KR20100100785A - 골 융합을 위한 다기능성 티타늄 표면 - Google Patents

Abstract

a) 표면 상에 존재하는 자연 산화물을 제거하기 위한 산 침투(acid attack) 단계; 및 b) 표면 상에 결합된 히드록실기를 노출시키기 위한 과산화수소 용액 중에서의 표면 조절된 산화 단계를 포함하며, 이에 따라 얻어진, 무기물적 관점으로부터 생체활성을 갖는 표면이 세포외 기질로부터의 단백질 또는 효소와의 표면의 작용성화에 의해 생물학적 관점으로부터 생체 활성을 나타내기 위하여 추가로 개질될 수 있다. 본 방법은 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드로의 표면 활성화, 및 공유 그래프팅을 얻기 위해 생체 분자의 용액 중에서 활성화된 표면의 인큐베이션을 포함한다.

Description

골 융합을 위한 다기능성 티타늄 표면 {MULTIFUNCTIONAL TITANIUM SURFACES FOR BONE INTEGRATION}

본 발명은 생체활성 표면을 형성시키기 위해 표면 개질 처리를 통하여, 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함한 보철 장치, 일반적으로 전부 또는 일부가 티타늄 및/또는 이의 합금으로 이루어진 이식가능한 장치를 제조하는 방법에 관한 것이다.

손상된 부위에서의 골 임플란트 융합 및 조직 재생의 개선은 정형외과와 치과에서 아직까지 문제로 남아있다. 이에 따라, 무기물적 관점 및 생물학적 관점 둘 모두로부터 조직 재생을 자극시킬 수 있는 다기능성 생체모방 표면을 갖는 임플란트를 제공하는 것에 관심을 가지고 있다.

이러한 테두리내에서, 본 발명은 무기물적 관점 및 생물학적 관점 둘 모두로부터 생체내 생체활성 거동을 얻기 위해, 열화학적 처리 및 임의적으로 생체 분자와의 표면 작용성화(functionalization)를 통해 티타늄 또는 이의 합금 (티타늄 또는 이의 합금으로 제조된 정형외과 보철물, 치과 임플란트 또는 일반적으로 의학용 임플란트용으로 사용됨)의 표면 개질을 제공한다.

용어 무기 생체활성은 생리학적 유체로부터 특히 Ca 및 P를 흡수하고 히드록시아파타이트 (골의 무기질 성분) 침전(precipitation)을 유도하기 위한 표면의 능력을 명시하는 것이다. 다른 한편으로, 생물학적 생체활성은 골의 유기물 부분의 성장을 가속시키기 위해 생물학적 반응 (세포 부착, 증식 및 분화)을 자극시키기 위한 표면의 능력을 의미하는 것이다.

상기 두가지 활성들 간의 상승적 상호작용과 함께, 두 가지의 활성을 동시에 자극할 수 있는 표면은 영구 임플란트의 빠르고 효과적인 골 융합을 위해 적합한 다기능성 물질이다.

티타늄 및 이의 합금에 대한 이러한 거동은 금속 상에 존재하는 표면 산화물 층의 화학적 조성, 결정학적 구조, 형태, 및 표면 에너지에 기인한다.

과학 문헌 및 특허에서, 티타늄 및 이의 합금의 무기 생체활성을 얻기 위한 여러 처리법들이 제안되었다.

US 5 609 633호에는 티타늄 기재를 알칼리 용액에 침액(soaking)시킨 후에 안정화된 알칼리 티타네이트 층을 형성시키기 위해 상기 물질을 열처리함으로써 얻어지는, 티타늄 기재, 및 티타늄 옥사이드와 비정질 알칼리 티타네이트로 이루어진 표면 층을 포함한 골 임플란트(osseous implant)용 물질이 개시되어 있다.

US 6 183 255호에는 소듐 히드록사이드 중에서의 화학적 처리를 통해, 또는 산 처리 후에 알칼리 처리하고, 임의적으로 공기 산화를 통해 얻어진, 생물학적 기능성을 갖는 치과 또는 정형외과 임플란트가 개시되어 있다.

문헌 [Biomaterials, 23, 1353-1357 (2002), Biomaterials, 23, 3103-3111 (2002), Biomaterials, 22, 875 (2001) e Surface & Coatings Technology, 195, 252-257 (2005)]에 기술된 바와 같이, 문헌에서는 생체활성을 유도하기 위해 과산화수소의 사용이 또한 보고되었다.

본 발명의 목적은 고도로 히드록실화된 표면을 얻기 위해 열화학적 처리를 통해 티타늄 또는 티타늄 합금 표면을 개질시키는 방법을 제공하기 위한 것이다. 이러한 방법은, 침습적 용액(aggressive solution) 중에서 장시간의 처리를 요구하지 않고, 표면을 기계적으로 손상시키지 않고, 피로 저항을 손상시키지 않기 때문에 바람직하다.

본 발명의 제 2 목적은 표면을 생체 분자로 작용성화시키는 후속의 임의적 처리 단계를 위해 특히 적합한 표면을 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 기술된 목적들을 고려하여, 본 발명의 대상은 하기 청구범위에 의해 규정된 방법이다.

첨부된 도면에서:
도 1은 산 침투 (acid attack) 후 (a), 및 산 침투와 과산화수소 처리 둘 모두 후 (b)의 티타늄 표면의 표면 미세거칠기를 도시한 SEM 현미경 사진이다.
도 2는 산소 영역의 XPS 스펙트럼으로서, 이는 자연 산화물 (a) 및 개질된 표면 (b)의 경우에서의 히드록실 출현을 도시한 것이다.
도 3은 SBF 중에서 15일 침액 후에 본 발명에 따라 개질된 물질 표면 상에 히드록시아파타이트 침전을 도시한 SEM 현미경 사진이다.
도 4는 SBF 중에서 15일 침액 후의 XRD 스펙트럼이다.
도 5는 화학적 처리 및 열처리 후의 샘플에 대한 XRD 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 6은 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드에 의해 활성화된 샘플에 대한 XPS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 7은 알칼리 포스파타제 (ALP)로 작용성화된 샘플에 대한 XPS 스펙트럼을 도시한 것이다: 조사 분석(Survay analysis) (a), 탄소 영역 상세도 (b).
도 8은 작용성화된 샘플에 대한 효소 활성을 도시한 히스토그램이다.

무기 생체활성

제 1 처리 단계는 티타늄 (또는 티타늄 합금) 표면 상에 존재하는 자연 산화물을 제거하고 이에 마크로 요철(macrorough)을 형성시키기 위한 산 침투이다. 산 침투는 예를 들어 3M 내지 8M의 농도를 갖는 묽은 플루오르화수소산을 이용하여, 1분 내지 5분 동안 우선적으로 수행된다. 도 1a는 3분 동안 5M 플루오르화수소산으로 처리된 마크로 요철 티타늄 표면을 도시한 것이다.

이러한 처리 후에는 15 내지 70 부피 범위의 농도의 과산화수소 용액으로, 우선적으로 20℃ 내지 80℃의 온도에서, 30 내지 400분의 범위, 가장 바람직하게 30 내지 225분의 범위의 시간 동안에 수행된 조절된 산화가 이루어진다.

도 1b는 60℃에서 225분 동안 40 부피의 과산화수소 산화 후의 표면 미세거칠기를 도시한 것이다.

상기 산화 과정은 두개의 경로 (산 침투 및 조절된 산화) 사이에서 표면 재-패시베이션(re-passivation)을 방지하도록 수행되어야 한다.

표면 크랙 형성을 방지하기 위하여 과정 파라미터는 최적화된다. 얻어진 산화물 층은 높은 수의 히드록실기 (도 2b) 및 서브-마이크로미터 스케일의 거칠기 및 다공도로 특징되는 전형적인 형태 (도 1b)를 나타낸다. 히드록실기는 531.5 - 532.2 eV 범위로 이루어진 결합 에너지를 가지는데, 이는 문헌[J. Biomed. Mater. Res. 55, 185-193 (2001)]에 보고된 바와 같이, 산 OH 기와 염기 OH 기 사이의 중간이다.

이렇게 처리된 물질은 무기물적 관점으로부터 생체활성이다. 실제로, 이는 유사 체액 (simulated body fluid; SBF) 중에서 15일 침액 후에 히드록시아파타이트 침전을 촉진시킨다. SEM 현미경 사진 (도 3)은 작은 구형 입자의 집합인 침전물의 전형적인 형태를 도시한 것이다. EDS 스펙트럼은 이들의 정성적 화학 조성을 강조한 것이다. Ca/P 비는 1.7로서, 히드록시아파타이트에 대한 화학양론적 비 (1.67)와 매우 근접한 값이다. 입자에 의해 덮혀지지 않은 샘플 표면 부분은 SBF 중에서의 침액 후에 칼슘 및 인이 풍부한 것으로 나타난다. 이는 이러한 원소들을 흡수하는 표면의 일반적인 능력을 의미한다. XRD 분석 (도 4)에서 물질 표면 상에 히드록시아파타이트의 존재가 확인되며; 이는 넓은 회절 피크의 존재로부터 추론될 수 있는 바와 같이, 작은 치수의 미소결정(crystallite)을 갖는 일부 비정질 상으로 존재한다.

화학적으로 처리된 샘플 (우선 HF로 처리된 후에 H₂O₂로 처리됨)은 이후에 산화물 층을 안정화시키기 위하여 열적으로 처리된다. 열처리는 공기, 진공 또는 불활성 대기 중에서, 300℃ 내지 600℃의 온도 범위로 1 내지 8 시간 동안 수행될 수 있다. 형태 및 생체활성은 열처리 후에 유지된다.

히드록실기는 온도에 대해 안정적인데, 실제로 이의 존재는 지연된 저장 및 열처리 후에 검출되었다.

산화물 층의 두께 및 결정화도는 열처리의 온도 및 대기를 변화시킴으로써 맞춰질 수 있다 (도 5). 예상되는 바와 같이, 처리 온도가 증가함에 따라 아나타제(anatase)의 반사 피크가 점진적으로 증가하는 것이 관찰될 수 있다.

피로 시험은 이러한 처리 후에 인장 강도의 적은 감소 (2 내지 15%)를 분명히 나타내는데; 이에 따라 이러한 과정은 물질의 기계적 성질을 현저히 변경시키지 않는다.

물질-세포 상호작용을 평가하기 위하여 생물학적 시험이 인간 골아세포 유사 세포 (MG63) 상에서 수행되었다. 천연 티타늄, 개질된 티타늄 및 대조군 간에 LDH 생산에 있어 어떠한 차이도 관찰되지 않았다: 이는 이러한 처리가 임의의 현저한 세포독성 효과를 유도하지 않는다는 표시이다.

세포는 천연 티타늄 및 전형적인 다각형 형태를 갖는 처리된 티타늄 상 둘 모두에 부착한다는 것이 관찰되었지만, 개질된 표면 상에서 세포가 더욱 퍼져있고, Ti 기준물 상에서 보다 더 큰 배면 러플(dorsal ruffles) 및 다수의 길쭉한 필로포디아(filopodies)를 나타낸다는 것이 강조될 수 있다.

외견상 개질된 티타늄 표면 상에서 배양된 골아세포는 양호한 증식 속도, 및 대조군 샘플에 비해 현저히 큰 ALP, 콜라겐 I 및 오스테오칼신(osteocalcin)의 생산을 나타낸다. 이는, 개질된 표면 상에서 배양된 골아세포가 미처리된 티타늄과 대조군에을 비교하는 경우 보다 높은 분화 정도를 가짐을 의미한다. 이에 따라, 단순한 무기성 개질은 물질의 생물학적 반응에 영향을 미친다.

생물학적 생체활성

바람직하게, 본 발명에서 고려되는 방법은 추가 스테이지(stage)로서 티타늄 또는 이의 합금의, 골 무기질화에서 수반되는 유기 분자 (천연 또는 합성) (예를 들어, 세포외 기질로부터의 단백질, 부착/증식 과정에서 수반되는 펩티드 또는 효소, 골형성 단백질, 성장 인자, 알부민, 피브로넥틴, 알카리 포스파타제 및 유사한 것)로의 표면 작용성화의 처리를 포함한다. 표면 작용성화는 국소 주사 또는 전신 전달로부터 초래되는 것과 같은 과도한 사용을 피하면서, 조절된 양의 생체 분자를 이식시킬 수 있기 때문에 유리하다.

생체 분자로 작용성화된 티타늄 표면을 갖는 보철 장치 또는 의학용 임플란트는 US 2007/077 346호 및 US 2004/083 006호에 기술되어 있다. US 2007/077 346호에서, 티타늄 표면은 하나 이상의 생체 분자를 함유한 상응하는 히드라이드로 코팅되며; 작용성화 과정은 생체 분자의 존재하에 전해질 처리를 통해 수행된다.

US 2004/083 006호에서, 금속성 표면은 하나 이상의 생체 분자의 존재하에 전기분해 과정을 통해 히드록사이드 층으로 코팅된다.

본 발명이 관련되는 한, 세포 반응을 유도할 수 있는 생체 분자는 바람직하게 무기물적 관점으로부터 이미 생체활성을 갖는 티타늄 (또는 티타늄 합금) 표면 상에 공유적으로 고정된다. 직접 공유 결합은 그래프팅 메카니즘(grafting mechanism)으로서 선택되는데, 이는 재흡수가능한 캐리어로부터의 단순한 흡수 또는 방출 보다 더욱 선택적이고 보다 양호한 부착을 허용할 수 있기 때문이다.

선택된 작용성화 과정은 실란화 및 독성적일 수 있는 다른 스페이서 분자 (예를 들어, 글루타르알데히드)의 사용을 방지한다. 특히 기술된 작용성화 과정의 경우에, 이는 처리된 표면 상에 히드록실기의 제공에 대한 기본인데, 이는 이러한 것들이 표면 상에 그래프팅된 생체 분자에 대해 유용한 반응성 작용기를 나타내기 때문이다.

특히, 이러한 표면 개질을 위하여, 산 침투 및 조절된 산화는 상기 섹션에 기술된 바와 같은 티타늄 표면 상에서 수행되며, 이후에 상기 표면은 문헌에서 이미 보고된 바와 같이 유기 염화물, 특히 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드 (TC)로 활성화된다 [참조, "Biochemical Surface Modification of CO-Cr-MO", D. A. Puleo, Biomaterials (17) (1996), 217-222 e "Direct Attachment of Fibronectine to Tresylchloride Activated Titanium", T. Hayakawa et al., J. Biomed. Mater. Res. 67 (2003), 684-688].

특정 예에서, 생물학적 작용성화는 효소 알칼리 포스파타제 (ALP)를 이용하여 수행되며, 이는 경조직의 무기질화 과정에서 수반되며; 여러 문헌에서는 이의 국소적 적용이 손상된 골의 성장 및 무기질화를 촉진시킴을 시사하고 있다. 이 외에, ALP는 양호한 모델 분자인데, 이는 매우 간단하게 검출되기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 생물학적 작용성화 단계는 기술된 특정 예로 제한되지 않지만, 상기에 기술된 바와 같이, 일반적으로 부착/증식 과정에서 수반되는 세포외 기질로부터의 단백질 또는 효소를 사용하는 것이 가능하다.

바람직하게, 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드로의 표면 활성화는 20℃ 내지 50℃의 반응 온도에서 10분 내지 72 시간 동안 수행된다. 바람직한 조건은 37℃에서 48 시간이다.

표면 상에 높은 수의 히드록실기의 존재는 이러한 제 2 처리 시기에서 물질 반응에 대해 중요하다.

물질 표면 상에 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드 존재는 XPS 분석에 의해 결정된다 (도 6): D 피크 (약 292 eV에서의 피크)는 C-F 결합의 특징이다.

과정의 최종 단계는 개질된 표면에 대한 효소적 그래프팅이다. 이러한 목적을 위하여, 선택된 생체 분자의 용액은 2 내지 40 mg/ml의 최종 농도에 도달하기 위해 바람직하게 PBS 중에 생체 분자를 희석시키고, 상기 샘플을 0℃ 내지 50℃의 온도에서 0.5 내지 72 시간 동안에 침액시켜 제조되어야 한다.

과정의 특별한 적용에 있어서, 4℃에서 24 시간의 인큐베이션과 함께 PBS 중 ALP의 용액 5 mg/ml가 사용된다.

개질 과정의 결과는 티타늄 표면에 분자의 직접 고정인데, 이는 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드가 양호한 이탈기이기 때문이다.

효소 존재는 개질된 표면의 외부층 상에서의 탄소 및 질소의 증가 및 티타늄 옥사이드의 감소를 나타내는 XPS 분석 (도 7)에 의해 결정된다. 이는 유기 코팅의 표시이다. 탄소 영역의 상세한 연구는 보다 높은 신호가 효소의 특징인 C-O 및 C-N 결합 (도 7 - 286 eV에서의 피크 B)에 기인한 것임을 분명히 나타낸다. D 피크 (289 eV)는 표면 상에 평평하게 된 효소의 방향족 고리에 의한 것일 수 있다. 두개의 신호는 티타늄 표면 상에 항상 존재하는 유기 오염물과 상당한 차이가 있다.

표면 상에 고정 후 효소 활성은 파라니트로페닐포스페이트와의 반응 후에, UV-가시광 분석에 의해 결정된다. 이러한 반응은 파라니트로페놀을 형성시키는데, 이는 알칼리 환경에서 황색 칼라를 갖는다. 분광학적으로 평가된 황색 세기는 물질 표면 상에 존재하는 ALP 양으로 보정될 수 있다.

결과 (도 8)는 표면에 고정된 효소가 이의 활성을 유지시키고 전체 작용성화 과정 (히드록실화, 표면 활성화 및 분자 그래프팅)이 효과적인 작용성화를 얻기 위해 요구됨을 나타낸다.

Claims (18)

1. a) 표면 상에 존재하는 자연 산화물을 제거하기 위한 산 침투(acid attack) 단계; 및
   b) 표면 상에 히드록실기를 형성시키기 위한 과산화수소 용액으로의 표면 산화 단계를 포함하는, 생체 활성 티타늄 또는 티타늄 합금 표면을 제조하기 위하여, 표면 개질 처리를 통해 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함한 보철 장치 또는 의학용 임플란트를 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 단계 b) 이후에, c) 단계 b)에서 형성된 산화물 층을 안정화시키기 위한 열처리 단계를 수행하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 단계 c)가 공기, 진공, 또는 불활성 대기 중에서, 300℃ 내지 600℃의 온도로, 1 시간 내지 8 시간 동안 수행되는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 산 침투가 플루오르화수소산 중에서 수행되는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 단계 a)의 산 침투가 1 내지 10의 몰 농도의 묽은 플루오르화수소산 중에서, 0.5분 내지 30분 범위의 시간 동안 수행되는 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 표면 산화가 15 내지 70 부피 농도의 과산화수소 중에서 20℃ 내지 80℃의 온도로 30분 내지 400분, 바람직하게 30분 내지 225분의 시간 동안 수행되는 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 또는 단계 c) 이후에, 생물학적 생체활성이 특징인 생체 분자에 의한 티타늄 또는 티타늄 합금 표면의 작용성화(functionalization) 단계를 포함하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 작용성화 처리가
   d) 유기 염화물, 바람직하게 순수하거나 용액 중에 희석된 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드로에 의한 단계 a), 단계 b) 및 임의적으로 단계 c)에 따라 앞서 처리된 티타늄 또는 티타늄 합금 표면의 활성화; 및
   e) 선택된 생체 분자의 용액 중에서 활성화된 표면의 인큐베이션에 의해 수행되는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 트리플루오로에탄설포닐 클로라이드 활성화가 20℃ 내지 50℃의 반응 온도로 10분 내지 72 시간의 범위에 포함된 시간 동안 수행되는 방법.
10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 인큐베이션 단계 e)가 활성화된 표면을 2 내지 40 mg/ml 농도의 용액 중에서 0℃ 내지 50℃의 온도로, 0.5 시간 내지 72 시간 동안 침액(soaking)시킴으로써 수행되는 방법.
11. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자가 골 무기질화 과정에서 수반되는 천연 또는 합성의 유기 분자들 중에서 선택되는 방법.
12. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자가 생접착제, 세포 부착 인자, 바이오폴리머, 혈액 단백질, 효소, 세포외 기질로부터의 단백질 또는 생체 분자, 성장 인자, 호르몬, 펩티드, 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 수용체, 효소 억제제, 약물, 생물학적으로 활성인 음이온 및 양이온, 펩티드, 골형성 단백질, 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 알부민, 피브로넥틴, 알칼리 포스파타제 및 상기 기술된 분자들의 조합 중에서 선택된, 천연, 재조합 또는 합성의 생체 분자인 방법.
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 생체활성을 나타내는 티타늄 또는 티타늄 합금 표면을 갖는, 티타늄 또는 티타늄 합금으로 전부 또는 일부 구성된 이식가능한 장치, 특히 관절 보철물 또는 치과 임플란트.
14. 제 13항에 있어서, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 히드록실기가 결합된 생체활성 표면을 나타내고, 상기 히드록실기의 결합 에너지가 531.5 내지 532.2 eV 범위인 이식가능한 장치.
15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 서브-마이크로미터 거칠기-다공도와 함께 마이크로미터 거칠기를 나타내는 티타늄 또는 티타늄 합금 표면을 갖는 이식가능한 장치.
16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 크랙이 결여된 표면을 갖는 이식가능한 장치.
17. 제 13항에 있어서, 표면에 공유적으로 그래프팅된 생체 분자로 작용성화된 티타늄 또는 티타늄 합금 표면을 갖는 이식가능한 장치.
18. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 형태의 이식가능한 장치.

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