JP2000088830A

JP2000088830A - クロマトグラムの解析装置

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Publication number: JP2000088830A
Application number: JP10256363A
Authority: JP
Inventors: Hidechika Hayashi; 秀知佳林
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1998-09-10
Filing date: 1998-09-10
Publication date: 2000-03-31
Anticipated expiration: 2018-09-10
Also published as: JP3911866B2

Abstract

(57)【要約】【課題】被分析物のピークを検出した後、該ピークにつ
いてベースライン点を検出するための装置であって、被
分析物質以外の成分ピークやゴーストピークがあっても
解析結果が影響され難い解析装置を提供すること。【解決手段】被分析物のピーク分析用ベースラインを設
定するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベ
ースライン検出終了時間（ｔｂ２）を記憶する第１記憶
手段、被分析物についてのクロマトグラフを記憶する第
２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、被分
析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ）を検出する第１
演算手段、そして、ｔｂ１からｔｘの間でクロマトグラ
ム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上
の値を変数とする関数を用いて第１ベースライン点を検
出し、前記ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高
さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変
数とする関数を用いて第２ベースライン点を検出し、こ
れら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースライ
ンとして設定する第２演算手段とを具備する装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーやガスクロマトグラフィー等、被分析物を含む試
料をカラム等の分離手段に供して取得されるクロマトグ
ラムを解析する解析装置に関するものであり、更に具体
的には、例えば液体クロマトグラフィーによる血液や尿
中のカテコールアミンやアミノ酸の分析における、クロ
マトグラムの解析装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から、種々の被分析物質を液体クロ
マトグラフィー等に供してクロマトグラムを得、該クロ
マトグラム中の被分析物のピークを検出し、その高さ、
巾、ピーク面積等を解析し、被分析物の定性、定量を行
うことが行われている。

【０００３】クロマトグラムの解析には、被分析物の溶
出ピークを検出した後、検出されたピークを予めその存
在を予想した成分と関連付ける方法（以下、第１法とい
う）と、予め測定しようとする被分析物毎にピークが出
現する時間（標準ピーク出現時間）を予想しておき、こ
の付近でピークを探す方法（以下、第２法という）があ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】第１法では、予め予想
した成分のピーク以外に、予想していない未知成分のピ
ークを検出することが可能である。即ち、クロマトグラ
ムの解析に当たり、通常はクロマトグラムの傾き等によ
りピーク開始点とピーク終了点を検出し、この範囲で最
大値を取る点をピークとするが、試料中の成分に由来し
ないノイズピークをもピークとして検出してしまう恐れ
がある。また、ベースラインがドリフトしている状態
（安定していない状態）ではその傾き等を正確に検知す
ることが困難であるため、ピーク開始点及びピーク終了
点を正しく検出できないという課題もある。

【０００５】これに対して前記第２法には、予め予想し
た被分析物以外のピークを検出することはできないもの
の、予想した被分析物のピークは正しく検出できるとい
う利点がある。

【０００６】しかしながら、正確なクロマトグラム解析
を行うには、被分析物のピークを正しく検出すること以
外にベースラインを正しく設定する必要がある。

【０００７】従来のピーク解析では、検出された被分析
物のピーク出現時間（ｔｘ）を基準として、その前後一
定の時間点でのクロマトグラム値を第１及び第２のベー
スライン点とし、これらを結ぶ直線をベースラインとし
ている。一定の時間点としては、例えば被分析物を含む
標準試料のクロマトグラムにおいて、被分析物のピーク
値が１／２となった時のピーク巾（ピーク半値巾）を一
定倍した時間点が使用されている。

【０００８】このため、例えばベースラインを指定する
ベースライン点に被分析物質以外の成分ピークやゴース
トピーク（例えば液体クロマトグラフィーにおける、試
料を導入する際の切り替え弁の動作に由来するピーク）
が重なってしまうと、その点でのクロマトグラム値が本
来のベースライン値からずれてしまい、例えばピーク高
さを求める解析を行う際には、解析の結果、本来の高さ
とは異なるピーク高さが得られてしまうことになる。被
分析物質以外の成分ピークやゴーストピークは、その成
分の種類や分析条件、更には室温等の分析環境によって
大きさや出現時間が変動するため、これらを避けて正し
いベースラインを指定すべく、ベースライン点を予め設
定するにしても、分析環境等が変化するたびに設定を変
更しなければならないという課題がある。

【０００９】そこで本発明の目的は、予め測定しようと
する被分析物毎にピークが出現する時間（標準ピーク出
現時間）を予想する等してピークを検出した後に適用さ
れるクロマトグラムの解析装置であって、被分析物質以
外の成分ピークやゴーストピークがあっても正しいベー
スラインを設定することが可能な解析装置を提供するこ
とにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に成された本願請求項１の発明（以下、第１発明とい
う）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに供す
ることによって得られるクロマトグラムの解析装置であ
って、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定する
ためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースラ
イン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ２で
ある）を記憶する第１記憶手段、被分析物についてのク
ロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロ
マトグラムについて、被分析物のピーク及びその出現時
間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を検出
する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの間で
クロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差の
うちの２以上の値を用いて第１のベースライン点を検出
し、前記ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高
さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変
数とする関数を用いて第２のベースライン点を検出し、
これら設定されたベースライン点を結ぶ直線をベースラ
インとして設定する第２演算手段とを具備する装置であ
る。

【００１１】また本願請求項２の発明（以下、第２発明
という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベー
スライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ
２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物について
のクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶された
クロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出
現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を
検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの
間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの
差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第１ベ
ースライン点を検出し、前記ｔｂ２におけるクロマトグ
ラム点を第２ベースライン点とし、これら設定されたベ
ースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する
第２演算手段とを具備する装置である。

【００１２】また本願請求項３の発明（以下、第３発明
という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベー
スライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ
２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物について
のクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶された
クロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出
現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を
検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１におけるク
ロマトグラム点を第１ベースライン点とし、前記ｔｘか
らｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及
びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用
いて第２ベースライン点を検出し、これら設定されたベ
ースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する
第２演算手段とを具備する装置である。

【００１３】また本願請求項４の発明（以下、第４発明
という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）を記憶
する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフ
を記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムに
ついて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、こ
こでｔｂ１＜ｔｘである）を検出する第１演算手段、そ
して、前記ｔｂｘからｔｘの間でクロマトグラム点の高
さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変
数とする関数を用いてベースライン点を検出し、ベース
ライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースライ
ンとして設定する第２演算手段とを具備する装置であ
る。

【００１４】そして本願請求項５の発明（以下、第５発
明という）は、試料中の被分析物をクロマトグラフィー
に供することによって得られるクロマトグラムの解析装
置であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設
定するためのベースライン検出終了時間（ｔｂ２）を記
憶する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラ
フを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラム
について、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、
ここでｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、
そして、ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高
さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変
数とする関数を用いてベースライン点を検出し、ベース
ライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースライ
ンとして設定する第２演算手段とを具備する装置であ
る。

【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
解析装置は、試料中の被分析物を分離・展開した後に検
出を行う、いわゆるクロマトグラフィーにおけるクロマ
トグラム解析に使用することができる。クロマトグラフ
ィーは、分離・展開の原理によって種々の液体クロマト
グラフィーやガスクロマトグラフィーが存在するが、解
析対象となるクロマトグラムはいかなるクロマトグラフ
ィーにより得られたものであっても良い。例えば電気泳
動結果を適当な染色試薬で染色後、光学測定装置でスキ
ャンニングする等した場合でも、その解析に本発明を使
用することができる。

【００１６】クロマトグラムは、本発明の装置による解
析に先立ち、例えば単純移動平均、多項式フィッティン
グ、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるスム
ージング処理を行ったり、単純スパイク除去処理、フー
リエ変換又はウェーブレット変換等によるノイズ除去処
理を行っておくことが好ましい。これらの処理を行うこ
とにより、ノイズを除去しておけば、クロマトグラムに
おける被分析物ピークの最高値や最低値がノイズの影響
を受けにくくなり、より信頼性の高い解析結果を得るこ
とができる。

【００１７】単純移動平均はＹｎ＝Ｓｕｍ（Ｘｉ）／ｍ
で表され（Ｓｕｍは連続するデータＸｉを加算する関数
であり、ｍは加算するデータの数である）、多項式フィ
ッティングはＹｎ＝Ｓｕｍ（Ｋｉ×Ｘｉ）／Ｓｕｍ（Ｋ
ｉ）で表され（Ｓｕｍ及びＸｉは前記同様であり、Ｋｉ
は例えばＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法により、デー
タを２次式又は３次式にフィッティングするように決定
される係数である）、フーリエ変換はデータをフーリエ
変換して周波数軸で高周波成分をカットするウィンドウ
関数をかけ、逆フーリエ変換で時間軸に戻すことをい
い、ウェーブレット変換は例えばＡｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６９巻、１号、１９９７年、
第７８〜９０頁に記載された処理であり、単純スパイク
除去処理としてはメディアン法（Ｙ＝Ｍｅｄｉａｎ（Ｘ
ｉ）で表される、連続する３ないし５のデータの中心を
取る方法）等が例示できる。

【００１８】なお本発明において第２演算手段で第１の
ベースライン点及び第２のベースライン点を検出するに
当たり、単純移動平均処理等を行ってスムージングをし
た後にこれら点を計算することは、これら点を計算する
に当たり、任意時点のクロマトグラムの値としてその前
後の値を平均した値を用いてこれら点を計算することと
同価となる。

【００１９】本発明の解析装置は、クロマトグラムにつ
いて初期的な解析が行われ、クロマトグラム中のピーク
を被分析物のピークと同定した後にベースライン設定等
を行うための装置である。しかしながら、本発明の装置
に被分析物のピークを検出するための手段を追加するこ
とに制限はない。

【００２０】被分析物のピークを検出するための第１演
算手段としては、従来のピーク検出手段等を用いること
ができるが、以下のような構成をも一例として例示する
ことができる。まず、適当な記憶手段に被分析物のピー
クを検出するためのピーク検出開始時間（ｔｐ１）やピ
ーク検出終了時間（ｔｐ２）等を記憶する。該手段は、
例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換
え可能な記憶媒体で構成することが可能であり、例えば
キーボード等の入力装置を用いてこれらを入力し、記憶
させれば良い。この記憶のため、第１演算手段に別途記
憶手段を併設するか、又は、本発明の第１又は第２記憶
手段を兼用に配置しても良い。第１演算手段は例えばコ
ンピュータ等で構成することができるが、後述する第２
演算手段と兼用としても良い。

【００２１】ｔｐ１とｔｐ２は、クロマトグラムにおい
て解析しようとする被分析物のピークを検出するための
ものであり、被分析物の種類毎に設定される。これらの
値はｔｐ１＜ｔｐ２の関係を満たすが、例えば、被分析
物のみを含む標準試料をクロマトグラフィーに供してク
ロマトグラムを得、このクロマトグラムから被分析物の
標準出現時間（ｔｓ）を求め、ｔｐ１＜ｔｓ＜ｔｐ２と
設定することが例示できる。より具体的にｔｐ１及びｔ
ｐ２は、使用するクロマトグラフィーの分離の様式、移
動相等の速度、分析を行う室温等の分析環境等における
ｔｓと、該環境が変動した場合にｔｓが変動する時間巾
を勘案し、適宜設定すれば良い。即ち、ｔｐ１＜ｔｘ＜
ｔｐ２とするのである。なお関係を満たすようにｔｐ１
及びｔｐ２を設定するために、ｔｓとｔｘの差を求め、
ｔｓに基づいて設定したｔｐ１及びｔｐ２の設定をこの
差に基づいて変更する等しても良い。

【００２２】ｔｐ１及びｔｐ２については、被分析物以
外の成分が含まれていることが予想される場合にはｔｐ
２−ｔｐ１が小さくなるように設定し、被分析物以外の
成分の存在が予想されない場合にはｔｐ２−ｔｐ１が大
きくなるように設定することが好ましいが、一般的にｔ
ｐ２−ｔｐ１は被分析物を含む標準試料のクロマトグラ
ムにおけるピークの高さが１／２となる時のピーク巾
（ピーク半値巾）の１倍程度〜２倍程度となるように設
定することが例示できる。ただし、必ずしもｔｓ−ｔｐ
１＝ｔｐ２−ｔｓとする必要はない。そしてｔｐ１〜ｔ
ｐ２までの範囲内で、最高値を有するクロマトグラム点
を被分析物のピークとする等すれば良い。本発明の第１
記憶手段は、第１〜第５発明の態様に応じて、前記のよ
うにして検出された被分析物のピークについて、その分
析用ベースラインを設定するためのベースライン検出開
始時間（ｔｂ１）及びベースライン検出終了時間（ｔｂ
２）等を記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーや
フラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成
することが可能である。

【００２３】第１〜第３発明において第１記憶手段が記
憶するベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベースラ
イン検出終了時間（ｔｂ２）は、ベースラインを設定す
るベースライン点を検出するためのものである。ｔｂ１
とｔｂ２は、ｔｂ１＜ｔｂ２との関係を満たすが、被分
析物のピーク出現時間（ｔｘ）との関係ではｔｂ１＜ｔ
ｘ＜ｔｂ２の関係をも満たすように設定する。一般的に
ｔｂ２−ｔｂ１は被分析物のピーク高さが１／２となる
ときのピーク巾（ピーク半値巾）の２倍〜６倍程度とす
ることが例示できる。またここで、必ずしもｔｘ−ｔｂ
１＝ｔｂ２−ｔｘとする必要はない。なお、本発明の解
析装置において、ベースラインを設定するまではピーク
高さやピーク巾を得ることはできないがピーク巾の概略
値を求めれば十分であるため、ピーク巾の初期値として
例えば被分析物のみを含む標準試料を予め分析し、得ら
れたクロマトグラムについて大まかに設定したベースラ
インに基づきピーク巾を求め、この値を第１記憶手段に
入力して第２演算手段に伝えるようにすれば良い。そし
て本発明の解析装置における第２演算手段でベースライ
ンを設定した後は、該ベースラインに基づき決定された
ピーク巾を第１記憶手段にフィードバックしても良い。
ｔｂ１及びｔｂ２は、各被分析物のピークに対して異な
る値を設定するが、ｔｂ１からｔｂ２の巾、即ちｔｂ２
−ｔｂ１は、全て同一であっても、ピーク毎に異なって
いても良い。またｔｂ１及びｔｂ２は、ｔｓの値に基づ
いて予め設定しておいても良い。更に、ｔｓ−ｔｂ１と
ｔｂ２−ｔｓは等しくても異なっていても良い。

【００２４】一方、例えばｔｓと実際の被分析物の出現
時間ｔｘに差が生じた場合には、該差によりｔｂ１、ｔ
ｂ２を補正するように構成しても良い。また、標準試料
では既知量の被分析物が含まれるのに対し、試料には未
知量の被分析物が含まれるため、標準試料として予想さ
れる量の被分析物を含むものを使用してピーク半値巾を
求めることが好ましい。

【００２５】本発明者の知見によれば、ベースライン点
の設定において夾雑物のピークやゴーストピークによる
妨害がないと予想される場合、ｔｂ１とｔｂ２として
は、共にｔｘから被分析物のピーク高さが１／２となる
ときのピーク巾分離れた時点を設定できるが、２倍分又
は３倍分離れた時点を設定することもできる。またベー
スライン点の設定において夾雑物のピークやゴーストピ
ークによる妨害があると予想される場合、ｔｂ１とｔｂ
２としては、共にｔｘから被分析物のピーク高さが１／
２となるときのピーク巾の３倍分離れた時点を設定する
ことが好ましい。第２記憶手段は、解析するクロマトグ
ラムを記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフ
ラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成で
き、例えば液体クロマトグラフィーにおける検出装置か
らの検出信号を経時的に記憶できれば良い。第２記憶手
段は前記第１記憶手段と一体に構成することもできる。
なお、該経時的記憶は連続的なものであっても良いし、
例えば１秒毎等の、間欠的なものであっても良い。間欠
的にクロマトグラムを記憶する場合には、可能な限り短
い時間間隔で値を記憶することが好ましい。なお、時間
は、例えば分離カラム等の分離手段に試料を供した時間
を０（ゼロ）として計算しても良いし、例えばクロマト
グラフィーに試料を供してから所定時間経過後にクロマ
トグラムの経時的記憶を開始する場合には、該開始時間
を０（ゼロ）として計算しても良い。電気泳動の結果を
スキャンする場合には、移動距離を時間に置き換えて考
えれば良い。

【００２６】第２演算手段では、以上のように設定した
ｔｂ１とｔｘの間、及び、ｔｘとｔｂ２の間で、クロマ
トグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの
２以上の値を変数とする関数を用いてそれぞれ第１ベー
スライン点、第２ベースライン点を設定し、これらを結
ぶ直線をベースラインとして設定する。該手段として
は、コンピュータ等を例示することができる。

【００２７】前記関数は、詳しくは、クロマトグラム点
の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値
を変数とし、それらの値又はそれらの値の絶対値の和を
表す関数や、それぞれの値の和と積を組み合わせる関数
が例示できる。クロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及
びｔｘとの差のうちの３以上の値を変数とする関数では
ゴーストピーク等を避けた位置にベースライン点を決定
するために好ましく、これら全てを変数とする関数は特
に好ましい。

【００２８】特に好ましいクロマトグラム点の高さ、傾
き、曲率及びｔｘとの差の全てを変数とする関数とし
て、より具体的に以下のような関数が例示できる。

【００２９】例えば、関数＝（クロマトグラム点の高
さ）＋ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値）＋ｂ×
（クロマトグラムの曲率の絶対値）＋ｃ×（（（ｔ−ｔ
ｘ）／（ｔｂ１−ｔｘ））の４乗）で表される関数。ま
た例えば、関数＝（クロマトグラム点の高さ）×（１＋
ａ×（クロマトグラムの傾きの絶対値））×（１＋ｂ×
（クロマトグラムの曲率の絶対値））×（１＋ｃ×
（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ１−ｔｘ））の４乗）で表さ
れる関数。

【００３０】前記式において、クロマトグラムの傾きは
任意の点におけるクロマトグラム値の一次微分の値であ
り、クロマトグラムの曲率は任意の点におけるクロマト
グラム値の二次微分の値である。またａ〜ｃは係数であ
り、正又はゼロの数となる。ここで変数を２又は３とす
る場合には、各２又は１の係数がゼロとすれば良い。係
数ｃを含む項は、ｔｘ−ｔｂ１とｔｂ２−ｔｘが異なる
場合には、ｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ２―ｔｘ））
の４乗）とし、ｔ＞ｔｘでｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔ
ｂ２−ｔｘ））の４乗）としても良い。係数ｃを含む項
は、ｔｘ−ｔｂ１とｔｂ２−ｔｘが異なる場合には、ｃ
×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ２−ｔｘ））の４乗）とし
ても良い。また、ｔ＜ｔｘでｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／
（ｔｂ−ｔｘ））の４乗）とし、ｔ＞ｔｘでｃ（（（ｔ
−ｔｘ）／（ｔｂ２−ｔｘ））の４乗）としても良い。

【００３１】前記式における係数の値は、被分析物のピ
ークや予想されるゴーストピークの出現時間、高さ、巾
等の値に応じて適宜決定することができる。また、予想
される夾雑物のピーク出現時間、高さ、巾等の値や、ク
ロマトグラフィーを実施する温度条件、溶離液組成に応
じて被分析物のピークと夾雑物のピークの出現する位置
関係が変化すること等を考慮し、適宜決定することがで
きる。これらに加え、ｔｂ１やｔｂ２の設定の仕方、更
には被分析物のピークの高さ等に応じて適宜決定するこ
とができる。

【００３２】前記した関数における係数は、例えば本発
明の装置を用いて解析するクロマトグラムが被分析物の
ピークが夾雑物を含むことが予想される通常の試料のク
ロマトグラムであるか、又は、夾雑物を含まない標準試
料のクロマトグラムであるかに応じて変更できる。即
ち、標準試料及び試料のクロマトグラムを解析するに当
たり、同一の係数を使用することも可能であるが、異な
る係数を使用することもできる。特に、標準試料では既
知量の被分析物のみを含み夾雑物を含まないのでゴース
トピークの存在だけを考慮して係数を決定すれば良く、
係数の値を広い範囲で変化させてもベースライン点はほ
とんど同一となる。一方、通常の試料では、未知量の被
分析物を含むため、ピーク高さ等が大きく変わったり、
又は夾雑物に由来するピークが出現するため、正しいベ
ースライン点を検出するためにはこれらで使用する関数
の係数を適切な値に設定する必要がある。

【００３３】上記のうち、クロマトグラム点の高さを変
数として用れば、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で
最低点に近いクロマトグラム点をベースライン点として
検出できる。またクロマトグラムの傾きを変数として用
いれば、ピークの斜面ではなくクロマトグラムが水平に
近い部分をベースライン点として検出できる。またクロ
マトグラムの曲率を変数として用いれば、負のゴースト
ピークの頂点をベースライン点として検出しないように
することができる。そしてｔｘとの差を変数として用い
れば、ピークにできるだけ近い点をベースライン点とし
て検出することができる。従ってこれら変数を２以上、
好ましくは３以上、そして特に好ましくは全て使用する
ことで、被分析物の定量等を最も正確に行い得るベース
ラインを設定するためのベースライン点を検出すること
が可能となる。

【００３４】即ち、これら変数を組み合わせることによ
り、基本的には高さが最も低い点をベースライン点とし
て検出するが、該点が傾斜面に存在するときや負のゴー
ストピークの頂点に位置するときはこれを無視し、むし
ろ高さは最低ではないが、より平らな部分をベースライ
ン点として検出するようなことが可能となるのである。
また更には、被分析物のピークの裾部分が他の被分析物
や夾雑物のピークの裾部分と重複していることが予想さ
れる場合にｔｘ−ｔｂ１及びｔｂ２−ｔｘが大きくなる
ように設定しても、実際にはピークの裾部分の重複が存
在しなければ被分析物のピーク出現時間ｔｘ付近にベー
スライン点を設定することが可能となり、ベースライン
ドリフト等の影響を排除することも可能になる。

【００３５】このようにしてクロマトグラムにおけるｔ
ｂ１〜ｔｘ、ｔｘ〜ｔｂ２の値を関数に代入し、各範囲
内で関数の値が最も小さくなる点を各第１ベースライン
点、第２ベースライン点とする。その後、両点を結ぶ直
線をベースラインとして設定するのである。ベースライ
ンが設定された後は、例えば被分析物のピーク高さやピ
ーク面積、ピーク半値巾等を算出し、被分析物の定量等
を行うことになるが、本発明においては第２演算手段を
当該算出手段と兼用に構成することもできる。第２発明
又は第３発明においては、ｔｂ１〜ｔｘの間又はｔｘ〜
ｔｂ２の間で前記のようにして第１又は第２ベースライ
ン点を検出する一方、もうひとつのベースライン点とし
ては、ｔｂ２又はｔｂ１におけるクロマトグラム点を用
いる。第４発明又は第５発明においては、第２演算手段
において、それぞれ、上記した第１発明におけるベース
ライン検出開始時間（ｔｂ１）又はベースライン検出終
了時間（ｔｂ２）のみを使用してベースライン点を１点
のみ検出し、ベースライン点を通過しかつ時間軸に平行
な直線をベースラインとして設定する。

【００３６】第４発明及び第５発明においても、ｔｂ１
又はｔｂ２の設定は同様である。第１〜第３発明は、被
分析物の前後に他の被分析物や夾雑物のピークが出現す
る場合に特に効果的であり、第４発明は、被分析物のピ
ークの後に他の被分析物ピークや夾雑物のピークが複数
個連なって存在する場合やベースラインが変動する場合
に特に効果的であり、第５発明は被分析物のピーク前に
他の被分析物ピークや夾雑物のピークが複数個連なって
存在する場合やベースラインが変動するする場合に特に
効果的である。従って本発明の解析装置は、解析するク
ロマトグラムにおける被分析物ピークの前後に出現する
ピークの有無により、第１〜第５発明を適宜選択して適
用することが特に好ましい。この目的を達成するため、
例えば、コンピュータと記憶装置で本発明の装置を構成
し、第１〜第５発明の全ての機能をカバーするようにし
ておき、必要に応じていずれかの態様を選択のうえ、ク
ロマトグラム解析を行うことが例示できる。

【００３７】本発明の解析装置においては、これまでに
説明した各手段に加え、例えば解析結果を表示したり印
刷する出力手段や、被分析物のピークを検出できなかっ
た場合に警告を発生する手段等を装備することができ
る。

【００３８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
るために実施例を示すが、本発明はこれらに限定される
ものではない。

【００３９】図１は、本発明を液体クロマトグラフィー
用のクロマトグラム解析装置に適用した一例を示すもの
である。図中、１は分離カラム、２は検出器を示し、送
液ポンプや試料導入装置等のその他のクロマトグラフィ
ー装置は省略した。

【００４０】図中、点線で囲った部分が本発明の解析装
置であり、一台のコンピュータにより本発明の各手段を
構成した。図中、３は第１記憶手段、４は第２記憶手
段、５は第１演算手段、６は第２演算手段をそれぞれ示
す。第１記憶手段３はキーボード７からの入力を記憶
し、第２記憶手段４は検出器２からの出力（クロマトグ
ラム）を記憶し、第１演算手段５は第１及び第２の記憶
手段と連絡され、そして第２演算演算手段は第１演算手
段と連絡されている。また第２演算手段６は、クロマト
グラム解析結果をプリンタ８に出力する。

【００４１】図２は、以下の実施例で用いた液体クロマ
トグラム装置の構成の概略を示すものである。該装置
は、溶離液ポンプ９ａ、９ｂ、試薬ポンプ１０ａ、１０
ｂ、オートサンプラ１１、２本の前処理カラム１２及び
１３と１本の分析カラム１４、リアクタ１５、そして蛍
光検出器１６から構成され、さらに溶離液を切り替える
バルブや流路を切り替えるバルブを有するものである。
図１に示した本発明の解析用装置は、検出器１６と連結
される。

【００４２】図３〜図７は、液体クロマトグラフィーで
得られたカテコールアミンの成分であるノルエピネフリ
ン（ＮｏｒＥｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ；ＮＥ）、エピネフ
リン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ；Ｅ）及びドーパミン
（Ｄｏｐａｍｉｎｅ；ＤＡ）のクロマトグラムについて
第１演算手段によりピーク検出を行った結果を示す結果
である。分析に供した試料は、カテコールアミン成分で
あるＮＥ、Ｅ及びＤＡを各１ｐｇ／ｍｌ含む標準試料で
あり、これを室温（２４．６℃）条件下で測定したもの
である。ピーク出現時間が約１６分のピークがＮＥ、約
１８．５分のピークがＥ、そして約２５．５分のピーク
がＤＡである。液体クロマトグラフィー装置としては、
前処理カラムとして２本のカラム（第１の前処理カラム
１２は直径４．６ｍｍ×７５ｍｍの逆相（エーテルゲ
ル）カラム、第２の前処理カラム１３は直径３．０ｍｍ
×６０ｍｍのイオン交換カラム）、分離カラム１４とし
て逆相（ＯＤＳ）用カラム（直径４．０ｍｍ×１５０ｍ
ｍ）を配置した装置を用いた。この装置では、ポンプ９
ａで溶離液（リン酸緩衝液（ｐＨ７））で試料を第１の
前処理用カラムに送液し（１．０ｍｌ／分）、第１の前
処理用カラムに保持された成分に対して、電磁弁を切り
替えることによりポンプ９ａで溶離液（硝酸アンモニウ
ム水溶液とアセトニトリルの混合液）を送液して第２の
前処理用カラムに導入し、そして第２の前処理用カラム
に保持された成分に対して、ポンプ９ｂで溶離液（硝酸
アンモニウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７））を分析カ
ラムに送液して分離し（０．７ｍｌ／分）、分析カラム
から溶出する成分に蛍光反応試薬を混合した後にリアク
タ１５に導入した。リアクタで蛍光反応試薬であるＤＰ
Ｅ（Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）
と９０℃、３分間反応させて蛍光誘導体化した。蛍光反
応試薬はポンプ１０ａと１０ｂ（各０．２５ｍｌ／分）
を用いて送液した。蛍光誘導体化した各被分析物は、蛍
光検出器を用いて励起波長３４０〜３６０ｎｍ、蛍光波
長４６０ｎｍで測定し、クロマトグラムを得た。

【００４３】図３〜図７は、従来の解析方法でベースラ
イン点を設定した図（図３、６）及び本発明の解析装置
でベースライン点を設定した図（図４、５、７）であ
る。図中、ＮＥの前の負のピークとＥとＤＡの間の負の
ピーク（図中矢印を付す）は、装置の切り替えバルブを
切り替えた際に発生したゴーストピークである。

【００４４】図中Ｐは、第１演算手段により検出された
ＮＥのピークであり、ｔｂ１及びｔｂ２はＮＥのピーク
についてベースラインを設定するために第１記憶手段に
記憶されたベースライン検出開始時間及びベースライン
検出終了時間、そしてＢは検出されたベースライン点を
それぞれ示す。

【００４５】図３は、ｔｘからピーク半値巾の５倍ずつ
離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として、ベースライン点を検
出した結果を示す図である。本例では、ｔｂ１〜ｔｘ及
びｔｘ〜ｔｂ２の間で最も低いクロマトグラム点を検出
し、これらをそれぞれ第１ベースライン点、第２ベース
ライン点とした。

【００４６】この例では、負のゴーストピークの影響を
受けて検出された第１ベースライン点がゴーストピーク
の斜面上に設定されてしまった。この結果、ＮＥのピー
ク面積やピーク高さ等が僅かではあるが不正確となっ
た。

【００４７】図４は、本発明の第１発明の解析装置によ
りベースライン点を検出した例を示す図である。第２記
憶手段に記憶されたクロマトグラムは図３に示したもの
と同一である。本例では、ｔｘからピーク半値巾の５倍
ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として第１記憶手段に記
憶した。第２演算手段におけるベースライン点の検出に
は、関数＝クロマトグラム点の高さ＋ｃ×（（（ｔ−ｔ
ｘ）／（ｔｂ１−ｔｘ）の４乗））という関数を用い、
ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で該関数が最低値と
なるクロマトグラム点を第１及び第２ベースライン点と
して検出した。

【００４８】なお、前記関数における係数ｃは、検出下
限濃度のピーク高さと同じオーダの値になるように決定
した。

【００４９】この例では、検出されたベースライン点は
ＮＥのピーク近くにあり、図３に示した例のように負の
ゴーストピークの影響を受けて第１ベースライン点がゴ
ーストピークの斜面上に検出されることはなかった。

【００５０】図５は、本発明の第１発明の解析装置によ
りベースライン点を検出した他の例を示す図である。第
２記憶手段に記憶されたクロマトグラムは図３に示した
ものと同一である。本例では、ｔｘからピーク半値巾の
５倍ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として第１記憶手段
に記憶した。第２演算手段におけるベースライン点の検
出には、関数＝クロマトグラム点の高さ＋ａ×（クロマ
トグラムの傾きの絶対値）という関数を用い、ｔｂ１〜
ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の間で該関数が最低値となるクロ
マトグラム点を第１及び第２ベースライン点として検出
した。

【００５１】なお、前記関数における係数ａは、ａ×
（クロマトグラムの傾きの絶対値）の値が、クロマトグ
ラムのピーク以外で最大傾きを持つ点で引いた接線の３
０秒あたりの変化量にほぼ等しくなるように決定した。

【００５２】この例でも、検出されたベースライン点は
ＮＥのピーク近くにあり、図３に示した例のように負の
ゴーストピークの影響を受けて第１ベースライン点がゴ
ーストピークの斜面上に検出されることはなかった。

【００５３】図６は、図３に示したクロマトグラムにつ
いてｔｘからピーク半値巾の６倍ずつ離れた点をｔｂ
１、ｔｂ２としてベースライン点を検出した結果を示す
図である。本例では、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜ｔｂ２の
間で最も低いクロマトグラム点を検出し、これらをそれ
ぞれ第１ベースライン点、第２ベースライン点とした。
この例では、負のゴーストピークの影響を受けて検出さ
れた第１ベースライン点がゴーストピークの頂点に検出
されてしまった。この結果、ＮＥのピーク面積やピーク
高さ等が僅かではあるが不正確となった。

【００５４】図７は、本発明の第１発明の解析装置によ
りベースライン点を検出した例を示す図である。第２記
憶手段に記憶されたクロマトグラムは図３に示したもの
と同一である。本例では、ｔｘからピーク半値巾の６倍
ずつ離れた点をｔｂ１、ｔｂ２として第１記憶手段に記
憶した。第２演算手段におけるベースライン点の検出に
は、関数＝クロマトグラム点の高さ＋ａ×（クロマトグ
ラムの傾きの絶対値）＋ｂ×（クロマトグラムの曲率の
絶対値）＋ｃ×（（（ｔ−ｔｘ）／（ｔｂ１−ｔｘ））
の４乗））という関数を用い、ｔｂ１〜ｔｘ及びｔｘ〜
ｔｂ２の間で該関数が最低値となるクロマトグラム点を
第１及び第２ベースライン点として検出した。

【００５５】なお、前記関数における係数ａは、ａ×
（クロマトグラムの傾きの絶対値）の値がクロマトグラ
ムのピーク以外で最大傾きを持つ点で引いた接線の３０
秒あたりの変化量にほぼ等しくなるように、ｂは、ｂ×
（クロマトグラムの曲率の絶対値）がゴーストピークの
頂点付近を２次曲線で近似した時に頂点から１０秒離れ
た点での２次曲線の変化量に等しくなるように、係数ｃ
は、検出下限濃度のピーク高さと同じオーダの値になる
ように決定した（ただしｃは、図４における係数ｃの１
／２とした）。

【００５６】本例では、ｔｂ１〜ｔｘの間に負のゴース
トピークが存在するにもかかわらず、図６に示した例の
ように負のゴーストピークの影響を受けて第１ベースラ
イン点がゴーストピークの頂点に検出されることはなか
った。

【００５７】

【発明の効果】本発明によれば、液体クロマトグラフィ
ーやガスクロマトグラフィー、更には電気泳動等の結果
得られるクロマトグラムを解析する際に、被分析物のピ
ークの前及び／又は後ろに夾雑物のピークやゴーストピ
ークが出現しても、より的確なベースラインを設定する
ことが可能となる。この結果、夾雑物ピークやゴースト
ピークによる影響を排除して、より正確に被分析物のピ
ーク高さやピーク面積等を求めることができる。

【００５８】特に、被分析物のピークの近くに負のゴー
ストピークが存在し、その位置が温度等の条件によって
変化する場合には、従来は、クロマトグラムから実施者
が経験的に判断してその影響を排除し得るようにベース
ラインを設定していたが、本発明により、自動的に負の
ゴーストピークの影響をも排除できるようになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の解析装置の概略を示すための
図である。

【図２】図２は、実施例で使用した液体クロマトグラフ
ィー装置の概要を示す図である。

【図３】図３は、カテコールアミンの一成分であるノル
エピネフリンのピークについてベースライン点を検出し
た様子を示す図である。

【図４】図４は、本発明の解析装置を用いてカテコール
アミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについ
てベースライン点を検出した様子を示す図である。

【図５】図５は、本発明の解析装置を用いてカテコール
アミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについ
てベースライン点を検出した他の様子を示す図である。

【図６】図６は、カテコールアミンの一成分であるノル
エピネフリンのピークについてベースライン点を検出し
た様子を示す図である。

【図７】図７は、本発明の解析装置を用いてカテコール
アミンの一成分であるノルエピネフリンのピークについ
てベースライン点を検出した他の様子を示す図である。

【符号の説明】

１分離カラム、２検出器、３第１記憶手段、４
第２記憶手段、５第１演算手段、６第２演算手段、
７入力手段、８出力手段、９ａ、９ｂ溶離液ポン
プ、１０ａ、１０ｂ試薬ポンプ、１１オートサンプ
ラ、１２、１３前処理カラム、１４分析カラム、１５
リアクタ、１６検出器

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベー
スライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ
２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物について
のクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶された
クロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出
現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を
検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの
間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの
差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第１ベ
ースライン点を検出し、前記ｔｘからｔｂ２の間でクロ
マトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうち
の２以上の値を変数とする関数を用いて第２ベースライ
ン点を検出し、これら設定されたベースライン点を結ぶ
直線をベースラインとして設定する第２演算手段とを具
備する前記装置。
【請求項２】試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベー
スライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ
２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物について
のクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶された
クロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出
現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を
検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１からｔｘの
間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及びｔｘとの
差のうちの２以上の値を変数とする関数を用いて第１ベ
ースライン点を検出し、前記ｔｂ２におけるクロマトグ
ラム点を第２ベースライン点とし、これら設定されたベ
ースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する
第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項３】試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）とベー
スライン検出終了時間（ｔｂ２）（ここでｔｂ１＜ｔｂ
２である）を記憶する第１記憶手段、被分析物について
のクロマトグラフを記憶する第２記憶手段、記憶された
クロマトグラムについて、被分析物のピーク及びその出
現時間（ｔｘ、ここでｔｂ１＜ｔｘ＜ｔｂ２である）を
検出する第１演算手段、そして、前記ｔｂ１におけるク
ロマトグラム点を第１ベースライン点とし、前記ｔｘか
らｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、傾き、曲率及
びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数とする関数を用
いて第２ベースライン点を検出し、これら設定されたベ
ースライン点を結ぶ直線をベースラインとして設定する
第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項４】試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出開始時間（ｔｂ１）を記憶
する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフ
を記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムに
ついて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、こ
こでｔｂ１＜ｔｘである）を検出する第１演算手段、そ
して、前記ｔｂｘからｔｘの間でクロマトグラム点の高
さ、傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変
数とする関数を用いてベースライン点を検出し、ベース
ライン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースライ
ンとして設定する第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項５】試料中の被分析物をクロマトグラフィーに
供することによって得られるクロマトグラムの解析装置
であって、被分析物のピーク分析用ベースラインを設定
するためのベースライン検出終了時間（ｔｂ２）を記憶
する第１記憶手段、被分析物についてのクロマトグラフ
を記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムに
ついて、被分析物のピーク及びその出現時間（ｔｘ、こ
こでｔｘ＜ｔｂ２である）を検出する第１演算手段、そ
して、ｔｘからｔｂ２の間でクロマトグラム点の高さ、
傾き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数と
する関数を用いてベースライン点を検出し、ベースライ
ン点を通過しかつ時間軸に平行な直線をベースラインと
して設定する第２演算手段とを具備する前記装置。
【請求項６】前記関数がクロマトグラム点の高さ、傾
き、曲率及びｔｘとの差のうちの２以上の値を変数と
し、かつ、変数が小さいほど値の小さくなる又は変数が
大きいほど値の小さくなる関数であり、第２演算手段は
該関数の値が最も小さくなる点又は大きくなる点をベー
スライン点とすることを特徴とする請求項１〜５いずれ
かの装置。
【請求項７】前記関数がクロマトグラム点の高さ、傾
き、曲率及びｔｘとの差のうちの３以上の値を変数と
し、かつ、変数が小さいほど値の小さくなる又は変数が
大きいほど値の小さくなる関数であり、第２演算手段は
該記関数の値が最も小さくなる点又は大きくなる点をベ
ースライン点とすることを特徴とする請求項１〜５いず
れかの装置。
【請求項８】前記関数がクロマトグラム点の高さ、傾
き、曲率及びｔｘとの差の値を変数とし、かつ、変数が
小さいほど値の小さくなる又は変数が大きいほど値の小
さくなる関数であり、第２演算手段は該関数の値が最も
小さくなる点又は大きくなる点をベースライン点とする
ことを特徴とする請求項１〜３いずれかの装置。