（東洋紡績社製、Imaging high-chemilu
mi-）でＸ線フィルム（Amersham社製、Hyperfilm-ECL）
を使用して行った。その結果１５個の陽性プラークを同
定した。得られた陽性プラークからCre-mediated excis
ion法により自動サブクローニング・スクリーニングを
行い、フルクトキナーゼ遺伝子を含む全長約１１ｋｂｐ
のプラスミドＩＲＣ７１１０６（ｐＩＲＣ７１１０６）
を得た。当該プラスミドＩＲＣ７１１０６の構造図を図
２に示す。

【００４０】ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ
-２１１由来フルクトキナーゼ遺伝子の全塩基配列の決
定 上記に記載の方法で単離したプラスミドＩＲＣ７１１
０６をプライマーウォーキング法にて全ＤＮＡ両鎖塩基
配列を確認・決定した。塩基配列は、非ＲＩサイクルシ
ークエンシングキット(PERKIN ELMER社製、ABI PRISM C
ycle Sequencing FS Kit）を用いて、オートシークエン
サー(PERKIN ELMER社製、ABI PRISM^TM 377）で決定し
た。なお、具体的な実験操作・試薬・条件等は各キット
・機器の添付マニュアルに従った。その結果、フルクト
キナーゼ遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有
していた。また、当該塩基配列から推定されるアミノ酸
配列を配列番号２に示す。

【００４１】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 生物名：ブルクホルデリア エスピー ＫＮＩＲＣ-２１１(Burkholderia sp. KNI RC-211 ) 配列 ATG GCA AGC GAG CAA ACT ACC TTT CCG CAA TTC GTC TCC GCC GGC 45 Met Ala Ser Glu Gln Thr Thr Phe Pro Gln Phe Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 GAC ATC CTC ACT GAC ATG ATT CGC ACG GAC GTG TCG AGC TGG CTC 90 Asp Ile Leu Thr Asp Met Ile Arg Thr Asp Val Ser Ser Trp Leu 20 25 30 TCG CGT CCG GGC GGC GCG GGC TGG AAC GTC GCG CGC GCG GTC GCG 135 Ser Arg Pro Gly Gly Ala Gly Trp Asn Val Ala Arg Ala Val Ala 35 40 45 CGT CTC GGC CTG CCG ACG GCC TGC GCC GGT TCG CTG GGC GTG GAC 180 Arg Leu Gly Leu Pro Thr Ala Cys Ala Gly Ser Leu Gly Val Asp 50 55 60 AAT TTC TCC GAC GAT CTG TGG GAA GCG AGC GTC GCC TCA GGC CTC 225 Asn Phe Ser Asp Asp Leu Trp Glu Ala Ser Val Ala Ser Gly Leu 65 70 75 GAC ATG CGC TTC ATG CAG CGC GTC GAG CGG CCG CCG CTG CTG GCC 270 Asp Met Arg Phe Met Gln Arg Val Glu Arg Pro Pro Leu Leu Ala 80 85 90 ATC GTC CAC AAG ACG CAG CCG CCG ACC TAC TAC TTC ATG GGC GAG 315 Ile Val His Lys Thr Gln Pro Pro Thr Tyr Tyr Phe Met Gly Glu 95 100 105 AAC GGC GCG GAT CTC GCG TTC GAT CCG TCG CGG CTG CCG CAA GGC 360 Asn Gly Ala Asp Leu Ala Phe Asp Pro Ser Arg Leu Pro Gln Gly 110 115 120 TGG ATG GAG CGC GTG AAG TGG GCG CAT TTC GGC TGC ATC AGC CTC 405 Trp Met Glu Arg Val Lys Trp Ala His Phe Gly Cys Ile Ser Leu 125 130 135 GTG CGC CAG CCG CTC GGC GCG ACG CTC GCC GCG CTC GCC CGC CAG 450 Val Arg Gln Pro Leu Gly Ala Thr Leu Ala Ala Leu Ala Arg Gln 140 145 150 TTG CGC GAG CAC GGC GTG AAG ATC AGC TTC GAC CCG AAC TAT CGC 495 Leu Arg Glu His Gly Val Lys Ile Ser Phe Asp Pro Asn Tyr Arg 155 160 165 AAT CTG ATG GAG CAC GGC TAC GAG CCG ATT CTG CGC AAC ATG GCG 540 Asn Leu Met Glu His Gly Tyr Glu Pro Ile Leu Arg Asn Met Ala 170 175 180 AGC CTC GCG GAT CTC ATC AAG GTA TCG GAC GAA GAT CTG CAC ATG 585 Ser Leu Ala Asp Leu Ile Lys Val Ser Asp Glu Asp Leu His Met 185 190 195 CTG TTC AAG GGC ATG CCC GAA GCG GAC GCG CTC TCG AAA ATC CTG 630 Leu Phe Lys Gly Met Pro Glu Ala Asp Ala Leu Ser Lys Ile Arg 200 205 210 TCG ATG AAT CCG CAA GCC ACC GTT CTC GTC ACG CGC GGC TCG GCA 675 Ser Met Asn Pro Gln Ala Thr Val Leu Val Thr Arg Gly Ser Ala 215 220 225 CAA GCC ACG CTC TAT GCC GGC GAC GAG CAA TTC AGC GCG CGC CCG 720 Gln Ala Thr Leu Tyr Ala Gly Asp Glu Gln Phe Ser Ala Arg Pro 230 235 240 CCG AGC GTC GAA GTG GCG GAT ACG GTC GGC GCG GGC GAT GCG TCG 765 Pro Ser Val Glu Val Ala Asp Thr Val Gly Ala Gly Asp Ala Ser 245 250 255 ATC GGC GGA TTG CTC TAC AGC CTC ATG GCG CGT CAC GGC GAG TGG 810 Ile Gly Gly Leu Leu Tyr Ser Leu Met Ala Arg His Gly Glu Trp 260 265 270 CCC GAT CAT CTG AAG TTC GCG CTC GCG GCG GGC GCG GCG GCG TGC 855 Pro Asp His Leu Lys Phe Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys 275 280 285 CGT CAT TCG GGC GCG CAT TCG CCA TCG CTG GAA GAG GTC GAA GAA 900 Arg His Ser Gly Ala His Ser Pro Ser Leu Glu Glu Val Glu Glu 290 295 300 TTG CTG GAA 909 Leu Leu Glu 303

【００４２】 配列番号：２ 配列の長さ：３０３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Ser Glu Gln Thr Thr Phe Pro Gln Phe Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Ile Leu Thr Asp Met Ile Arg Thr Asp Val Ser Ser Trp Leu 20 25 30 Ser Arg Pro Gly Gly Ala Gly Trp Asn Val Ala Arg Ala Val Ala 35 40 45 Arg Leu Gly Leu Pro Thr Ala Cys Ala Gly Ser Leu Gly Val Asp 50 55 60 Asn Phe Ser Asp Asp Leu Trp Glu Ala Ser Val Ala Ser Gly Leu 65 70 75 Asp Met Arg Phe Met Gln Arg Val Glu Arg Pro Pro Leu Leu Ala 80 85 90 Ile Val His Lys Thr Gln Pro Pro Thr Tyr Tyr Phe Met Gly Glu 95 100 105 Asn Gly Ala Asp Leu Ala Phe Asp Pro Ser Arg Leu Pro Gln Gly 110 115 120 Trp Met Glu Arg Val Lys Trp Ala His Phe Gly Cys Ile Ser Leu 125 130 135 Val Arg Gln Pro Leu Gly Ala Thr Leu Ala Ala Leu Ala Arg Gln 140 145 150 Leu Arg Glu His Gly Val Lys Ile Ser Phe Asp Pro Asn Tyr Arg 155 160 165 Asn Leu Met Glu His Gly Tyr Glu Pro Ile Leu Arg Asn Met Ala 170 175 180 Ser Leu Ala Asp Leu Ile Lys Val Ser Asp Glu Asp Leu His Met 185 190 195 Leu Phe Lys Gly Met Pro Glu Ala Asp Ala Leu Ser Lys Ile Arg 200 205 210 Ser Met Asn Pro Gln Ala Thr Val Leu Val Thr Arg Gly Ser Ala 215 220 225 Gln Ala Thr Leu Tyr Ala Gly Asp Glu Gln Phe Ser Ala Arg Pro 230 235 240 Pro Ser Val Glu Val Ala Asp Thr Val Gly Ala Gly Asp Ala Ser 245 250 255 Ile Gly Gly Leu Leu Tyr Ser Leu Met Ala Arg His Gly Glu Trp 260 265 270 Pro Asp His Leu Lys Phe Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys 275 280 285 Arg His Ser Gly Ala His Ser Pro Ser Leu Glu Glu Val Glu Glu 290 295 300 Leu Leu Glu 303

【図面の簡単な説明】

【図１】フルクトキナーゼＮ末端アミノ酸配列・塩基配
列／合成オリゴヌクレオチゴ配列を示す図である。

【図２】プラスミドＩＲＣ７１１０６の構造図を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 永松 剛 神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際試薬株 式会社研究開発センター内 (72)発明者 渡津 吉史 神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際試薬株 式会社研究開発センター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 DA06 EA04 GA11 GA19 GA27 HA01 HA14 4B050 CC01 CC03 DD02 LL03 4B065 AA01X AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 BA25 CA29 CA46

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）に示される
   タンパク質。 （ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   タンパク質 （ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において
   １若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加
   されたアミノ酸配列を有し、かつフルクトキナーゼ活性
   を有するタンパク質
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク
   質をコードするフルクトキナーゼ遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   タンパク質 （ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において
   １若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加
   されたアミノ酸配列を有し、かつフルクトキナーゼ活性
   を有するタンパク質
3. 【請求項３】 以下の（ａ）〜（ｃ）に示すＤＮＡ
   からなるフルクトキナーゼ遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
   Ａ （ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
   Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
   つフルクトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードす
   るＤＮＡ （ｃ）遺伝子コドンの縮重のため、（ａ）及び（ｂ）に
   示されるＤＮＡとハイブリッド形成しないが、（ａ）又
   は（ｂ）に示されるＤＮＡによりコードされるタンパク
   質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする
   ＤＮＡ
4. 【請求項４】 請求項２又は３に記載された遺伝子
   又はその一部からなるＤＮＡをプローブ又はプライマー
   として用いることを特徴とするフルクトキナーゼ遺伝子
   の単離方法。
5. 【請求項５】 フルクトキナーゼを産生するブルク
   ホルデリア（Burkholderia)属に属する微生物。
6. 【請求項６】 微生物が、ブルクホルデリア エスピ
   ー ＫＮＩＲＣ-２１１（Burkholderia sp. KNIRC-211、
   ＦＥＲＭ Ｐ−１６８３８）である請求項５に記載の微
   生物。
7. 【請求項７】 下記の理化学的性質及び生化学的性質
   を有するフルクトキナーゼ。 フルクトースに特異的に作用する； 分子量が、ゲル濾過法で約７６，０００であり、ＳＤ
   Ｓ−ＰＡＧＥで約３７，０００である； 陰イオン交換体に吸着する； 熱安定性：４０℃以下で安定； ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜８．５。