JP4009737B2 - クロマトグラム用解析装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー、更には電気泳動等により複数種の被分析物を含む試料をカラム等の分離手段に供して取得されるクロマトグラムを解析する解析装置に関するものであり、特に測定する目的分析成分が予め定まっている場合に好適に用いられるクロマトグラム用解析装置に関するものである。このような例として、血液や尿中のカテコールアミンやアミノ酸の分析等が例示される。また、品質管理に使用される分析等が例示される。
【０００２】
【従来の技術】
クロマトグラフィー装置を用いて目的とする被分析物の濃度を測定するためには、まず被分析物を含む試料を液体クロマトグラフ装置、ガスクロマトグラフ装置又は電気泳動装置等に供して分離、検出し、クロマトグラムを取得する。次にクロマトグラムを解析することによりクロマトグラム中のピークがいずれの被分析物のピークであるかを同定する（以下、時として単にピークの同定ともいう）。そして最後に、同定されたピークのピーク高さやピーク面積を求め、既知量の被分析物を同様の条件下でクロマトグラフィーに供した時のピーク高さやピーク面積と比較して当該被分析物の定量等を行うのである。
【０００３】
従来のクロマトグラム解析は、ピークの同定に際して各被分析物のピークが出現すると予想される時間（標準ピーク出現時間；Ｔi）の前後をピーク検出開始時間及びピーク検出終了時間として設定し、このピーク検出範囲内でクロマトグラムの傾きが正から負へと変化する点やクロマトグラムがゼロに近い傾きから正の傾きをもって増加した後、負の傾きをもって再びゼロに近い傾きに減少するピーク等をピークとして検出し、各被分析物のピークと同定する方法や、前記ピーク検出範囲内のクロマトグラム最高点をピークとして検出し、各被分析物のピークとして同定する方法により行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ピークの同定は、従来、被分析物ピークの標準ピーク出現時間（Ｔi）とピーク検出開始時間からピーク検出終了時間までの時間巾（ΔＴi）を設定し、ＴiとΔＴiにより規定されるピーク検出範囲（通常はＴi−ΔＴi／２からＴi＋ΔＴi／２）の範囲に存在するピークを検出し、検出されたピークを該被分析物ピークと同定している。
【０００５】
ΔＴiは、複数種の被分析物についてピーク検出を行う場合、各ピーク検出のために設定されるピーク検出範囲同士が重複しないように、隣接して出現すると予想されるピーク同士の間隔以下に設定するのが普通である。
【０００６】
液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、電気泳動等で得られるクロマトグラムは、カラムやキャピラリ、溶離液組成やキャリアガス組成、流速等の内的要因と温度等の外的要因が一定であれば再現性は良好であり、同一被分析物ピークのピーク出現時間やピーク巾の変化は小さい。従って、これら要因が一定であれば予め設定したＴi前後に狭い範囲のΔＴiを設定しピークを検出すれば正しくピーク同定を行うことが可能である。
【０００７】
ところが実際のクロマトグラフィーでは、例えば液体クロマトグラフィーを例とすれば、温度、流速、溶離液組成を一定にすることは事実上不可能であり、またカラムにもロット間格差や経時変化が存在することから、同一の被分析物をクロマトグラフィに供した場合であってもクロマトグラムの形や位置は一定ではなく、実際のピーク出現時間は早まったり、逆に遅くなったりして被分析物用のピーク検出範囲から外れる場合がある。
【０００８】
このような場合には、従来の解析法では正しいピーク同定ができなくなり、信頼のおける測定を行うのは困難となる。このように実際のピーク出現時間が変動した場合でもピーク同定を実現するためにΔＴiを大きく（ピーク検出範囲を広く）したとしても、何らかの理由により被分析物ピークの実際の出現時間が想定した隣接ピーク出現時間との間隔の１／２以上ずれると正しいピーク同定ができないという課題があった。またΔＴiを大きくすると、ゴーストピーク（例えば液体クロマトグラフィーにおいて溶媒を切り替える際に出現する、被分析物に由来しないピーク）や夾雑物に由来するピーク等の妨害ピークを誤って被分析物のピークと同定したり、ピーク検出範囲に他の被分析物ピークが出現する可能性が大きくなるため、結局は正しいピーク同定を行うことは困難である。
【０００９】
従って本発明の目的は、クロマトグラムの形や位置が大きく変化し、実際の被分析物ピークがＴiと異なる時間に出現した場合でも、ゴーストピークや夾雑物ピークを誤って被分析物のピークと同定することなく、各被分析物ピークを正しく同定できるクロマトグラム用解析装置を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本願請求項１の発明（以下、第１発明という）は、ｎ種の被分析物（ｎは２以上の自然数）を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムを解析してｎ種の被分析物の各ピークを検出するクロマトグラム用解析装置であり、各ピークを検出するためのピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数であり、任意の一の検索セットと他の一の検索セットにおいて、ｎ種の被分析物のそれぞれに対して同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が互いに重複する）記憶する第１記憶手段、試料のクロマトグラムを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、各検索セットに含まれる各ｎ個の被分析物に対するピーク検出範囲においてピーク検出を行い、ピークが検出された場合には、該被分析物に検出されたピークを関係づけ、ピークが検出されない場合には、該被分析物にピークを関係づけないで、ｍ個の検索セット間で同一又は異なるピーク同定結果を得る第１演算手段、そして、第１演算手段により得られたｍ個のピーク同定結果から一の同定結果を選択する第２演算手段とを具備する装置である。
【００１１】
また本願請求項４の発明（以下、第２発明という）は、ｎ種の被分析物（ｎは３以上の自然数）を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムを解析してｎ種の被分析物の各ピークを検出するクロマトグラム用解析装置であり、各ピークを検出するためのピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数であり、任意の一の検索セットと他の一の検索セットにおいて、ｎ種の被分析物のそれぞれに対して同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が互いに重複する）を記憶する第１記憶手段、試料のクロマトグラムを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、各検索セットに含まれる各ｎ個のピーク検出範囲においてピーク検出を行い、ピークが検出された場合には、該被分析物に検出されたピークを関係づけ、ピークが検出されない場合には、該被分析物にピークを関係づけないで、ｍ個の検索セット間で同一又は異なるピーク同定結果を得る第１演算手段、そして、第１演算手段により得られたｍ個のピーク同定結果から一の同定結果を選択する第２演算手段とを具備する装置である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のクロマトグラム用解析装置は、試料中の被分析物を分離・展開した後に検出を行う、いわゆるクロマトグラフィーにより取得されたクロマトグラムを解析するために使用することができる。クロマトグラフィーは、分離・展開の原理によって種々の液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーが存在するが、解析対象となるクロマトグラムはいかなるクロマトグラフィーにより得られたものであっても良い。例えば電気泳動結果を適当な染色試薬で染色後、光学測定装置でスキャンニングする等した場合でも、その解析に本発明を使用することができる。更に本発明は、時間の概念を質量数の概念に置き換えることにより、マススペクトル用の解析装置等に適用することも可能である。以下本明細書においては、説明を容易にするために液体クロマトグラフィーにより取得されたクロマトグラムを解析するための装置について説明する。
【００１３】
従来の解析方法を実施するための装置は、ｎ種の被分析物ピークを同定する際、ピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲からなる１個の検索セットを使用するのみであるが、第１発明ではこのような検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数）使用する点、そしてこれらｍ個の検索セットのうち、一の検索セットと他の一の検索セットにおける、同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲の一部を互いに重複させるという特徴を有する。また更には、各検索セットに含まれるｎ個のピーク検出範囲の各々でピーク検出を行い、検出されたピークを各被分析物のピークと同定して各検索セット間で同一又は異なるｍ個のピーク同定結果を得、これらのピーク同定結果を評価して最も適当な同定結果を選択する点にも特徴を有する。ピーク検出において、ｎ個のピーク検出範囲のすべてに対してピークが検出されるわけではなく、ピークが検出されない場合もある。ピークが検出されない場合には、被分析物にピークの関係づけが存在しないというピーク同定結果になる。
【００１４】
一方第２発明は、ｎ種の被分析物（ｎは３以上の自然数）のピークを同定するに当たり、ｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数）使用する点、そしてこれらｍ個の検索セットのうち、一の検索セットと他の一の検索セットにおける、同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲の一部をそれぞれ互いに重複させるという特徴を有する。また更には、各検索セットに含まれるｎ個のピーク検出範囲の各々でピーク検出を行い、検出されたピークを各被分析物のピークと同定して各検索セット間で同一又は異なるｍ個のピーク同定結果を得、これらのピーク同定結果を評価して最も適当な同定結果を選択する点にも特徴を有する。第１発明と同様に、ピーク検出において、ｎ個のピーク検出範囲のすべてに対してピークが検出されるわけではなく、ピークが検出されない場合もある。ピークが検出されない場合には、被分析物にピークの関係づけが存在しないというピーク同定結果になる。
【００１５】
第１記憶手段は、ｎ種（ｎは、第１発明においては２以上の自然数、第２発明においては３以上の自然数である）の被分析物ピークを検出するためのｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットを記憶する手段であり、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成することができる。第１記憶手段が記憶する検索セットの数は、ｍ（ｍは２以上の自然数）である。各検索セットに含まれるピーク検出範囲は、ｎ種の被分析物の各ピークを検出するためｎ個であるが、同一の検索セットに含まれる、異なる被分析物のピーク検出用ピーク検出範囲は互いに重複しないように、例えばキーボード等の外部入力手段を用いて第１記憶手段に記憶させる。
【００１６】
第１記憶手段に記憶させる検索セット中の各ピーク検出範囲は、例えば既知量の各被分析物を含む標準試料をクロマトグラフィーに供して得たクロマトグラムから算出される、各ピーク出現時間（標準ピーク出現時間；Ｔi）に基づき設定することができる。測定は実際の測定と同一条件下で実施されることがより好ましいが、本発明においては必ずしも同一条件でなくともかまわない。即ち、標準ピーク出現時間に基づいて任意の検索セット中の各ピーク検出範囲を設定し、他の検索セットにおいてはこれとは異なるピーク検出範囲を設定し、第１記憶手段に記憶させるのである。例えば第１発明及び第２発明において、それぞれ、例えば後述する式に従ってＴiに基づき任意の検索セット中の各ピーク検出範囲を設定することが例示できる。ここで、各被分析物ピークの出現時間の間隔や、実際のピーク出現時間は、内的又は外的要因の変化により変動する。例えば溶媒組成や温度が一定条件下で液体クロマトグラフィーを実施する場合には、内的・外的要因が変化しても一分析を実行している間はほぼ一定と考えられるならば、ピーク出現時間の間隔やピーク出現時間の変動量はピーク出現時間に比例した値又は素通り成分の出現時間からピーク出現時間までの時間差に比例した値になる。また溶媒組成や温度にグラジエントをかけた場合やカラムスイッチなどで流路を切り替えた場合は、通常、ピーク出現時間の変動量はピーク毎に異なる。このような変動を考慮した上で、第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セットにおけるピーク検索範囲を設定する。
【００１７】
第１発明においては、より具体的に、同一種の被分析物ピークを検出するための、ｍ個の検索セットに含まれるｍ個のピーク検出範囲の中心は、実数Ａj（ｊ＝１〜ｍ、Ａj＜Ａj+1）に対してＴ1＋Ａj×ΔＴ1、Ｔ2＋Ａj×ΔＴ2、Ｔ3＋Ａj×ΔＴ3、・・、Ｔn＋Ａj×ΔＴnで与えられ、ここでＡj+1−Ａj＜１であるように設定することが例示できる。特定のピークのピーク出現時間が内的・外的要因によって他のピークと逆方向に移動する場合には、該ピークに対する実数ＡjはＡj＞Ａj+1であり、Ａj+1−Ａj＞−１となるように設定する。ΔＴiはピーク検出範囲の巾であり、正の値である。より具体的に、例えば２個の検索セットを設定する場合に、ピーク検出範囲の中心をＴi−ΔＴi／６及びＴi＋ΔＴi／６とすることが例示できる。また３個の検索セットを設定する場合に、ピーク検出範囲の中心をＴi−ΔＴi／２、Ｔi、Ｔi＋ΔＴi／２とすることが例示できる。５個の検索セットを設定する場合に、ピーク検出範囲の中心をＴi−ΔＴi、Ｔi−ΔＴi／２、Ｔi、Ｔi＋ΔＴi／２、Ｔi＋ΔＴiとすることが例示できる。ピーク検出範囲の中心とピーク検出範囲の巾が与えられた時、中心の前後、各ΔＴi／２を検出範囲とすればよい。
【００１８】
上記具体例は各検索セット中の、同一の被分析物のピークを検出するためのピーク検出範囲をΔＴi×２／３又はΔＴi／２づつ重複させる設定であるが、重複量は、一般的にはΔＴi／４からΔＴi×３／４程度の範囲で変更することができる。
【００１９】
第２発明においては、ｎ種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲の中心は、ａj×Ｔ1＋ｂj、ａj×Ｔ2＋ｂj、ａj×Ｔ3＋ｂj、・・、ａj×Ｔn＋ｂj（ただし、ｊ＝１〜ｍ）で与えられ、その前ΔＴi／２からその後ΔＴi／２を検出範囲とすることが例示できる。各ピーク検出範囲の中心の位置は、標準ピーク出現時間を時間ゼロを基準として伸縮させた後に平行にずらしたものであるが、標準ピーク出現時間を時間ゼロ以外の点を基準として伸縮させたものと等価である。
【００２０】
即ちａjとｂjの値を検索セット毎に変化させるのである。ただしいずれの検索セットにおいても、ａjは１に近い実数、ｂjはゼロを含む範囲から選ばれる実数である。
【００２１】
特にすべてのｊに対してａjが１のときに検索セットにおける各ピーク検出範囲の中心はＴ1＋ｂj、Ｔ2＋ｂj、Ｔ3＋ｂj、・・、Ｔn＋ｂjとなり、任意の検索セットにおける各ピーク検出範囲の中心の位置関係は他の検索セットで変動せず（相対的な位置関係を保持したまま）平行にずれるのみとなる。特にすべてのｊに対してｂjがゼロの時には他の検出セットにおける各ピーク検出範囲の中心はａj×Ｔ1、ａj×Ｔ2、ａj×Ｔ3、・・、ａj×Ｔnとなり、任意の検索セットにおける各ピーク検出範囲の中心の位置関係は他の検索セットでは相対的な位置関係を保持したまま時間ゼロを基準にして伸縮するのみとなる。このように、第２発明においては、被分析物のピーク出現時間の位置関係が保持されたまま、平行にずれて出現し、伸縮して出現し、又は伸縮した上で平行にずれて（＝時間ゼロ以外の点を基準として伸縮して）出現した場合に備えて検索セット中のピーク検出範囲を設定する。
【００２２】
係数ａjは、通常は０．７〜１．３程度の範囲の値とすることが好ましく、特に好ましくは０．８〜１．２程度の値である。一方係数ｂmは、通常は全ピークが溶出される時間の１０〜１５％程度の値とすることが好ましい。
【００２３】
係数ａjとｂjの設定についてさらに好ましい具体的例をあげて説明する。
【００２４】
クロマトグラムが唯一の要因により変動する場合には、一般に時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準として伸縮すると考えられるので、各ピーク検出範囲の中心を （１＋ｐ（ｊ−（ｍ＋１）／２））（Ｔi−ｒ）＋ｒ（ただし、ｐ、ｑは実数、ｊ＝１〜ｍ）と表わすことができる。この時、係数ａjとｂjはａj＝１＋ｐ （ｊ−（ｍ＋１）／２）、ｂj＝ｐ（ｊ−（ｍ＋１）／２）（−ｒ）となる。
【００２５】
クロマトグラムが二つの要因により変動する場合には、一般に時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準として伸縮した上で、時間ゼロ以外の一点（ｓ）を基準として伸縮すると考えられるので、各ピーク検出範囲の中心を（１＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２））（（１＋ｐ（ｔ−（ｍ1＋１）／２））（Ｔi−ｒ）＋ｒ−ｓ）＋ｓ（ただし、ｐ、ｑは実数、ｔ＝１〜ｍ1、ｕ＝１〜ｍ2）と表わすことができる。ここで、ｍ＝ｍ1×ｍ2、ｊ＝（ｔ−１）×ｍ2＋ｕとおけば、ｊ＝１〜ｍの整数となり、係数ａjとｂjはａj＝（１＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２）） （１＋ｐ（ｔ−（ｍ1＋１）／２））、ｂj＝（１＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２））ｐ（ｔ−（ｍ1＋１）／２）（−ｒ）＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２）（−ｓ）となる。
【００２６】
クロマトグラムが３つの要因で変動する場合には、一般に時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準として伸縮した上で、時間ゼロ以外の一点（ｓ）を基準として伸縮し、さらに第３の時間ゼロ以外の一点を基準として伸縮すると考えられるが、第３の時間ゼロ以外の一点を基準とした伸縮は第１の点（ｒ）と第２の点（ｓ）を基準とした伸縮の組み合わせで表現することが可能である。したがって、３つの要因から、クロマトグラムに与える影響が大きい要因を２つ取出し、２つの要因により変動する場合と同じように係数ａjとｂjを設定することができる。第３の要因による変動の大きさが第１と第２の要因による変動の大きさに比例して十分に小さいといえない場合は、第３の要因による変動を第１及び第２の要因を組み合わせて表現できるように全体としての検索範囲を広くすることが好ましい。例えば、パラメータｐ、ｑ及びｍ1、ｍ2を第３の要因を考慮して大きめの値に設定することが好ましい。
【００２７】
クロマトグラムが４つ以上の要因で変動する場合には、３つの要因で変動する場合と同じで、クロマトグラムに与える影響が大きい要因を２つ取出し、２つの要因により変動する場合と同じように係数ａjとｂjを設定することができる。 第１発明及び第２発明において、ピーク検出範囲の巾ΔＴiは、各隣接して出現するピークの標準ピーク出現時間の差（Ｔi+1−Ｔi又はＴi−Ｔi-1の差）より小さくなるようにΔＴi＝α×Ｔi＋β（α、βは係数）とすることが例示できる。内的・外的要因による各ピーク出現時間の変動量がピーク出現時間に比例する場合にはΔＴi＝α×Ｔiとすることができる。内的・外的要因による各ピーク出現時間の変動量がほぼ同じ大きさである場合やほぼ同じ時間に出現する複数のピークを扱う場合にはΔＴi＝βとすることができる。また、隣接するピーク間隔が比較的狭い場合には、全検索セット中の各ピーク検出範囲の巾ΔＴiを、可能な限り小さい値とすることが例示できる。内的・外的要因による各ピーク出現時間の変動が時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準とした伸縮で表わすことができる場合には、ΔＴiを小さくして検索セットの数を多くし、全体としての検索範囲を広くすることができる。一方、ピークの間隔が十分に広い場合又は各ピーク出現時間が不規則に変動する場合には、ΔＴiを大きくし、検索セットの数を少なくすることが例示できる。第１演算手段が十分な処理能力を有する場合には、多数の検索セットを設定して、ΔＴiをピーク出現時間の自然な変動の大きさの数倍程度の大きさまで小さくすることが特に好ましい。ここで自然な変動とは、内的・外的環境を一定の条件に保持した場合でも避けられないピーク出現時間の変動を意味する。ΔＴiを小さくすることにより、一つのピーク検出範囲に二つ以上のピークが含まれることを防止することができ、評価関数による選択と組合せることにより、夾雑物ピークやゴーストピークによる同定ミスを避けることができるからである。
【００２８】
検索セットの数、検出範囲の巾は、被分析物のピーク出現時間が変動すると予想される範囲を勘案のうえ決定する。全体としての検索範囲を一定とした場合、各検索セットにおけるピーク検出範囲を仮に同一の小さな値とすると、検索セット数は多くなる。各検索セット間でのピーク検出範囲の重複を大きくとった場合も同様である。例えば第２発明を用いて液体クロマトグラフィーによりノルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパミン（ＤＡ）を分離後、そのクロマトグラムを分析する場合には、本発明者の知見では、変動要因１つ当たり５〜２１程度、変動要因が２つ以上の時は５×５〜２１×２１程度の検索セットを設定し、各検索セットに対してＮＥ、Ｅ、ＤＡの各被分析物のピーク検出範囲を設定し（各検索範囲のΔＴiは５〜３０秒程度である）、標準試料のクロマトグラムにおいては全ピーク検索セットにより、流量要因と温度要因に対してそれぞれ、ＮＥについては２．１分と０．９分、Ｅについては２．７分と１．６分、ＤＡについては４．６分と４．２分の範囲をカバーすることが好ましい具体例として例示できる。また、未知試料のクロマトグラムにおいては全ピーク検索セットにより、流量要因と温度要因に対してそれぞれ、ＮＥについては０．４分と０．７分、Ｅについては０．５分と１．２分、ＤＡについては０．９分と３．２分の範囲をカバーすることが好ましい具体例として例示できる。
【００２９】
なお検索セット中の各ピーク検出範囲のΔＴiは同一である必要がなく、通常、被分析物毎に異なる値を設定する。また、異なる検索セット中の同一の被分析物に対するピーク検出範囲についてもΔＴiを同一とする必要はない。たとえば、ｋ番目のピーク検索セットにおいてΔＴi＝αk×Ｔi＋βk（αk，βkは係数）としてもよい。
【００３０】
以上のように、第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セット中には、同一種の被分析物ピークを検出するためのｍ個のピーク検出範囲が含まれるが、クロマトグラムに変動が生じた場合であっても、通常、ピーク検出範囲の中心の時間（又はピーク検出開始時間とピーク検出終了時間）が異なる少なくとも１つのピーク検出範囲においてピーク同定が可能となる。
【００３１】
本発明における第２記憶手段は、解析するクロマトグラムを記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成でき、例えば液体クロマトグラフィーにおける検出装置からの検出信号を経時的に記憶できれば良い。また第２記憶手段は前記第１記憶手段と一体に構成することもできる。なお、該経時的記憶は連続的なものであっても良いし、例えば１秒毎等の、間欠的なものであっても良い。間欠的にクロマトグラムを記憶する場合には、ピーク巾に比較して十分に短い時間間隔で値を記憶することが好ましい。なお、時間は、例えば分離カラム等の分離手段に試料を供した時間を０（ゼロ）として記憶しても良いし、試料を供した時間から所定の時間経過した後に検出信号の記憶を開始する場合には該時間を０（ゼロ）として記憶しても良い。電気泳動の結果をスキャンする場合には、移動距離を時間に置き換えて考えれば良い。
【００３２】
ここで第２記憶手段は、第１演算手段による各被分析物のピーク同定に先立ち、記憶したクロマトグラムについて、例えば単純移動平均、多項式フィッティング、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるスムージング処理を行ったり、単純スパイク除去処理、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるスパイクノイズ除去処理を行うものであっても良い。もちろんスパイクノイズ処理を行ってからスムージング処理を行うこともできる。これらの処理を行うことにより、ノイズを除去しておけば、クロマトグラムから得られる被分析物ピークの最高値や最低値が正確になり、より信頼性の高い解析結果を得ることができる。むろん、第２記憶手段に代えて第１演算手段で上記のようなクロマトグラムの処理を行うように構成することもできる。
【００３３】
単純移動平均はＹn＝Ｓｕｍ（Ｘi）／ｍで表され（Ｓｕｍは連続するデータＸiを加算する関数であり、ｍは加算するデータの数である）、多項式フィッティングはＹn＝Ｓｕｍ（Ｋi×Ｘi）／Ｓｕｍ（Ｋi）で表され（Ｓｕｍ及びＸiは前記同様であり、Ｋiは例えばＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法により、データを２次式又は３次式にフィッティングするように決定される係数である）、フーリエ変換によるスムージング処理はデータをフーリエ変換して周波数軸で高周波成分をカットするウィンドウ関数をかけ、逆フーリエ変換で時間軸に戻すことをいい、ウェーブレット変換によるスムージング処理とスパイクノイズ除去処理は例えばＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６９巻、１号、１９９７年、第７８〜９０頁に記載された処理であり、単純スパイク除去処理としてはメディアン法（Ｙ＝Ｍｅｄｉａｎ（Ｘi）で表される、連続する３ないし５のデータの中心を取る方法）等が例示できる。
【００３４】
第１演算手段は、前記第１記憶手段が記憶したｍ個の検索セット毎に、各被分析物のピークを同定する手段であり、コンピュータ等を用いて構成することができる。各被分析物のピーク同定は、検索セットに含まれる各被分析物ピークを検出するためのピーク検出範囲においてピークを検出し、各検索セット毎のピーク同定結果を第２演算手段に出力する。即ち、例えばｎ＝３でｍ＝３である場合、第１〜第３の検索セットのそれぞれが第１〜第３の被分析物のピーク同定結果を含む。むろん、ピーク検出範囲でピークが検出されないことも起こり得る。したがって、ｎ＝３である場合には、各ピーク同定結果に、３又は２以下の被分析物とピークの関係づけが含まれる。
【００３５】
第１演算手段による各ピーク検出範囲でのピーク検出は、従来のクロマトグラム検出方法でのピーク検出と同様にすれば良い。具体的に例えば、（１）各ピーク検出範囲でクロマトグラムの傾きが正から負へと変化するクロマトグラム点を含むピークを検出し、（２）各ピーク検出範囲でクロマトグラムがゼロに近い傾きから正の傾きをもって増加した後、負の傾きをもって再びゼロに近い傾きに減少するピークを検出し、又は、（３）各ピーク検出範囲でのクロマトグラム最高点をピークとして検出するように第１演算手段を構成することが例示できる。第１演算手段を（１）又は（２）のように構成すると、ピーク検出範囲内で複数のピークが検出され得るが、この場合には検出された複数のピークの中で最高のクロマトグラム点を含むピークを選択し、又は、面積が最大のピークを選択するように構成すれば良い。また（１）又は（２）の構成では、各ピーク検出範囲毎にピーク検出を行う代わりに、予め全てのピークを検出し、その属性を求め、続いて各ピーク検出範囲毎にその範囲に出現したピークを予め検出されたピークの中から選択することもできる。
【００３６】
なお、第１演算手段を（３）のように構成した場合であって、検出されたクロマトグラム最高点がピーク検出範囲の端に位置するときは、これをピークとして検出しないように第１演算手段を構成することが好ましい。
【００３７】
第２演算手段は、第１演算手段によるピーク同定結果を検索セット毎に評価し、その中から１の同定結果を選択するものである。ここで評価とは、ｍ個の被分析物ピーク同定結果について、それぞれ同定されたピークが真に被分析物に由来するピークであるか否かを判定することを意味する。第２演算手段はコンピュータ等を用いて構成することができ、第１演算手段と兼用としても良い。また第２演算手段は、単にｍ個のピーク同定結果から１の同定結果を選択することに留まらず、例えば各同定された各被分析物ピークについて更に解析を行い、ピーク高さ又はピーク面積を既知濃度の被分析物を含む試料のクロマトグラム解析結果と比較する等してその定量を行うように構成することもできる。
【００３８】
第１演算手段と第２演算手段の間にさらに第３演算手段を設けることができる。第３演算手段は第１演算手段によるピーク同定結果を入力とし、同定結果について各被分析物ピークが適正かどうかを判定し、適正でない場合には被分析物とピークの関係づけを削除する。このように第３演算手段で処理されたピーク同定結果が第２演算手段に与えられる。
【００３９】
第３演算手段における被分析物ピークの判定は、例えば、各被分析物ピークの属性を数値化した基準を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピーク属性を数値化した後、前記基準と比較し、該基準値を満たさない同定結果を除外することにより実行されるようにすることが例示される。比較は一種のピーク属性に基づいて行うこともできるが、複数のピーク属性に基づいて行うこともできる。 この構成におけるピーク属性を数値化した基準値としては、各被分析物のピーク出現時間、ピーク巾、ピーク高さ、ピーク面積から選ばれる１以上の基準値を例示できる。複数のピーク属性の基準値を用いる例として、ピーク巾とピーク高さを基準値とすることもできる。
【００４０】
基準値は予め各被分析物を含む標準試料についてのクロマトグラムに基づいて設定されるが、ピーク巾、ピーク高さ、ピーク面積等の変動要因である内的・外的要因は刻々と変化することから、例えば一定時間毎に標準試料についてのクロマトグラムを取得し、第３演算回路が使用する基準値を更新することが好ましい。なおピーク高さ等を求めるためには、各ピーク毎にベースラインを設定等し、ベースラインから該点までの距離を求める等すれば良い。
【００４１】
より具体的に、第３演算手段は、例えばピーク巾を基準値として使用するのであれば、半値巾（ピーク高さの１／２の高さにおけるピーク巾）、１／５値巾 （ピーク高さの１／５の高さにおけるピーク巾）、１／１０値巾（ピーク高さの１／１０の高さにおけるピーク巾）等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらの基準値を用い、第１演算手段で検出されたピークの属性を数値化した値を同定された被分析物のピーク基準値と比較し、該値が該基準値と大きく異なる場合にはゴーストピークや夾雑物に由来するピークと判定して被分析物とピークの関係づけを削除する。該値が該基準値と大きく異なる場合として、例えば該値が基準値のプラスマイナス４０％の範囲内に収まらない場合や、ピーク巾の上限及び下限として設定された値の範囲に含まれない場合等を例示することができる。
【００４２】
本発明のクロマトグラム用解析装置では、第３演算手段において、既知の被分析物を含む標準試料についてのクロマトグラム解析に用いるピーク巾等の基準値と、被分析物を含むか否かさえ不明の試料についてのクロマトグラム解析に用いるピーク巾等の基準値として、異なる値を基準値とすることもできる。ここでいう標準試料とは、例えば被分析物を含む（又は含むと予想される）試料を液体クロマトグラフィー等に供するに先立ち、一定時間経過毎に供される、既知濃度の被分析物を含む試料を意味する。つまり、標準試料のクロマトグラムを解析するに当たり、別の装置を使用するか、又は以前に同じ装置で取得した標準試料のクロマトグラムにおけるピーク出現時間やピーク巾を基準値として使用し、以後の被分析物を含む試料のクロマトグラム解析に当たっては、この新たに取得された標準試料のクロマトグラムにおけるピーク出現時間やピーク巾を基準値として使用するのである。
【００４３】
基準値として例示したピーク出現時間、ピーク巾、ピーク高さ、ピーク面積の中で、ピーク巾とピーク高さ又はピーク面積を基準値として使用することが特に好ましい。またピーク巾の中では、ピークの重なりの影響を受けにくいことから、半値巾を使用することが特に好ましい。標準試料のクロマトグラム解析ではピーク巾とピーク高さをピーク巾とピーク高さの基準値と比較することにより判定することができる。一方、未知試料の場合には、ピーク巾については標準試料と同じように判定できるが、含まれている被分析物濃度（もし含まれていればであるが）により、クロマトグラムのピーク高さや面積が異なるので、クロマトグラムのノイズの大きさに応じてピーク高さ又はピーク面積の基準値を設定し、該基準値以下のピークをノイズによるピークであると判定し、被分析物とピークとの関係づけを削除することが好ましい。
【００４４】
夾雑物に由来するピークが出現すると予想される試料のクロマトグラム解析においては、検索セットに含まれるピーク検出範囲の巾を狭くして被分析物ピーク検出を行うことが好ましいが、これと共にピーク巾等の基準値を厳密に設定することが好ましい。この目的を達成するためには、既知濃度の被分析物を含む標準試料を一定時間毎にクロマトグラフィーに供してクロマトグラムを得、該クロマトグラムからこれら基準値を求めて第３演算手段が使用する基準値を随時更新することが特に好ましい。いずれにせよ、外的要因が変化した場合には、前記標準試料のクロマトグラムを広いピーク検出範囲又はピーク巾等の緩やかな基準で解析し、ピークの出現時間とピーク巾を求めたうえで、試料のクロマトグラムを狭いピーク検出範囲又はピーク巾等のきつい基準値で解析するようにすることが好ましい。
【００４５】
第２演算手段においてｍ個の検索セットによるｍ個の同定結果を評価し、１個の同定結果を選択するためには、被分析物のピーク属性等を組合せて用いることができる。評価は評価内容を評価関数で表現し、評価関数の関数値の大小で評価することが好ましい。また例えば、（１）関係づけられた被分析物の数を関数値として出力する関数を用い、該関数の結果に基づき実行されるようにしたり、 （２）関係づけられた被分析物ピークの数、及び各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差のうち１以上の値を変数とする評価関数を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピークによって得られた値を該評価関数に代入して得られる結果に基づき実行されるようにしたり、又は、（３）関係づけられた被分析物ピークの数、及び各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積の均一性、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差のうち１以上の値を変数とする評価関数を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピークによって得られた値を該評価関数に代入して得られる結果に基づき実行されるように第２演算手段を構成することが例示できる。相関の指標としては、ピーク出現時間の標準値と検出されたピーク検出時間の相関係数、ピーク出現時間の標準値と検出されたピーク出現時間の間の回帰直線からの誤差の絶対値の最大値、誤差の絶対値の平均値、回帰直線からの誤差の分散又は標準偏差などを使うことができる。
【００４６】
（２）及び（３）において同じ評価内容に対して、評価関数を単一の評価関数で表現することも複数の評価関数の組み合わせで表現することも可能である。後者の場合には、複数の評価関数で表現し、複数回繰返して評価することもできる。より具体的には、被分析物ピークの数とピーク高さの均一性を変数とする関数を用いて評価してもよいし、被分析物ピークの数を変数とする関数を用いて評価して被分析物ピークの数が最大となる同定結果を選択した後で、選択された同定結果をピーク高さの均一性を変数とする関数を用いて評価してもよい。
【００４７】
上記（１）の評価関数の例として、各検索セット中で被分析物ピークであると判定されたピークの数を関数値として出力する関数を例示することができる。そして、関数が最大値をとる検索セットを選択する。被分析物ピークであると評価されるピーク数は最大ｎであるが、被分析物ピークであると評価されたピーク数がｎである検索セットが複数存在する場合には、単に、先に評価した結果を選択することが例示できる。第２演算手段において、上記（１）のように被分析物ピークの数だけで評価することは、夾雑物ピークやゴーストピークが被分析物ピークの近くに出現しない場合に有効である。これに対し、例えば血漿や尿等の試料のカテコールアミン分析のように、夾雑物ピークやゴーストピークが被分析物ピークの近くに出現する場合等には、第２演算手段において前記（２）又は（３）のようにピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差等を変数とする評価関数を用いることが好ましい。
【００４８】
全検索セットにおいて被分析物ピークであると評価されたピーク数が０である場合には、検索セットの設定にもよるが、試料に被分析物が含まれていない、クロマトグラムが何らかの外的・内的要因により解析不能となるほど変動している、という理由が考えられる。従ってこのような場合には、第２演算手段と連絡する出力手段を設け、評価結果とともにこのようなアラートを表示することが好ましい。第２演算手段は、このような評価結果を出力するため、ディスプレイ装置又はプリンタ等の出力装置と連絡していることが好ましい。また、全検索セットにおいて被分析物ピークであると評価されたピーク数がｎ以下である場合には、ｎ種の被分析物のうち一以上の被分析物について上記同様のことが考えられる。
【００４９】
評価関数としては、各被分析物ピーク数、各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積に関する評価関数や、各被分析物ピーク数、各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積の均一性に関する評価関数を例示できる。関係づけられない被分析物ピークの扱いについては、各被分析物ピーク数を評価関数の変数とし関係づけられた被分析物ピークに関する変数だけを評価関数に代入することも、また、関係づけられない被分析物ピークには適当な値を割り付けて全被分析物ピークに関する値を評価関数に代入することもできる。この時の適当な値としては、第３演算手段で用いたピーク巾やピーク高さの限界値などを選択することができる。例えば既知濃度の被分析物を含む標準試料のクロマトグラム解析用評価関数としては、各被分析物ピーク数に加えて、標準試料のクロマトグラムでは各被分析物ピークの巾がある程度予想可能であること、各ピークの高さ又は面積が大きく、しかも各ピークの高さ又は面積の値が同じオーダの値であること等を総合的に考慮して、これらの要素を単一又は組み合わせて評価する関数を使用することが好ましい。単一の要素を用いる場合、ピーク巾を用いることが好ましいが、特にピークの重なりの影響を受けにくい半値巾が好ましい。また、２以上の要素を用いる場合には、優先される要素を決定しておくこともできる。
【００５０】
第２演算手段において、各ピークの高さ又は面積が大きく、しかも各ピークの高さ又は面積の値が同じオーダの値であることから評価を行うためには、例えば、ｉ番目に出現したピークの高さ又は面積の値をＸiとすれば（Ｘ1・Ｘ2・・・Ｘn）×（（ｍｉｎ（Ｘ）／ｍａｘ（Ｘ））ｐ（ｐは１を超える値）という評価関数を使用することが例示できる。従って、全成分数が３の時に、Ｘiを小さい順にＸmin、Ｘmid、Ｘmaxとし、ｐを２とすると評価関数はＸmin 3×Ｘmid／Ｘmaxとなる。また、ｐを３とすると評価関数はＸmin 4×Ｘmid／Ｘmax 2となる。なお、評価関数としてここに例示した関数を累乗した関数を用いても評価関数が最大となるピーク検索セットは同一であり、同じ効果が得られる。また、例えば既知濃度の被分析物を含む標準試料のクロマトグラムにおいて、ピークの高さ又は面積が検出感度の差異等により各被分析物のピークによって大きく異なることが予想される場合には、ピークの高さ又は面積の値に係数をかけ、ほぼ一定の値に変換してから上記評価関数による評価を行うことが好ましい。
【００５１】
未知濃度の被分析物を含む複数の試料についてのクロマトグラム解析では、各試料に含まれる同一種の被分析物濃度が同じオーダであることが分かっている場合には、上記説明したような評価関数を用いてクロマトグラム解析を行うことができる。一方、被分析物濃度が試料により数１０倍以上まで変化する場合には、上記した評価関数を用いることは困難となるが、ピーク巾や被分析物の予想される濃度範囲から推定されるピークの高さ又はピーク面積の取り得る値の範囲等を考慮して解析を行うことができる。
【００５２】
第２演算手段において評価関数を用いてｍ個の検索セットによるｍ個の同定結果を評価し、１個の評価結果を選択するためには、関係づけられた被分析物ピークの数、及び被分析物ピークに関する１以上の値を変数とする前記（２）又は （３）の評価関数が最大となる検索セットにおける同定結果を選択すれば良い。また先に、ピークが検出されたピーク検出範囲数の数により第１の評価関数を用いて評価を行っておき、次に第２の評価関数を用いる評価を行って最終的に１の同定結果を選択することもできる。
【００５３】
本発明のクロマトグラム用解析装置を用いてクロマトグラムを解析するに当たっては、クロマトグラム全体を一度に解析する以外に、例えばクロマトグラムを標準的なピーク出現時間や被分析物の溶出挙動により、複数の、１以上のピークを含む群に分割したうえで２以上のピークを含む群に対して本発明を適用することもできる。ピーク出現時間による分割は、クロマトグラム中のピーク数が多い場合やピーク出現時間の変動量が比較的出現時間の早い被分析物と遅い被分析物の間で良好に相関しない場合には、特に有効である。被分析物の溶出挙動による分割は、酸性物質と中性物質と塩基性物質に分割したり、親水性物質と疎水性物質に分割する例が例示できる。このような例としてはアミノ酸分析などが例示できる。
【００５４】
本発明の解析装置は、例えばコンピュータ等の単一装置で構成することができる。この場合、複数の第１記憶手段を構成しておき、被分析物の種類によって適宜適当な手段を選択使用するように構成したり、第２演算手段及び第３演算手段が使用する評価又は判定用の基準値や評価関数を複数設定しておき、適宜適当なものを選択使用するように構成することができる。
【００５５】
また、これまでに説明した各手段に加え、例えば解析結果を表示したり印刷する出力手段や被分析物のピークを検出できなかった場合にアラートを発生する手段等を装備することもできる。
【００５６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
図１は、本発明を液体クロマトグラフィー用のクロマトグラム解析装置に適用した一例を示すものである。図中、１は分離カラム、２は検出器を示し、送液ポンプや試料導入装置等のその他のクロマトグラフィー装置は省略した。
【００５８】
図中、点線で囲った部分が本発明の解析装置であり、一台のコンピュータにより各手段を構成してある。図中、３は第１記憶手段、４は第２記憶手段、５は第１演算手段、６は第２演算手段である。第３演算手段を追加する場合には、第１演算手段と第２演算手段の間に配置すれば良い。第１記憶手段３はキーボード７からの入力を記憶し、第２記憶手段４は検出器２からの出力（クロマトグラム）を記憶し、第１演算手段５は第１及び第２の記憶手段と連絡され、そして第２演算手段は第１演算手段と連絡されている。また第２演算手段６は、クロマトグラム解析結果をプリンタ８に出力する。
【００５９】
図２は、以下の実施例で用いた液体クロマトグラム装置の構成の概略を示すものである。該装置は、溶離液ポンプ９ａ、９ｂ、試薬ポンプ１０ａ、１０ｂ、オートサンプラ１１、２本の前処理カラム１２及び１３と１本の分析カラム１４、リアクタ１５、そして蛍光検出器１６から構成され、さらに溶離液を切り替えるバルブや流路を切り替えるバルブを有するものである。図１に示した本発明の解析装置は、検出器１６と連結される。
【００６０】
図３は、高速液体クロマトグラフィーにノルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパミン（ＤＡ）を各１ｐｇ／ｍｌ含む標準試料を供して得られたクロマトグラムを模式的に示す図である。図中、「×」を付したピークは、装置中の溶離液や流路切り替えバルブを切り替えた際に発生した、前記被分析物に由来しないゴーストピークである。液体クロマトグラフィー装置としては、前処理カラムとして２本のカラム（第１の前処理カラム１２は直径４．６ｍｍ×７５ｍｍの逆相（エーテルゲル）カラム、第２の前処理カラム１３は直径３．０ｍｍ×６０ｍｍのイオン交換カラム）、分離カラム１４として逆相（ＯＤＳ）用カラム（直径４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）を配置した装置を用いた。この装置では、ポンプ９ａで溶離液（リン酸緩衝液（ｐＨ７））で試料を第１の前処理用カラムに送液し（１．０ｍｌ／分）、第１の前処理用カラムに保持された成分に対して、電磁弁を切り替えることによりポンプ９ａで溶離液（硝酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルの混合液）を送液して第２の前処理用カラムに導入し、そして第２の前処理用カラムに保持された成分に対して、ポンプ９ｂで溶離液（硝酸アンモニウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７））を分析カラムに送液して分離し（０．７ｍｌ／分）、分析カラムから溶出する成分に蛍光反応試薬を混合した後にリアクタ１５に導入した。リアクタで蛍光反応試薬であるＤＰＥ（Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）と９０℃、３分間反応させて蛍光誘導体化した。蛍光反応試薬はポンプ１０ａとポンプ１０ｂ（各０．２５ｍｌ／分）を用いて送液した。蛍光誘導体化した各被分析物は、蛍光検出器を用いて励起波長３４０〜３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定し、クロマトグラムを得た。
【００６１】
図４は、ＮＥ、Ｅ及びＤＡを含む試料のクロマトグラムを解析する例について説明するための図であり、前記標準試料のクロマトグラムからＮＥ、Ｅ、ＤＡそれぞれのピーク出現時間１、２又は３を求め、ＮＥとＥについては１と２の時間差の８０％のピーク検出範囲巾（ΔＴi）を設定し、ＤＡについては、ＤＡのピーク付近に他のピークが存在しないことから、他の検出範囲巾の２倍とした。ＮＥについてのピーク検出開始時間は１の前ΔＴi／２から１の後ΔＴi／２であり、Ｅについてのピーク検出開始時間は２の前ΔＴi／２から２の後ΔＴi／２、そしてＤＡについてのピーク検出範囲は３の前ΔＴi／２から３の後ΔＴi／２である。
【００６２】
図４の例では、実際のクロマトグラムにおけるＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク出現時間が、外部環境温度の変化により、標準試料におけるピーク出現時間１、２又は３からそれぞれ点線の位置にずれて（遅れて）いるが、ずれの巾が小さいため、各ピーク検出範囲内でクロマトグラムの最高点を探し、該点を含むピークを検出することにより、各ピークの同定を正しく行える。
【００６３】
図５では、実際のクロマトグラムにおけるＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク出現時間が１、２及び３からそれぞれ点線の位置にずれて（遅れて）いるが、ずれの巾がピーク間隔よりは小さいにもかかわらず、Ｅ及びＤＡのピーク検出範囲に実際のピークが入らないため、正しいピーク検出ができない例を示すものである。
【００６４】
図６は、第１発明の第１記憶手段に記憶させる検索セットの一例、及び、第２演算手段における同定結果の選択について説明するための図である。本例では、それぞれＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク検出範囲を含む３つの検索セットを記憶させる例を示している。また解析対象のクロマトグラムは、図５に示したクロマトグラムである。
【００６５】
ＮＥとＥのピーク検索巾ΔＴiは、図４と同様にＮＥとＥのピーク出現時間１と２の時間差の８０％に設定してある。ＤＡについては、ＤＡのピーク付近に他のピークが存在しないことから、他の検出範囲巾の２倍とした。標準試料におけるＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク出現時間をそれぞれ１、２又は３とすると、第１の検索セットに含まれる各ピーク検出開始時間は、ＮＥ；１−ΔＴi、Ｅ；２−Ｔi、ＤＡ；３−Ｔiであり、第２の検索セットに含まれる各ピーク検出開始時間は、ＮＥ；１−ΔＴi／２、Ｅ；２−Ｔi／２、ＤＡ；３−Ｔi／２であり、第３の検索セットに含まれる各ピーク検出開始時間は、ＮＥ；１、Ｅ；２、ＤＡ；３である。
【００６６】
第１演算手段では、各ピーク検出範囲の中でクロマトグラムの最高点を探し、該点を含むピークを検出する。そして、ＮＥのピークを検出するためのピーク検出範囲で検出されたピークはＮＥのピークと、Ｅのピークを検出するためのピーク検出範囲で検出されたピークはＥのピークと、ＤＡのピークを検出するためのピーク検出範囲で検出されたピークはＤＡのピークと同定する。
【００６７】
第３演算手段では、第１演算手段で同定されたピークについてベースラインを設定し、ベースラインと該最高点との距離をピーク高さとする。次いで、ベースラインからピーク高さの１／２となる点を求め、半値巾を求める。一方、図３における標準試料のクロマトグラムからＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク半値巾を計算して基準値とし、前記のように求めた巾と比較した。第３演算手段におけるこれら半値巾等の比較は、１のピークについて半値巾を基準値と比較して、プラスマイナス４０％の巾に収まらない場合には被分析物ピークとして同定したピークは正しいピークでないと判定する。同定結果の中で前記比較により異常と判定されたものはなかった。
【００６８】
第２演算手段では、先に第１の評価関数で関係づけられた被分析物ピークの数で評価し、全ての被分析物ピークが同定された検索セットについてだけ、第２の評価関数で評価を行うように構成した。本例では、第１検索セットにおいてＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク検出ができず、第３検索セットにおいてＥ及びＤＡのピーク検出ができなかったため、第２演算手段により被検出物ピークの数で評価し、第３検索セットが選択されたが、実際、第２演算手段は、２個以上の検索セットが除外されずに残った場合に、これらの中から１の検索セットを選択するため、再度、評価関数を用いる評価を行うように構成してある。
【００６９】
評価関数による評価は、同定されたＮＥ、Ｅ、ＤＡのピーク高さのうち、最大の値をＸmax、最小の値をＸmin、真中の値をＸmidとし、Ｘmin 4×Ｘmid／Ｘmax 2との評価関数に代入して行った。なお例えば、ベースラインとクロマトグラムの距離を１／１０値巾の範囲で積算した値をピーク面積として上記式を適用することも可能である。
【００７０】
図７は、図６で説明した検索セット等を用いて、他のクロマトグラムを解析する様子について説明するための図である。第３演算手段における基準値との比較により、第３検索セットでは、Ｅのピーク検出範囲で検出され、Ｅのピークであると同定されたピークの巾はピーク巾の基準値とほぼ同等であり、正常と評価された。第３検索セットでは、ＤＡのピーク検出範囲ではピークが検出されなかった。第１のピーク検索セットと第２のピーク検索セットでは、ＮＥのピークであると同定されたピークの巾が基準値のプラスマイナス４０％以内に収まり正常と判定された。
【００７１】
第１検索セットを除外した後、第２検索セットと第３検索セットについて評価関数を用いて評価したが、評価結果は一致したため、第２演算手段は、評価結果が同等である場合には先に評価した結果を優先させるという基準に基づいて第２検索セットの同定結果を選択した。なお、本例において第２検索セットと第３検索セットは同等の同定結果となっているので、どちらを選択しても同じである。実際、少なくとも１つの検索セットの各ピーク検出範囲は他の検索セットの対応するピーク検出範囲と一部が重なっているので、まったく同一の同定結果が複数の検索セットで得られることが生じる。
【００７２】
図８は、図６で説明した検索セット等を用いて、外部環境が異なる条件下で取得した他のクロマトグラムを解析する様子について説明するための図である。
【００７３】
図８において、第３検索セットにおけるＥのピーク検出範囲で検出されたピークは、夾雑物のピークである。また第３検索セットにおけるＤＡのピーク検出範囲で検出されたピークは、実際にはゴーストピークである。ここで、該ゴーストピークのピーク巾がＤＡのピーク巾と近似している場合、ピーク巾に関する判定基準のみを用いて判定するとゴーストピークをＤＡのピークと同定することは正しいと判定してしまう。しかし、本発明の第２演算手段では、ＤＡのピークと同定されたゴーストピークのピーク高さがＮＥやＥのピークと同定されたピークのピーク高さよりはるかに大きいため、ピーク高さの不均一性が大きくなることに着目し、評価関数を用いた評価の段階で第３検索セットの同定結果に対する評価を小さくし、その結果、第１及び第２の検索セットから、先に評価した第１の検索セットの同定結果を選択した。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、クロマトグラムにおけるピークの位置が外的・内的要因の変動によって隣接するピークとの間隔に近い量だけ変化した場合や、隣接するピークとの間隔より大きな量だけ変化した場合でも、試料に含まれる可能性のある被分析物のピークとして正しく同定できるようになる。特に、第２発明では、基準ピーク出現時間と相関を保持したピーク出現時間をもつピークを検出するのに適したピーク検索セットが設定されるため、夾雑物ピーク又はゴーストピークと一つの被分析物ピークが特定のピーク検索セットで同定されることはあっても、夾雑物ピーク又はゴーストピークが一つのピーク検出範囲で検出された場合に残りの複数の被分析物がピークと関係づけられる可能性は非常に小さいので、正確な同定が達成できる。
【００７５】
本発明によれば、検索範囲を広くしても、ゴーストピークを被分析物のピークと同定したり、あるピークを誤って隣接して出現するはずの他の被分析物と同定してしまう危険性を排除できるようになる。更に本発明によれば、カラムや溶媒の製造ロットの切り替えによりピーク出現時間が大きく変化したため、標準試料のクロマトグラムを解析するために、従来はピークの出現時間等を改めて設定しなければならないような場合にも、再設定を行う必要がなくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のクロマトグラム用解析装置の各手段を説明するための図である。
【図２】図２はカテコールアミンのクロマトグラムを求めるのに用いた装置の概略構成を示す図である。
【図３】図３はカテコールアミン標準試料のクロマトグラムを示す図である。
【図４】図４はクロマトグラムがずれた場合（遅れた場合）のピーク同定の様子を説明するための図である。
【図５】図５はクロマトグラムがずれた場合（遅れた場合）のピーク同定の様子を説明するための図である。
【図６】図６は本発明における検索セットを説明するための図である。
【図７】図７は本発明におけるピーク同定の様子を説明するための図である。
【図８】図８は本発明におけるピーク同定の様子を説明するための図である。
【符号の説明】
１ 分離カラム、２ 検出器、３ 第１記憶手段、４ 第２記憶手段、５ 第１演算手段、６ 第２演算手段、７ 入力手段、８ 出力手段、９ａ、９ｂ 溶離液ポンプ、１０ａ、１０ｂ 試薬ポンプ、１１ オートサンプラ、１２、１３前処理カラム、１４ 分析カラム、１５ リアクタ、１６ 検出器
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー、更には電気泳動等により複数種の被分析物を含む試料をカラム等の分離手段に供して取得されるクロマトグラムを解析する解析装置に関するものであり、特に測定する目的分析成分が予め定まっている場合に好適に用いられるクロマトグラム用解析装置に関するものである。このような例として、血液や尿中のカテコールアミンやアミノ酸の分析等が例示される。また、品質管理に使用される分析等が例示される。
【０００２】
【従来の技術】
クロマトグラフィー装置を用いて目的とする被分析物の濃度を測定するためには、まず被分析物を含む試料を液体クロマトグラフ装置、ガスクロマトグラフ装置又は電気泳動装置等に供して分離、検出し、クロマトグラムを取得する。次にクロマトグラムを解析することによりクロマトグラム中のピークがいずれの被分析物のピークであるかを同定する（以下、時として単にピークの同定ともいう）。そして最後に、同定されたピークのピーク高さやピーク面積を求め、既知量の被分析物を同様の条件下でクロマトグラフィーに供した時のピーク高さやピーク面積と比較して当該被分析物の定量等を行うのである。
【０００３】
従来のクロマトグラム解析は、ピークの同定に際して各被分析物のピークが出現すると予想される時間（標準ピーク出現時間；Ｔi）の前後をピーク検出開始時間及びピーク検出終了時間として設定し、このピーク検出範囲内でクロマトグラムの傾きが正から負へと変化する点やクロマトグラムがゼロに近い傾きから正の傾きをもって増加した後、負の傾きをもって再びゼロに近い傾きに減少するピーク等をピークとして検出し、各被分析物のピークと同定する方法や、前記ピーク検出範囲内のクロマトグラム最高点をピークとして検出し、各被分析物のピークとして同定する方法により行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ピークの同定は、従来、被分析物ピークの標準ピーク出現時間（Ｔi）とピーク検出開始時間からピーク検出終了時間までの時間巾（ΔＴi）を設定し、ＴiとΔＴiにより規定されるピーク検出範囲（通常はＴi−ΔＴi／２からＴi＋ΔＴi／２）の範囲に存在するピークを検出し、検出されたピークを該被分析物ピークと同定している。
【０００５】
ΔＴiは、複数種の被分析物についてピーク検出を行う場合、各ピーク検出のために設定されるピーク検出範囲同士が重複しないように、隣接して出現すると予想されるピーク同士の間隔以下に設定するのが普通である。
【０００６】
液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、電気泳動等で得られるクロマトグラムは、カラムやキャピラリ、溶離液組成やキャリアガス組成、流速等の内的要因と温度等の外的要因が一定であれば再現性は良好であり、同一被分析物ピークのピーク出現時間やピーク巾の変化は小さい。従って、これら要因が一定であれば予め設定したＴi前後に狭い範囲のΔＴiを設定しピークを検出すれば正しくピーク同定を行うことが可能である。
【０００７】
ところが実際のクロマトグラフィーでは、例えば液体クロマトグラフィーを例とすれば、温度、流速、溶離液組成を一定にすることは事実上不可能であり、またカラムにもロット間格差や経時変化が存在することから、同一の被分析物をクロマトグラフィに供した場合であってもクロマトグラムの形や位置は一定ではなく、実際のピーク出現時間は早まったり、逆に遅くなったりして被分析物用のピーク検出範囲から外れる場合がある。
【０００８】
このような場合には、従来の解析法では正しいピーク同定ができなくなり、信頼のおける測定を行うのは困難となる。このように実際のピーク出現時間が変動した場合でもピーク同定を実現するためにΔＴiを大きく（ピーク検出範囲を広く）したとしても、何らかの理由により被分析物ピークの実際の出現時間が想定した隣接ピーク出現時間との間隔の１／２以上ずれると正しいピーク同定ができないという課題があった。またΔＴiを大きくすると、ゴーストピーク（例えば液体クロマトグラフィーにおいて溶媒を切り替える際に出現する、被分析物に由来しないピーク）や夾雑物に由来するピーク等の妨害ピークを誤って被分析物のピークと同定したり、ピーク検出範囲に他の被分析物ピークが出現する可能性が大きくなるため、結局は正しいピーク同定を行うことは困難である。
【０００９】
従って本発明の目的は、クロマトグラムの形や位置が大きく変化し、実際の被分析物ピークがＴiと異なる時間に出現した場合でも、ゴーストピークや夾雑物ピークを誤って被分析物のピークと同定することなく、各被分析物ピークを正しく同定できるクロマトグラム用解析装置を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本願請求項１の発明（以下、第１発明という）は、ｎ種の被分析物（ｎは２以上の自然数）を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムを解析してｎ種の被分析物の各ピークを検出するクロマトグラム用解析装置であり、各ピークを検出するためのピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数であり、任意の一の検索セットと他の一の検索セットにおいて、ｎ種の被分析物のそれぞれに対して同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が互いに重複する）記憶する第１記憶手段、試料のクロマトグラムを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、各検索セットに含まれる各ｎ個の被分析物に対するピーク検出範囲においてピーク検出を行い、ピークが検出された場合には、該被分析物に検出されたピークを関係づけ、ピークが検出されない場合には、該被分析物にピークを関係づけないで、ｍ個の検索セット間で同一又は異なるピーク同定結果を得る第１演算手段、そして、第１演算手段により得られたｍ個のピーク同定結果から一の同定結果を選択する第２演算手段とを具備する装置である。
【００１１】
また本願請求項４の発明（以下、第２発明という）は、ｎ種の被分析物（ｎは３以上の自然数）を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムを解析してｎ種の被分析物の各ピークを検出するクロマトグラム用解析装置であり、各ピークを検出するためのピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数であり、任意の一の検索セットと他の一の検索セットにおいて、ｎ種の被分析物のそれぞれに対して同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が互いに重複する）を記憶する第１記憶手段、試料のクロマトグラムを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、各検索セットに含まれる各ｎ個のピーク検出範囲においてピーク検出を行い、ピークが検出された場合には、該被分析物に検出されたピークを関係づけ、ピークが検出されない場合には、該被分析物にピークを関係づけないで、ｍ個の検索セット間で同一又は異なるピーク同定結果を得る第１演算手段、そして、第１演算手段により得られたｍ個のピーク同定結果から一の同定結果を選択する第２演算手段とを具備する装置である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のクロマトグラム用解析装置は、試料中の被分析物を分離・展開した後に検出を行う、いわゆるクロマトグラフィーにより取得されたクロマトグラムを解析するために使用することができる。クロマトグラフィーは、分離・展開の原理によって種々の液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーが存在するが、解析対象となるクロマトグラムはいかなるクロマトグラフィーにより得られたものであっても良い。例えば電気泳動結果を適当な染色試薬で染色後、光学測定装置でスキャンニングする等した場合でも、その解析に本発明を使用することができる。更に本発明は、時間の概念を質量数の概念に置き換えることにより、マススペクトル用の解析装置等に適用することも可能である。以下本明細書においては、説明を容易にするために液体クロマトグラフィーにより取得されたクロマトグラムを解析するための装置について説明する。
【００１３】
従来の解析方法を実施するための装置は、ｎ種の被分析物ピークを同定する際、ピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲からなる１個の検索セットを使用するのみであるが、第１発明ではこのような検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数）使用する点、そしてこれらｍ個の検索セットのうち、一の検索セットと他の一の検索セットにおける、同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲の一部を互いに重複させるという特徴を有する。また更には、各検索セットに含まれるｎ個のピーク検出範囲の各々でピーク検出を行い、検出されたピークを各被分析物のピークと同定して各検索セット間で同一又は異なるｍ個のピーク同定結果を得、これらのピーク同定結果を評価して最も適当な同定結果を選択する点にも特徴を有する。ピーク検出において、ｎ個のピーク検出範囲のすべてに対してピークが検出されるわけではなく、ピークが検出されない場合もある。ピークが検出されない場合には、被分析物にピークの関係づけが存在しないというピーク同定結果になる。
【００１４】
一方第２発明は、ｎ種の被分析物（ｎは３以上の自然数）のピークを同定するに当たり、ｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットをｍ個（ｍは２以上の自然数）使用する点、そしてこれらｍ個の検索セットのうち、一の検索セットと他の一の検索セットにおける、同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲の一部をそれぞれ互いに重複させるという特徴を有する。また更には、各検索セットに含まれるｎ個のピーク検出範囲の各々でピーク検出を行い、検出されたピークを各被分析物のピークと同定して各検索セット間で同一又は異なるｍ個のピーク同定結果を得、これらのピーク同定結果を評価して最も適当な同定結果を選択する点にも特徴を有する。第１発明と同様に、ピーク検出において、ｎ個のピーク検出範囲のすべてに対してピークが検出されるわけではなく、ピークが検出されない場合もある。ピークが検出されない場合には、被分析物にピークの関係づけが存在しないというピーク同定結果になる。
【００１５】
第１記憶手段は、ｎ種（ｎは、第１発明においては２以上の自然数、第２発明においては３以上の自然数である）の被分析物ピークを検出するためのｎ個のピーク検出範囲を含む検索セットを記憶する手段であり、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成することができる。第１記憶手段が記憶する検索セットの数は、ｍ（ｍは２以上の自然数）である。各検索セットに含まれるピーク検出範囲は、ｎ種の被分析物の各ピークを検出するためｎ個であるが、同一の検索セットに含まれる、異なる被分析物のピーク検出用ピーク検出範囲は互いに重複しないように、例えばキーボード等の外部入力手段を用いて第１記憶手段に記憶させる。
【００１６】
第１記憶手段に記憶させる検索セット中の各ピーク検出範囲は、例えば既知量の各被分析物を含む標準試料をクロマトグラフィーに供して得たクロマトグラムから算出される、各ピーク出現時間（標準ピーク出現時間；Ｔi）に基づき設定することができる。測定は実際の測定と同一条件下で実施されることがより好ましいが、本発明においては必ずしも同一条件でなくともかまわない。即ち、標準ピーク出現時間に基づいて任意の検索セット中の各ピーク検出範囲を設定し、他の検索セットにおいてはこれとは異なるピーク検出範囲を設定し、第１記憶手段に記憶させるのである。例えば第１発明及び第２発明において、それぞれ、例えば後述する式に従ってＴiに基づき任意の検索セット中の各ピーク検出範囲を設定することが例示できる。ここで、各被分析物ピークの出現時間の間隔や、実際のピーク出現時間は、内的又は外的要因の変化により変動する。例えば溶媒組成や温度が一定条件下で液体クロマトグラフィーを実施する場合には、内的・外的要因が変化しても一分析を実行している間はほぼ一定と考えられるならば、ピーク出現時間の間隔やピーク出現時間の変動量はピーク出現時間に比例した値又は素通り成分の出現時間からピーク出現時間までの時間差に比例した値になる。また溶媒組成や温度にグラジエントをかけた場合やカラムスイッチなどで流路を切り替えた場合は、通常、ピーク出現時間の変動量はピーク毎に異なる。このような変動を考慮した上で、第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セットにおけるピーク検索範囲を設定する。
【００１７】
第１発明においては、より具体的に、同一種の被分析物ピークを検出するための、ｍ個の検索セットに含まれるｍ個のピーク検出範囲の中心は、実数Ａj（ｊ＝１〜ｍ、Ａj＜Ａj+1）に対してＴ1＋Ａj×ΔＴ1、Ｔ2＋Ａj×ΔＴ2、Ｔ3＋Ａj×ΔＴ3、・・、Ｔn＋Ａj×ΔＴnで与えられ、ここでＡj+1−Ａj＜１であるように設定することが例示できる。特定のピークのピーク出現時間が内的・外的要因によって他のピークと逆方向に移動する場合には、該ピークに対する実数ＡjはＡj＞Ａj+1であり、Ａj+1−Ａj＞−１となるように設定する。ΔＴiはピーク検出範囲の巾であり、正の値である。より具体的に、例えば２個の検索セットを設定する場合に、ピーク検出範囲の中心をＴi−ΔＴi／６及びＴi＋ΔＴi／６とすることが例示できる。また３個の検索セットを設定する場合に、ピーク検出範囲の中心をＴi−ΔＴi／２、Ｔi、Ｔi＋ΔＴi／２とすることが例示できる。５個の検索セットを設定する場合に、ピーク検出範囲の中心をＴi−ΔＴi、Ｔi−ΔＴi／２、Ｔi、Ｔi＋ΔＴi／２、Ｔi＋ΔＴiとすることが例示できる。ピーク検出範囲の中心とピーク検出範囲の巾が与えられた時、中心の前後、各ΔＴi／２を検出範囲とすればよい。
【００１８】
上記具体例は各検索セット中の、同一の被分析物のピークを検出するためのピーク検出範囲をΔＴi×２／３又はΔＴi／２づつ重複させる設定であるが、重複量は、一般的にはΔＴi／４からΔＴi×３／４程度の範囲で変更することができる。
【００１９】
第２発明においては、ｎ種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲の中心は、ａj×Ｔ1＋ｂj、ａj×Ｔ2＋ｂj、ａj×Ｔ3＋ｂj、・・、ａj×Ｔn＋ｂj（ただし、ｊ＝１〜ｍ）で与えられ、その前ΔＴi／２からその後ΔＴi／２を検出範囲とすることが例示できる。各ピーク検出範囲の中心の位置は、標準ピーク出現時間を時間ゼロを基準として伸縮させた後に平行にずらしたものであるが、標準ピーク出現時間を時間ゼロ以外の点を基準として伸縮させたものと等価である。
【００２０】
即ちａjとｂjの値を検索セット毎に変化させるのである。ただしいずれの検索セットにおいても、ａjは１に近い実数、ｂjはゼロを含む範囲から選ばれる実数である。
【００２１】
特にすべてのｊに対してａjが１のときに検索セットにおける各ピーク検出範囲の中心はＴ1＋ｂj、Ｔ2＋ｂj、Ｔ3＋ｂj、・・、Ｔn＋ｂjとなり、任意の検索セットにおける各ピーク検出範囲の中心の位置関係は他の検索セットで変動せず（相対的な位置関係を保持したまま）平行にずれるのみとなる。特にすべてのｊに対してｂjがゼロの時には他の検出セットにおける各ピーク検出範囲の中心はａj×Ｔ1、ａj×Ｔ2、ａj×Ｔ3、・・、ａj×Ｔnとなり、任意の検索セットにおける各ピーク検出範囲の中心の位置関係は他の検索セットでは相対的な位置関係を保持したまま時間ゼロを基準にして伸縮するのみとなる。このように、第２発明においては、被分析物のピーク出現時間の位置関係が保持されたまま、平行にずれて出現し、伸縮して出現し、又は伸縮した上で平行にずれて（＝時間ゼロ以外の点を基準として伸縮して）出現した場合に備えて検索セット中のピーク検出範囲を設定する。
【００２２】
係数ａjは、通常は０．７〜１．３程度の範囲の値とすることが好ましく、特に好ましくは０．８〜１．２程度の値である。一方係数ｂmは、通常は全ピークが溶出される時間の１０〜１５％程度の値とすることが好ましい。
【００２３】
係数ａjとｂjの設定についてさらに好ましい具体的例をあげて説明する。
【００２４】
クロマトグラムが唯一の要因により変動する場合には、一般に時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準として伸縮すると考えられるので、各ピーク検出範囲の中心を （１＋ｐ（ｊ−（ｍ＋１）／２））（Ｔi−ｒ）＋ｒ（ただし、ｐ、ｑは実数、ｊ＝１〜ｍ）と表わすことができる。この時、係数ａjとｂjはａj＝１＋ｐ （ｊ−（ｍ＋１）／２）、ｂj＝ｐ（ｊ−（ｍ＋１）／２）（−ｒ）となる。
【００２５】
クロマトグラムが二つの要因により変動する場合には、一般に時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準として伸縮した上で、時間ゼロ以外の一点（ｓ）を基準として伸縮すると考えられるので、各ピーク検出範囲の中心を（１＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２））（（１＋ｐ（ｔ−（ｍ1＋１）／２））（Ｔi−ｒ）＋ｒ−ｓ）＋ｓ（ただし、ｐ、ｑは実数、ｔ＝１〜ｍ1、ｕ＝１〜ｍ2）と表わすことができる。ここで、ｍ＝ｍ1×ｍ2、ｊ＝（ｔ−１）×ｍ2＋ｕとおけば、ｊ＝１〜ｍの整数となり、係数ａjとｂjはａj＝（１＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２）） （１＋ｐ（ｔ−（ｍ1＋１）／２））、ｂj＝（１＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２））ｐ（ｔ−（ｍ1＋１）／２）（−ｒ）＋ｑ（ｕ−（ｍ2＋１）／２）（−ｓ）となる。
【００２６】
クロマトグラムが３つの要因で変動する場合には、一般に時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準として伸縮した上で、時間ゼロ以外の一点（ｓ）を基準として伸縮し、さらに第３の時間ゼロ以外の一点を基準として伸縮すると考えられるが、第３の時間ゼロ以外の一点を基準とした伸縮は第１の点（ｒ）と第２の点（ｓ）を基準とした伸縮の組み合わせで表現することが可能である。したがって、３つの要因から、クロマトグラムに与える影響が大きい要因を２つ取出し、２つの要因により変動する場合と同じように係数ａjとｂjを設定することができる。第３の要因による変動の大きさが第１と第２の要因による変動の大きさに比例して十分に小さいといえない場合は、第３の要因による変動を第１及び第２の要因を組み合わせて表現できるように全体としての検索範囲を広くすることが好ましい。例えば、パラメータｐ、ｑ及びｍ1、ｍ2を第３の要因を考慮して大きめの値に設定することが好ましい。
【００２７】
クロマトグラムが４つ以上の要因で変動する場合には、３つの要因で変動する場合と同じで、クロマトグラムに与える影響が大きい要因を２つ取出し、２つの要因により変動する場合と同じように係数ａjとｂjを設定することができる。 第１発明及び第２発明において、ピーク検出範囲の巾ΔＴiは、各隣接して出現するピークの標準ピーク出現時間の差（Ｔi+1−Ｔi又はＴi−Ｔi-1の差）より小さくなるようにΔＴi＝α×Ｔi＋β（α、βは係数）とすることが例示できる。内的・外的要因による各ピーク出現時間の変動量がピーク出現時間に比例する場合にはΔＴi＝α×Ｔiとすることができる。内的・外的要因による各ピーク出現時間の変動量がほぼ同じ大きさである場合やほぼ同じ時間に出現する複数のピークを扱う場合にはΔＴi＝βとすることができる。また、隣接するピーク間隔が比較的狭い場合には、全検索セット中の各ピーク検出範囲の巾ΔＴiを、可能な限り小さい値とすることが例示できる。内的・外的要因による各ピーク出現時間の変動が時間ゼロ以外の一点（ｒ）を基準とした伸縮で表わすことができる場合には、ΔＴiを小さくして検索セットの数を多くし、全体としての検索範囲を広くすることができる。一方、ピークの間隔が十分に広い場合又は各ピーク出現時間が不規則に変動する場合には、ΔＴiを大きくし、検索セットの数を少なくすることが例示できる。第１演算手段が十分な処理能力を有する場合には、多数の検索セットを設定して、ΔＴiをピーク出現時間の自然な変動の大きさの数倍程度の大きさまで小さくすることが特に好ましい。ここで自然な変動とは、内的・外的環境を一定の条件に保持した場合でも避けられないピーク出現時間の変動を意味する。ΔＴiを小さくすることにより、一つのピーク検出範囲に二つ以上のピークが含まれることを防止することができ、評価関数による選択と組合せることにより、夾雑物ピークやゴーストピークによる同定ミスを避けることができるからである。
【００２８】
検索セットの数、検出範囲の巾は、被分析物のピーク出現時間が変動すると予想される範囲を勘案のうえ決定する。全体としての検索範囲を一定とした場合、各検索セットにおけるピーク検出範囲を仮に同一の小さな値とすると、検索セット数は多くなる。各検索セット間でのピーク検出範囲の重複を大きくとった場合も同様である。例えば第２発明を用いて液体クロマトグラフィーによりノルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパミン（ＤＡ）を分離後、そのクロマトグラムを分析する場合には、本発明者の知見では、変動要因１つ当たり５〜２１程度、変動要因が２つ以上の時は５×５〜２１×２１程度の検索セットを設定し、各検索セットに対してＮＥ、Ｅ、ＤＡの各被分析物のピーク検出範囲を設定し（各検索範囲のΔＴiは５〜３０秒程度である）、標準試料のクロマトグラムにおいては全ピーク検索セットにより、流量要因と温度要因に対してそれぞれ、ＮＥについては２．１分と０．９分、Ｅについては２．７分と１．６分、ＤＡについては４．６分と４．２分の範囲をカバーすることが好ましい具体例として例示できる。また、未知試料のクロマトグラムにおいては全ピーク検索セットにより、流量要因と温度要因に対してそれぞれ、ＮＥについては０．４分と０．７分、Ｅについては０．５分と１．２分、ＤＡについては０．９分と３．２分の範囲をカバーすることが好ましい具体例として例示できる。
【００２９】
なお検索セット中の各ピーク検出範囲のΔＴiは同一である必要がなく、通常、被分析物毎に異なる値を設定する。また、異なる検索セット中の同一の被分析物に対するピーク検出範囲についてもΔＴiを同一とする必要はない。たとえば、ｋ番目のピーク検索セットにおいてΔＴi＝αk×Ｔi＋βk（αk，βkは係数）としてもよい。
【００３０】
以上のように、第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セット中には、同一種の被分析物ピークを検出するためのｍ個のピーク検出範囲が含まれるが、クロマトグラムに変動が生じた場合であっても、通常、ピーク検出範囲の中心の時間（又はピーク検出開始時間とピーク検出終了時間）が異なる少なくとも１つのピーク検出範囲においてピーク同定が可能となる。
【００３１】
本発明における第２記憶手段は、解析するクロマトグラムを記憶する。該手段は、例えば通常のメモリーやフラッシュメモリー等の書き換え可能な記憶媒体で構成でき、例えば液体クロマトグラフィーにおける検出装置からの検出信号を経時的に記憶できれば良い。また第２記憶手段は前記第１記憶手段と一体に構成することもできる。なお、該経時的記憶は連続的なものであっても良いし、例えば１秒毎等の、間欠的なものであっても良い。間欠的にクロマトグラムを記憶する場合には、ピーク巾に比較して十分に短い時間間隔で値を記憶することが好ましい。なお、時間は、例えば分離カラム等の分離手段に試料を供した時間を０（ゼロ）として記憶しても良いし、試料を供した時間から所定の時間経過した後に検出信号の記憶を開始する場合には該時間を０（ゼロ）として記憶しても良い。電気泳動の結果をスキャンする場合には、移動距離を時間に置き換えて考えれば良い。
【００３２】
ここで第２記憶手段は、第１演算手段による各被分析物のピーク同定に先立ち、記憶したクロマトグラムについて、例えば単純移動平均、多項式フィッティング、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるスムージング処理を行ったり、単純スパイク除去処理、フーリエ変換又はウェーブレット変換等によるスパイクノイズ除去処理を行うものであっても良い。もちろんスパイクノイズ処理を行ってからスムージング処理を行うこともできる。これらの処理を行うことにより、ノイズを除去しておけば、クロマトグラムから得られる被分析物ピークの最高値や最低値が正確になり、より信頼性の高い解析結果を得ることができる。むろん、第２記憶手段に代えて第１演算手段で上記のようなクロマトグラムの処理を行うように構成することもできる。
【００３３】
単純移動平均はＹn＝Ｓｕｍ（Ｘi）／ｍで表され（Ｓｕｍは連続するデータＸiを加算する関数であり、ｍは加算するデータの数である）、多項式フィッティングはＹn＝Ｓｕｍ（Ｋi×Ｘi）／Ｓｕｍ（Ｋi）で表され（Ｓｕｍ及びＸiは前記同様であり、Ｋiは例えばＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法により、データを２次式又は３次式にフィッティングするように決定される係数である）、フーリエ変換によるスムージング処理はデータをフーリエ変換して周波数軸で高周波成分をカットするウィンドウ関数をかけ、逆フーリエ変換で時間軸に戻すことをいい、ウェーブレット変換によるスムージング処理とスパイクノイズ除去処理は例えばＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６９巻、１号、１９９７年、第７８〜９０頁に記載された処理であり、単純スパイク除去処理としてはメディアン法（Ｙ＝Ｍｅｄｉａｎ（Ｘi）で表される、連続する３ないし５のデータの中心を取る方法）等が例示できる。
【００３４】
第１演算手段は、前記第１記憶手段が記憶したｍ個の検索セット毎に、各被分析物のピークを同定する手段であり、コンピュータ等を用いて構成することができる。各被分析物のピーク同定は、検索セットに含まれる各被分析物ピークを検出するためのピーク検出範囲においてピークを検出し、各検索セット毎のピーク同定結果を第２演算手段に出力する。即ち、例えばｎ＝３でｍ＝３である場合、第１〜第３の検索セットのそれぞれが第１〜第３の被分析物のピーク同定結果を含む。むろん、ピーク検出範囲でピークが検出されないことも起こり得る。したがって、ｎ＝３である場合には、各ピーク同定結果に、３又は２以下の被分析物とピークの関係づけが含まれる。
【００３５】
第１演算手段による各ピーク検出範囲でのピーク検出は、従来のクロマトグラム検出方法でのピーク検出と同様にすれば良い。具体的に例えば、（１）各ピーク検出範囲でクロマトグラムの傾きが正から負へと変化するクロマトグラム点を含むピークを検出し、（２）各ピーク検出範囲でクロマトグラムがゼロに近い傾きから正の傾きをもって増加した後、負の傾きをもって再びゼロに近い傾きに減少するピークを検出し、又は、（３）各ピーク検出範囲でのクロマトグラム最高点をピークとして検出するように第１演算手段を構成することが例示できる。第１演算手段を（１）又は（２）のように構成すると、ピーク検出範囲内で複数のピークが検出され得るが、この場合には検出された複数のピークの中で最高のクロマトグラム点を含むピークを選択し、又は、面積が最大のピークを選択するように構成すれば良い。また（１）又は（２）の構成では、各ピーク検出範囲毎にピーク検出を行う代わりに、予め全てのピークを検出し、その属性を求め、続いて各ピーク検出範囲毎にその範囲に出現したピークを予め検出されたピークの中から選択することもできる。
【００３６】
なお、第１演算手段を（３）のように構成した場合であって、検出されたクロマトグラム最高点がピーク検出範囲の端に位置するときは、これをピークとして検出しないように第１演算手段を構成することが好ましい。
【００３７】
第２演算手段は、第１演算手段によるピーク同定結果を検索セット毎に評価し、その中から１の同定結果を選択するものである。ここで評価とは、ｍ個の被分析物ピーク同定結果について、それぞれ同定されたピークが真に被分析物に由来するピークであるか否かを判定することを意味する。第２演算手段はコンピュータ等を用いて構成することができ、第１演算手段と兼用としても良い。また第２演算手段は、単にｍ個のピーク同定結果から１の同定結果を選択することに留まらず、例えば各同定された各被分析物ピークについて更に解析を行い、ピーク高さ又はピーク面積を既知濃度の被分析物を含む試料のクロマトグラム解析結果と比較する等してその定量を行うように構成することもできる。
【００３８】
第１演算手段と第２演算手段の間にさらに第３演算手段を設けることができる。第３演算手段は第１演算手段によるピーク同定結果を入力とし、同定結果について各被分析物ピークが適正かどうかを判定し、適正でない場合には被分析物とピークの関係づけを削除する。このように第３演算手段で処理されたピーク同定結果が第２演算手段に与えられる。
【００３９】
第３演算手段における被分析物ピークの判定は、例えば、各被分析物ピークの属性を数値化した基準を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピーク属性を数値化した後、前記基準と比較し、該基準値を満たさない同定結果を除外することにより実行されるようにすることが例示される。比較は一種のピーク属性に基づいて行うこともできるが、複数のピーク属性に基づいて行うこともできる。 この構成におけるピーク属性を数値化した基準値としては、各被分析物のピーク出現時間、ピーク巾、ピーク高さ、ピーク面積から選ばれる１以上の基準値を例示できる。複数のピーク属性の基準値を用いる例として、ピーク巾とピーク高さを基準値とすることもできる。
【００４０】
基準値は予め各被分析物を含む標準試料についてのクロマトグラムに基づいて設定されるが、ピーク巾、ピーク高さ、ピーク面積等の変動要因である内的・外的要因は刻々と変化することから、例えば一定時間毎に標準試料についてのクロマトグラムを取得し、第３演算回路が使用する基準値を更新することが好ましい。なおピーク高さ等を求めるためには、各ピーク毎にベースラインを設定等し、ベースラインから該点までの距離を求める等すれば良い。
【００４１】
より具体的に、第３演算手段は、例えばピーク巾を基準値として使用するのであれば、半値巾（ピーク高さの１／２の高さにおけるピーク巾）、１／５値巾 （ピーク高さの１／５の高さにおけるピーク巾）、１／１０値巾（ピーク高さの１／１０の高さにおけるピーク巾）等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらの基準値を用い、第１演算手段で検出されたピークの属性を数値化した値を同定された被分析物のピーク基準値と比較し、該値が該基準値と大きく異なる場合にはゴーストピークや夾雑物に由来するピークと判定して被分析物とピークの関係づけを削除する。該値が該基準値と大きく異なる場合として、例えば該値が基準値のプラスマイナス４０％の範囲内に収まらない場合や、ピーク巾の上限及び下限として設定された値の範囲に含まれない場合等を例示することができる。
【００４２】
本発明のクロマトグラム用解析装置では、第３演算手段において、既知の被分析物を含む標準試料についてのクロマトグラム解析に用いるピーク巾等の基準値と、被分析物を含むか否かさえ不明の試料についてのクロマトグラム解析に用いるピーク巾等の基準値として、異なる値を基準値とすることもできる。ここでいう標準試料とは、例えば被分析物を含む（又は含むと予想される）試料を液体クロマトグラフィー等に供するに先立ち、一定時間経過毎に供される、既知濃度の被分析物を含む試料を意味する。つまり、標準試料のクロマトグラムを解析するに当たり、別の装置を使用するか、又は以前に同じ装置で取得した標準試料のクロマトグラムにおけるピーク出現時間やピーク巾を基準値として使用し、以後の被分析物を含む試料のクロマトグラム解析に当たっては、この新たに取得された標準試料のクロマトグラムにおけるピーク出現時間やピーク巾を基準値として使用するのである。
【００４３】
基準値として例示したピーク出現時間、ピーク巾、ピーク高さ、ピーク面積の中で、ピーク巾とピーク高さ又はピーク面積を基準値として使用することが特に好ましい。またピーク巾の中では、ピークの重なりの影響を受けにくいことから、半値巾を使用することが特に好ましい。標準試料のクロマトグラム解析ではピーク巾とピーク高さをピーク巾とピーク高さの基準値と比較することにより判定することができる。一方、未知試料の場合には、ピーク巾については標準試料と同じように判定できるが、含まれている被分析物濃度（もし含まれていればであるが）により、クロマトグラムのピーク高さや面積が異なるので、クロマトグラムのノイズの大きさに応じてピーク高さ又はピーク面積の基準値を設定し、該基準値以下のピークをノイズによるピークであると判定し、被分析物とピークとの関係づけを削除することが好ましい。
【００４４】
夾雑物に由来するピークが出現すると予想される試料のクロマトグラム解析においては、検索セットに含まれるピーク検出範囲の巾を狭くして被分析物ピーク検出を行うことが好ましいが、これと共にピーク巾等の基準値を厳密に設定することが好ましい。この目的を達成するためには、既知濃度の被分析物を含む標準試料を一定時間毎にクロマトグラフィーに供してクロマトグラムを得、該クロマトグラムからこれら基準値を求めて第３演算手段が使用する基準値を随時更新することが特に好ましい。いずれにせよ、外的要因が変化した場合には、前記標準試料のクロマトグラムを広いピーク検出範囲又はピーク巾等の緩やかな基準で解析し、ピークの出現時間とピーク巾を求めたうえで、試料のクロマトグラムを狭いピーク検出範囲又はピーク巾等のきつい基準値で解析するようにすることが好ましい。
【００４５】
第２演算手段においてｍ個の検索セットによるｍ個の同定結果を評価し、１個の同定結果を選択するためには、被分析物のピーク属性等を組合せて用いることができる。評価は評価内容を評価関数で表現し、評価関数の関数値の大小で評価することが好ましい。また例えば、（１）関係づけられた被分析物の数を関数値として出力する関数を用い、該関数の結果に基づき実行されるようにしたり、 （２）関係づけられた被分析物ピークの数、及び各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差のうち１以上の値を変数とする評価関数を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピークによって得られた値を該評価関数に代入して得られる結果に基づき実行されるようにしたり、又は、（３）関係づけられた被分析物ピークの数、及び各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積の均一性、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差のうち１以上の値を変数とする評価関数を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピークによって得られた値を該評価関数に代入して得られる結果に基づき実行されるように第２演算手段を構成することが例示できる。相関の指標としては、ピーク出現時間の標準値と検出されたピーク検出時間の相関係数、ピーク出現時間の標準値と検出されたピーク出現時間の間の回帰直線からの誤差の絶対値の最大値、誤差の絶対値の平均値、回帰直線からの誤差の分散又は標準偏差などを使うことができる。
【００４６】
（２）及び（３）において同じ評価内容に対して、評価関数を単一の評価関数で表現することも複数の評価関数の組み合わせで表現することも可能である。後者の場合には、複数の評価関数で表現し、複数回繰返して評価することもできる。より具体的には、被分析物ピークの数とピーク高さの均一性を変数とする関数を用いて評価してもよいし、被分析物ピークの数を変数とする関数を用いて評価して被分析物ピークの数が最大となる同定結果を選択した後で、選択された同定結果をピーク高さの均一性を変数とする関数を用いて評価してもよい。
【００４７】
上記（１）の評価関数の例として、各検索セット中で被分析物ピークであると判定されたピークの数を関数値として出力する関数を例示することができる。そして、関数が最大値をとる検索セットを選択する。被分析物ピークであると評価されるピーク数は最大ｎであるが、被分析物ピークであると評価されたピーク数がｎである検索セットが複数存在する場合には、単に、先に評価した結果を選択することが例示できる。第２演算手段において、上記（１）のように被分析物ピークの数だけで評価することは、夾雑物ピークやゴーストピークが被分析物ピークの近くに出現しない場合に有効である。これに対し、例えば血漿や尿等の試料のカテコールアミン分析のように、夾雑物ピークやゴーストピークが被分析物ピークの近くに出現する場合等には、第２演算手段において前記（２）又は（３）のようにピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差等を変数とする評価関数を用いることが好ましい。
【００４８】
全検索セットにおいて被分析物ピークであると評価されたピーク数が０である場合には、検索セットの設定にもよるが、試料に被分析物が含まれていない、クロマトグラムが何らかの外的・内的要因により解析不能となるほど変動している、という理由が考えられる。従ってこのような場合には、第２演算手段と連絡する出力手段を設け、評価結果とともにこのようなアラートを表示することが好ましい。第２演算手段は、このような評価結果を出力するため、ディスプレイ装置又はプリンタ等の出力装置と連絡していることが好ましい。また、全検索セットにおいて被分析物ピークであると評価されたピーク数がｎ以下である場合には、ｎ種の被分析物のうち一以上の被分析物について上記同様のことが考えられる。
【００４９】
評価関数としては、各被分析物ピーク数、各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積に関する評価関数や、各被分析物ピーク数、各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積の均一性に関する評価関数を例示できる。関係づけられない被分析物ピークの扱いについては、各被分析物ピーク数を評価関数の変数とし関係づけられた被分析物ピークに関する変数だけを評価関数に代入することも、また、関係づけられない被分析物ピークには適当な値を割り付けて全被分析物ピークに関する値を評価関数に代入することもできる。この時の適当な値としては、第３演算手段で用いたピーク巾やピーク高さの限界値などを選択することができる。例えば既知濃度の被分析物を含む標準試料のクロマトグラム解析用評価関数としては、各被分析物ピーク数に加えて、標準試料のクロマトグラムでは各被分析物ピークの巾がある程度予想可能であること、各ピークの高さ又は面積が大きく、しかも各ピークの高さ又は面積の値が同じオーダの値であること等を総合的に考慮して、これらの要素を単一又は組み合わせて評価する関数を使用することが好ましい。単一の要素を用いる場合、ピーク巾を用いることが好ましいが、特にピークの重なりの影響を受けにくい半値巾が好ましい。また、２以上の要素を用いる場合には、優先される要素を決定しておくこともできる。
【００５０】
第２演算手段において、各ピークの高さ又は面積が大きく、しかも各ピークの高さ又は面積の値が同じオーダの値であることから評価を行うためには、例えば、ｉ番目に出現したピークの高さ又は面積の値をＸiとすれば（Ｘ1・Ｘ2・・・Ｘn）×（（ｍｉｎ（Ｘ）／ｍａｘ（Ｘ））ｐ（ｐは１を超える値）という評価関数を使用することが例示できる。従って、全成分数が３の時に、Ｘiを小さい順にＸmin、Ｘmid、Ｘmaxとし、ｐを２とすると評価関数はＸmin 3×Ｘmid／Ｘmaxとなる。また、ｐを３とすると評価関数はＸmin 4×Ｘmid／Ｘmax 2となる。なお、評価関数としてここに例示した関数を累乗した関数を用いても評価関数が最大となるピーク検索セットは同一であり、同じ効果が得られる。また、例えば既知濃度の被分析物を含む標準試料のクロマトグラムにおいて、ピークの高さ又は面積が検出感度の差異等により各被分析物のピークによって大きく異なることが予想される場合には、ピークの高さ又は面積の値に係数をかけ、ほぼ一定の値に変換してから上記評価関数による評価を行うことが好ましい。
【００５１】
未知濃度の被分析物を含む複数の試料についてのクロマトグラム解析では、各試料に含まれる同一種の被分析物濃度が同じオーダであることが分かっている場合には、上記説明したような評価関数を用いてクロマトグラム解析を行うことができる。一方、被分析物濃度が試料により数１０倍以上まで変化する場合には、上記した評価関数を用いることは困難となるが、ピーク巾や被分析物の予想される濃度範囲から推定されるピークの高さ又はピーク面積の取り得る値の範囲等を考慮して解析を行うことができる。
【００５２】
第２演算手段において評価関数を用いてｍ個の検索セットによるｍ個の同定結果を評価し、１個の評価結果を選択するためには、関係づけられた被分析物ピークの数、及び被分析物ピークに関する１以上の値を変数とする前記（２）又は （３）の評価関数が最大となる検索セットにおける同定結果を選択すれば良い。また先に、ピークが検出されたピーク検出範囲数の数により第１の評価関数を用いて評価を行っておき、次に第２の評価関数を用いる評価を行って最終的に１の同定結果を選択することもできる。
【００５３】
本発明のクロマトグラム用解析装置を用いてクロマトグラムを解析するに当たっては、クロマトグラム全体を一度に解析する以外に、例えばクロマトグラムを標準的なピーク出現時間や被分析物の溶出挙動により、複数の、１以上のピークを含む群に分割したうえで２以上のピークを含む群に対して本発明を適用することもできる。ピーク出現時間による分割は、クロマトグラム中のピーク数が多い場合やピーク出現時間の変動量が比較的出現時間の早い被分析物と遅い被分析物の間で良好に相関しない場合には、特に有効である。被分析物の溶出挙動による分割は、酸性物質と中性物質と塩基性物質に分割したり、親水性物質と疎水性物質に分割する例が例示できる。このような例としてはアミノ酸分析などが例示できる。
【００５４】
本発明の解析装置は、例えばコンピュータ等の単一装置で構成することができる。この場合、複数の第１記憶手段を構成しておき、被分析物の種類によって適宜適当な手段を選択使用するように構成したり、第２演算手段及び第３演算手段が使用する評価又は判定用の基準値や評価関数を複数設定しておき、適宜適当なものを選択使用するように構成することができる。
【００５５】
また、これまでに説明した各手段に加え、例えば解析結果を表示したり印刷する出力手段や被分析物のピークを検出できなかった場合にアラートを発生する手段等を装備することもできる。
【００５６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
図１は、本発明を液体クロマトグラフィー用のクロマトグラム解析装置に適用した一例を示すものである。図中、１は分離カラム、２は検出器を示し、送液ポンプや試料導入装置等のその他のクロマトグラフィー装置は省略した。
【００５８】
図中、点線で囲った部分が本発明の解析装置であり、一台のコンピュータにより各手段を構成してある。図中、３は第１記憶手段、４は第２記憶手段、５は第１演算手段、６は第２演算手段である。第３演算手段を追加する場合には、第１演算手段と第２演算手段の間に配置すれば良い。第１記憶手段３はキーボード７からの入力を記憶し、第２記憶手段４は検出器２からの出力（クロマトグラム）を記憶し、第１演算手段５は第１及び第２の記憶手段と連絡され、そして第２演算手段は第１演算手段と連絡されている。また第２演算手段６は、クロマトグラム解析結果をプリンタ８に出力する。
【００５９】
図２は、以下の実施例で用いた液体クロマトグラム装置の構成の概略を示すものである。該装置は、溶離液ポンプ９ａ、９ｂ、試薬ポンプ１０ａ、１０ｂ、オートサンプラ１１、２本の前処理カラム１２及び１３と１本の分析カラム１４、リアクタ１５、そして蛍光検出器１６から構成され、さらに溶離液を切り替えるバルブや流路を切り替えるバルブを有するものである。図１に示した本発明の解析装置は、検出器１６と連結される。
【００６０】
図３は、高速液体クロマトグラフィーにノルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパミン（ＤＡ）を各１ｐｇ／ｍｌ含む標準試料を供して得られたクロマトグラムを模式的に示す図である。図中、「×」を付したピークは、装置中の溶離液や流路切り替えバルブを切り替えた際に発生した、前記被分析物に由来しないゴーストピークである。液体クロマトグラフィー装置としては、前処理カラムとして２本のカラム（第１の前処理カラム１２は直径４．６ｍｍ×７５ｍｍの逆相（エーテルゲル）カラム、第２の前処理カラム１３は直径３．０ｍｍ×６０ｍｍのイオン交換カラム）、分離カラム１４として逆相（ＯＤＳ）用カラム（直径４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）を配置した装置を用いた。この装置では、ポンプ９ａで溶離液（リン酸緩衝液（ｐＨ７））で試料を第１の前処理用カラムに送液し（１．０ｍｌ／分）、第１の前処理用カラムに保持された成分に対して、電磁弁を切り替えることによりポンプ９ａで溶離液（硝酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルの混合液）を送液して第２の前処理用カラムに導入し、そして第２の前処理用カラムに保持された成分に対して、ポンプ９ｂで溶離液（硝酸アンモニウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ７））を分析カラムに送液して分離し（０．７ｍｌ／分）、分析カラムから溶出する成分に蛍光反応試薬を混合した後にリアクタ１５に導入した。リアクタで蛍光反応試薬であるＤＰＥ（Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）と９０℃、３分間反応させて蛍光誘導体化した。蛍光反応試薬はポンプ１０ａとポンプ１０ｂ（各０．２５ｍｌ／分）を用いて送液した。蛍光誘導体化した各被分析物は、蛍光検出器を用いて励起波長３４０〜３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定し、クロマトグラムを得た。
【００６１】
図４は、ＮＥ、Ｅ及びＤＡを含む試料のクロマトグラムを解析する例について説明するための図であり、前記標準試料のクロマトグラムからＮＥ、Ｅ、ＤＡそれぞれのピーク出現時間１、２又は３を求め、ＮＥとＥについては１と２の時間差の８０％のピーク検出範囲巾（ΔＴi）を設定し、ＤＡについては、ＤＡのピーク付近に他のピークが存在しないことから、他の検出範囲巾の２倍とした。ＮＥについてのピーク検出開始時間は１の前ΔＴi／２から１の後ΔＴi／２であり、Ｅについてのピーク検出開始時間は２の前ΔＴi／２から２の後ΔＴi／２、そしてＤＡについてのピーク検出範囲は３の前ΔＴi／２から３の後ΔＴi／２である。
【００６２】
図４の例では、実際のクロマトグラムにおけるＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク出現時間が、外部環境温度の変化により、標準試料におけるピーク出現時間１、２又は３からそれぞれ点線の位置にずれて（遅れて）いるが、ずれの巾が小さいため、各ピーク検出範囲内でクロマトグラムの最高点を探し、該点を含むピークを検出することにより、各ピークの同定を正しく行える。
【００６３】
図５では、実際のクロマトグラムにおけるＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク出現時間が１、２及び３からそれぞれ点線の位置にずれて（遅れて）いるが、ずれの巾がピーク間隔よりは小さいにもかかわらず、Ｅ及びＤＡのピーク検出範囲に実際のピークが入らないため、正しいピーク検出ができない例を示すものである。
【００６４】
図６は、第１発明の第１記憶手段に記憶させる検索セットの一例、及び、第２演算手段における同定結果の選択について説明するための図である。本例では、それぞれＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク検出範囲を含む３つの検索セットを記憶させる例を示している。また解析対象のクロマトグラムは、図５に示したクロマトグラムである。
【００６５】
ＮＥとＥのピーク検索巾ΔＴiは、図４と同様にＮＥとＥのピーク出現時間１と２の時間差の８０％に設定してある。ＤＡについては、ＤＡのピーク付近に他のピークが存在しないことから、他の検出範囲巾の２倍とした。標準試料におけるＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク出現時間をそれぞれ１、２又は３とすると、第１の検索セットに含まれる各ピーク検出開始時間は、ＮＥ；１−ΔＴi、Ｅ；２−Ｔi、ＤＡ；３−Ｔiであり、第２の検索セットに含まれる各ピーク検出開始時間は、ＮＥ；１−ΔＴi／２、Ｅ；２−Ｔi／２、ＤＡ；３−Ｔi／２であり、第３の検索セットに含まれる各ピーク検出開始時間は、ＮＥ；１、Ｅ；２、ＤＡ；３である。
【００６６】
第１演算手段では、各ピーク検出範囲の中でクロマトグラムの最高点を探し、該点を含むピークを検出する。そして、ＮＥのピークを検出するためのピーク検出範囲で検出されたピークはＮＥのピークと、Ｅのピークを検出するためのピーク検出範囲で検出されたピークはＥのピークと、ＤＡのピークを検出するためのピーク検出範囲で検出されたピークはＤＡのピークと同定する。
【００６７】
第３演算手段では、第１演算手段で同定されたピークについてベースラインを設定し、ベースラインと該最高点との距離をピーク高さとする。次いで、ベースラインからピーク高さの１／２となる点を求め、半値巾を求める。一方、図３における標準試料のクロマトグラムからＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク半値巾を計算して基準値とし、前記のように求めた巾と比較した。第３演算手段におけるこれら半値巾等の比較は、１のピークについて半値巾を基準値と比較して、プラスマイナス４０％の巾に収まらない場合には被分析物ピークとして同定したピークは正しいピークでないと判定する。同定結果の中で前記比較により異常と判定されたものはなかった。
【００６８】
第２演算手段では、先に第１の評価関数で関係づけられた被分析物ピークの数で評価し、全ての被分析物ピークが同定された検索セットについてだけ、第２の評価関数で評価を行うように構成した。本例では、第１検索セットにおいてＮＥ、Ｅ及びＤＡのピーク検出ができず、第３検索セットにおいてＥ及びＤＡのピーク検出ができなかったため、第２演算手段により被検出物ピークの数で評価し、第３検索セットが選択されたが、実際、第２演算手段は、２個以上の検索セットが除外されずに残った場合に、これらの中から１の検索セットを選択するため、再度、評価関数を用いる評価を行うように構成してある。
【００６９】
評価関数による評価は、同定されたＮＥ、Ｅ、ＤＡのピーク高さのうち、最大の値をＸmax、最小の値をＸmin、真中の値をＸmidとし、Ｘmin 4×Ｘmid／Ｘmax 2との評価関数に代入して行った。なお例えば、ベースラインとクロマトグラムの距離を１／１０値巾の範囲で積算した値をピーク面積として上記式を適用することも可能である。
【００７０】
図７は、図６で説明した検索セット等を用いて、他のクロマトグラムを解析する様子について説明するための図である。第３演算手段における基準値との比較により、第３検索セットでは、Ｅのピーク検出範囲で検出され、Ｅのピークであると同定されたピークの巾はピーク巾の基準値とほぼ同等であり、正常と評価された。第３検索セットでは、ＤＡのピーク検出範囲ではピークが検出されなかった。第１のピーク検索セットと第２のピーク検索セットでは、ＮＥのピークであると同定されたピークの巾が基準値のプラスマイナス４０％以内に収まり正常と判定された。
【００７１】
第１検索セットを除外した後、第２検索セットと第３検索セットについて評価関数を用いて評価したが、評価結果は一致したため、第２演算手段は、評価結果が同等である場合には先に評価した結果を優先させるという基準に基づいて第２検索セットの同定結果を選択した。なお、本例において第２検索セットと第３検索セットは同等の同定結果となっているので、どちらを選択しても同じである。実際、少なくとも１つの検索セットの各ピーク検出範囲は他の検索セットの対応するピーク検出範囲と一部が重なっているので、まったく同一の同定結果が複数の検索セットで得られることが生じる。
【００７２】
図８は、図６で説明した検索セット等を用いて、外部環境が異なる条件下で取得した他のクロマトグラムを解析する様子について説明するための図である。
【００７３】
図８において、第３検索セットにおけるＥのピーク検出範囲で検出されたピークは、夾雑物のピークである。また第３検索セットにおけるＤＡのピーク検出範囲で検出されたピークは、実際にはゴーストピークである。ここで、該ゴーストピークのピーク巾がＤＡのピーク巾と近似している場合、ピーク巾に関する判定基準のみを用いて判定するとゴーストピークをＤＡのピークと同定することは正しいと判定してしまう。しかし、本発明の第２演算手段では、ＤＡのピークと同定されたゴーストピークのピーク高さがＮＥやＥのピークと同定されたピークのピーク高さよりはるかに大きいため、ピーク高さの不均一性が大きくなることに着目し、評価関数を用いた評価の段階で第３検索セットの同定結果に対する評価を小さくし、その結果、第１及び第２の検索セットから、先に評価した第１の検索セットの同定結果を選択した。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、クロマトグラムにおけるピークの位置が外的・内的要因の変動によって隣接するピークとの間隔に近い量だけ変化した場合や、隣接するピークとの間隔より大きな量だけ変化した場合でも、試料に含まれる可能性のある被分析物のピークとして正しく同定できるようになる。特に、第２発明では、基準ピーク出現時間と相関を保持したピーク出現時間をもつピークを検出するのに適したピーク検索セットが設定されるため、夾雑物ピーク又はゴーストピークと一つの被分析物ピークが特定のピーク検索セットで同定されることはあっても、夾雑物ピーク又はゴーストピークが一つのピーク検出範囲で検出された場合に残りの複数の被分析物がピークと関係づけられる可能性は非常に小さいので、正確な同定が達成できる。
【００７５】
本発明によれば、検索範囲を広くしても、ゴーストピークを被分析物のピークと同定したり、あるピークを誤って隣接して出現するはずの他の被分析物と同定してしまう危険性を排除できるようになる。更に本発明によれば、カラムや溶媒の製造ロットの切り替えによりピーク出現時間が大きく変化したため、標準試料のクロマトグラムを解析するために、従来はピークの出現時間等を改めて設定しなければならないような場合にも、再設定を行う必要がなくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のクロマトグラム用解析装置の各手段を説明するための図である。
【図２】図２はカテコールアミンのクロマトグラムを求めるのに用いた装置の概略構成を示す図である。
【図３】図３はカテコールアミン標準試料のクロマトグラムを示す図である。
【図４】図４はクロマトグラムがずれた場合（遅れた場合）のピーク同定の様子を説明するための図である。
【図５】図５はクロマトグラムがずれた場合（遅れた場合）のピーク同定の様子を説明するための図である。
【図６】図６は本発明における検索セットを説明するための図である。
【図７】図７は本発明におけるピーク同定の様子を説明するための図である。
【図８】図８は本発明におけるピーク同定の様子を説明するための図である。
【符号の説明】
１ 分離カラム、２ 検出器、３ 第１記憶手段、４ 第２記憶手段、５ 第１演算手段、６ 第２演算手段、７ 入力手段、８ 出力手段、９ａ、９ｂ 溶離液ポンプ、１０ａ、１０ｂ 試薬ポンプ、１１ オートサンプラ、１２、１３前処理カラム、１４ 分析カラム、１５ リアクタ、１６ 検出器
Claims (19)
- ｎ種の被分析物（ｎは２以上の自然数）を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムを解析してｎ種の被分析物の各ピークを検出するクロマトグラム用解析装置であり、ｍ個（ｍは２以上の自然数）の検索セットであって、（１）各検索セットはそれぞれ各ピークを検出するためのピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲を含み、（２）任意の一の検索セットと他の一の検索セットにおいてｎ種の被分析物のそれぞれに対して同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が互いに重複する検索セットを記憶する第１記憶手段、試料のクロマトグラムを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、各検索セットに含まれる各ｎ個の被分析物に対するピーク検出範囲においてピーク検出を行い、ピークが検出された場合には、該被分析物に検出されたピークを関係づけ、ピークが検出されない場合には、該被分析物にピークを関係づけないで、ｍ個の検索セット間で同一又は異なるピーク同定結果を得る第１演算手段、そして、第１演算手段により得られたｍ個のピーク同定結果から一の同定結果を選択する第２演算手段とを具備する前記装置。
- 第１演算手段の出力と第２演算手段の入力に接続され、同定結果について各被分析物ピークが適正かどうかを判定する第３演算手段を具備する請求項１のクロマトグラム用解析装置。
- 第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セットに含まれる同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が、当該ｎ種の被分析物のピークが出現すると予想される標準ピーク出現時間をＴ１、Ｔ２、Ｔ３、・・、Ｔｎとし、ピーク検出開始時間からピーク検出終了時間までの時間巾をΔＴｉとした場合に実数Ａｊ（ここでｊ＝１〜ｍなる整数、Ａｊ＜Ａｊ＋１）に対してＴ１＋Ａｊ×ΔＴ１、Ｔ２＋Ａｊ×ΔＴ２、Ｔ３＋Ａｊ×ΔＴ３、・・・、Ｔｎ＋Ａｊ×ΔＴｎを中心とする範囲で与えられ、ここでＡｊ＋１−Ａｊ＜１であることを特徴とする請求項１のクロマトグラム用解析装置。
- ｎ種の被分析物（ｎは３以上の自然数）を含む試料をクロマトグラフィーに供することによって得られるクロマトグラムを解析してｎ種の被分析物の各ピークを検出するクロマトグラム用解析装置であり、ｍ個（ただし、ｍは２以上の自然数）の検索セットであって、（１）各検索セットはそれぞれ各ピークを検出するためのピーク検出開始時間とピーク検出終了時間で規定されるピーク検出範囲であって互いに重複しないｎ個のピーク検出範囲を含み、（２）任意の一の検索セットと他の一の検索セットにおいてｎ種の被分析物のそれぞれに対して同一種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が互いに重複する検索セットを記憶する第１記憶手段、試料のクロマトグラムを記憶する第２記憶手段、記憶されたクロマトグラムについて、各検索セットに含まれる各ｎ個のピーク検出範囲においてピーク検出を行い、ピークが検出された場合には、該被分析物に検出されたピークを関係づけ、ピークが検出されない場合には、該被分析物にピークを関係づけないで、ｍ個の検索セット間で同一又は異なるピーク同定結果を得る第１演算手段、そして、第１演算手段により得られたｍ個のピーク同定結果から一の同定結果を選択する第２演算手段とを具備する前記装置。
- 第１演算手段の出力と第２演算手段の入力に接続され、同定結果について各被分析物ピークが適正かどうかを判定する第３演算手段を具備する請求項４のクロマトグラム用解析装置。
- 第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セットに含まれるｎ種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が、当該ｎ種の被分析物のピークが出現すると予想される標準ピーク出現時間をＴ１、Ｔ２、Ｔ３、・・、Ｔｎとした場合に、ａｊ×Ｔ１＋ｂｊ、ａｊ×Ｔ２＋ｂｊ、ａｊ×Ｔ３＋ｂｊ、・・、ａｊ×Ｔｎ＋ｂｊ（ここでｊ＝１〜ｍなる整数）の各点を中心とする範囲であることを特徴とする請求項４又は５のクロマトグラム用解析装置。
- 第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セットに含まれるｎ種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が、当該ｎ種の被分析物のピークが出現すると予想される標準ピーク出現時間をＴ１、Ｔ２、Ｔ３、・・、Ｔｎとした場合に、Ｔ１＋ｂｊ、Ｔ２＋ｂｊ、Ｔ３＋ｂｊ、・・、Ｔｎ＋ｂｊ（ここでｊ＝１〜ｍなる整数）の各点を中心とする範囲であることを特徴とする請求項６のクロマトグラム用解析装置。
- 第１記憶手段が記憶するｍ個の検索セットに含まれるｎ種の被分析物ピーク検出用のピーク検出範囲が、当該ｎ種の被分析物のピークが出現すると予想される標準ピーク出現時間をＴ１、Ｔ２、Ｔ３、・・、Ｔｎとした場合に、ａｊ×Ｔ１、ａｊ×Ｔ２、ａｊ×Ｔ３、・・、ａｊ×Ｔｎ（ここでｊ＝１〜ｍなる整数）の各点を中心とする範囲であることを特徴とする請求項６のクロマトグラム用解析装置。
- 第１演算手段におけるピーク検出が、各ピーク検出範囲でクロマトグラムの傾きが正から負へと変化するクロマトグラム点を含むピークを検出するものである、請求項１、２、４又は５のクロマトグラム用解析装置。
- 第１演算手段におけるピーク検出が、各ピーク検出範囲でクロマトグラムがゼロに近い傾きから正の傾きをもって増加した後、負の傾きをもって再びゼロに近い傾きに減少するピークをピークとして検出するものである、請求項１、２、４又は５のクロマトグラム用解析装置。
- 第１演算手段におけるピーク検出が、各ピーク検出範囲でのクロマトグラムの最高点を含むピークをピークとして検出するものである、請求項１、２、４又は５のクロマトグラム用解析装置。
- 第３演算手段における各被分析物に関係づけられたピークが適正かどうかの判定が、各被分析物ピークの属性を数値化した基準値を用い、ｍ個の検索セットに対して求められた同定結果毎に各被分析物ピーク属性を数値化した後、前記基準値と比較し、該基準値を満たさない場合に該被分析物ピークの関係づけを外すことに基づき実行される、請求項２又は５のクロマトグラム用解析装置。
- ピーク属性を数値化した基準値が、各被分析物のピーク巾、ピーク高さ、ピーク面積から選ばれる１以上の基準値であることを特徴とする請求項１２のクロマトグラム用解析装置。
- 第２演算手段におけるピーク同定結果の選択が、各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差のうち１以上の値を変数とする評価関数を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピークの前記値を該評価関数に代入して得られる結果に基づき実行される、請求項１、２、４又は５のクロマトグラム用解析装置。
- 第２演算手段におけるピーク同定結果の選択が、各被分析物のピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積の均一性、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間との差のうち１以上の値を変数とするに関する評価関数を用い、ｍ個の検索セットにおいて同定された各ピークのピーク巾、ピーク高さ又はピーク面積の均一性、ピーク出現時間の相関の指標、基準ピーク時間を該評価関数に代入して得られる結果に基づき実行される、請求項１、２、４又は５のクロマトグラム用解析装置。
- 第２演算手段におけるピーク同定結果の選択が、被分析物のピークの関係づけが存在しない時には、予め定めた所定の値を評価関数に代入して得られる結果に基づき実行される、請求項１４又は１５のクロマトグラム用解析装置。
- 被分析物のピークの関係づけが存在しない時の評価関数の値が被分析物のピークの関係づけが存在する時の評価関数の値と比較して評価が不利になるように予め定める所定の値を設定する、請求項１６のクロマトグラム用解析装置。
- ｎ個の被分析物のうち、ピークに関係づけられた被分析物の数に対応した複数の評価関数を用意し、第２演算手段におけるピーク同定結果の選択が、関係づけられた被分析物の数に応じて評価関数を選択し、各被分析物の前記値を評価関数に代入して得られる結果に基づき実行される、請求項１４のクロマトグラム用解析装置。
- ピークに関係づけられた被分析物の数が少ない同定結果が、ピークに関係づけられた被分析物の数が多い同定結果より、評価が不利になるように複数の評価関数を設定する、請求項１８のクロマトグラム用解析装置。
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