ITTO20080801A1 - Composizioni per somministrazione orale, ad uso farmaceutico o di integrazione alimentare, con effetti benefici su freschezza, tono ed elasticita' della pelle - Google Patents

Description

"Composizioni per somministrazione orale, ad uso farmaceutico o di integrazione alimentare, con effetti benefici su freschezza, tono ed elasticità della pelle"

DESCRIZIONE

INTRODUZIONE

Struttura della pelle

La pelle o cute à ̈ l'organo più grande del nostro corpo. Essa nell'adulto raggiunge la dimensione di 2 metri quadrati e un peso di parecchi chilogrammi. La pelle svolge la funzione meccanica di coprire e racchiudere il nostro corpo, la funzione protettiva di proteggere il nostro organismo dagli agenti esterni di natura meccanica, chimica e microbica, la funzione omeostatica di impedire la perdita di acqua e di fluidi dal nostro organismo e di mantenere la temperatura corporea a livelli pressoché costanti, e funzioni endocrine, per esempio quella di sintetizzare la vitamina D sotto l'effetto dei raggi solari. La pelle à ̈ anche l'organo sensoriale del tatto, del caldo e del freddo.

La pelle à ̈ formata dall'epidermide, dal derma e dall'ipodermide. Quest'ultima à ̈ formata da tessuto connettivo lasso che permette una certa mobilità della pelle rispetto alle strutture sottostanti. L'ipodermide contiene anche adipociti in cui si accumulano trigliceridi come riserva energetica.

L'epidermide à ̈ un tessuto epiteliale di rivestimento ed à ̈ formata da vari tipi di cellule. Il tipo principale à ̈ rappresentato dai cheratinociti, che si generano nello strato basale dove hanno una forma cubica e sono ancorati alla membrana basale che separa l'epidermide dal derma. Nello strato basale i cheratinociti sono uniti tra loro da giunzioni cellulari chiamate desmosomi. Nello strato soprastante successivo, detto spinoso, i cheratinociti hanno una forma poliedrica e contengono filamenti intermedi di cheratina. Più in superficie abbiamo lo strato granulare composto da cellule pavimentose ricche di cheratina e di granuli di chetoialina. In superficie abbiamo lo strato corneo in cui le cellule sono andate incontro ad apoptosi, sono ridotte a lamine ricche di cheratina con continuo sfaldamento e distacco dall'epidermide. Le cellule dell'epidermide si rinnovano in continuazione: dalla loro germinazione nello strato basale allo sfaldamento in superficie dello strato corneo passano circa 28 giorni.

Nell'epidermide le cellule aderiscono le une alle altre con spazi intercellulari praticamente assenti. Con questa struttura l'epidermide forma una barriera quasi impermeabile verso l'ambiente esterno grazie anche all'elevato contenuto di cheratina delle cellule dello strato corneo. L'epidermide à ̈ priva di vasi e riceve nutrimento solo nello strato basale dal derma.

Il derma à ̈ lo strato intermedio della pelle ed ha uno spessore che varia da 0,3 a 3 mm, a seconda delle zone del corpo. In esso sono presenti le ghiandole sudoripare, le ghiandole sebacee, i bulbi pilifere e i peli, le terminazioni nervose e i vasi sanguigni. Questi ultimi permettono la circolazione del sangue e provvedono al nutrimento e all'ossigenazione del derma e della soprastante epidermide.

Le caratteristiche meccaniche della pelle, ossia la resistenza alla trazione, l'elasticità e la plasticità sono dovute alle strutture del derma. Le principali cellule del derma sono i fibroblasti che sono immersi in un gel chiamato sostanza fondamentale. I fibroblasti sintetizzano diverse sostanze, tutte di grande importanza strutturale. Tra queste si annoverano le proteine fibrose come il collagene e l'elastina e le sostanze non fibrose che costituiscono la sostanza fondamentale e cioà ̈ l'acido ialuronico e i proteoglicani.

Il collagene à ̈ una glicoproteina costituita da polimeri di glicina (34%), prolina (12%), idrossiprolina (10%) e frazioni di altri aminoacidi. Il collagene si organizza in fasci di fibre che formano un fitto intreccio tridimensionale molto resistente alla trazione e alla rottura.

L'elastina à ̈ anche essa una glicoproteina fibrosa con una composizione simile a quella del collagene, ma con una maggiore presenza di valina, alanina, desmosina e isodesmosina. A differenza del collagene, le fibre di elastina sono dotate di notevoli proprietà elastiche. Le fibre elastiniche sono molto meno numerose e più sottili di quelle di collagene, non si organizzano in fasci, ma si ramificano e si riuniscono formando un reticolo. Le fibre di elastina si intrecciano con le fibre di collagene conferendo elasticità all'intera struttura della pelle.

L'acido ialuronico à ̈ una grande molecola glicosaminoglicanica, di massa superiore a 1000 kDa, costituita da una catena polisaccaridica non ramificata risultante dalla polimerizzazione di migliaia di unità disaccaridiche formate da acido glucuronico e da N-acetilglucosamina. Tutti i gruppi carbossilici dell'acido glucuronico sono ionizzati conferendo alla molecola di acido ialuronico un'elevatissima polarità e di conseguenza una elevata capacità di complessarsi con moltissime molecole di acqua (fino a 1000 volte il suo peso) raggiungendo un elevato grado di idratazione e di viscosità. Una delle funzioni principali dell'acido ialuronico à ̈ quella di mantenere inalterato lo spazio intercellulare, prevenendo il danneggiamento delle cellule da stress fisici. L'acido ialuronico conferisce al derma e quindi alla pelle anche il giusto grado di idratazione, turgidità, plasticità e viscosità.

I proteoglicani sono macromolecole composte da un asse proteico (core) a cui sono unite covalentemente lunghe catene di glucosaminoglicani (GAG) nei quali, a differenza dell'acido ialuronico, le molecole di acido glucuronico, oltre ai gruppi carbossilici, contengono anche gruppi solfonici con ulteriore aumento della polarità e della capacità di complessazione con molecole polari quali l'acqua. I proteoglicani presenti nella sostanza fondamentale del derma si associano non covalentemente e in gran numero a una singola molecola di acido ialuronico formando degli aggregati che raggiungono pesi molecolari fino a 2 milioni di Dalton. Intercalate a questi enormi aggregati proteoglicanici nella sostanza fondamentale del derma si trovano le proteine fibrose come collagene, fibronectina ed elastina che formano una rete complessa in grado di conferire resistenza, elasticità, viscosità e plasticità meccanica all'intera struttura del derma e alla pelle.

Invecchiamento della pelle

La sostanza fondamentale del derma à ̈ soggetta a un rinnovamento continuo determinato dalle capacità biosintesintetiche da parte dei fibroblasti, dai processi catabolici innescati da enzimi demolitori che degradano le fibre di collagene ed elastiniche e dalla ialuronidasi che degrada l'acido ialuronico. Si valuta, infatti, che collagene ed elastina si rinnovino per il 50% ogni 1000 giorni.

Fino a quando i processi catabolici sono compensati da quelli biosintetici la pelle si mantiene "giovane", ossia elastica, turgida e liscia. Quando invece c'à ̈ uno squilibrio tra i processi biosintetici e quelli catabolici, il derma si assottiglia per un insufficiente contenuto di acido ialuronico e di proteoglicani, perde resistenza ed elasticità a causa della diminuzione delle fibre di collagene e di elastina e tende quindi ad afflosciarsi. In superficie questi fenomeni si traducono in un assottigliamento e raggrinzimento della pelle con la conseguente formazione di rughe. Questi fenomeni sono fisiologici con l'avanzare dell'età e rientrano nel normale processo di invecchiamento della pelle.

Tale invecchiamento à ̈ fortemente accelerato da fattori che stimolano i fenomeni catabolici e tra questi sono soprattutto dannosi i radicali liberi e le ROS (Reactive Oxygen Species) che stimolano l'espressione delle collagenasi e delle elastasi promuovendo la degradazione delle fibre di collagene e di elastina. La produzione di radicali liberi e di ROS nella pelle à ̈ fortemente stimolata dai raggi ultravioletti conseguente ad una eccessiva esposizione al sole, ma anche dal fumo, da diete inadeguate e dalle sostanze che caratterizzano l'inquinamento atmosferico, ambientale e alimentare. L'invecchiamento cutaneo à ̈ anche accelerato dalla carenza dei substrati necessari alla biosintesi di collagene ed elastina e soprattutto dalla carenza dei nutrienti necessari per la biosintesi dell'acido ialuronico e dei proteoglicani che sono le sostanze maggiormente responsabili della turgidità e idratazione del derma.

La buona salute della pelle à ̈ mantenuta in primo luogo da una accurata igiene e cura della pelle, da un corretto stile di vita (astenersi dal fumo attivo, evitare il fumo passivo, sana alimentazione e movimento), dal riparo da una eccessiva esposizione diretta ai raggi solari e, nei limiti del possibile, dall'inquinamento atmosferico, alimentare e ambientale.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

In base a quanto evidenziato nella parte introduttiva ed ai risultati dei test descritti più avanti nella parte sperimentale, risulta evidente che la buona salute della pelle può essere supportata anche dall'assunzione di sostanze che forniscano i substrati necessari a garantire la corretta funzionalità dei fibroblasti e/o in grado di neutralizzare o rallentare i processi catabolici che hanno luogo nel derma.

La ricerca alla base della presente invenzione à ̈ stata mirata a selezionare un'associazione di sostanze, la cui somministrazione per via orale à ̈ utile e vantaggiosa nella cura della pelle ed in particolare un'associazione di sostanze che, quantunque di per sé note, dà luogo ad un effetto potenziato e sinergico nel trattamento cosmetico e terapeutico della pelle, particolarmente utile per essere impiegata come medicamento ed integratore alimentare per combattere i radicali liberi ed i processi di invecchiamento della pelle.

A tale fine, l'invenzione fornisce una composizione per somministrazione orale, ad uso farmaceutico o cosmetico, comprendente un derivato di glucosamina in associazione con epigallocatechingallato.

La glucosamina à ̈ il 2-amino-2-deossi-D-glucosio o chitosamina. La glucosamina a base libera, d'ora in poi indicata con "GB", à ̈ instabile e come tale non utilizzabile tecnologicamente. La glucosamina à ̈ un aminozucchero sintetizzato fisiologicamente nell'organismo umano dal glucosio ed utilizzato per la sintesi di molte macromolecole strutturali dei tessuti connettivi e quindi della pelle. Essa à ̈, infatti, il substrato preferito per la biosintesi dei glucosaminoglicani (GAG) e dei proteoglicani e ne stimola la sintesi da parte dei fibroblasti risultando quindi direttamente ed indirettamente coinvolta nel mantenimento, a livello del tessuto connettivo, dei livelli fisiologicamente corretti di quelle sostanze che, assieme all'acido ialuronico, sono le principali responsabili delle caratteristiche reologiche della pelle quali resistenza meccanica, tono ed elasticità. Le principali attività biochimiche e fisiologiche della glucosamina registrate nella letteratura scientifica sono state dettagliatamente descritte da G. Herrero Beaumont e L. Rovati [Future Rheumatol 2006; 1:397-414] e possono essere riassunte nel modo seguente.

La glucosamina:

™ Contrasta l'espressione di COX-2 e di citochine (IL-1β, NFκB) responsabili dei processi di denaturazione delle fibre di collagene e della sostanza fondamentale del derma;

™ riduce l'attività della PLA2 (fosfolipasi A2), enzima che idrolizza i fosfolipidi e che da origine ad acidi grassi liberi e a sostanze proinfiammatorie come l'acido arachidonico;

™ riduce l'espressione della collagenasi, enzima che attacca, denatura e depolimerizza le fibre di collageno, compromettendo così la resistenza del derma agli stress meccanici;

™ riduce l'espressione dell'elastasi, enzima che attacca, denatura e depolimerizza le fibre di elastina, compromettendo così l'elasticità della pelle rendendola floscia e avvizzita.

In conclusione, la glucosamina e derivati forniscono i substrati molecolari necessari per la biosintesi delle componenti della sostanza fondamentale del derma e ne ostacolano la denaturazione e il catabolismo. Essi sono e risultano quindi importanti nel mantenere la buona salute della pelle e nel contrastarne l'invecchiamento.

Epigallocatechin-gallato (EGCG)

L'EGCG à ̈ un polifenolo con formula bruta C22H18O11, PM 458.38, CAS n. 989-51-5 ed à ̈ il principale principio attivo del tà ̈ verde. La letteratura scientifica sull'EGCG documenta che:

™ l'EGCG esplica potenti attività antiossidanti, 10 volte superiori a quelle della vitamina E; ™ esso à ̈ inoltre un potente scavenger (spegnitore) dei radicali ossidanti delle ROS;

™ studi in vitro, su animali e sull'uomo hanno dimostrato le eccezionali attività dell'EGCG nel proteggere i tessuti cutanei dalle ROS e dai radicali liberi originati dall'irradiazione con raggi UV e come tali causa del fotoinvecchiamento cutaneo;

l'EGCG riduce l'incidenza di tumori cutanei come il basalioma e il carcinoma spinocellulare a cellule squamose che sono i più frequenti tumori cutanei maligni nell'uomo (negli Stati Uniti la loro incidenza annua supera il milione di persone);

protegge anche da altri tipi di carcinomi, come quelli della prostata, del cavo orale, del colon e della vescica. Le attività antitumorali dell'EGCG sono confermate da studi epidemiologici condotti su popolazioni asiatiche forti consumatrici di tà ̈ verde. In queste popolazioni l'incidenza dei suddetti tipi di tumori à ̈ notevolmente inferiore a quella delle popolazioni del mondo occidentale, nonostante il fatto che le popolazioni asiatiche abusino del fumo molto di più delle popolazioni occidentali;

l'effetto salutare dell'EGCG sulla pelle à ̈ dovuto in gran parte alla capacità di sopprimere le attività denaturanti esercitate dalle collagenasi e dalle elastasi sulle proteine fibrose del derma e quindi di contrastarne il catabolismo. In aggiunta l'EGCG previene la deplezione degli enzimi antiossidanti (glutatione, glutatione perossidasi, superossidodismutasi e catalasi) indotta dall'irradiazione di raggi UV. Infine l'EGCG inibisce l'attività di enzimi pro-ossidanti (NO sintetasi, lipossigenasi, COX e xantinossidasi) provvedendo una seconda linea di difesa contro i radicali liberi, in particolare da quelli originati da H2O2.

In conclusione l'EGCG protegge i tessuti cutanei dalla denaturazione e dall'invecchiamento causati dai radicali liberi e dalle ROS prodotte dall'esposizione ai raggi UV, dall'inquinamento atmosferico ed alimentare, dal fumo di sigaretta, dalle reazioni metaboliche ossidative e da una incongrua alimentazione.

L'associazione oggetto dell'invenzione à ̈ stata studiata con un set di test ben noti in campo scientifico come predittivi dell'effetto delle sostanze testate sulle caratteristiche e funzionalità della cute. Dai risultati dei test, descritti più avanti nella parte sperimentale, apparirà evidente che fra i derivati della glucosamina (in particolar modo la glucosamina solfato cristallina e la condramina) e l'EGCG esiste un sinergismo d'azione, nei confronti del benessere della pelle, del tutto positivo e imprevedibile a priori.

Come conseguenza di tali risultati aprioristicamente insospettabili, à ̈ stato quindi messo a punto e descritto nella parte dedicata agli esempi un set di formulazioni per uso orale da impiegare in campo farmaceutico o di integrazione alimentare in cui il range dei dosaggi dei principi attivi utilizzati sono quelli approvati e permessi dalle autorità sanitarie nazionali e internazionali e tali da garantire assenza di tossicità o sgradevoli effetti collaterali.

L'associazione, oggetto della presente invenzione, non esclude inoltre l'inclusione nelle formulazioni descritte di altre sostanze complementari che possano contribuire ad un ulteriore miglioramento dell'effetto sinergico dei due principi attivi studiati e fra queste possono essere prese in considerazione agenti antiossidanti, vitamine, aminoacidi, sali minerali, estratti vegetali ed altri eventuali con effetto benefico sul trofismo della pelle.

I derivati di glucosamina utilizzati nell'ambito dell'invenzione comprendono Sia suoi sali semplici e misti quali rispettivamente glucosamina cloridrato e glucosamina solfato cristallina che altri tipi di derivati quali n-acetil glucosamina e condramina le cui caratteristiche vengono qui di seguito descritte.

Sali di Glucosamina

Glucosamina cloridrato (GC)

™ Numero CAS : Fare riferimento a 3416-24-8 corrispondente alla glucosamina base libera (GB) ™ peso molecolare : 215.63

™ formula bruta : C6H13NO5• HCl

™ le concentrazioni di GC, utilizzate nei test descritti nella parte sperimentale (per il razionale dei dosaggi fare riferimento alla parte sperimentale – standardizzazione delle concentrazioni) sono comprese fra 0,043124 e 1,72496 mg/ml (corrispondenti a glucosamina 0,035834-1,43336 mg/ml);

™ la GC non à ̈ stata inserita come tale nelle formulazioni descritte nella parte esemplificativa ma sotto forma di glucosamina solfato cristallina il cui uso risulta più vantaggioso come dimostrato nella parte sperimentale.

Glucosamina solfato cristallina (GSC)

La GSC à ̈ un sale misto nel quale glucosamina, ioni solfato, cloruro e sodio o altro metallo alcalino (per evitare confusione d'ora in poi si farà riferimento al solo sale sodico e cioà ̈ GSCNa), sono presenti in proporzioni stechiometriche pari a 2:1:2:2 e rispetto alla GC presenta il plus della presenza degli ioni solfato, necessari come substrato per la biosintesi del condroitin solfato e dei proteoglicani, come già specificato, componenti strutturali fondamentali della matrice extra-cellulare del tessuto connettivo e quindi della pelle. I vantaggi diretti ed indiretti dell'impiego della GSC nello stimolare e/o normalizzare la sintesi dei proteoglicani e la condroformazione sono ampiamente documentati in letteratura [cfr. G. Herrero Beaumont e L. Rovati, Future Rheumatol 2006;1:397-414] e nella parte sperimentale della presente invenzione e tali da giustificarne e consigliarne l'impiego in campo farmaceutico e nell'integrazione alimentare.

™ Numero CAS : Fare riferimento a 29031-19-4 corrispondente alla glucosamina solfato (GS)

™ peso molecolare : 573.32

™ formula bruta: [C<+2 - -2>

6H14NO5]2• 2Cl • SO4• 2Na ™ le concentrazioni di GSC utilizzate nella conduzione dei test sperimentali, più avanti descritti (per il razionale dei dosaggi fare riferimento alla parte sperimentale – standardizzazione delle concentrazioni), sono comprese fra 0,05733 e 2,2932 mg/ml (corrispondenti a glucosamina 0,035834 e 1,43336 mg/ml);

™ dosaggi giornalieri. La GSC può essere assunta per via orale, secondo la presente invenzione, a dosi giornaliere, espresse in termini di GB, comprese tra 125 e 2000 e preferibilmente 250 – 1000 mg, in una o più somministrazioni dipendentemente dal dosaggio e dalla forma farmaceutica utilizzati.

- Altri derivati della glucosamina

N-acetil-glucosamina (NAG):

Come già dettagliato nella parte introduttiva, fra i componenti fondamentali della matrice extracellulare del tessuto connettivo e quindi della pelle, troviamo i GAG e l'acido ialuronico. Dal punto di vista strutturale si tratta, in entrambi i casi, di polimeri glicosidici non ramificati in cui uno dei componenti dell'unità disaccaridica replicante à ̈ rappresentato dalla NAG. Esistono studi in letteratura e test, descritti più avanti nella parte sperimentale, che dimostrano come la NAG eserciti su funzionalità e caratteristiche cutanee, un'azione chiaramente positiva e tale da giustificarne l'uso in campo farmaceutico e nell'integrazione alimentare.

™ Numero CAS: 28905-11-5

™ peso molecolare : 221.20

™ formula bruta: C8H15NO6

™ le concentrazioni di NAG utilizzate nei test descritti nella parte sperimentale (per il razionale dei dosaggi fare riferimento alla parte sperimentale – standardizzazione delle concentrazioni), sono comprese fra 0,044238 e 1,43336 mg/ml (corrispondenti a GB 0,035834-1,43336 mg/ml);

™ la NAG non à ̈ stata inserita come tale nelle formulazioni descritte nella parte esemplificativa ma sotto forma di condramina (CA) il cui uso risulta più vantaggioso come dimostrato nella parte sperimentale.

Condramina (CA):

Con il termine di condramina si intende una composizione molecolare fra NAG e solfato di un metallo alcalino (per evitare confusione d'ora in poi si farà riferimento esclusivamente al sodio solfato anidro indicato come SSA),in rapporto molecolare 2:1(in termini ponderali : 75.7% di NAG e 24.3% di SSA), descritta in PCT/ EP2008/053286 in cui viene messo in evidenza un vantaggioso sinergismo d'azione fra i due componenti nell'esercitare un'azione di stimolo nella produzione di sostanze utili al trofismo della pelle e tale da consigliarne un vantaggioso impiego a dosi/concentrazioni corrispondenti a quelle del suo contenuto in NAG.

Nella descrizione e nelle prove che seguono si à ̈ utilizzata come condramina un'associazione di NAG e solfato di sodio anidro in rapporto molecolare 2:1 ed a quest'associazione si riferiscono i dati che seguono.

™ Numero CAS: Fare riferimento a 28905-11-5 corrispondente alla N-acetil-glucosamina e 7757-82-6 corrispondente al SSA

™ peso minimo unitario della composizione: 584,46 (rapporto molecolare NAG : SSA= 2:1)

™formula minima molecolare della composizione:

[C8H15NO6]2+ Na2SO4

™ le concentrazioni di CA, utilizzate nei test descritti nella parte sperimentale (per il razionale dei dosaggi fare riferimento alla parte sperimentale – standardizzazione delle concentrazioni) sono comprese fra 0,058444 e 2,33776 mg/ml (corrispondenti a glucosamina 0,035834 – 1,43336 mg/ml);

™ la CA può essere assunta per via orale, secondo la presente invenzione, a dosi giornaliere, espresse in termini di GB, comprese fra 125 e 2000 e preferibilmente 250 – 1000 mg, in una o più somministrazioni dipendentemente dal dosaggio e dalla formulazione utilizzati.

- Epigallocatechin-gallato (EGCG):

L'EGCG à ̈ un polifenolo presente nel te verde il cui sinergismo d'azione con i derivati della glucosamina, come evidenziato nella parte sperimentale, nello stimolare i processi anabolici della pelle e nell'ostacolarne quelli catabolici degenerativi, si à ̈ dimostrato del tutto imprevedibile a priori e tale da giustificare l'originalità inventiva della presente domanda di brevetto.

™ Numero CAS: 989-51-5

™ Peso molecolare: 458.37

™ Formula bruta: C22H18O11

™ le concentrazioni di EGCG, utilizzate nei test descritti nella parte sperimentale (per il razionale dei dosaggi fare riferimento alla parte sperimentale – standardizzazione delle concentrazioni), sono comprese fra 0,04309 e 0,21498 mg/ml (nel rispetto dei rapporti ponderali con la glucosamina base utilizzati nella descrizione delle forme farmaceutiche descritte nella parte dedicata agli esempi);

™ l'EGCG può essere assunto per via orale a dosi giornaliere comprese fra 30 e 360 mg e preferibilmente fra 60 e 240 mg in una o più somministrazioni dipendentemente dal dosaggio e/o dalla forma farmaceutica impiegata.

PARTE SPERIMENTALE

Premessa

Come già visto nella parte introduttiva, il derma contiene diversi tipi di cellule. Le più numerose sono i fibroblasti preposti alla produzione di collagene, elastina, acido ialuronico e proteoglicani da cui dipende il mantenimento del trofismo e delle qualità meccaniche della pelle. La deficienza funzionale dei fibroblasti causa perdita di turgore e di viscoelasticità della pelle e quindi che si traduce nel cosiddetto invecchiamento della pelle.

L'invecchiamento à ̈ accelerato dai processi catabolici denaturanti innescati dai radicali liberi e dalle ROS (specie reattive di ossigeno). Per evitare o rallentare i processi di invecchiamento può essere utile l'apporto di sostanze naturali che forniscano i substrati per la biosintesi della sostanza fondamentale della pelle e cioà ̈ del collagene, dell'elastina, dell'acido ialuronico e dei proteoglicani.

La parte sperimentale del presente brevetto à ̈ perciò focalizzata sulla capacità delle sostanze oggetto della presente invenzione di stimolare le attività biosintetiche dei fibroblasti cutanei e di ostacolare i processi catabolici che portano all'invecchiamento della pelle.

Attività dei derivati della Glucosamina

Materiali e metodi

Stimolazione della sintesi di collagene (Col), di elastina (Ela) e di acido ialuronico (AI) in colture di fibroblasti cutanei umani

• Modello cellulare:

Fibroblasti umani, Detroit 551 ATCC CCL III forniti da LGC Promochem (Milano – Italia).

• Sostanze esaminate:

Sono stati valutati gli effetti dei derivati della glucosamina e cioà ̈ della glucosamina solfato cristallina (GSC), della glucosamina cloridrato (GC), della condramina (CA) e della N-acetiglucosamina (NAG). La formula bruta e il peso molecolare di queste sostanze sono riportati nella Tabella 1. Nella Tabella à ̈ anche riportato, per ogni sostanza, il peso equivalente al contenuto di una mole di glucosamina (Eq) il cui peso molecolare à ̈ 179.17.

Tabella 1. Caratteristiche dei derivati della glucosamina indagati

Sostanza Formula bruta PM Eq Glucosamina solfato cristallina (GSC) [C<2>

6H14NO5]<+>

2•2Cl-•SO-4573,32 286,65<2>•2Na<+>

Glucosamina cloridrato (GC) C6H13NO5• HCl 215,63 215,62 Condramina (CA) (NAG e SSA in rapporto 2C8H15NO6+ Na2SO4584,43 292,22 molecolare 2:1)

N-acetilglucosamina (NAG) C8H15NO6221,20 221,20 • Concentrazioni utilizzate:

Per rendere confrontabili gli effetti delle sostanze testate, sono state utilizzate concentrazioni proporzionali ai rispettivi pesi equivalenti espressi in milligrammi(vedi tab.1 Eq) ovvero alle quantità di ciascun principio attivo equivalenti alle stesse quantità di glucosamina base.

All'uopo sono state impiegate concentrazioni variabili tra 0,00 e 8,00 mEq/ml laddove la concentrazione di 1mEq/ml corrisponde in termini ponderali a:

0,2865 mg/ml di GSC

0,21562 mg/ml di GC

0,29222 mg/ml di GC

0,2219 mg/ml di NAG

• Procedimento per valutare la biosintesi di Col e

di Ela

Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti, 2500 cellule/pozzetto, e incubate per 24 ore in Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) 10% Fetal Calf Serum (FCS). E' stato quindi aggiunto terreno di coltura fresco arricchito con solo 5% FCS e contenente le sostanze da saggiare in modo da raggiungere le concentrazioni finali desiderate. Col e Ela sono state dosate dopo 24 ore di incubazione. Ogni campione à ̈ stato testato in doppio e gli esperimenti sono stati ripetuti 2 volte. In queste condizioni si osserva una biosintesi basale di 4.4 – 5.0 Î1⁄4g/ml di Col e di 5.1 – 5.8 di Ela. Come controllo si sono usati campioni prelevati da pozzetti a cui non erano state aggiunte le sostanze in esame. • Dosaggio del collagene

E' stato usato il kit Sircol<TM>, Biodye Science, Newtownabbey, N. Ireland, che utilizza la capacità del colorante Sirius Red di interagire con i gruppi basici laterali degli aminoacidi presenti nel collagene. La concentrazione di Col à ̈ stata valutata sulla curva di taratura ottenuta utilizzando lo standard di collagene fornito nel kit.

• Dosaggio dell'elastina

E' stato usato il kit Fastin<TM>Biodye Science che utilizza l'interazione della 5,10,15,20-tetrafenil-21,23-porfirina con le molecole di elastina. La concentrazione di Ela à ̈ stata valutata sulla curva di taratura ottenuta utilizzando lo standard di elastina fornito nel kit.

• Procedimento per valutare la biosintesi di AI

I fibroblasti sono stati coltivati in Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) supplementato con 10% FCS, 1mM sodio piruvato, 2 mM glutamina, aminoacidi non essenziali e 50 µg/ml di glutamicina. A confluenza le cellule sono state sospese in 5 % FCS e seminate in piastre da 24 pozzetti, 5x10<4>cellule/pozzetto. Ai pozzetti si à ̈ quindi aggiunto EMEM contenente le sostanze da testare alle concentrazioni desiderate. Dopo 48 ore si à ̈ prelevato il surnatante per dosare l'AI. In queste condizioni si osserva una biosintesi basale di 3.0 – 4.5 Î1⁄4g/ml di AI. Come controllo si sono usati campioni prelevati da pozzetti a cui era stato aggiunto EMEM senza le sostanze in esame.

• Dosaggio dell'AI

E' stato usato il test immuno-enzimatico del kit EIA Corgenix. La concentrazione di AI Ã ̈ stata valutata sulla curva di taratura ottenuta utilizzando lo standard di AI fornito nel kit.

Risultati

Effetti sulla biosintesi di collagene (Col)

• Effetti della glucosamina solfato cristallina (GSC)

La GSC à ̈ stata la sostanza usata come riferimento principale perché essa à ̈ certamente la meglio documentata sotto il profilo salutistico e farmacocinetico. Si sono usate concentrazioni scalari da 0 a 8 mEq/ml e precisamente 0,0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 8,0 mEq/ml. Come atteso, l'aumento delle concentrazioni ha provocato un incremento della biosintesi di collagene. L'aumento, tuttavia, non à ̈ stato proporzionale alle concentrazioni. Infatti esso à ̈ stato scarso e statisticamente non significativo fino alla concentrazione di 1,0 mEq/ml. È seguito un aumento di sintesi di collagene quasi proporzionale alla concentrazione di GSC fino a 5 mEq/ml. Poi, per concentrazioni più elevate, l'incremento di sintesi di collagene non à ̈ più stato proporzionale alle concentrazioni.

Per valutare quantitativamente la capacità della GSC di stimolare la biosintesi di collagene da parte dei fibroblasti si à ̈ calcolata, con il metodo del trapezio, l'area sotto la curva dell'incremento per ogni concentrazione di GSC, dalla concentrazione 0,0 alla concentrazione 5,0 mEq/ml e cioà ̈ fino alla fine dell'incremento proporzionale alla dose, usando il seguente algoritmo:

EI = Efficacia integrata = Σ0 - 5 mEq/mlΔÎ1⁄4g/ml (Formula 1)

in cui ΔÎ1⁄4g/ml à ̈ l'aumento di biosintesi della sostanza stimolata (in questo caso Col) ottenuto con le diverse concentrazioni di GSC.

Si à ̈ anche calcolato l'aumento medio della biosintesi di collagene nell'intervallo 0,0–5,0 mMeqG mediante la formula:

IM = Incremento medio = EI/5

(Formula 2)

in cui il divisore 5 rappresenta l'intervallo da 0,0 a 5,0 mEq/ml entro il quale à ̈ stata misurata la EI.

Con lo stesso procedimento si sono calcolate EI e IM per gli altri derivati della glucosamina e cioà ̈ per la glucosamina cloridrato (GC), per la condramina (CA) e per la N-acetilglucosamina (NAG). Nella Tabella 2 sono riportate le medie e gli errori standard di questi risultati e i rapporti di EI e di IM con i valori trovati per la GSC.

Tabella 2. Biosintesi di collagene. EI e IM trovati per GSC, GC, CA e NAG. Medie e ES

Sostanza GSC GC Rapp/GSC p EI 11,41±0,94 8,59±0,80 0,75 <0,05 IM 2,28±0,18 1,72±0,16 0,75 <0,05

Sostanza CA NAG Rapp/CA p EI 9,58±0,76 6,88±0,32 0,72 <0,05 Rapp/GSC 0,84 p NS 0,60 p<0,05

IM 1,91±0,16 1,38±0,11 0,84 <0,05 Rapp/GSC 0,84 p NS 0,61 p<0,05

Legenda alla Tabella 2

EI = Efficacia integrata: Σ0 - 5 mEq/mlΔÎ1⁄4g/ml

IM = Incremento medio da 0,0 a 5,0 mMeq/ml = EI/5

NS = Statisticamente non significativo

GSC = Gucosamina solfato cristallina

GC = Gucosamina cloridrato

CA = Condramina

NAG = N-acetilglucosamina

Rapp/GSC = Rapporto con glucosamina solfato cristallina

Rapp/CA = Rapporto con condramina

Dalla tabella à ̈ facile desumere che la GSC esercita una notevole attività nello stimolare la biosintesi di Col, con una EI di 11,41 ± 0,94 mMeq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml Col. Anche l'Incremento Medio IM à ̈ stato notevole, pari a 2,28 ± 0,18 ΔÎ1⁄4g/ml Col.

Effetto della Glucosamina cloridrato (GC):

La EI della GC Ã ̈ risultata pari al 75% di quella della GSC, con una differenza statisticamente significativa (p<0,05). Anche la IM della GC Ã ̈ risultata pari al 75% di quella della GSC, con una differenza statisticamente significativa (p<0,05).

• Effetto della Condramina (CA)

La EI della CA à ̈ risultata essere 9,58 ± 0,76 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml Col, pari all'84% di quella della GSC, con una differenza statisticamente non significativa. La IM della CA à ̈ risultata essere 1,91 ± 0,16 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml Col, pari all'84% di quella della GSC, con una differenza statisticamente non significativa.

• Effetto della N-acetilglucosamina (NAG)

La EI della NAG Ã ̈ risultata pari al 60% di quella della GSC, con una differenza statisticamente significativa (p<0,05). Anche la IM della NAG Ã ̈ risultata pari al 60% di quella della GSC, con una differenza statisticamente significativa (p<0,05). La EI della NAG Ã ̈ risultata significativamente inferiore a quella della CA, ossia pari al 72% di questa ultima.

Conclusioni

• Nelle colture di fibroblasti la GSC esercita un notevole potere stimolante sull'attività biosintetica di collagene. L'aumento di sintesi di collagene à ̈ legato alla concentrazione di GSC nel medium, ma non à ̈ direttamente proporzionale alla concentrazione. Infatti, oltre i 5,0 mEq/ml di GSC, l'incremento di biosintesi di collagene si attenua fino a non essere più statisticamente significativo.

• Questa caratteristica si à ̈ osservata anche per gli altri derivati della glucosamina e cioà ̈ per la glucosamina cloridrato (GC), la condramina (CA) e la N-acetilglucosamina (NAG).

L'area sotto la curva Incremento Col su concentrazione da 0,0 a 5,0 mEq/ml à ̈ una buona stima quantitativa della capacità della sostanza in esame di stimolare la biosintesi di collagene dei fibroblasti. Utilizzando questo algoritmo la GSC à ̈ risultata 1,33 volte più efficace della GC, 1,19 volte più efficace della CA (differenza non statisticamente significativa) e 1,67 volte più efficace della NAG (p<0,05). E'anche rimarchevole e inaspettato che la CA, che à ̈ una combinazione molecolare di NAG e sodio solfato, à ̈ risultata essere 1,39 volte più efficace della NAG (p<0,05) e questo risultato conferma quanto già emerso in PCT/EP2008/ 053286 e cioà ̈ che la presenza del solfato nella CA sinergizza in modo significativo, imprevisto e determinante la stimolazione dei fibroblasti alla biosintesi del collagene.

Effetti sulla biosintesi di elastina (Ela)

• Effetti della glucosamina solfato cristallina (GSC)

Come già visto per il test sulla biosintesi del collagene e per le stesse ragioni, anche per l'elastina la sostanza scelta come riferimento principale à ̈ stata la GSC. Anche in questo caso si sono saggiate concentrazioni scalari da 0 a 8 mMeqG e precisamente 0,0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 8,0 mEq/ml. L'aumento delle concentrazioni ha provocato un incremento della biosintesi di elastina da parte dei fibroblasti. Come per il collagene, l'aumento della biosintesi di elastina ha mostrato una curva ad S e su questi aumenti si sono calcolati EI e IM come era stato fatto per gli aumenti di biosintesi di collagene. I risultati sono riportati nella Tabella 3.

Tabella 3. Biosintesi di elastina. EI e IM trovati per GSC, GC, CA e NAG. Medie e ES

Sostanza GSC GC Rapp/GSC p EI 10,90±0,97 10,78±0,80 0,99 NS IM 2,18±0,21 2,16±0,16 0,99 NS

Sostanza CA NAG Rapp/CA p EI 11,12±0,86 8,78±0,32 0,79 <0,05 Rapp/GSC 1,02 p NS 0,81 p NS

IM 2,22±0,18 1,76±0,11 0,79 <0,05 Rapp/GSC 1,02 p NS 0,81 p NS

Legenda alla Tabella 3: cfr. legenda alla Tabella 2.

La Tabella 3 mostra che la GSC esercita una notevole attività nello stimolare la biosintesi di Ela, con una Efficacia Integrata (EI) di 10,90 ± 0,97 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml Ela. Anche l'Incremento Medio IM à ̈ stato notevole, pari a 2,18 ± 0,21 ΔÎ1⁄4g/ml.

Effetti della glucosamina cloridrato (GC)

La EI della GC à ̈ risultata quasi uguale a quella della GSC (99%), con una differenza statisticamente non significativa. Lo stesso à ̈ stato osservato per IM.

• Effetti della condramina (CA)

La EI della CA à ̈ risultata essere 11,12 ± 0,86 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml Ela, pari al 102 di quella della GSC, con una differenza statisticamente non significativa. La IM della CA à ̈ risultata essere 2,22 ± 0,18 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml Ela, praticamente uguale quindi a quella della GSC.

• Effetti della N-acetilglucosamina (NAG)

La EI della NAG Ã ̈ risultata pari al 81% di quella della GSC, con una differenza statisticamente non significativa. Anche la IM della NAG Ã ̈ risultata pari al 81% di quella della GSC, con una differenza statisticamente non significativa. Nei confronti di CA, l'EI della NAG Ã ̈ stata pari al 79%, con una differenza statisticamente significativa (p<0,05). Lo stesso vale per i confronti di IM.

Conclusioni

• Nelle colture di fibroblasti la GSC esercita un notevole potere stimolante sull'attività biosintetica di elastina. L'aumento di sintesi di elastina à ̈ legato alla concentrazione di GSC nel medium, ma non à ̈ direttamente proporzionale alla concentrazione. Infatti, oltre i 5,0 mEq/ml di GSC, l'incremento di biosintesi di elastina si attenua fino a non essere più statisticamente significativo.

• Questa caratteristica si osserva anche per gli altri derivati della glucosamina e cioà ̈ per la glucosamina cloridrato (GC), la condramina (CA) e la N-acetilglucosamina (NAG).

• EI e cioà ̈ l'area sotto la curva di ΔÎ1⁄4g/ml Ela su mEq/ml da 0,0 a 5,0 mEq/ml, à ̈ una buona stima quantitativa della capacità delle sostanze in esame di stimolare la biosintesi di elastina dei fibroblasti. GC e CA hanno stimolato delle EI praticamente uguali a quella della GSC, senza differenze significative di efficacia. La NAG, invece, ha un'efficacia minore, pari cioà ̈ all'81% di quella della GSC, ma tale differenza non à ̈ statisticamente significativa.

• E' importante, infine, mettere in evidenza che per quanto riguarda la NAG, la sua EI risulta essere il 79% di quella della CA. Tale differenza à ̈ statisticamente significativa e conferma, come già evidenziato in PCT/EP/2008/053286, l'effetto imprevedibilmente sinergico fra NAG e sodio solfato, che sono appunto i componenti della CA, nello stimolare la sintesi dell'elastina da parte dei fibroblasti.

Effetti sulla biosintesi di acido ialuronico (AI) • Effetti della glucosamina solfato cristallina (GSC)

Come sostanza di riferimento principale dei derivati della glucosamina à ̈ stata usata la GSC, perché tra tutti questa ha la più ampia documentazione farmacologica, salutistica e farmacocinetica. Anche in questo caso si sono usate concentrazioni scalari da 0 a 8 mEq/ml e precisamente 0,0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 8,0 mEq/ml. L'aumento delle concentrazioni ha provocato un incremento della biosintesi di acido ialuronico da parte dei fibroblasti, ma, come per il collagene e l'elastina, tale aumento ha evidenziato un andamento di tipo sigmoide e pertanto EI e IM sono stati calcolati con gli stessi criteri utilizzati per gli aumenti di biosintesi di collagene e di elastina. I risultati sono riportati nella Tabella 4.

Tabella 4. Biosintesi di acido ialuronico. EI e IM trovati per GSC, GC, CA e NAG. Medie e ES

Sostanza GSC GC Rapp/GSC p EI 18,16±0,83 14,44±0,88 0,80 <0,05 IM 3,63±0,28 2,89±0,16 0,80 <0,05

Sostanza CA NAG Rapp/CA p EI 26,32±2,07 17,72±1,72 0,67 <0,05 Rapp/GSC 1,45 p<0,01 0,98 p NS

IM 5,26±0,48 3,54±0,11 0,67 <0,05 Rapp/GSC 1,45 p<0,01 0,98 p NS

Legenda alla Tabella 4: cfr. legenda alla Tabella 2.

La Tabella 4 mostra che la GSC esercita una notevolissima attività nello stimolare la biosintesi di AI, con una EI di 18,16 ± 0,83 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml AI.

Anche IM à ̈ stato notevole, pari a 3,63 ± 0,28 ΔÎ1⁄4g/ml AI.

Condramina (CA) e della N-acetilglucosamina (NAG). • Effetto della glucosamina cloridrato (GC)

La EI della GC à ̈ risultata pari all'80% di quella della GSC, con una differenza statisticamente significativa (p<0,05). Lo stesso à ̈ stato osservato per IM.

• Effetto della condramina (CA)

La EI della CA à ̈ risultata essere 26,32 ± 2,07 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml AI, pari al 145% di quella della GSC, con una differenza statisticamente molto significativa (p<0,01). L'IM della CA à ̈ risultato essere 5,26 ± 0,48 mMeqG × ΔÎ1⁄4g/ml AI, anche esso molto più elevato di quello osservato per la GSC.

• Effetto della N-acetilglucosamina (NAG)

La EI della NAG à ̈ risultata essere 17,72 ± 1,72 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml AI pari al 98% di quella della GSC e quindi praticamente uguale. Lo stesso à ̈ stato osservato per l'IM con una differenza statisticamente non significativa rispetto a quello della GSC.

• Ad ulteriore conferma dell'effetto sinergico fra NAG e sodio solfato, l'EI della NAG risulta essere pari al 67% di quella della CA . Tale differenza à ̈ statisticamente significativa (p<0,05) e lo stesso vale per i confronti fra i rispettivi IM.

Conclusioni

• Nelle colture di fibroblasti la GSC esercita un notevole potere stimolante sull'attività biosintetica dell' acido ialuronico. Tale aumento di sintesi di acido ialuronico à ̈ legato alla concentrazione di GSC nel medium, ma non à ̈ direttamente proporzionale alla sua concentrazione. Infatti, al di sopra dei 5,0 mEq/ml di GSC, l'incremento di biosintesi di acido ialuronico si attenua fino a non essere più statisticamente significativo.

• Questa caratteristica si à ̈ osservata anche per gli altri derivati della glucosamina e cioà ̈ per la glucosamina cloridrato (GC), la condramina (CA) e la N-acetilglucosamina (NAG).

• L'EI à ̈ una buona stima quantitativa della capacità delle sostanze in esame di stimolare la biosintesi di acido ialuronico da parte dei fibroblasti. U-tilizzando questo algoritmo la GC à ̈ risultata avere una capacità stimolante pari all'80% di quella della GSC con una differenza statisticamente significativa (p<0,05).

• La CA, al contrario, risulta sorprendentemente ed inaspettatamente molto più efficace della GSC. Infatti con una EI di 26,32 ± 2,07 mEq/ml × ΔÎ1⁄4g/ml AI, la CA à ̈ risultata essere 1,45 volte più attiva della GSC nello stimolare la biosintesi di acido ialuronico da parte dei fibroblasti (p<0,01) e tra tutti i derivati della glucosamina esaminati à ̈ stato quello che ha esplicato la maggiore attività su questo parametro.

• Tenendo conto del fatto che l'acido ialuronico del derma à ̈ la macromolecola maggiormente responsabile di turgore, tonicità e plasticità della pelle si può ragionevolmente concludere che la CA può giocare un ruolo di primo piano nel mantenere una qualità ottimale della pelle.

Conclusioni generali sugli effetti esercitati dai derivati della glucosamina sulle biosintesi di collagene, elastina e acido ialuronico da parte di fibroblasti umani

Tutti i derivati della glucosamina esaminati e cioà ̈ GSC, GC, CA e NAG, hanno stimolato la biosintesi di collagene, elastina e acido ialuronico da parte dei fibroblasti. Si sono rilevate, però, sorprendenti e rilevanti differenze.

Stimolazione della biosintesi di collagene

• Il derivato più efficace à ̈ stata la GSC (glucosamina solfato cristallina), seguito da CA (condramina) con una differenza statisticamente non significativa.

• Meno efficaci e in modo statisticamente significativo sono state, nell'ordine, la GC (glucosamina cloridrato) e la NAG (N-acetilglucosamina).

• Un'analoga gerarchia di efficacia à ̈ stata trovata valutando l'IM, ossia l'incremento medio di biosintesi del collagene.

E' opportuno ricordare che le fibre di collagene sono le strutture del derma che principalmente conferiscono alla pelle resistenza meccanica alla rottura e alla distensibilità. Nel modello in vitro utilizzato la GSC risulta quindi essere la maggiore responsabile per conferire alla pelle resistenza meccanica alla rottura e alla distensibilità.

- Stimolazione della biosintesi di elastina

I derivati più efficaci e con parità di efficacia sono stati la CA (condramina) e la GSC (glucosamina solfato cristallina). Leggermente meno efficace, ma in modo statisticamente non significativo, à ̈ stata la NAG (N-acetilglucosamina). Analoghe conclusioni si possono fare valutando l'IM, ossia l'incremento medio di biosintesi di elastina.

Stimolazione della biosintesi di acido ialuronico • Il derivato più efficace à ̈ stato la CA (condramina). Significativamente meno efficaci (p<0,01) sono state GSC (69% di CA) e NAG (67% di CA) mentre quella con minore attività à ̈ risultata la GC (con il 54% di CA). Analoghe conclusioni si possono trarre valutando l'IM, ossia l'incremento medio di biosintesi di acido ialuronico.

• E' opportuno ricordare che l'acido ialuronico à ̈ la macromolecola della sostanza fondamentale del derma che conferisce alla pelle turgore e plasticità e che una sua diminuzione o depolimerizzazione, nella sostanza fondamentale del derma, rende la pelle flaccida e rugosa e le fa assumere le caratteristiche dell'invecchiamento.

• Va ulteriormente messo in evidenza l'eccezionale effetto di stimolazione, esercitato dalla CA la quale, grazie alla sua composizione molecolare, à ̈ in grado di fornire, assieme all'acido glucuronico, tutti gli elementi strutturali necessari alla formazione del dimero che si polimerizza a formare la grandissima molecola di acido ialuronico.

Associazione dei derivati della glucosamina con epigallocatechin-gallato (EGCG). Effetti sulla stimolazione dei fibroblasti umani nell'espressione di collagene, elastina e acido ialuronico.

Materiali e metodi

I risultati dei test descritti nella presente sezione sperimentale mettono in evidenza gli effetti, esercitati dai derivati della glucosamina da soli o associati all'EGCG, sull'espressione di collagene, elastina e acido ialuronico su colture "in vitro" di fibroblasti umani.

Metodi sperimentali

Si sono utilizzati gli stessi metodi di stimolo dei fibroblasti cutanei umani descritti nella sezione precedente.

Standardizzazione delle concentrazioni

Poiché, come esplicitato negli esempi più avanti descritti, l'associazione fra derivati della glucosamina ed EGCG prevede un rapporto ponderale costante fra 120 (o 60) mg di EGCG (0,2618 Eq ; PM = 458,38) e derivato della glucosamina pari a 500 mg (o 250) di glucosamina base (2,7906 Eq ; PM = 179,17) con un rapporto, espresso in equivalenti, glucosamina/EGCG = 10,66, anche nei test "in vitro", in cui à ̈ stato testato l'effetto dell'associazione fra derivati della glucosamina ed EGCG, à ̈ stato rispettato lo stesso rapporto fra mEq/ml, laddove le concentrazioni prescelte per l'EGCG sono incluse nel range 0-0,469 mEq/ml (0,000; 0,094; 0,188; 0,281; 0,375; 0,469) e quella dei derivati della glucosamina, selezionati per il test e cioà ̈ GSC e CA, sono compresi tra 0 e 5 mEq/ml (0; 1; 2; 3; 4 e 5).

- Valutazione dei risultati

Per la valutazione dell'efficacia delle sostanze in esame, si sono misurati gli aumenti (in µg/ml), rispetto al basale, della biosintesi di collagene, elastina e acido ialuronico (ΔCol, ΔEla e ΔAI), osservati nelle colture di fibroblasti, ottenuti utilizzando le concentrazioni sopra descritte. Entro questo range di concentrazioni si ottiene in genere una risposta lineare di stimolo. Sui risultati si sono calcolate le rette di regressione con il metodo dei minimi quadrati che permette di valutare anche i limiti di fiducia con p = 95% dei principali parametri della retta di regressione e di ottenere i parametri della seguente equazione:

ΔCol (µg/ml) = f × mEq/ml Int (eq. 1) Nell'equazione 1:

ΔCol à ̈ l'aumento della biosintesi di collagene osservato alle diverse concentrazioni dell'agonista;

f (fattore di potenza) Ã ̈ il coefficiente angolare che descrive l'incremento di biosintesi di collagene provocato dall'incremento di concentrazione di agonista nel medium e rappresenta la potenza stimolante dell'agonista in esame;

Int à ̈ l'intercetta con l'asse delle ordinate;

Int = 0 indica che la retta di regressione attraversa l'origine degli assi.

Con lo stesso approccio si sono calcolate le regressioni di ΔEla e di ΔAI per i due derivati di glucosamina più efficaci nello stimolo di collagene, di elastina e di acido ialuronico e cioà ̈ la glucosamina solfato cristallina (GSC) e la condramina (CA). Le rette di regressione sono state calcolate anche per l'EGCG e per le associazioni di

GSC e di CA con EGCG.

Risultati

Biosintesi di collagene. Effetti di GSC, CA, EGCG e Associazioni di GSC e CA con EGCG

I vari parametri di efficacia sono presentati

nella Tabella 5.

Tabella 5. Parametri di efficacia sulla biosintesi

di collagene

Agonista f (IC 95%) Int (IC 95%) Rmult EI±ES GSC 1,03 (0,74÷1,32) -0,11 (-0,74÷1,32) 0,980 10,90±1,22 CA 0,85 (0,62÷1,08) -0,06 (-0,75÷0,63) 0,982 11,12±0,86 EGCG 0,23 (0,07÷0,40) -0,05 (-0,55÷0,46) 0,888 1,02±0,08 GSC+EGCG 2,64 (2,03÷3,26) -0,54 (-2,40÷1,32) 0,986 14,55±1,50 CA+EGCG 1,83 (1,37÷2,29) 0,53 (-0,86÷1,91) 0,984 13,70±1,55 Legenda alla Tabella 5.

GSC = Glucosamina solfato cristallina; CA = Condramina; EGCG = Epigallocatechin-gallato; f = fattore

di potenza; IC 95% = intervalli di confidenza

p=95%; Int = Intersezione con l'ascissa; Rmult = Coefficiente di correlazione multiplo; EI = Efficacia integrata da 0,0 a 5,0 mMeq/ml; ES = Errore standard.

Dai dati riportati in Tabella 5 risulta che:

• Per tutti gli agonisti l'intersezione con l'ordinata (Int) non differisce significativamente da 0

e che c'Ã ̈ dunque una proporzione diretta tra concentrazione e stimolo alla biosintesi di collagene.

Il fattore di potenza f à ̈ quindi un indice diretto

della potenza dei singoli agonisti nello stimolare

la biosintesi di collagene.

• Esiste un'ottima correlazione lineare tra l'incremento della biosintesi di collagene e la concentrazione degli agonisti, come risulta da Rmult maggiore di 0,90 per tutti gli agonisti presi in esame, con l'eccezione di EGCG, per il quale, tutta

via, la correlazione à ̈ ancora buona (Rmult = 0,89). • L'agonista più potente nello stimolare la biosintesi di collagene si dimostra la GSC.

• La CA ha una potenza pari all'83% di quella della GSC, ma gli intervalli di confidenza di f si sovrappongono, dimostrando che la differenza non può essere considerata statisticamente significativa.

• L'EGCG à ̈ 4,5 volte meno potente della GSC e 3,7 volte meno potente di CA e le differenze risultano significative.

• Associando EGCG con GSC si osserva un notevole, sorprendente, inatteso e molto significativo potenziamento della f della GSC, che va ben oltre la semplice somma delle potenze della GSC e dell'EGCG. • Un analogo sorprendente e inatteso potenziamento, sia pure di grado inferiore, si osserva associando EGCG con CA.

• L'agonista con la più elevata Efficacia integrata (EI - indice della massima capacità di stimolazione della biosintesi di collagene) à ̈ risultata essere la CA, seguita con una differenza non significativa dalla GSC. L'EGCG ha presentato un'EI signficativamente più modesta, pari a 1/10 circa di quella della CA.

Biosintesi di elastina. Effetti di GSC, CA, EGCG e Associazioni di GSC e CA con EGCG

I vari parametri di efficacia sono presentati

nella Tabella 6.

Tabella 6. Parametri di efficacia sulla biosintesi

di elastina

Agonista f (IC 95%) Int (IC 95%) Rmult EI±ES GSC 0,84 (0,62÷1,06) 0,12 (-0,54÷0,77) 0,982 11,26±1,21 CA 0,85 (0,62÷1,08) -0,06 (-0,75÷0,63) 0,982 10,41±1,07 EGCG 0,42 (0,25÷0,59) 0,01 (-0,51÷0,53) 0,961 5,24±0,08 GSC+EGCG 1,47 (1,15÷1,78) 0,35 (-0,60÷1,31) 0,994 20,32±1,95 CA+EGCG 1,29 (0,93÷1,64) 0,65 (-0,41÷1,72) 0,984 19,79±2,02 Legenda alla Tabella 6. Cfr. legenda alla Tabella

5.

Dai risultati riportati in tabella 6 risulta

che:

• Per tutti gli agonisti l'intersezione con l'ordinata (Int) non differisce significativamente da 0

e che c'Ã ̈ quindi una proporzione diretta tra concentrazione e stimolo alla biosintesi di elastina.

Il fattore f à ̈ quindi un indice diretto della potenza dei singoli agonisti nello stimolare la biosintesi di elastina.

• Esiste un'ottima correlazione lineare tra l'incremento della biosintesi di elastina e la concentrazione degli agonisti, come risulta da Rmult maggiore di 0,90 in tutti i casi.

• L'agonista più potente nello stimolare la sintesi di elastina à ̈ la CA.

• La GSC ha una potenza praticamente identica a quella della CA (99%) e priva di significatività statistica.

• L'EGCG à ̈ due volte meno potente della CA e della GSC con differenze significative.

• Associando EGCG con GSC si osserva un sorprendente, inatteso e molto significativo potenziamento dell'f della GSC (75%), che va ben oltre la semplice somma delle potenze della GSC e dell'EGCG.

• Un analogo sorprendente e inatteso potenziamento, sia pure di grado inferiore, si osserva associando EGCG con CA.

• L'agonista con la più elevata Efficacia integrata (EI - indice della massima capacità di stimolazione della biosintesi di elastina) à ̈ stata la GSC, seguita con una differenza non significativa dalla CA. L'EGCG ha presentato un'EI signficativamente più modesta, pari alla metà di quella della GSC.

• Le EI ottenute con i vari agonisti e con le associazioni mostrano rapporti simili a quelli descritti per f.

Biosintesi di acido ialuronico. Effetti di GSC, CA, EGCG e Associazioni di GSC e CA con EGCG

I vari parametri di efficacia sono presentati nella Tabella 7.

Tabella 7. Parametri di efficacia sulla biosintesi

di acido ialuronico

Agonista f (IC 95%) Int (IC 95%) Rmult EI±ES GSC 1,26 (0,94÷1,58) 0,38 (-0,60÷1,36) 0,983 18,05±2,01 CA 1,89 (1,30÷2,48) 0,54 (-1,25÷2,33) 0,975 26,80±2,27 EGCG 0,19 (0,09÷0,30) 0,01 (-0,32÷0,45) 0,929 2,56±0,28 GSC+EGCG 1,50 (1,00÷2,00) 0,56 (-0,95÷2,08) 0,972 22,29±2,42 CA+EGCG 3,09 (2,05÷4,13) 1,33 (-1,82÷4,48) 0,972 46,65±4,06 Legenda alla Tabella 7. Cfr. legenda alla Tabella

5.

Dai risultati riportati in tabella 7 risulta

che:

• Per tutti gli agonisti l'intersezione con l'ordinata (Int) non differisce significativamente da 0

e che c'Ã ̈ una proporzione diretta tra concentrazione e stimolo alla biosintesi di acido ialuronico.

Il fattore f à ̈ quindi un indice diretto della potenza dei singoli agonisti nello stimolare la bio sintesi di acido ialuronico.

• Esiste un'ottima correlazione lineare tra l'incremento della biosintesi di acido ialuronico e la concentrazione degli agonisti, come risulta da Rmult maggiore di 0,90 per tutti gli agonisti presi in esame.

• L'agonista più potente nello stimolare la biosintesi di acido ialuronico à ̈ la CA.

• La GSC ha una potenza pari al 66% di quella della CA e la differenza à ̈ statisticamente significativa.

• L'EGCG à ̈ 10 volte meno potente della CA e 8 volte meno potente della GSC. Le differenze sono significative.

• Associando EGCG con GSC si osserva un sorprendente, inatteso e molto significativo potenziamento del 25% dell'f della GSC, che va oltre la semplice somma delle potenze della GSC e dell'EGCG.

• Ancora più sorprendente e inatteso à ̈ il potenziamento di f del 63% esplicato associando EGCG con CA.

• L'agonista con la più elevata Efficacia integrata (EI - indice della massima capacità di stimolazione della biosintesi di acido ialuronico) risulta essere la CA.

• La GSC ha presentato un'EI pari al 67% di quella della CA con una differenza molto significativa. • L'EGCG presenta un'EI molto modesta, pari a un decimo di quella della CA.

• Notevolissimo e inatteso à ̈ stato l'incremento del 74% di EI della CA ottenuto associando EGCG alla CA.

• Notevole, inatteso e sorprendente risulta essere anche l'incremento del 23% di EI della GSC ottenuto associando EGCG alla GSC.

Associazione di EGCG con i derivati della glucosamina. Effetti sulle biosintesi di collagene, elastina e acido ialuronico da parte di fibroblasti umani – Conclusioni.

Per questo studio sono state selezionate la glucosamina solfato cristallina (GSC) e la condramina (CA), i due derivati della glucosamina che hanno esercitato i migliori effetti sulle biosintesi di collagene, elastina e acido ialuronico (cfr. Tabelle 2, 3 e 4). Entrambe hanno stimolato la biosintesi di collagene, elastina e acido ialuronico in modo linearmente e proporzionalmente correlato alla concentrazione, con un elevato coefficiente di correlazione multiplo, in generale superiore a 0,90.

Stimolazione della biosintesi di collagene

• La GSC esercita la potenza più elevata. La CA ha una potenza pari all'83% di quella della GSC. • L'EGCG à ̈ dotato di scarsa potenza ma, associato alla GSC, aumenta in modo sorprendente e inatteso la potenza della GSC del 256%.

In modo analogo, l'associazione fra EGCG e CA provoca un aumento del 215% della potenza di CA nello stimolare la biosintesi di collagene.

Stimolazione della biosintesi di elastina

• CA e GSC hanno esercitato una potenza praticamente identica con f = 0,85 per CA e f = 0,84 per GSC.

• L'EGCG esercita una potenza stimolante pari a metà di quelle della CA e della GSC. Tuttavia, se associato alla CA ne aumenta la potenza del 152% e associato a GSC ne aumenta la potenza del 175%. Tali aumenti risultano significativamente più elevati di quelli attesi dalla semplice somma di effetti, che sarebbero stati del 127% e, rispettivamente, del 126%.

Stimolazione della biosintesi di acido ialuronico I risultati più sorprendenti e importanti si sono osservati sulla biosintesi di AI.

• L'agonista più potente à ̈ la CA, con un fattore di potenza f pari a 1,89. La GSC risulta meno efficace, con una potenza pari al 67% di quella della CA.

• Scarsa risulta essere la potenza dell'EGCG, pari al 15% di quella della CA testata individualmente.

• Associando l'EGCG alla CA si à ̈ osservato in modo sorprendente e inaspettato un aumento del 163% della potenza della CA. Associando l'EGCG alla GSC si à ̈ osservato un aumento del 119% della potenza della GSC testata individualmente.

Conclusioni generali

I risultati dei test descritti nella parte sperimentale , condotti sull’associazione fra i derivati della glucosamina e l’EGCG , oggetto della presente invenzione , evidenziano un imprevedibile e sorprendente sinergismo d’azione nell’inibire i radicali liberi ed i processi di invecchiamento della pelle.

Dai dati sperimentali ottenuti si possono infatti trarre le seguenti conclusioni:

• GSC e CA sono risultati i due derivati più potenti nella stimolazione delle sopraddette biosintesi.

• EGCG à ̈ poco potente, ma à ̈ rimarchevole e sorprendente che quando associata alla GSC ne aumenta notevolmente e sorprendentemente la potenza nello stimolare le biosintesi di collagene, elastina e acido ialuronico.

• Di interesse eccezionale à ̈ l'aumento della biosintesi di acido ialuronico provocato associando l'EGCG alla CA. Si osserva, infatti, un aumento del 163% della potenza stimolante rispetto a quella esercitata dalla CA da sola. Quantunque questi risultati siano stati osservati utilizzando CA con rapporto di equivalente NAG/SSA, la stessa conclusione vale per rapporti di equivalenti compresi tra 1:0,5 e 1:3.

• L'associazione CA EGCG assume una particolare importanza se si tiene conto che l'acido ialuronico à ̈ il costituente della sostanza fondamentale del derma che conferisce a questo ultimo e alla pelle la tonicità e la plasticità tipiche della pelle giovane. L'associazione CA EGCG sembrerebbe quindi essere particolarmente e sorprendentemente effi cace per mantenere la salute della pelle, anche perché questa particolare associazione à ̈ molto potente nell'incrementare la biosintesi di collagene e di elastina responsabili rispettivamente della resistenza meccanica e dell'elasticità della pelle. • Le suddette conclusioni sono certamente valide per le associazioni di CA con EGCG nel rapporto molecolare con il quale sono stati condotti gli studi e cioà ̈ di 5.30:1.00 (espresso in equivalenti = 10.60:1). Tuttavia, se si tiene conto degli intervalli di confidenza di f delle rette di regressione riportati nella Tabella 7, si può ragionevolmente assumere che le conclusioni possano essere considerate valide anche se estrapolate a rapporti molecolari diversi e precisamente da 2.15:1.00 a 10.70:1.00, pari a rapporti ponderali da 3.40:1.00 a 13.60:1.00.

• Analogamente, per un'associazione GSC con EGCG, i rapporti molecolari da 2.15:1.00 a 10.7:1.00 equivalgono a rapporti ponderali da 3.33:1.00 a 13.33:1.00.

ESEMPI

Le formulazioni qui di seguito riportate illustrano possibili applicazioni pratiche della presente invenzione e come tali non devono essere ritenute, in alcun modo, limitative dell'invenzione stessa.

Si fa particolare riferimento agli eccipienti delle varie forme considerate, che possono essere utilizzati in alternativa a quelli esplicitamente menzionati negli esempi qui di seguito illustrati, dipendentemente dalle esigenze formulativo-tecnologiche e che, comunque, possono essere scelti fra una larghissima serie di prodotti presenti sul mercato e ben noti agli esperti di tecnica farmaceutica e pertanto di nessuna originalità inventiva.

Va precisato ancora che il dosaggio dei principi attivi, esplicitato negli esempi, à ̈ puramente indicativo e comunque compreso nel range di dosaggi rivendicato nella presente domanda di brevetto e cioà ̈ variabile fra 125 e 2000 mg (preferibilmente fra 250 e 1000) giornalieri, espressi in termini di GB, per i derivati della glucosamina e variabile fra 30 e 360 mg (preferibilmente fra 60 e 240 mg)per l'EGCG.

Poiché, inoltre, l'associazione, oggetto dell'invenzione, non esclude l'inclusione di sostanze complementari che possano contribuire ad un ulteriore miglioramento del reciproco effetto sinergico dei principi attivi rivendicati, à ̈ evidente che eventuali ed opportune modifiche formulative andranno studiate di caso in caso dipendentemente da qualità,quantità e caratteristiche reologiche delle sostanze complementari di nuova istituzione.

Esempio 1: Compresse per uso orale

Le formulazioni riportata nelle tabelle 1 e 2, oltre ai principi attivi, comprendono eccipienti (con descrizione della corrispondente funzione tecnologica)di normale impiego nella preparazione di compresse da utilizzarsi per somministrazione orale dell'oggetto della presente invenzione da solo o associato ad altri eventuali ingredienti attivi. Nel caso specifico va precisato che la tecnica di veicolazione delle dosi prescelte di ingredienti attivi in una compressa, richiede solo operazioni che sono tecnologicamente ben note e del tutto normali per un qualsiasi tecnico del settore e cioà ̈: - pesata dei singoli componenti la formulazione - granulazione a umido dei principi attivi e cellulosa microcristallina con soluzione acquosa di polivinilpirrolidone K-25 in un opportuno granulatore (granulato A);

- essiccamento del granulato A in stufa a circolazione d'aria a temperatura non superiore a 50°C e fino a peso costante (à ̈ utilizzabile qualsiasi altro tipo di essiccamento purché previamente validato);

- setacciatura del granulato A con gli altri componenti la formulazione;

- preparazione della miscela di compressione per setacciatura e successiva omogeneizzazione del granulato A con gli altri componenti la formulazione in un opportuno miscelatore;

- compressione della risultante miscela in un'opportuna comprimitrice automatica con ottenimento finale di compresse aventi forma e dimensioni opportune.

Tabella 1: Esempio di formulazione in compresse contenenti CA e EGCG come componenti attivi

Ingredienti mg/compressa Funzione tecnologica Principi attivi

Condramina<(1)(2)>407,7 Ingrediente funzionale (corrisponde .a GB) (250)

EGCG (sotto forma di e- 60 Ingrediente funzionale stratto secco)<(2)>

Eccipienti

Cellulosa microcrist.<(2)>36,7 Diluente/disintegrante Polivinilpirrolidone K-25<(2)>24,3 Legante Carbossimetil cellulosa soq.b. Disaggregante dica cross-lincata<(3)>

Talco<(3)>q.b. Lubrif./antiaderente Mg stearato<(3)>q.b. Lubrif./antiaderente Acqua<(4)>q.b. Supporto formulativi (1) La quantità di CA à ̈ formulata e calcolata in modo che il rapporto fra NAG e SSA, in termini di peso molecolare sia 2:1 (ponderalmente 75,7% di NAG e 24,3% di SSA) e tale da corrispondere ad un contenuto, espresso in GB, pari a 500 mg(PM di NAG = 221,2 ; PM di GB = 179,2 : in termini ponderali 221,2 di NAG corrispondono pertanto a 179,17 mg di GB).

(2) Utilizzati nella preparazione del granulato A.

(3) Le quantità assolute e relative di questi eccipienti dipendono dalle dimensioni e forma del punzone di compressione, dal tipo di comprimitrice e dal sistema di caricamento delle polveri nella camera di compressione in essa installato.

(4) L'acqua viene impiegata nella preparazione del granulato A e la sua quantità relativa ai componenti del granulato stesso dipende dal tipo e dalle dimensioni del granulatore impiegato. Essa viene eliminata in fase di essiccamento.

Tabella 2: Esempio di formulazione in compresse contenenti GSCNa e EGCG come componenti attivi

Ingredienti mg/compressa Funzione tecnologica Principi attivi

Glucosamina solfato cristallina

400,0 Ingrediente funzionale sale di Na GSCNa)<(1)(2)>

(corrispondente a GB) (250)

EGCG (sotto forma di estratto 60 Ingrediente funzionale secco)<(2)>

Eccipienti

Cellulosa microcrist.<(2)>36,1 Diluente/disintegrante Polivinilpirrolidone K-25<(2)>23,9 Legante Carbossimetil cellulosa sodica

q.b. Disaggregante cross-lincata<(3)>

Talco<(3)>q.b. Lubrif./antiaderente Mg stearato<(3)>q.b. Lubrif./antiaderente Acqua<(4)>q.b. Supporto formulativi (1) La GSCNa à ̈ un sale misto nel quale glucosamina,

ioni solfato, sodio e cloruro sono presenti in proporzioni stechiometriche pari a 2:1:2:2.

Nella presente formulazione à ̈ dosata in modo

tale da corrispondere ad un contenuto, espresso

in GB, pari a 250 mg (Peso molecolare di GSCNa sodico = 573,32; peso molecolare di GB = 179,17: in termini ponderali pertanto 573,32 mg

di GSCNa corrispondono a 358,34 mg di GB).

(2) Utilizzati nella preparazione del granulato A. (3) Vedi nota (3) della tabella 1.

(4) Vedi nota (4) della tabella 1.

Esempio 2: Capsule per uso orale

Le formulazioni riportate nelle tabelle 3 e 4, oltre ai principi attivi, comprendono eccipienti (con descrizione della corrispondente funzione tecnologica),che possono essere impiegati nella preparazione di capsule di gelatina dura da utilizzarsi per la somministrazione orale dell'oggetto della presente invenzione da solo o associato ad altri eventuali ingredienti attivi.

Anche in questo caso la tecnica di veicolazione delle dosi prescelte dei principi attivi nella forma farmaceutica prescelta, richiede solo operazioni che sono tecnologicamente ben note e del tutto normali per un qualsiasi tecnico del settore e cioà ̈: - pesata dei singoli componenti la formulazione; - preparazione della miscela da incapsulare per omogeneizzazione a secco in un opportuno miscelatore;

- ripartizione finale in un'opercolatrice automatica in capsule di gelatina dura di dimensione opportuna e del colore desiderato.

Tabella 3: Esempio di formulazione in capsule contenenti CA e EGCG come principi attivi

Ingredienti mg/capsula Funzione tecnologica Principio att.

Condramina<(1)>407,7 Ingrediente funzionale (corrispondente a GB) (250)

EGCG (sotto forma di estrat- 60

to secco)

Eccipienti

Cellulosa microcristallina<(2)>q.b. Diluente/disintegrante Talco<(2)>q.b. Lubrificante/antiaderente Mg stearato<(2)>q.b. Lubrificante/antiaderente SiO2q.b. Antiaderente

(1) Vedi quanto già specificato nella nota (1) della tabella 1 per il calcolo del dosaggio di CA

(2) e dei rapporti ponderali fra NAG e SSA.

(3) Impiego e quantità assolute e relative degli eccipienti dipendono dalla dimensione delle capsule utilizzate come veicolo di somministrazione e dal tipo/sistema di dosaggio installato sull'opercolatrice impiegata nella ripartizione della formulazione in capsule di gelatina dura.

Tabella 4: Esempio di formulazione in capsule contenenti GSCNa e EGCG come principi attivi

Ingredienti mg/capsula Funzione tecnologica Principio att.

Glucosamina solfato cristal-407,7 Ingrediente funzionale lina sale di Na (GSCNa)<(1)>

(corrispondente a GB) (250)

EGCG (sotto forma di estratto 60 Ingrediente funzionale secco)

Eccipienti

Cellulosa microcristallina<(2)>q.b. Diluente/disintegrante Talco<(2)>q.b. Lubrificante/antiaderente Mg stearato<(2)>q.b. Lubrificante/antiaderente SiO2q.b. Antiaderente

(1) Vedi quanto già specificato nella nota (1) della tabella 2 per il razionale del dosaggio della

GSCNa.

(2) Impiego e quantità assolute e relative degli eccipienti dipendono dalla dimensione delle capsule utilizzate come veicolo di somministrazione e dal tipo/sistema di dosaggio installato sull'opercolatrice impiegata nella ripartizione della formulazione in capsule di gelatina dura.

Esempio 3: Bustine termosaldate contenenti polvere

per la preparazione estemporanea di soluzioni/sospensioni bevibili

Le formulazioni, riportate nelle tabella 5 e 6,

oltre ai principi attivi, comprendono eccipienti (con descrizione della corrispondente funzione tecnologica), che possono essere impiegati nell'utilizzo dell'oggetto della presente invenzione, da solo o eventualmente associato ad altri eventuali ingredienti attivi, nella formulazione di una polvere per la preparazione di soluzioni/sospensioni estemporanee da assumere per via orale.

A questo scopo le formulazione in oggetto possono essere opportunamente veicolate in una bustina termosaldata e costituita da uno strato esterno di carta, un interfaccia di alluminio ed uno strato interno di polietilene, utilizzando operazioni di preparazione ben note ed utilizzabili da qualsiasi staff tecnico del settore e cioà ̈:

- pesata e setacciatura dei singoli componenti la formulazione;

- preparazione della miscela dei componenti per omogeneizzazione a secco in un opportuno miscelatore;

- termoformatura delle bustine in un'opportuna linea automatica;

- riempimento e sigillatura, sulla stessa linea automatica, di bustine, aventi la forma e le dimensioni desiderate e contenenti la polvere

da utilizzare per la preparazione di soluzioni/sospensioni da assumere estemporaneamente

per via orale.

Tabella 5: Esempio di formulazione in polvere per

la preparazione di soluzioni/sospensioni da assumere estemporaneamente per via orale contenenti CA e

EGCG come principi attivi

Ingredienti mg/bustina Funzione tecnologica Principio att.

Condramina<(1)>815.4 Ingrediente funzionale (corrispondente a GB) (500)

EGCG (sotto forma di e-120 Ingrediente funzionale stratto secco)

Eccipienti

Sorbitolo<(2)>q.b. Diluente/dolcificante Sodio citrato tribasico

q.b. Correttore di acidita’ biidrato<(2)>

Acido citrico monoidraq.b. Esaltazione sapore to<(2)>

Biossido di silicio<(2)>q.b. Antiaggregante

Altri<(3)>q.b. Dolcificanti/aromatizzanti (1) Vedi quanto già specificato nella nota (1) della tabella 1 per il calcolo del dosaggio di CA

e dei rapporti ponderali fra NAG e SSA.

(2) Le quantità assolute e relative di questi eccipienti dipendono dal tipo di imbustinatrice impiegata e dalle dimensioni delle bustine.

(3) Agenti aromatizzanti e dolcificanti possono essere aggiunti liberamente, dipendentemente dalle preferenze organolettiche.

Tabella 6: Esempio di formulazione in polvere per

la preparazione di soluzioni/sospensioni da assumere estemporaneamente per via orale contenenti GSCNa

e EGCG come principi attivi

Ingredienti mg/bustina Funzione tecnologica Principio att.

Glucosamina solfato cristalli-800,0 Ingrediente funzionale na sale di Na (GSCNa)<(1)>

(corrispondente a GB) (500)

EGCG (sotto forma di estratto

120 Ingrediente funzionale secco)

Eccipienti

Sorbitolo<(2)>q.b. Diluente/dolcificante Sodio citrato tribasico biiq.b. Correttore di acidita’ drato<(2)>

Acido citrico monoidrato<(2)>q.b. Esaltazione sapore Biossido di silicio<(2)>q.b. Antiaggregante

Altri<(3)>q.b. Dolcificanti/aromatizzanti (1) Vedere quanto già specificato nella nota (1)

della tabella 2 per il razionale del dosaggio della GSCNa

(2) Le quantià assolute e relative di questi eccipienti dipendono dal tipo di imbustinatrice impiegata e dalle dimensioni delle bustine

(3) Agenti aromatizzanti e dolcificanti possono essere aggiunti liberamente dipendentemente dalle preferenze organolettiche

Esempio 4. Compresse disperdibili per la preparazione estemporanea di sospensioni bevibili

Le formulazioni riportate nelle tabelle 7 e 8, oltre ai principi attivi comprendono eccipienti (con descrizione delle corrispondenti funzioni tecnologiche), che possono essere impiegati nell'utilizzo dell'oggetto della presente invenzione, da solo o eventualmente associato ad altri eventuali ingredienti attivi, nella formulazione di una sospensione estemporanea da assumere per via orale.

Anche in questo caso va precisato che la tecnica di veicolazione delle dosi prescelte degli ingredienti attivi, in questo tipo di forma farmaceutica, richiede solo operazioni tecnologicamente ben note e del tutto routinarie per un qualsiasi tecnologo del settore e cioà ̈:

- pesata e setacciatura dei singoli componenti la formulazione;

- sospensione di una porzione dell'amido totale (circa 26% ) in acqua a 80C° e agitazione vigorosa della risultante sospensione a dar luogo alla sospensione legante (SL);

- miscelazione e setacciatura dei principi attivi e di altri ingredienti e cioà ̈ ulteriore porzione di amido (circa 53% del totale), cellulosa microcristallina, parte della SiO2(50% del totale) e sodio amido glicolato a dare il mix A; - granulazione a umido del mix A con SL a 60°C in opportuno granulatore (granulato A);

- essiccamento del granulato A in stufa a circolazione d'aria a temperatura non superiore a 50°C fino a raggiungimento dell'umidità residua stabilita compresa tra l'1,5 ed il 2,5% (à ̈ utilizzabile qualsiasi altro tipo di essiccamento purché previamente validato);

- pre-setacciatura del granulato A e del resto dei componenti la formulazione e cioà ̈ il restante amido (21% del totale), la restante SiO2, talco, magnesio stearato, dolcificanti e aromatizzanti vari a dare la miscela di compressione (MC);

- compressione di MC in una opportuna comprimitrice automatica con ottenimento finale di compresse disperdibili aventi forma e dimensioni opportune.

Tabella 7. Esempio di formulazione di compresse disperdibili per la preparazione estemporanea di soluzioni/sospensioni da assumere oralmente e contenenti CA e EGCG come principi attivi

Ingredienti mg/compressa Funzione tecnologica Principi attivi

Condramina<(1)(3)>407,7 Ingrediente funzionale (corrisondente a GB) (250)

EGCG (sotto forma di estratto 60 Ingrediente funzionale secco)<(3)>

Eccipienti

Amido di mais<(2)(3)(4)>97,0 Legante

Cellulosa microcristallina<(3)>255,0 Diluente/disintegrante Sodio amido glicolato<(3)>59,5 Disaggregante

SiO<(3)(4)>

217,0 Antiaderente Talco<(3)>11,1 Lubrif./antiaderente Mg stearato<(3)>13,6 Lubrif./antiaderente Altri<(4)(5)>q.b. Dolcificanti/Aromatizz. Acqua<(6)>q.b. Supporto formulativi (1) Vedi quanto già specificato nella tabella 1-nota (1) per il calcolo del dosaggio di CA e

dei rapporti ponderali fra NAG e SSA

(2) Utilizzato nella preparazione della sospensione legante

(3) Ingredienti attivi ed altri eccipienti utilizzati nella preparazione del mix A e del granulato A dopo trattamento con la sospensione legante.

(4) Resto degli eccipienti che, omogeneizzati con

il granulato A, danno luogo alla miscela di compressione (MC)

(5) Agenti aromatizzanti e dolcificanti possono essere aggiunti liberamente dipendentemente dalle preferenze organolettiche.

(6) L'acqua viene impiegata nella preparazione della sospensione legante e viene eliminata nella

fase di essiccamento del granulato A.

Tabella 8. Esempio di formulazione di compresse disperdibili per la preparazione estemporanea di soluzioni/sospensioni da assumere oralmente e contenenti GSCNa e EGCG come principi attivi

Ingredienti mg/compressa Funzione tecnologica Principi attivi

Glucosamina solfato cristal-400.0 Ingrediente funzionale lina sale di Na (GSCNa)<(1)(3)>

(corrispondente a GB) (250)

EGCG (sotto forma di estratto 60 Ingrediente funzionale secco)<(3)>

Eccipienti

Amido di mais<(2)(3)(4)>95.2 Legante

Cellulosa microcristallina<(3)>250.5 Diluente/disintegrante Sodio amido glicolato<(3)>58.5 Disaggregante

SiO<(3)(4)>

216.7 Antiaderente Talco<(3)>10.9 Lubrif./antiaderente Mg stearato<(3)>13.4 Lubrif./antiaderente Altri<(4)(5)>q.b. Dolcificanti/Aromatizz. Acqua<(6)>q.b. Supporto formulativi (1): Vedi quanto già specificato nella tabella 2-nota(1) per il razionale del dosaggio della

GSCNa

(2),(3),(4),(5),(6): Vedi corrispondenti note della tabella 7

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione per somministrazione orale ad uso farmaceutico o di integrazione alimentare, utile per la cura della pelle, comprendente epigallocatechin-gallato (EGCG) ed un derivato di glucosamina scelto tra un suo sale semplice o misto o ancora altri derivati della glucosamina quali N-acetil glucosamina (NAG) o sue associazioni molecolari con il solfato di un metallo alcalino.
2. 2. Composizione secondo la rivendicazioni 1, in cui detto derivato di glucosamina à ̈ scelto tra glucosamina cloridrato e glucosamina solfato cristallina.
3. 3. Composizione secondo la rivendicazione 1, comprendente N-acetilglucosamina ed un solfato di metallo alcalino in rapporto di equivalenti fra 1:0,5 e 1:3, preferibilmente 1:1.
4. 4. Composizione secondo le rivendicazioni 1 o 2, comprendente glucosamina solfato cristallina ed EGCG in rapporto di peso molecolare compreso tra 2,15:1 e 10,7:1, preferibilmente 5,4:1, ovvero, in termini ponderali, tra 3,33:1 e 13,33:1 e preferibilmente 6,77:1.
5. 5. Composizione secondo le rivendicazioni 1 o 3, contenente l'associazione di N-acetilglucosamina e solfato di sodio anidro in rapporto di peso molecolare 2:1,individuata come Condramina (CA),ed in cui la suddetta associazione ed EGCG sono in rapporto di peso molecolare compreso tra 2,15:1 e 10,7:1, preferibilmente circa 5,4:1.
6. 6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente inoltre sostanze complementari scelte dal gruppo che consiste di antiossidanti, vitamine, aminoacidi, sali minerali, estratti vegetali e sostanze utili al trofismo ed alla salute della pelle.
7. 7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, comprendente inoltre veicoli, eccipienti, coloranti, agenti dolcificanti e/o agenti aromatizzanti.
8. 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in forma idonea per somministrazione orale, scelta tra compresse, capsule, polveri da utilizzare per l'ottenimento estemporaneo di una soluzione/sospensione bevibile, barrette, alimenti per usi particolari e preparazioni salutistiche.
9. 9. Impiego di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8 per la preparazione di un medicamento o alimento o integratore alimentare per combattere i radicali liberi ed i processi di invecchiamento della pelle.
10. 10. Impiego secondo la rivendicazione 9 per la preparazione di un medicamento, integratore alimentare o alimento comprendente glucosamina solfato cristallina o N-acetilglucosamina in rapporto molare con solfato di sodio anidro 2:1 ed atto alla somministrazione contemporanea giornaliera di glucosamina in dosa da 125 a 2000 mg, preferibilmente da 250 a 1000 mg e di EGCG in dose compresa tra 30 e 360 mg, preferibilmente da 60 a 240 mg.
11. 11. Impiego di EGCG per potenziare l'attività dermotrofica di derivati della glucosamina, ove detto impiego comprende la preparazione di una composizione contenente un derivato di glucosamina e l'addizione a detta composizione di EGCG.
12. 12. Impiego secondo la rivendicazione 11 per potenziare l'attività di un derivato di glucosamina nella biosintesi di collagene, nella biosintesi di elastina e/o nella biosintesi di acido ialuronico.