ITTO20070719A1

ITTO20070719A1 - Superfici di titanio multifunzionali per osteointegrazione.

Info

Publication number: ITTO20070719A1
Authority: IT
Inventors: Sara Ferraris; Silvia Spriano; Enrica Verne
Original assignee: Torino Politecnico
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2007-10-12
Publication date: 2009-04-13
Also published as: EP2214732B1; ES2427043T3; WO2009047730A2; WO2009047730A3; KR20100100785A; EP2214732A2; WO2009047730A8

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Superfici di titanio multifunzionali per osteointegrazione "

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione dì dispositivi prostetici comprendenti titanio o una lega di titanio, in generale di dispositivi impiantabili costituiti in tutto o in parte da titanio e/o sue leghe, mediante un trattamento di modifica superficiale atto a rendere bioattiva la superficie trattata.

L'integrazione tra tessuto ed impianto e la rigenerazione del tessuto osseo danneggiato sono elementi fondamentali per il successo di un intervento di chirurgia protesica, sia nel settore ortopedico che dentale, e costituiscono ad oggi un problema aperto. A questo proposito, di particolare interesse è la realizzazione, per gli impianti, di superfici che risultino biomimetiche, cioè capaci di stimolare la rigenerazione tissutale sia da un punto di vista inorganico, sia biologico.

L'invenzione si situa in questo contesto e riguarda la modifica superficiale di titanio o sue leghe (utilizzate per artroprotesi, impianti dentali o in genere per impianti medicali in titanio o sue leghe), mediante trattamento termochimico ed eventualmente funzionalizzazione superficiale con biomolecole, in modo che queste esplichino in vivo un comportamento bioattivo sia dal punto di vista inorganico, sia da quello biologico.

Con il termine di comportamento bioattivo inorganico, si indica la capacità, da parte della superficie, di adsorbire preferenzialmente Ca e P dai liquidi fisiologici ed indurre la precipitazione di idrossiapatite, ossia della componente minerale dell'osso. Con il termine di comportamento bioattivo biologico si indica la capacità, da parte della superficie, di stimolare la risposta biologica (adesione, proliferazione, differenziazione cellulare), in modo accelerare la crescita della componente organica dell'osso.

Una superficie che sia in grado di stimolare contemporaneamente entrambe le attività, con un comportamento sinergico tra di esse, risulta essere un materiale multifunzionale, adatto per una rapida ed efficace osteointegrazione di un impianto permanente .

Tale comportamento, nel caso di titanio e sue leghe, deriva dalla composizione chimica, struttura cristallografica, morfologia ed energia superficiale dell'ossido superficiale che il metallo espone.

Diversi trattamenti sono stati proposti in letteratura scientifica e brevettuale in merito alla bioattività, dal punto di vista inorganico, del titanio e delle sue leghe.

US 5 609 633 descrìve un materiale di impianto osseo con un substrato di titanio con uno strato superficiale comprendente ossido di titanio ed una fase amorfa di titanato alcalino, ottenuto immergendo il substrato di titanio in una soluzione alcalina e successivo riscaldamento per formare uno strato stabilizzato di titanato alcalino.

US 6 183 255 descrive impianti dentari o ortopedici, dotati di funzionalità biologica, ottenuti mediante trattamento chimico con idrossido di sodio, oppure con un trattamento acido, seguito da un trattamento alcalino ed eventuale ossidazione in aria.

In letteratura è altresì riportato l'impiego di idrossido di idrogeno per indurre bioattività, come descritto ad esempio in Biomaterials, 23, 1353-1357 (2002), Biomaterials, 23, 3103-3111 (2002), Biomaterials, 22, 875 (2001) e Surface & Coatings Technology, 195, 252-257 (2005).

Scopo della presente invenzione è quello di fornire un procedimento di modifica superficiale di titanio o sue leghe mediante un trattamento termochimico atto a produrre una superficie altamente idrossilata e si presenta vantaggioso in quanto non richiede lunghi tempi di trattamento in soluzioni aggressive, non danneggia meccanicamente la superficie trattata e non ne compromette la resistenza a fatica.

Un altro scopo dell'invenzione è quello di fornire un procedimento che fornisce una superficie particolarmente idonea ad un successivo eventuale trattamento di funzionalizzazione superficiale con biomolecole .

In vista di tali scopi, costituisce oggetto dell'invenzione un procedimento, quale definito dalle rivendicazioni che seguono.

Nei disegni annessi:

la fig. 1 è una micrografia SEM che illustra la microrugosità della superficie di titanio a seguito di attacco acido (a) e la microrugosità dopo attacco acido e trattamento in acqua ossigenata (b);

la fig. 2 è uno spettro XPS nella regione dell’ossigeno e mostra l'esposizione di gruppi ossidrili nel caso dell'ossido nativo (a) e sulla superficie modificata (b);

la fig. 3 è una micrografia SEM che illustra la precipitazione di idrossiapatite sulla superficie del materiale trattato secondo l'invenzione dopo immersione in SBF per 15 giorni;

la fig. 4 è uno spettro di analisi XRD dopo 15 giorni in SBF;

la fig. 5 illustra spettri XRD per i campioni a seguito di trattamento chimico e termico;

la fig. 6 illustra i risultati di analisi XPS di campioni attivati mediante trifluoroetanosolfonil cloruro;

la fig. 7 illustra spettri XPS di campioni funzìonalizzati con fosfatasi alcalina (ALP): analisi di Survey (a) , dettaglio della regione del carbonio (b); e

la fig. 8 è un istogramma che illustra l'attività enzimatica su campioni funzionalizzati.

Bioattività inorganica

La prima fase del trattamento è un attacco acido finalizzato a rimuovere l'ossido nativo presente sulla superficie del materiale di titanio o di lega di titanio ed a rendere questa macrorugosa. L'attacco acido è preferibilmente eseguito con l'impiego di acido fluoridrico diluito, ad esempio con una concentrazione da 3 M a 8 M, per un tempo compreso tra 1 e 5 minuti. La fig. la illustra la superficie macrorugosa di titanio, trattata con acido fluoridrico 5 M, per un tempo di 3 minuti.

A questo trattamento segue un'ossidazione controllata , realizzata con una soluzione di perossido di idrogeno di concentrazione variabile tra 15-70 volumi, preferibilmente ad una temperatura compresa tra 20°C e 80°C e per un tempo compreso tra 30 e 400 minuti, più preferìbilmente tra 30 e 225 minuti.

La fig. lb illustra la microrugosità della superficie ottenuta a seguito di ossidazione con H2O2, con concentrazione di 40 volumi per 225 minuti a 60°C.

Il trattamento di ossidazione deve essere eseguito in modo tale da evitare la ripassivazione della superficie tra le due operazioni di attacco acido e dì ossidazione controllata.

I parametri del processo sono stati ottimizzati per evitare la formazione di cricche superficiali. Lo strato di ossido sviluppato presenta un elevato numero di ossidrili (fig. 2b) ed una morfologia con rugosità e porosità sub-micrometrica (fig. lb). I gruppi ossidrili presentano un'energìa dì legame compresa tra 531,5 e 532,2 eV, che è intermedia tra quella dei gruppi OH acidi e basici, riportato in J. Biomed. Mater. Res. 55, 185-193 (2001).

Il materiale così trattato si presenta bioattivo da punto di vista inorganico. Esso infatti promuove la precipitazione di idrossiapatite dopo 15 giorni di permanenza in soluzione fisiologica simulata (SBF). La micrografia SEM (fig. 3) presenta la morfologia tipica dei precipitati, che risultano aggregati di piccole particelle sferiche. Lo spettro EDS evidenzia la loro composizione chimica qualitativa. Il rapporto Ca/P risulta 1,7, cioè molto vicino a quello stechiometrico per idrossiapatite (1,67) . La superficie del campione non coperta da particelle presenta un arricchimento in calcio e fosforo a seguito dell'immersione in SBF. Questo è indice di una capacità diffusa della superficie di adsorbire questi elementi. L'analisi XRD (fig. 4) conferma la presenza di idrossiapatite sulla superficie; essa è presente in forma parzialmente amorfa con cristalliti di piccole dimensioni: questo è indicato dalla presenza di ampi picchi di diffrazione .

I campioni trattati chimicamente (prima in HF e poi in H2O2) sono stati successivamente sottoposti a trattamento termico per stabilizzare lo strato di ossido generato. Il trattamento termico può essere eseguito in un campo di temperature compreso tra 300°C e 600°C, sotto vuoto o in aria, o in atmosfera inerte, con una durata del trattamento da 1 a 8 ore. La morfologia superficiale e la bioattività sono mantenute a seguito di tale trattamento termico.

I gruppi ossidrili si dimostrano termicamente stabili, in quanto se ne riscontra la presenza dopo prolungato periodo dì stoccaggio e dopo trattamento termico .

Lo spessore e la cristallinità dello strato dì ossido possono essere modificati variando la temperatura e l'atmosfera impiegate nel trattamento termico (fig. 5). Si osserva, come prevedibile, un progressivo incremento del picco relativo all'anatasio con l'aumento della temperatura.

Inoltre, i test di fatica evidenziano un basso decremento della resistenza a trazione (2-15%) a seguito del trattamento; si può quindi ritenere che questo tipo di modifica superficiale non alteri significativamente le proprietà meccaniche del materiale .

Test biologici sono stati realizzati utilizzando osteoblasti umani di linea (MG 63) per valutare l’interazione cellule-materiale. Non sono state rilevate differenze nella produzione di LDH tra titanio trattato, non trattato e controllo: questo è indice che il trattamento non introduce significativi effetti citotossici.

E' stato osservato inoltre che le cellule aderiscono e si estendono sia sul titanio tal quale, che su quello trattato con la tipica morfologia poligonale, ma si può notare che sulla superficie trattata le cellule presentano un maggior numero di increspature e filopodi e mostrano una maggiore distensione .

Gli osteoblasti coltivati sulla superficie del titanio modificato superficialmente presentano un buon grado di proliferazione ed una produzione di ALP, collagene I ed osteocalcina significativamente più elevato rispetto ai controlli. Ciò significa che gli osteoblasti cresciuti sul materiale trattato presentano un maggior grado di differenziazione rispetto al titanio non trattato ed al controllo. Si ha quindi che la semplice modifica inorganica della superficie è in grado di influenzare la risposta biologica del materiale.

Bioattività biologica

Preferibilmente, il procedimento secondo l'invenzione comprende - come ulteriore stadio - un trattamento di funzionalizzazione della superficie di titanio o sue leghe con molecole organiche naturali o di sintesi coinvolte nei meccanismi di mineralizzazione del tessuto osseo(ad esempio proteine della matrice estracellulare, peptidi o enzimi coinvolti nel processo di adesione/proliferazione, proteine morfogenetiche, fattori di crescita, albumina, fibronettina, fosfatasi alcalina e simili). Il vantaggio della funzionalizzazione superficiale è la possibilità di ancorare alla superficie un quantitativo controllato di biomolecole, evitando il rischio di un utilizzo eccessivo, come quello conseguente all'iniezione locale o alla somministrazione sistemica.

Dispostivi prostetici o impianti medicali con superfici di titanio funzionalizzate con biomolecole sono descritti in US 2007/077346 e US 2004/083 006. In US 2007/077 346, le superfici di titanio sono rivestite con un corrispondente idruro che contiene una o più biomolecole; il processo di funzionalizzazione è eseguito mediante un trattamento elettrolitico, effettuato in presenza delle biomolecole .

Secondo US 2004/083 006, le superficie metalliche sono rivestite con uno strato di idrossido mediante un processo di elettrolisi effettuato in presenza di uno o più biomolecole.

Nell'ambito della presente invenzione, le biomolecole di interesse in grado di stimolare la risposta cellulare sono preferibilmente fissate in modo covalente sulla superficie di titanio o sue leghe, precedentemente resa bioattiva dal punto di vista inorganico. Il legame covalente diretto è stato scelto come meccanismo di ancoraggio, in quanto risulta più selettivo e consente un'adesione migliore rispetto al semplice adsorbimento o al rilascio dì carrier riassorbibili.

Il procedimento adottato di funzionalizzazione evita la silanizzazìone o l'utilizzo di molecole spacer che possono risultare tossiche (come la glutaraldeide) . In particolare, nel processo di funzionalizzazione adottato risulta di fondamentale importanza la presenza di gruppi ossidrili sulla superficie del metallo trattato, in quanto tali gruppi risultano essere il gruppo funzionale reattivo utile per le reazioni che portano alla funzionalizzazione della superficie.

In particolare, per questa modifica superficiale, la superficie del titanio è stata dapprima sottoposta ad attacco acido ed ossidazione controllata, come descritto precedentemente ed in seguito attivata con un cloruro organico, particolarmente con trifluoroetanosolfonil cloruro (TC), come già proposto in letteratura; vedasi ad esempio "Biochemical Surface Modification of CO-Cr-MO", D. A. Puleo, Biomaterials (17) (1996), 217-222 e "Direct Attachment of Fibronectine to Tresylchloride Activated Titanium", T. Hayakawa et al., J. Biomed. Mater. Res. 67 (2003), 684-688.

In uno specifico esempio di attuazione, la funzionalizzazione biologica è stata attuata con l'utilizzo dell'enzima fosfatasi alcalina (ALP), che è coinvolta nei processi di mineralizzazione dei tessuti duri; diversi lavori di letteratura suggeriscono che la sua applicazione locale promuove la crescita e la mineralizzazione del tessuto osseo danneggiato. Inoltre, ALP si presenta come una buona molecola modello, in quanto è piuttosto semplice da individuare. Si intende tuttavia che la fase di funzionalizzazione con biomolecole non è limitata all'esempio specifico descritto, essendo possibile utilizzare in generale proteine della matrice estracellulare o enzimi coinvolti nel processo di adesione/proliferazione cellulare, come sopra indicato .

Preferibilmente, l'attivazione mediante soluzione di trifluoroetanosolfonil cloruro si effettua a temperatura di reazione da 20°C a 50°C, con tempi da 10 minuti a 72 ore. Condizioni preferite sono una temperatura di 37°C per 48 ore.

La presenza di un rilevante quantitativo di gruppi ossidrili sulla superficie è fondamentale per la risposta del materiale a questa seconda fase .

La presenza del trifluoroetanosolfonil cloruro sulla superficie è stata determinata mediante analisi XPS (fig.6); il picco D (situato a circa 292 eV) è caratteristico dei legami C-F.

La fase finale prevede l'ancoraggio enzimatico alle superfici trattate. A tale fine, la biomolecole di interesse è posta in soluzione, preferibilmente in PBS, con una concentrazione preferibilmente compresa tra 2 e 40 mg/ml, per un tempo da 0.5 a 72 ore, ad una temperatura preferibilmente compresa tra 0°C e 50°C.

In un esempio specifico di attuazione, si è utilizzata una soluzione di ALP in PBS con concentrazione di 5 mg/ml con un tempo di incubazione di 24 ore a 4°C.

Si ottiene un ancoraggio diretto della molecola alla superficie del titanio, in quanto il trifluoroetanosolfonil cloruro si comporta come buon gruppo uscente.

La presenza dell'enzima è stata determinata mediante analisi XPS che rileva un incremento in carbonio ed azoto ed un decremento in ossido di titanio (fig. 7) sullo strato più esterno della superficie. Questo significa che essa risulta coperta da un film organico. Lo studio dettagliato della regione del carbonio evidenzia che questo picco presenta, come contributo prevalente, quello relativo ai legami C-O e C-N, caratteristici dell'enzima (fig. 7b - picco B a 286 eV). Il picco D (289 eV) è attribuibile ad anelli aromatici dell'enzima, paralleli alla superficie. Entrambi i segnali risultano significativamente differenti dalle contaminazioni organiche solitamente presenti sulla superficie del titanio.

L'attività dell'enzima a seguito dell'ancoraggio sulla superficie è stata determinata mediante analisi UV- visibile, a seguito della reazione con paranitrofenilfosfato . Questa reazione produce paranitrofenolo che, in ambiente alcalino, ha una colorazione gialla. L'intensità del giallo misurata spettrofotometricamente può essere correlata al quantitativo di ALP presente sulla superficie.

I risultati (fig. 8) mostrano che l'enzima ancorato alla superficie mantiene le sue attività e che l'intero processo di funzionalizzazione {idrossilazione, attivazione superficiale ed ancoraggio molecolare) è necessario per ottenere un'efficace funzionalizzazione .

Claims

RIVENDICAZIONI 1- Procedimento per la preparazione di un dispositivo prostetico o impianto medicale comprendente titanio o una lega di titanio, mediante un trattamento di modifica superficiale atto a rendere bioattiva la superficie di titanio o lega di titanio, caratterizzato dal fatto che comprende le fasi di: a) attacco acido per la rimozione dell'ossido nativo presente su detta superficie; e b) ossidazione superficiale con una soluzione di perossido di idrogeno, in modo da generare gruppi ossidrili legati a detta superficie.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che comprende, a seguito della fase b) , una fase: c) di trattamento termico per la stabilizzazione dello strato di ossido generato.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detta fase c) è condotta con trattamento termico a temperatura compresa tra 300°C e 600°C, per tempi da 1 a 8 ore in aria, vuoto o atmosfera inerte.
4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, caratterizzato dal fatto che detta fase a) dì attacco acido è effettuato con acido fluoridrico .
5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detta fase a) di attacco acido è attuata con l'impiego di acido fluoridrico diluito , avente una concentrazione molare compresa tra 1 e 10, per tempi da 0.5 a 30 minuti.
6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta fase b) di ossidazione superficiale è attuata con perossido di idrogeno avente una concentrazione tra 15-70 volumi, ad una temperatura compresa tra 20°C e 80°C e per un tempo compreso tra 30 e 400 min preferibilmente per un tempo tra 30 e 225 minuti .
7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che, a seguito delle fasi b)o c), comprende una fase di funzionalizzazione della superficie di titanio o sue leghe con biomolecole contenenti bioattività biologica) .
8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detto trattamento di funzionalizzazione è eseguito mediante d) attivazione della superficie di titanio o sue leghe, precedentemente trattata secondo le fasi a), b) ed opzionalmente c) con un cloruro organico, preferibilmente con trifluoroetanosolfonil cloruro puro o in soluzione; e e) incubazione delle superfici attivate con una soluzione contenente la biomolecola di interesse.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detta fase di attivazione con trifluoroetanosolfonil cloruro si effettua a temperatura di reazione da 20°C a 50°C, con tempi da 10 minuti a 72 ore.
10 . Procedimento secondo le rivendicazioni 8 o 9, caratterizzato dal fatto che detta fase e) di incubazione è attuata esponendo la superficie attivata ad una soluzione avente una concentrazione compresa tra 2 e 40 mg/ml, per un tempo da 0.5 a 72 ore, ad una temperatura compresa tra 0°C e 50°C.
11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 10, caratterizzato dal fatto che detta biomolecola è scelta tra molecole organiche naturali o di sintesi coinvolte nei meccanismi di mineralizzazione del tessuto osseo.
12. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 a 10, caratterizzato dal fatto che detta biomolecola è una biomolecola naturale, ricombinante o sintetica, scelta tra bioadesivi, fattori di adesione cellulare, biopolimeri, proteine del sangue, enzimi, proteine o biomolecole della matrice extracellulare, fattori di crescita, ormoni, peptidici, acidi deossiribonucleici (DNA), acidi ribonucleici (RNA), recettori, inibitori enzimatici, farmaci, anioni e cationi biologicamente attivi, peptidi, proteine morfogenetiche, adenosina monofosfato (AMP), adenosima difosfato (ADP), adenosina trifosfato (ATP), albumina, fibronettina, fosfatasi alcalina e combinazioni di queste.
13. Dispositivo impiantabile, particolarmente artroprotesì o impianto dentale, costituito in tutto o in parte da titanio o sue leghe, avente una superficie di titanio o sue leghe resa bioattiva ed ottenibile mediante un procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12.
14. Dispositivo impiantabile secondo la rivendicazione 13, ottenibile mediante il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, presentante la superficie bioattiva con gruppi ossidrili legati a detta superficie, detti gruppi ossidrile avendo un'energia di legame tra 531,5 e 532,2 eV.
15. Dispositivo impiantabile secondo le rivendicazioni 13 o 14, avente una superficie di titanio o sue leghe con rugosità micrometrica in combinazione con una rugosità-porosità submicrometrica.
16. Dispositivo impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 15, avente una superficie esente da cricche superficiali.
17. Dispositivo impiantabile secondo la rivendicazione 13, avente una superficie di titanio o sue leghe funzionalizzata con biomolecole, legate a detta superficie con legame covalente.
18. Dispositivo impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 17, in forma sterile.