KR101095962B1 - 임플란트 소재표면에서 효과적인 유전자 전달을 위한 표면처리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치과용 임플란트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체적합성에 유용한 유전자와 상기 유전자를 효과적으로 전달하기 위한 유전자 전달체가 결합된 유전자-유전자 전달 복합체가 표면에 코팅된 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 분자 생물학적인 방법에 의해 임플란트 표면에 유전자를 직접코팅시킴으로서, 임플란트 식립 이후, 상기 유전자가 직접 골아세포 내에서 지속적으로 세포를 증식시킴으로서 임플란트 소재의 생체적합성을 획기적으로 향상 시킬 수 있다. 따라서, 선택적 유전자를 골아세포 등에 직접전달이 가능하기 때문에, 지금까지 임플란트 시술시 동반되었던 염증반응 등의 치주질환과 관련하여 임플란트 시술이 부적합하였던 환자들에게도 다양한 맞춤형 유전자 선별을 통하여, 보다 폭넓고 성공적인 시술이 가능하다.

Description

임플란트 소재표면에서 효과적인 유전자 전달을 위한 표면처리방법{Surface treatment methods for effective gene delivery on dental implant surface}

본 발명은 치과용 임플란트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체적합성에 유용한 유전자와 상기 유전자를 효과적으로 전달하기 위한 유전자 전달체가 결합된 유전자-유전자 전달 복합체가 표면에 코팅된 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트에 관한 것이다.

임플란트 시술의 실패의 주요 원인은 크게 임플란트 식립 시, 골과 임플란트 표면의 초기 접촉 불량과 코팅 표면층의 박리현상 등 임플란트 소재에 관한 문제와 임플란트 식립 이후, 골세포 내에 축적되는 활성산소와 각종 산화물질에 기인하는 생체거부반응과 스트레스, 주위염(Periimplantitis) 발생 등으로 대별할 수 있다.

현재, 임플란트 소재로는 우수한 화학 기계적 특성을 갖는 티타늄 및 그 합금이 가장 널리 사용되고 있으나 생체활성이 없어, 상용 시 생체활성향상과 골과의 접촉면 증가를 위해 인산이나 인산칼슘코팅을 비롯하여 양극산화법을 비롯하여 나노튜브형성 등 다양한 화학적, 물리적 표면처리방법들이 적용되고 있다.

또한, 임플란트 식립 이후, 골형성과 골조직 반응증진을 통한 생체적합성을 향상시키기 위해, 합성펩타이드나 BMP 등의 골형성 단백질을 임플란트 소재표면에 결합시키거나, 식립와 주위에 주입하는 방법들이 시도되고 있다.

그러나 이러한 골형성을 유도하는 합성펩타이드나 BMP 등의 단백질은 매우 고가라는 경제적인 측면과 더불어, 임플란트 식립 시, 임플란트 표면에 결합된 생체활성물질의 유실 등 고정화기술에 관한 문제점이 발생되고 있으며, 식립와 주위에 주입하는 방법 역시, 단백질 형성이 지속적이지 못하고 단기간의 일회적인 소모성 방법이 문제점이다.

본 발명은 기존의 단순한 기계적, 물리적 표면처리 방법이나 골아세포의 증식을 유도하기 위해 펩타이드나 BMP등의 다양한 단백질을 주입하는 방법에 비해, 저가이면서 골아세포를 지속적으로 증식시키며, 향후 임플란트 시술시 동반되는 염증반응 등의 치주질환과 관련하여 임플란트 시술이 부적합한 환자들에게도 성공적인 임플란트 시술이 가능하도록 하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 치과용 임플란트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체적합성에 유용한 유전자와 상기 유전자를 효과적으로 전달하기 위한 유전자 전달체가 결합된 유전자-유전자 전달 복합체가 표면에 코팅된 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트에 관한 것이다.

상기 유전자는 항산화, 함염, 항스트레스와 관련된 생체적합성 및 골형성 증진에 효과적인 유전요소를 가지는 유전자라면 어떠한 것이라도 사용가능하며, 예를 들면, LacZ, PPAR-gamma, c-myb,PTEN 등이 사용될 수 있다. 하기 실시예에서는 락 오페론(Lac Z) 유전자를 사용하였다.

상기 유전자 전달체는 생체적합성 및 골 형성 증진과 관련된 유전자를 골아 세포 등에 효과적으로 전달하는 역할을 하는 벡터로서, 키토산-나노골드, Adenovirus 벡터,pc3DNA 벡터 등 특별히 그 종류가 제한되는 것은 아니나, 생체 분해성이 우수하고 면역거부반응이 없는 키토산-나노골드 유전자 전달체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 유전자-유전자 전달 복합체는 유전자 및 유전자 전달체의 결합시 유전자 및 유전자 전달체의 혼합비를 1:1 내지 1:10(vol%)으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태는 치과용 임플란트 표면의 처리방법에 관한 것으로서, 유전자 및 유전자 전달체를 결합하는 유전자-유전자 전달 복합체의 형성 단계; 상기 형성된 유전자-유전자 전달 복합체를 치과용 임플란트 표면에 코팅하는 코팅단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 치과용 임플란트 표면의 처리방법에서, 상기 유전자는 항산화, 함염, 항스트레스와 관련된 생체적합성 및 골형성 증진에 효과적인 유전요소를 가지는 유전자라면 어떠한 것이라도 사용가능하며, 예를 들면, LacZ, PPAR-gamma,c-myb,PTEN 등이 사용될 수 있다. 하기 실시예에서는 락 오페론(Lac Z) 유전자를 사용하였다.

또한, 상기 유전자 전달체는 생체적합성 및 골 형성 증진과 관련된 유전자를 세포에 효과적으로 전달하는 역할을 하는 벡터로서, 키토산-나노골드, Adenovirus 벡터,pc3DNA 벡터 등 특별히 그 종류가 제한되는 것은 아니나, 생체 분해성이 우수하고, 면역거부반응이 없으며 유전자 전달효율이 높은 키토산-나노골드 유전자 전달체를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 유전자-유전자 전달 복합체의 형성 단계에서는 유전자 및 유전자 전달체의 혼합비를 1:1 내지 1:10(vol%)으로 하여, 음전하를 가지는 유전자와 양전하를 가지는 유전자 전달체를 전기적으로 결합시켜 유전자-유전자 전달 복합체를 형성한다.

상기 코팅단계는 유전자-유전자 전달 복합체를 농도 10 내지 100㎍/㎠농도로, 보다 바람직하게는 10 내지 50㎍/㎠로 임플란트 표면에 분사(spreading)하여 임플란트 표면을 코팅할 수 있다.

상기 치과용 임플란트의 표면 처리방법은, 무균 건조 단계, 유전자 고정단계, 세포 독성 제거단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 후, 1 내지 10 시간 동안 실시한 무균 건조 단계와, 0.1 내지 1wt% 포름알데히드 고정 용액(Formaldehyde fix solution)을 이용한 dipping 방법으로 유전자 고정단계를 거친 후, phosphate buffer saline으로 세척하여 세포 독성을 제거하였다.

본 발명에 의하면, 분자 생물학적인 방법에 의해 임플란트 표면에 유전자를 직접코팅시킴으로서, 임플란트 식립 이후, 상기 유전자가 직접 골아세포 내에서 지속적으로 세포를 증식시킴으로서 임플란트 소재의 생체적합성을 획기적으로 향상 시킬 수 있다. 따라서, 선택적 유전자를 골아세포 등에 직접전달이 가능하기 때문에, 지금까지 임플란트 시술시 동반되었던 염증반응 등의 치주질환과 관련하여 임플란트 시술이 부적합하였던 환자들에게도 다양한 맞춤형 유전자 선별을 통하여, 보다 폭넓고 성공적인 시술이 가능하다.

도 1은 LNAC로 개질된 키토산과 Hydrogen tetrachloaurate이 결합된 키토산-나노골드 유전자 전달체의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 키토산-나노골드 유전자 전달체의 결합 정도를 확인하기 위하여, 자외선-가시광선 분광 광도계(UV/VIS Spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 티타늄 임플란트 소재 표면에 유전자-유전자 전달 복합체를 코팅한 후, 세포 배양 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 유전자 및 유전자 전달체가 결합한 유전자-유전자 전달 복합체의 전기영동 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 티타늄 임플란트 소재 표면에 코팅 된 유전자-유전자 전달 복합체에 대한 SEM-EPMA 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 유전자의 확보 - LacZ 유전자

본 발명의 실시예에 사용된 유전자는 생체적합성과 항산화을 비롯하여 항염, 세포증식 및 분화 등에 요구되는 유전자들을 세포내 전이 가능성을 확인시키기 위하여, 면역조직화학 염색법(immunohistochemistry staining)으로 확인 가능한 LacZ 유전자를 사용하였다.

LacZ 유전자의 발현확인은 β-galactosidase에 의해 분해되어 푸른 색을 나타내는 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopy ranoside)을 사용하여 수행하였다.

한편, LacZ 유전자의 대량 확보를 위해 pc3DNA 벡터에 LacZ 유전자를 삽입한 후, 형질전환된 대장균 DH5a에서 대량 배양하여 수확하였다.

2. 유전자 전달체의 제조

생체내 적합성이 우수하며, 비독성인 키토산을 유전자 전이 전달체로 구성하기 위하여 천연 키토산을 아민기가 많은 N-acetyl cystin(LNAC)으로 개질하였다.

상기와 같이 LNAC로 개질된 수용성 키토산을 sodium borohydrate(NaBH)의 환원작용에 의해 나노골드입자를 형성하는 Hydrogen tetrachloaurate와 결합시켜, 나노수준의 양전하를 띠는 유전자 전달체를 제조하였다.

상기방법에 의해 제조된 평균 5nm (20nm 이하)의 키토산-나노골드 유전자 전달체는 도 1에 나타난 바와 같다. 도 2는 상기 키토산-나노골드 유전자 전달체의 결합 정도를 확인하기 위하여, 자외선-가시광선 분광 광도계(UV/VIS Spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정한 것을 나타내는 것인데, 흡광도 530nm에서 강한 피크가 형성되는 것으로 보아, LNAC로 개질된 키토산과 Hydrogen tetrachloaurate가 잘 결합하였음을 보여주고 있다.

3. 유전자와 유전자 전달체가 결합된 ‘유전자-유전자 전달 복합체’의 제조

유전자와 유전자 전달체가 결합된 유전자-유전자 전달복합체의 제조는 상기 공정에 의해서 제조된 양전하를 갖는 키토산 나노 골드 유전자 전달체와 음전하를 갖는 LacZ 유전자를 각각의 비율로 조성하고 30분에서 6시간 동안 실온에서 반응시켜 유전자와 유전자 전달체를 결합시킴으로써 유전자 전달 복합체를 제조하였다.

도 3에 의하면, LacZ 유전자와 키토산 나노 골드 유전자 전달체의 결합비를 1:2로 하였을 때가 1:4로 하였을 때 보다 세포 증식이 활발히 일어남을 확인 할 수 있다.

또한, 상기 LacZ 유전자와 키토산 나노 골드 유전자 전달체의 결합 여부는 1% agarose gel에서 EtBr 염색을 통한 전기영동에 의해 확인할 수 있었다(도 4 참조).

4. 임플란트 소재 표면의 표면처리공정

유전자-유전자 전달 복합체를 임플란트 소재 표면에 표면 처리하는 공정은 임플란트 소재의 전처리 단계, 유전자-유전자 전달 복합체의 코팅 단계, 무균 건조 단계, 유전자 고정 단계, 세포 독성 제거 단계 순으로 실시하였다.

상기 임플란트 소재 전처리 단계에서는 임플란트 소재로 현재 상용으로 널리 사용되는 티타늄을 사용하였으며, 코팅처리 이전에 SiC paper에서 #600에서 연마한 후, 증류수, 아세톤으로 5분간 초음파 세척한 후 건조하였다.

다음으로 유전자-유전자 전달 복합체의 코팅 단계에서는, 전처리된 티타늄 임플란트 소재 표면에 키토산 나노골드입자와 LacZ 유전자가 결합 된 유전자-유전자 전달 복합체를 농도 30㎍/㎠로 하여 분사(spreading) 하여 티타늄 임플란트 소재 표면을 코팅하였다.

이 후, 5 시간 동안 실시한 무균 건조 단계와, 0.8 wt% 포름알데히드 고정 용액(Formaldehyde fix solution)을 이용한 dipping 방법으로 유전자고정단계를 거친 후, phosphate buffer saline으로 세척하여 세포 독성을 제거하였다.

도 5는 티타늄 임플란트 소재 표면에서 키토산-나노골드 복합체가 나타내는 SEM-EPMA 분석 결과로서, Au, K, Si, Cl 등의 원소가 검출된 것으로 미루어 보아, 키토산-나노골드 복합체가 티타늄 임플란트 소재 표면에 잘 코팅되었음을 확인할 수 있었다.

5. 표면 처리된 임플란트 표면의 생체적합성 평가

상기공정에 의해서 얻어진 유전자-유전자 전달복합체가 세포내에서 활발히 증식하여 생체적합성을 구비하는지 여부를 평가하기 위해, 정상적으로 배양된 MC-3T3E1 골아세포를 트립신(trypsin) 처리하여 배양용기로부터 분리하고, 세포수를 측정 한 후 5 x 10⁴개의 세포를 LacZ 유전자-키토산 나노골드 유전자 전달복합체가 코팅된 티타늄 소재 임플란트 표면에 이식하였다.

상기 MC-3T3E1 골아세포의 배양과 trypsin 처리는 통상의 생화학 전문가들이 수행하는 방법에 준하여 수행하였다.

도 3은 MC-3T3E1 골아세포를 티타늄 소재 임플란트 표면에 이식하여 48시간 세포 배양한 후, 면역조직화학적(immunohistochemistry) 방법으로 x-gal 염색(stain)을 하여 유전자 전이에 따른 b-galactosidase의 발현을 확인결과를 나타내고 있다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 유전자가 코팅되지 않은 티타늄 원시편(mock)에서는 LacZ 유전자의 발현이 전혀 관찰되지 않았으나, 유전자-유전자 전달 복합체가 1:2, 1:4(vol%)로 코팅된 티타늄시편에서는 세포가 현저하게 증식됨으로서, 본 표면처리에 의해 티타늄 소재 임플란트 표면의 생체적합성이 향상됨을 알 수 있다.

이상에 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다는 후술할 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. LacZ, PPAR-gamma, c-myb 및 PTEN 으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 유전자, 및 키토산-나노골드 유전자 전달체, Adenovirus 벡터 및 pc3DNA 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 유전자 전달체가 결합된 유전자-유전자 전달 복합체가 표면에 코팅된 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 유전자-유전자 전달 복합체는 유전자 및 유전자 전달체의 혼합비가 1:1 내지 1:10(vol%)인 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트.
5. LacZ, PPAR-gamma, c-myb 및 PTEN 으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 유전자, 및 키토산-나노골드 유전자 전달체, Adenovirus 벡터 및 pc3DNA 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 유전자 전달체를 결합하는 유전자-유전자 전달 복합체의 형성 단계; 및
   상기 형성된 유전자-유전자 전달 복합체를 치과용 임플란트 표면에 코팅하는 코팅단계;를 포함하는 치과용 임플란트 표면의 처리방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 5항에 있어서,
   상기 유전자-유전자 전달 복합체의 형성 단계는 유전자 및 유전자 전달체의 혼합비를 1:1 내지 1:10(vol%)으로 하여, 음전하를 가지는 유전자와 양전하를 가지는 유전자 전달체를 전기적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트 표면의 처리방법.
9. 제 5항에 있어서,
   상기 코팅단계는 유전자-유전자 전달 복합체를 농도 10 내지 100㎍/㎠로 임플란트 표면에 분사(spreading) 하여 임플란트 표면을 코팅하는 것을 특징으로 하는 치과용 임플란트 표면의 처리방법.

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