IT201600091766A1 - Dispositivi medici impiantabili aventi uno strato di rivestimento con proprieta' antimicrobiche a base di idrossiapatite nanostrutturata. - Google Patents

Description

DISPOSITIVI MEDICI IMPIANTABILI AVENTI UNO STRATO DI RIVESTIMENTO CON PROPRIETA' ANTIMICROBICHE A BASE DI IDROSSIAPATITE NANOSTRUTTURATA.

La presente invenzione concerne dispositivi medici impiantabili, utilizzabili in particolare in campo ortopedico e traumatologico, aventi uno strato di rivestimento con proprietà antimicrobiche a base di idrossiapatite nanostrutturata.

I dispositivi medici impiantabili sono tipicamente sterilizzati prima dell'uso e sono confezionati in imballaggi che mantengono la sterilità del dispositivo fino a quando la confezione non viene aperta, quindi al momento dell’utilizzo.

A seconda dell'ambiente in cui viene impiegato, il dispositivo può essere contaminato da microbi prima dell'uso o durante l'inserimento, o dopo l'inserimento o impianto se il sito di impianto nel paziente risulta essere contaminato, ad esempio come risultato di un trauma o di procedure sterili difettose o inadeguate. La contaminazione microbica dei dispositivi medici può provocare gravi infezioni nel paziente che spesso non sono facilmente trattabili per una varietà di motivi, tra cui la formazione di biofilm microbici che sono altamente resistenti alle terapie antibiotiche.

Inoltre, è noto che una protesi articolare può dare una reazione da corpo estraneo all'interno del corpo umano ed essere quindi rigettata dallo stesso. Anche se nella maggior parte dei casi il nostro corpo accetta le protesi articolari, queste posso essere colonizzate da microbi una volta impiantate generando quindi importanti infezioni.

In seguito a una, anche minima, contaminazione microbica e alla conseguente infezione subliminale dei tessuti, non rilevabile nell’immediato intraoperatorio o nei primi giorni del postoperatorio, si instaura non di rado un processo infiammatorio iperplastico che causa dolore ed edema a livello del sito chirurgico o dell’impianto, con esuberante cicatrizzazione e formazione di tenaci aderenze che quasi sempre necessitano di revisione e della rimozione dell’impianto.

Recenti studi indicano che le infezioni periprotesiche sono il primo motivo di fallimento per le protesi di ginocchio e il terzo per le protesi d'anca negli Stati Uniti. Anche in Europa, con lievi differenze tra i paesi, le infezioni peri-protesiche sono tra i primi tre motivi che portano a un intervento di revisione. Nei centri specializzati oggi il rischio complessivo di infezione peri-protesica è relativamente basso, da 0,5 a 3%, tuttavia, alcune condizioni possono aumentare il rischio. Queste includono: interventi precedenti sulla stessa articolazione, diabete, fumo, alcool o droga, vasculopatie periferiche, insufficienza renale, trattamenti con corticosteroidi. Il verificarsi, nello stesso paziente, di due o più fattori di rischio, aumenta il rischio esponenzialmente. Inoltre l’infezione si verifica mediamente nel 2% dei casi, anche in presenza di un'asepsi ottimale, di una procedura chirurgica corretta e di una profilassi antibiotica adeguata.

Limitatamente alla Italia, secondo recenti statistiche vengono effettuati oltre 150.000 impianti protesici primari all’anno (65% di anca, 31% di ginocchio) con percentuale di infezione compresa tra 0,5-2% per l’anca e tra 2,5-5% (nord) a 0.6-12%(centrosud-isole) per il ginocchio. La percentuale di infezione per reimpianti varia tra il 2.5% ed il 20%. I batteri più frequentemente coinvolti sono Staphylococcus epidermidis (36% della casistica infettivologica su protesi), Staphylococcus aureus e MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (29%), flora plurimicrobica (16%). Inoltre in percentuale a seguire: batteri anaerobi (5%), Enterococcus faecalis (4%), Escherichia coli (3%), Pseudomonas species (spp.) (2%).

Le infezioni peri-protesiche possono essere classificate in base al tempo di insorgenza dei sintomi dopo l'impianto, e possono essere così suddivise:

(a) infezioni precoci (early infections) con tempo di insorgenza da 4 settimane a 3 mesi dall'impianto, le quali si ritiene vengano acquisite durante l'intervento per dispersione di materiale microbico sul campo operatorio, oppure, più raramente, siano collegabili ad altri focolai infettivi già presenti e non eradicati prima dell'intervento;

(b) infezioni ritardate (late infections) con tempo di insorgenza tra 3 e 24 mesi dall'impianto, le quali sono considerate di acquisizione esogena e, poiché si presuppone che il biofilm sia ormai ben strutturato, la strada terapeutica più condivisa è rappresentata da un approccio combinato medicochirurgico che prevede la rimozione della protesi con posizionamento di cemento spaziatore e riposizionamento della protesi una volta accertata l'eradicazione dell'infezione;

(c) infezioni tardive (delayed infections) le quali insorgono dopo 24 mesi dall'impianto e sono considerate a patogenesi ematogena da siti di infezione remoti, il cui trattamento dipende dalla precocità della diagnosi e quindi dalla formazione o meno di un biofilm strutturato.

Sono stati proposti vari metodi per il trattamento antimicrobico superficiale di dispositivi medici impiantabili, finalizzati a minimizzare il rischio di proliferazione microbica.

Diverse tecnologie sono in fase di studio o già sul mercato, tra cui ricordiamo:

1. PSM (Passive Surface finishing/Modification): rivestimenti inerti che non rilasciano sostanze battericide nei tessuti circostanti, ma sono realizzati in modo da prevenire o ridurre l’adesione batterica attraverso substrati chimici e/o modificazioni strutturali.

2. ASM (Active Surface finishing/Modification): rivestimenti biologicamente attivi caratterizzati dall’essere costituiti da antibatterici pre-incorporati farmacologicamente attivi.

3. LCC (Local Carriers or Coatings): carrier locali o rivestimenti di antibiotici, biodegradabili o meno, somministrati nel momento della procedura chirurgica, immediatamente prima o contestualmente all’impianto.

La classificazione delle diverse tecnologie è utile per poter confrontare meglio soluzioni diverse e migliorare la progettazione di test di validazione, onde ottimizzare i processi regolatori in questo campo a rapida evoluzione.

Ad esempio, nell’articolo di Visai et al, Int. J. Artif. Organs (2011) (9):929-946 le protesi di titanio, o sue leghe, sono trattate superficialmente tramite metodi elettrochimici con formazione di un rivestimento di biossido di titanio con struttura di anatase, in grado di essere attivato con opportuna radiazione UV-Vis così da generare radicali liberi. Ciò porta allo sviluppo sulla superficie della protesi di proprietà antisettiche e idrofiliche. Le proprietà idrofiliche vengono mantenute per un certo tempo anche dopo l’impianto, stimolando in situ una specifica azione cellulare in grado di favorirne l’integrazione ossea. Tuttavia, la fotosensibilizzazione dell’anatase e le conseguenti proprietà antisettiche cessano una volta impiantata la protesi, dal momento che ovviamente cessa l'azione di attivazione da parte della radiazione UV-Vis. Secondo alcuni autori, inoltre, l'azione antisettica e antibatterica del rivestimento di anatase esplica un’azione tossica nei confronti degli osteoblasti ostacolando la formazione di nuovo osso. Si vedano ad esempio gli articoli di Arenas M.A. et al, Colloids Surf B: Biointerfaces (2013) 105:106–12 e Hu H. et al, Acta Biomater. (2012) 8:904–15.

Dai rivestimenti con anatase, aventi caratteristiche ben lontane da quelle dei materiali biogenici, si è passati recentemente alla realizzazione di protesi con rivestimenti biomimetici, i quali mimano il più possibile il tessuto osseo per composizione, struttura morfologica e proprietà meccaniche, e a cui possono essere impartite proprietà antimicrobiche.

Ad esempio, nell'articolo di M. Stigter et al, J. Controlled Release, Vol. 99, Issue 1 (2004), 127-137, si descrive l'applicazione di un rivestimento di carbonato idrossiapatite (CHA) su impianti di titanio tramite un metodo di precipitazione biomimetica, in cui vengono incorporati diversi antibiotici, in particolare cefalotina, carbenicillina, amoxicillina, cefamandolo, tobramicina, gentamicina e vancomicina, i quali vengono rilasciati in situ.

Nel brevetto US 5.217.493 si descrive invece l'utilizzo di miscele specifiche di antibiotici (rifampina e minociclina oppure rifampina e novobiocina) per il trattamento superficiale di dispositivi medici impiantabili tramite semplice immersione in una soluzione contenente gli antibiotici, eventualmente con l'ausilio di tensioattivi o altri materiali atti a realizzare un legame tra le molecole di antibiotico e la superficie del dispositivo.

Il brevetto US 6.596.338 illustra un processo per il rivestimento di una protesi metallica con uno strato di calcio fosfato, il quale viene realizzato per semplice immersione in una soluzione acquosa da cui precipita il calcio fosfato. Il rivestimento può essere realizzato tramite deposizioni successive di calcio fosfato, in cui il primo strato ha uno spessore da 0,01 µm a 10 µm, mentre gli strati successivi hanno uno spessore da 1 µm a 40 µm. Il rivestimento contiene un principio attivo, in particolare un antibiotico, che può essere aggiunto al calcio fosfato prima del confezionamento della protesi, oppure può essere fatto assorbire dallo strato di rivestimento al momento dell'impianto tramite immersione in una soluzione acquosa dell'antibiotico.

In merito all'utilizzo di antibiotici per impedire la proliferazione di microrganismi, occorre notare che numerosi studi scientifici hanno dimostrato che tale utilizzo in ambito ortopedico genera una resistenza da parte dell’organismo nei confronti degli antibiotici stessi e dei principi attivi utilizzati per limitare la proliferazione batterica sulla superficie delle protesi metalliche utilizzate in implantologia.

Sempre al fine di limitare la proliferazione microbica sulla superficie degli impianti protesici, sono note alcune tecniche per realizzare rivestimenti di idrossiapatite dopata con argento. A tale proposito si veda ad esempio l'articolo di W. Chen et al, Biomaterials, 27 (2006), 5512-5517, dove la deposizione di idrossiapatite e ioni argento su dischi di titanio viene realizzata con tecniche di co-polverizzazione (co-sputtering) che richiedono l'utilizzo di un magnetrone.

Nell'articolo di V. Stanić et al, Applied Surface Science, 256 (2010), 6083-6089, di descrive la preparazione di nanopolveri di idrossiapatite dopata con rame e zinco, le quali presenterebbero proprietà antimicrobiche che ne suggerirebbero l'utilizzo in vari settori, tra cui il trattamento di impianti in campo ortopedico.

A tale proposito, è opportuno notare che sono noti gli effetti negativi dell’argento, il quale, quando posto a contatto prolungato con la cute, anche in piccole dosi, può provocare gravi danni all’organismo a causa della sua elevata tossicità. Sono altresì noti gli effetti tossici del rame, un metallo pesante estremamente tossico nei confronti degli organismi viventi anche in piccolissime dosi.

Infine, nel brevetto italiano IT 1.402.560 si descrive un processo per rivestire un impianto protesico metallico allo scopo di ottenere un'elevata osteointegrazione dell'impianto stesso con la struttura ossea ricevente, che comprende l'elettrodeposizione sulla superficie dell'impianto di uno strato nanometrico di idrossiapatite e un successivo trattamento termico ad una temperatura compresa tra 70°C e 800°C allo scopo di aumentare l'adesione dei nanocristalli apatitici alla superficie dell'impianto.

La Richiedente si è posta il problema di dotare i dispositivi medici impiantabili, in particolare le protesi metalliche, di un rivestimento che sia in grado di garantire un elevato effetto antimicrobico, in particolare rispetto ai principali ceppi batterici di riferimento, che si esplica non solo al momento dell'inserimento dell'impianto, ma anche ad impianto concluso, in quanto, come sopra illustrato, il rischio di sviluppo dell'infezione permane. Tale rivestimento non deve inoltre costituire un ostacolo per l'osteointegrazione della protesi, anzi deve avere proprietà biomimetiche tali da favorire i processi di osteointegrazione e rimanere perfettamente adeso alla protesi senza determinare distacchi molto pericolosi per la stabilità e la durata della protesi stessa. Inoltre, il rivestimento non deve contenere prodotti che possano avere effetti nocivi o addirittura tossici per il paziente.

Questo problema tecnico viene risolto secondo la presente invenzione tramite un rivestimento del dispositivo medico impiantabile come definito nella descrizione che segue e nelle accluse rivendicazioni.

Secondo un primo aspetto, la presente invenzione riguarda pertanto un dispositivo medico impiantabile avente uno strato di rivestimento che comprende una idrossiapatite nanostrutturata dopata con ioni zinco e funzionalizzata con lattoferrina.

Si ritiene che l'idrossiapatite nanostrutturata conferisca le desiderate proprietà di osteointegrazione, mentre l'associazione di ioni zinco e lattoferrina eserciti un forte effetto antimicrobico. Infatti, gli ioni zinco sono dotati di spiccate proprietà antibatteriche senza alcun effetto negativo dal punto di vista biologico, essendo lo zinco un oligoelemento presente negli esseri viventi e indispensabile per il metabolismo cellulare. La lattoferrina è invece una glicoproteina (peso molecolare pari a circa 80 kDa), presente in vari fluidi biologici e nel latte dei mammiferi, che interviene nel metabolismo del ferro ed è in grado di influire sullo sviluppo dei microrganismi proprio grazie alle sue proprietà leganti rispetto agli ioni ferro, indispensabili per la crescita microbica. La Richiedente ha trovato che la lattoferrina esercita un effetto di potenziamento dell'attività antimicrobica degli ioni zinco e che tale effetto è particolarmente evidente quando gli ioni zinco sono inclusi in una idrossiapatite come droganti, in parziale sostituzione degli ioni calcio, la quale viene funzionalizzata con la lattoferrina

Senza volersi legare ad alcuna teoria interpretativa, si ritiene che la lattoferrina sia in grado di funzionalizzare l'idrossiapatite legandosi alla superficie di quest'ultima tramite interazioni di varia natura, che possono essere sia legami covalenti, sia legami più deboli, quali interazioni elettrostatiche, legami idrogeno o di van der Waals.

Secondo un aspetto particolarmente preferito, il dispositivo medico impiantabile è almeno parzialmente costituito da un materiale metallico e l'idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco è ottenuta tramite elettrodeposizione sulla superficie di detto materiale metallico. Tale processo, come verrà meglio illustrato in seguito, consente di ottenere uno strato di idrossiapatite nanostrutturata di spessore ridotto costituita da nanocristalli di dimensioni e forma tali da garantire un elevato effetto biomimetico, cioè una morfologia che imita quella tipica del tessuto osseo e quindi favorisce l'osteointegrazione. Preferibilmente, i nanocristalli hanno una forma lanceolata oppure rotondeggiante, che li rende simili ai cristalli di idrossiapatite presenti nel tessuto osseo.

Preferibilmente, l'idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco è costituita da nanocristalli aventi una dimensione media (x e y) inferiore o uguale a 400 nm, più preferibilmente da 10 nm a 200 nm. Più preferibilmente i nanocristalli hanno una lunghezza media da 10 nm a 200 nm e una larghezza media da 10 nm a 100 nm. I nanocristalli possono essere eventualmente almeno parzialmente aggregati a formare "clusters" aventi in genere dimensioni micrometriche, in particolare da 0,2 µm a 10 µm, preferibilmente da 0,5 µm a 2 µm.

Nell’ambito della presente descrizione e delle rivendicazioni allegate, in generale le dimensioni medie delle particelle sono determinate, preferibilmente per quanto riguarda i clusters, tramite diffusione dinamica della luce con sorgente laser (tecnica DLS, Dynamic Light Scattering, si veda ad esempio la norma ISO 13320-2009), oppure, preferibilmente per quanto riguarda i nanocristalli, tramite analisi di immagini ottenute al TEM (microscopio a trasmissione elettronica).

Come sopra indicato, l'idrossiapatite nanostrutturata è drogata con ioni zinco, ovvero gli ioni zinco parzialmente sostituiscono gli ioni calcio. Preferibilmente, gli ioni zinco sono presenti in una quantità tale da ottenere un grado di sostituzione degli ioni calcio da 0,01% a 10% in peso, più preferibilmente da 0,1% a 5% in peso, rispetto al contenuto totale di ioni calcio.

Preferibilmente, l'idrossiapatite nanostrutturata comprende inoltre ioni carbonato che parzialmente sostituiscono gli ioni fosfato. Preferibilmente, gli ioni carbonato sono presenti in una quantità tale da ottenere un grado di sostituzione degli ioni fosfato da 0,1% a 10% in peso, più preferibilmente da 0,5% a 5% in peso, rispetto al contenuto totale di ioni fosfato.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita, l’idrossiapatite nanostrutturata dopata con ioni zinco ha la seguente formula:

Ca10-xZnx(PO4)6-y(CO3)y+z(OH)2

dove:

x è un numero compreso tra 0,0055 e 0,6;

y è un numero compreso tra 0,065 e 0,9.

Preferibilmente, l'idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco ha un grado di cristallinità (CD) compreso tra 15% e 50%, più preferibilmente compreso tra 20% e 40%.

Il grado di cristallinità (CD) può essere determinato utilizzando metodi ben noti ad un tecnico del ramo, come ad esempio tramite l’analisi dei dati di diffrazione dei raggi X. In particolare, il grado di cristallinità (CD) viene misurato in accordo con il metodo descritto in Landi, E., Tampieri, A., Celotti, G., Sprio, S., “Densification behaviour and mechanisms of synthetic hydroxyapatites”, J. Eur. Ceram. Soc., 20 (2000), 2377-2387:

CD = (1-X/Y)<●>100

in cui:

Y = altezza del massimo di diffrazione a 2θ = 33°;

X = altezza del background di diffrazione a 2θ = 33° dei pattern di diffrazione dei raggi X delle nanoparticelle.

Per quanto riguarda la lattoferrina, questa è una proteina disponibile commercialmente e può essere ottenuta tramite separazione e purificazione da prodotti che naturalmente la contengono (ad esempio latte), oppure tramite tecniche in ingegneria genetica (DNA ricombinante).

Preferibilmente, lo strato di rivestimento in accordo con la presente invenzione comprende: da 85% in peso a 99,99% in peso, più preferibilmente da 90% in peso a 99,9% in peso, di idrossiapatite nanostrutturata dopata con ioni zinco; e da 0,01% in peso a 15% in peso, più preferibilmente da 0,1% in peso a 10% in peso, di lattoferrina, rispetto al peso complessivo dello strato di rivestimento.

Preferibilmente, lo strato di rivestimento ha uno spessore medio da 10 nm a 500 nm, più preferibilmente da 50 nm a 200 nm.

Per quanto riguarda il dispositivo medico impiantabile, questo è preferibilmente un dispositivo protesico metallico avente una superficie porosa, che può essere impiantato nel corso di interventi di sostituzione delle grandi articolazioni, ad esempio anca o ginocchio, oppure di osteosintesi. Tali dispositivi sono in genere costituiti da titanio o sue leghe, in particolare leghe titanio/vanadio, titanio/alluminio oppure titanio/vanadio/alluminio. Particolarmente preferite sono le leghe di titanio con 6% di Al e 4% di V (Ti6Al4V ELI).

In genere, i dispositivi protesici metallici hanno una superficie porosa allo scopo di favorire l'apposizione ossea e una rapida vascolarizzazione. La porosità è generalmente compresa tra 20% e 80% in volume, mentre la dimensione media dei pori è preferibilmente compresa tra 100 µm e 500 µm, più preferibilmente compresa tra 150 µm e 450 µm. Tali parametri possono essere determinati secondo tecniche note, ad esempio tramite analisi di immagini al SEM di una sezione trasversale del dispositivo (si veda ad esempio EP 2 130 516 A1).

La porosità superficiale può essere ottenuta in diversi modi, in particolare:

(a) tramite sinterizzazione casuale di microparticelle di titanio puro (CPTi – commercially pure titanium), le quali, stratificandosi, creano una superficie tridimensionale con porosità attorno 63% e diametro medio dei pori di circa 300 µm, ideale per promuovere la ricrescita ossea, ottenuta ad esempio secondo la tecnica GRIPTION-STAT (Super Textured Asperity Topography) della DePuy Orthopedics Inc., Warsaw, USA;

(b) tramite sinterizzazione con tecnica SLM (Selective Laser Melting), con cui si realizza una superficie di titanio trabecolare ad elevata rugosità con pori di forma irregolare (porosità media del 55% e diametro medio dei pori di circa 500 µm), ottenuta ad esempio secono la tecnica TRASER della Permedica S.p.A.

La porosità superficiale può essere altresì ottenuta tramite scolpitura laser della superficie metallica per ottenere una struttura a spugna.

In un secondo aspetto, la presente invenzione riguarda un primo processo per rivestire un dispositivo medico impiantabile, che comprende:

predisporre un bagno elettrolitico comprendente ioni calcio, ioni fosfato, ioni zinco e lattoferrina; immergere in detto bagno elettrolitico un catodo ed un anodo, detto catodo comprendendo il dispositivo medico impiantabile;

far passare corrente elettrica continua attraverso detto bagno elettrolitico così da ottenere una deposizione elettrolitica sul dispositivo medico impiantabile di una idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco e funzionalizzata con lattoferrina.

In un terzo aspetto, la presente invenzione riguarda un secondo processo per rivestire un dispositivo medico impiantabile, che comprende:

predisporre un bagno elettrolitico comprendente ioni calcio, ioni fosfato e ioni zinco;

immergere in detto bagno elettrolitico un catodo ed un anodo, detto catodo comprendendo il dispositivo medico impiantabile;

far passare corrente elettrica continua attraverso detto bagno elettrolitico così da ottenere una deposizione elettrolitica sul dispositivo medico impiantabile di una idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco;

depositare lattoferrina sul dispositivo medico impiantabile rivestito con la idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco.

Pertanto, secondo il primo processo la lattoferrina viene combinata con l'idrossiapatite durante la produzione di quest'ultima, per cui si ottiene una più completa funzionalizzazione di quest'ultima con la proteina, la quale si distribuisce sostanzialmente in tutto lo spessore del rivestimento. In accordo con il secondo processo, invece, la lattoferrina viene depositata sul rivestimento di idrossiapatite solo quando questo è già formato, per cui la lattoferrina è presente solo in superficie. Si ottiene dunque un rivestimento a doppio strato: un primo strato interno di idrossiapatite priva di lattoferrina ed un secondo strato esterno in cui l'idrossiapatite è funzionalizzata con la lattoferrina.

Nel seguito vengono illustrate alcune condizioni preferite di processo che possono essere applicate ad entrambi i processi sopra illustrati, salvo dove indicato diversamente.

Preferibilmente, il dispositivo medico impiantabile è almeno parzialmente costituito da un materiale metallico.

Preferibilmente, il bagno elettrolitico viene mantenuto ad una temperatura compresa tra 5°C e 50°C, preferibilmente tra 20°C e 30°C.

Gli ioni calcio vengono aggiunti al bagno elettrolitico tramite un sale di calcio solubile in acqua nelle condizioni di reazione, ad esempio Ca(NO3)2*4H2O, Ca(NO3)2*2H2O, Ca(CH3COO)2, o loro miscele. La concentrazione iniziale degli ioni calcio nel bagno elettrolitico è generalmente compresa tra 0,01 e 0,1 moli/litro, preferibilmente tra 0,02 e 0,06 moli/litro.

Gli ioni fosfato vengono aggiunti al bagno elettrolitico tramite un sale fosfato solubile in acqua nelle condizioni di reazione, ad esempio NH4H2PO4, K2HPO4, KH2PO4, H3PO4, o loro miscele. La concentrazione iniziale degli ioni fosfato nel bagno elettrolitico è generalmente compresa tra 0,01 e 0,10 moli/litro, preferibilmente tra 0,02 e 0,04 moli/litro.

Gli ioni zinco vengono aggiunti al bagno elettrolitico tramite un sale di calcio solubile in acqua nelle condizioni di reazione, ad esempio ZnCl2, Zn(CH3COO)2, Zn(NO3)2, o loro miscele. La concentrazione iniziale degli ioni zinco nel bagno elettrolitico è generalmente compresa tra 0,001 e 0,30 moli/litro, preferibilmente tra 0,01 e 0,05 moli/litro.

Secondo una forma preferita di realizzazione, all'inizio della deposizione il bagno elettrolitico ha un pH compreso tra 3,0 e 4,5, preferibilmente tra 3,5 e 4,0, detto pH innalzandosi in prossimità del catodo ad un valore superiore a 8, generalmente compreso tra 10 e 12, durante il processo di deposizione senza aggiunta di composti alcalini. Al termine del processo di elettrodeposizione, il bagno elettrolitico ha un pH generalmente compreso tra 4,0 e 6,0, preferibilmente tra 4,5 e 5,5.

Secondo il primo processo, la lattoferrina viene aggiunta al bagno elettrolitico, ad esempio sottoforma di soluzione acquosa. La concentrazione iniziale della lattoferrina nel bagno elettrolitico è generalmente compresa tra 0,001 e 0,3 mg/mL, preferibilmente tra 0,01 e 0,1 mg/mL.

L’utilizzo della lattoferrina permette di ottenere un rivestimento costituito da nanocristalli di idrossiapatite dopati con ioni zinco e funzionalizzati dalla proteina, che è in grado di offrire alla superficie ossea un’interfaccia non puramente inorganica, ma biologicamente ibrida in grado di esibire un elevato effetto antibatterico. In accordo con il primo processo sopra definito, la lattoferrina viene inserita nel processo di elettrodeposizione del rivestimento idrossiapatitico all'interno del bagno elettrolitico: in tal modo si ottiene la crescita di nanocristalli di idrossiapatite drogata con ioni zinco sulla superficie metallica, in presenza di lattoferrina, la quale risulta inglobata nel rivestimento stesso.

In accordo con il secondo processo sopra definito, invece, è possibile depositare la lattoferrina sul rivestimento idrossiapatitico già formato, ad esempio tramite semplice immersione dello stesso in una soluzione acquosa di lattoferrina. In tal modo, la funzionalizzazione dell’idrossiapatite da parte della lattoferrina è sostanzialmente solo superficiale. Si ottiene in questo modo un rivestimento ibrido costituito da una fase idrossiapatitica e da una fase biopolimerica superficiale.

Secondo una forma preferita di realizzazione, l’elettrodeposizione viene condotta con una corrente continua sostanzialmente costante. Preferibilmente la corrente continua viene mantenuta a valori relativamente bassi onde evitare distacchi del materiale depositato causati da un eccessivo sviluppo di idrogeno gassoso al catodo. Generalmente la corrente continua ha un’intensità compresa tra 10 mA e 100 mA, più preferibilmente tra 20 mA e 60 mA.

Il potenziale della corrente applicato può variare tra 5 V a 150 V, ma preferibilmente tra 20 V ed 80 V.

Preferibilmente, il rivestimento del dispositivo medico impiantabile viene realizzato tramite una pluralità di fasi di deposizione elettrolitica della idrossiapatite nanostrutturata realizzate in successione (processo elettrochimico pulsato). Tali fasi sono realizzate per un tempo relativamente breve e separate da brevi pause in cui viene interrotto il passaggio di corrente. In tal modo viene migliorata l'omogeneità e l'adesione dello strato di rivestimento complessivo, in quanto una fase di deposizione elettrolitica troppo prolungata può portare a un considerevole sviluppo di idrogeno sulla superficie da rivestire, che dà origine a difetti e disomogeneità nel materiale di rivestimento.

Preferibilmente, ciascuna fase di deposizione elettrolitica ha una durata compresa tra 3 secondi e 60 secondi, preferibilmente tra 10 secondi e 20 secondi. Le fasi di deposizione elettrolitica successive sono separate da una pausa in cui il passaggio di corrente viene interrotto, la cui durata può variare da 1 secondo e 1 minuto, preferibilmente da 1 secondo e 10 secondi.

La durata complessiva del processo di deposizione elettrolitica dipende principalmente dallo spessore del rivestimento che si intende produrre e dalle condizioni di processo, ed è compresa in genere tra 40 secondi e 10 minuti, preferibilmente tra 1 minuto e 5 minuti.

Il numero di fasi di deposizione in successione è in genere da 4 a 50, preferibilmente da 6 a 30.

Al termine del processo elettrochimico il dispositivo medico così rivestito viene estratto dal bagno elettrolitico e asciugato tramite un flusso di gas (in genere aria) con temperatura compresa tra 20°C e 100°C, più preferibilmente tra 30°C e 50°C, per un tempo compreso tra 100 minuti e 500 minuti.

Il dispositivo medico impiantabile rivestito secondo la presente invenzione presenta elevate caratteristiche antibatteriche senza l’utilizzo di composti di sintesi ad effetto antibatterico (ad esempio antibiotici come la vancomicina), e neppure di sostanze ad effetto tossico nei confronti degli organismi viventi (come i citati rame e argento), né nanoparticelle metalliche (aventi anch'esse un effetto tossico), ma tramite l’utilizzo di ioni di zinco, che è un importante oligoelemento, e della lattoferrina, una proteina di origine naturale. Tali componenti sono inclusi in un rivestimento di idrossiapatite nanostrutturata, avente caratteristiche del tutto simili a quella ossea con la quale andrà in contatto una volta impiantata in situ la protesi.

I seguenti esempi di realizzazione sono forniti a mero scopo illustrativo della presente invenzione e non devono essere intesi in senso limitativo dell’ambito di protezione definito dalle accluse rivendicazioni.

ESEMPIO 1

In una cella elettrolitica sono stati introdotti: 55 mL di una soluzione acquosa di ioni Ca<2+>alla concentrazione di 55 mM, 47 mL di una soluzione acquosa di ioni PO4<3->alla concentrazione di 25 mM, 7 mL di una soluzione di ioni Zn<2+>alla concentrazione di 20 mM, 7 mL di una soluzione di lattoferrina alla concentrazione di 0,02 mg/mL. Dopo aver miscelato completamente le soluzioni, nella cella elettrolitica è stato introdotto un anodo di platino e un elettrodo di controllo. Come catodo, posto di fronte all'anodo di platino, è stata utilizzata come campione una porzione di protesi d'anca in lega di titanio, avente dimensione di circa 5 cm x 5 cm e spessore di 6 mm, corrispondente ad un quarto della emisfera di una coppa acetabolare di 64 mm di diametro del cotile protesico Gription™ Pinnacle in lega di titanio (Ti6Al4V) della DePuy, Warsaw, USA. Tale componente protesico è trattato superficialmente tramite sinterizzazione di microparticelle di CPTi (titanio commercialmente puro) secondo la tecnica Gription™ (porosità 63%, diametro medio dei pori circa 300 µm).

Nella cella elettrochimica è stata quindi applicata un’intensità di corrente pari a 22 mA e un potenziale di 33 V. Il processo di elettrodeposizione è stato realizzato alla temperatura di 25°C, suddiviso in quattro fasi successive, ciascuna della durata di 12 secondi. Tra una fase e la successiva il passaggio di corrente è stato interrotto per 5 secondi.

I due elettrodi erano di dimensioni paragonabili tra di loro onde evitare disomogeneità nella formazione del rivestimento. La distanza tra i due elettrodi era variabile da 1 cm a 3 cm, essendo il catodo di forma non piana.

Al termine del processo, il catodo costituito dalla porzione di protesi rivestita è stato estratto dal bagno elettrochimico ed asciugato sotto un flusso di aria calda alla temperatura di 50°C, per un tempo pari a 120 minuti.

Il rivestimento così ottenuto conteneva idrossiapatite parzialmente sostituita con ioni zinco in una percentuale, rispetto agli ioni calcio, pari al 1,5%, e funzionalizzata con 0,1% in peso di lattoferrina, rispetto al peso complessivo del rivestimento.

Le Figure 1-3 allegate sono relative a:

Figura 1 - immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) della superficie della protesi prima del rivestimento per elettrodeposizione;

Figura 2 - immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) della superficie della protesi dopo il rivestimento per elettrodeposizione: è ben visibile la presenza di agglomerati micrometrici;

Figura 3 – spettro di analisi ottenuto con sonda EDX della superficie della protesi dopo il rivestimento per elettrodeposizione: si nota la presenza di calcio (Ca) e fosforo (P) nei rapporti tipici dell’idrossiapatite, sono inoltre presenti i segnali tipici del titanio (Ti) e dell'alluminio (Al), che compongono la lega di cui era costituita la protesi.

ESEMPIO 2

Nella medesima cella elettrolitica dell'Esempio 1 sono stati introdotti: 40 mL di una soluzione acquosa di ioni Ca<2+>alla concentrazione di 42 mM, 40 mL di una soluzione acquosa di ioni PO4<3->alla concentrazione 25 mM, 4 mL di una soluzione di ioni Zn<2+>alla concentrazione di 42 mM. Dopo aver miscelato completamente le soluzioni, nella cella elettrolitica è stato introdotto un anodo di platino e un elettrodo di controllo. Come catodo, posto di fronte all'anodo di platino, è stata utilizzata un'identica porzione di protesi d'anca in lega di titanio come descritta nell'Esempio 1.

Nella cella elettrochimica è stata quindi applicata un’intensità di corrente pari a 20 mA e un potenziale di 30 V. Il processo di elettrodeposizione è stato realizzato alla temperatura di 25°C, suddiviso in sei fasi successive, ciascuna della durata di 10 secondi. Tra una fase e la successiva il passaggio di corrente è stato interrotto per 10 secondi.

I due elettrodi erano di dimensioni paragonabili tra di loro onde evitare disomogeneità nella formazione del rivestimento. La distanza tra i due elettrodi era variabile da 1 cm a 3 cm, essendo il catodo di forma non piana.

Al termine del processo, il catodo costituito dal campione di protesi rivestita è stato estratto dal bagno elettrochimico e immerso in una soluzione di lattoferrina con concentrazione pari a 0,059 mg/mL per un tempo pari a 50 secondi. Dopo estrazione dalla soluzione la protesi è stata asciugata sotto un flusso di aria calda alla temperatura di 40°C, per un tempo pari a 300 minuti.

Il rivestimento così ottenuto conteneva idrossiapatite parzialmente sostituita con ioni zinco in una percentuale, rispetto agli ioni calcio, pari al 2,0%, e funzionalizzata con 0,2% in peso di lattoferrina, rispetto al peso complessivo del rivestimento.

Le Figure 4-5 allegate sono relative a:

Figura 4 - immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) della superficie della protesi dopo il rivestimento per elettrodeposizione;

Figura 5 – spettro di analisi ottenuto con sonda EDX della superficie della protesi dopo il rivestimento per elettrodeposizione: si nota la presenza di calcio (Ca) e fosforo (P) nei rapporti tipici dell’idrossiapatite, sono inoltre presenti i segnali tipici del titanio (Ti) e dell'alluminio (Al), che compongono la lega di cui era costituita la protesi.

ESEMPI 3-4 (comparativi)

L'Esempio 1 è stato ripetuto utilizzando le medesime condizioni sopra riportate, eccetto che: nell'Esempio 3 lo strato di rivestimento finale conteneva idrossiapatite drogata con ioni zinco ma era privo di lattoferrina, che non è stata aggiunta né al bagno elettrolitico né dopo la deposizione elettrolitica; nell'Esempio 4 lo strato di rivestimento finale conteneva idrossiapatite funzionalizzata con lattoferrina ma era privo di ioni zinco, in quanto questi non sono stati aggiunti al bagno elettrolitico.

ESEMPIO 5: test microbiologici

I campioni di protesi metallica rivestiti secondo gli Esempi 1, 3 e 4 sono stati valutati in merito all'attività antimicrobica rispetto alla contaminazione in vitro con diversi batteri, monitorando tale attività a intervalli di tempo crescenti dal momento della contaminazione. La crescita batterica è stata verificata in condizioni di aerobiosi a 37°C.

La determinazione dell’attività antibatterica è stata effettuata secondo quanto descritto nel Metodo Standard ASTM E2180:2007. Il metodo prevede il confronto dell'attività inibente del campione in esame con un equivalente campione non trattato superficialmente e quindi privo di antibatterico (controllo).

I campioni in esame sono stati sterilizzati in autoclave (autoclave NUARE a 121°C, 1 atm per 15 min), inoculati con il ceppo microbico (400 µL) sulla superficie porosa destinata a entrare in contatto con il tessuto osseo, coperti con film, inseriti in una piastra Petri e posti in incubatore alla temperatura di 37 ± 1 °C. La determinazione della carica batterica vitale residua è stata effettuata dopo tempi di incubazione crescenti: 24 ore, 48 ore, 7 giorni, 15 giorni, 21 giorni. I valori di seguito riportati sono la media su tre campioni identici per ogni ceppo batterico. Al termine del periodo di incubazione, per evitare interferenze nel risultato microbiologico, l'effetto dell'attività antibatterica è stato annullato tramite immersione del campione in una soluzione neutralizzante, costituita da: 3g di lecitina, 30 g di polisorbato 80, 5 g di sodio tiosolfato, 1 g di L-istidina, acqua distillata a 100 ml.

La contaminazione dei campioni è stata effettuata utilizzando i seguenti ceppi batterici:

(A) Staphylococcus epidermidis (SCN – batterio Gram ) (ATCC 12228);

(B) Polimicrobiale costituito da una combinazione di batteri anaerobi (Propionibacterium species) e aerobi/anaerobi facoltativi (Staphylococcus MRSA, Pseudomonas aeruginosa ed Enterococcus faecalis).

La contaminazione batterica viene espressa come CFU/ml, dove CFU = Unità Formanti Colonia.

Per ogni campione e ceppo batterico, è stata determinata la riduzione percentuale della vitalità batterica (R) secondo la seguente formula:

R = [(A - B) / A] * 100

dove:

A è il logaritmo della conta batterica sul campione di controllo;

B è il logaritmo della conta batterica sul campione in esame al termine del tempo prefissato.

Ciascun valore di A e B è la media su tre campioni.

I risultati sono riportati nella seguente Tabella 1:

TABELLA 1

ampione Inoculo dopo dopo dopo dopo dopo batterico 24 h 48 h 7 gg 15 gg 21 gg

Es. 1 Staphylococcus 42% 47% 90% 98% 98% epidermidis

Zn+LTF)

Es. 1 Polimicrobiale 50% 52% 83% 97% 98%

Zn+LTF)

Es. 3 Staphylococcus 15% 17% 73% 85% 86% epidermidis

HA+Zn)

Es. 3 Polimicrobiale 28% 28% 66% 78% 83%

HA+Zn)

Es. 4 Staphylococcus 24% 42% 85% 88% 89% epidermidis

HA+LTF)

Es. 4 Polimicrobiale 38% 43% 79% 83% 83%

HA+LTF)

HA : idrossiapatite

LTF : lattoferrina

Dai dati sopra riportati appare evidente che il trattamento superficiale con HA+Zn+LTF consente di ottenere una riduzione di crescita microbica di gran lunga superiore rispetto ai trattamenti superficiali con HA+Zn e HA+LTF, sia con inoculo di St. epidermidis sia con inoculo polimicrobiale. L'effetto antimicrobico migliorato è evidente già dopo 24 ore di incubazione, cresce nel tempo e diventa quali completo (97-98%) con HA+Zn+LTF dopo 15 e 21 giorni di incubazione.

ESEMPI 6-7

L'Esempio 1 è stato ripetuto con gli stessi materiali e le medesime condizioni operative sopra riportate, eccetto che il processo di elettrodeposizione è stato realizzato in otto (Esempio 6) oppure sedici (Esempio 7) fasi successive, ciascuna della durata di 13 secondi (intervallo tra una fase e l’altra di 5 secondi).

I campioni di protesi in titanio così rivestiti sono stati valutati in merito all'attività antimicrobica rispetto alla contaminazione in vitro con i seguenti ceppi batterici:

(A) Staphylococcus epidermidis (SCN – batterio Gram ) (ATCC 12228);

(B) Pseudomonas aeruginosa (batterio Gram -) (ATC 9027);

(C) Polimicrobiale costituito da una combinazione di batteri anaerobi (Propionibacterium species) e aerobi/anaerobi facoltativi (Staphylococcus MRSA, Pseudomonas aeruginosa ed Enterococcus faecalis).

La determinazione dell’attività antibatterica è stata effettuata secondo quanto descritto nel Metodo Standard ASTM E2180:2007, nelle medesime condizioni riportate nell’Esempio 5. La determinazione della carica batterica vitale residua è stata effettuata dopo tempi di incubazione crescenti: 18 ore, 24 ore e 48 ore.

I risultati sono riportati nella seguente Tabella 2:

TABELLA 2

Campione Inoculo dopo dopo dopo batterico

18 h 24 h 48 h

Es. 6 Staphylococcus 92,3% 99,6% 99,97% epidermidis

(HA+Zn+LTF)

Es. 7 Staphylococcus 93.1% 99,4% 99,90% epidermidis

(HA+Zn+LTF)

Es. 6 Pseudomonas 90,0% 99,7% 99,99% aeruginosa

(HA+Zn+LTF)

Es. 7 Pseudomonas 90,0% 99,4% 99,98% aeruginosa

(HA+Zn+LTF)

Es. 6 Polimicrobiale 63,0% 98,6% 99,00%

(HA+Zn+LTF)

Es. 7 Polimicrobiale 55,6% 98,25% 99,00%

(HA+Zn+LTF)

I dati della Tabella 2 sono riportati graficamente nella Figura 6 allegata. Essi evidenziano che, anche per tempi di contatti brevi (24 ore), il rivestimento secondo la presente invenzione, ottenuto con un processo di elettrodeposizione con 8 oppure 16 fasi successive, consente di ottenere una riduzione percentuale della vitalità batterica superiore al 99%, nei confronti sia di batteri Gram positivi (Staphylococcus epidermidis) sia di batteri Gram negativi (Pseudomonas aeruginosa). Per quanto riguarda il polimicrobiale, dopo 24 ore di contatto si è osservata una riduzione attorno al 98%, dovuta soprattutto a un aumento del valore del campione di controllo.

La riduzione della vitalità batterica si è attestata dopo 48 ore a valori prossimi al 100%, cioè una quasi completa scomparsa dei batteri, sia Gram positivi (Staphylococcus epidermidis) sia Gram negativi (Pseudomonas aeruginosa). Analoghi valori, attorno al 99%, sono stati ottenuti con la carica polimicrobiale.

E’ stata verificata l’eventuale presenza di disomogeneità o addirittura di distacchi dello strato di rivestimento tramite l’esecuzione di microfotografie al SEM dei campioni secondo l’Esempio 7, le quali sono riportate nelle Figure 7-9 allegate. Come si può osservare da tali microfotografie, lo strato di rivestimento è omogeneo e perfettamente adeso alla superficie della protesi.

Barzanò & Zanardo Milano S.p.A.

Claims (19)

1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo medico impiantabile avente uno strato di rivestimento che comprende una idrossiapatite nanostrutturata dopata con ioni zinco e funzionalizzata con lattoferrina.
2. 2. Dispositivo medico impiantabile secondo la rivendicazione 1, almeno parzialmente costituito da un materiale metallico e l'idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco è ottenuta tramite elettrodeposizione sulla superficie di detto materiale metallico.
3. 3. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l'idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco è costituita da nanocristalli aventi una dimensione media (x e y) inferiore o uguale a 400 nm, preferibilmente da 10 nm a 200 nm.
4. 4. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui gli ioni zinco sono presenti in una quantità tale da ottenere un grado di sostituzione degli ioni calcio da 0,01% a 10% in peso, preferibilmente da 0,1% a 5% in peso, rispetto al contenuto totale di ioni calcio.
5. 5. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l'idrossiapatite nanostrutturata comprende inoltre ioni carbonato che parzialmente sostituiscono gli ioni fosfato.
6. 6. Dispositivo medico impiantabile secondo la rivendicazione 5, in cui gli ioni carbonato sono presenti in una quantità tale da ottenere un grado di sostituzione degli ioni fosfato da 0,1% a 10% in peso, preferibilmente da 0,5% a 5% in peso, rispetto al contenuto totale di ioni fosfato.
7. 7. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l'idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco ha un grado di cristallinità (CD) compreso tra 15% e 50%, preferibilmente compreso tra 20% e 40%.
8. 8. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui lo strato di rivestimento comprende: da 85% in peso a 99,99% in peso, preferibilmente da 90% in peso a 99,9% in peso, di idrossiapatite nanostrutturata dopata con ioni zinco; e da 0,01% in peso a 15% in peso, preferibilmente da 0,1% in peso a 10% in peso, di lattoferrina, rispetto al peso complessivo dello strato di rivestimento.
9. 9. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui lo strato di rivestimento ha uno spessore medio da 10 nm a 500 nm, preferibilmente da 50 nm a 200 nm.
10. 10. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto dispositivo è un dispositivo protesico metallico avente una superficie porosa, avente preferibilmente una porosità da 20% a 80% in volume.
11. 11. Dispositivo medico impiantabile secondo la rivendicazione 10, in cui la dimensione media dei pori è compresa tra 100 µm e 500 µm, preferibilmente compresa tra 150 µm e 450 µm.
12. 12. Dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto dispositivo è costituito da titanio o sue leghe, in particolare leghe titanio/vanadio, titanio/alluminio oppure titanio/vanadio/alluminio.
13. 13. Processo per rivestire un dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, che comprende: predisporre un bagno elettrolitico comprendente ioni calcio, ioni fosfato, ioni zinco e lattoferrina; immergere in detto bagno elettrolitico un catodo e un anodo, detto catodo comprendendo il dispositivo medico impiantabile; far passare corrente elettrica continua attraverso detto bagno elettrolitico così da ottenere una deposizione elettrolitica sul dispositivo medico impiantabile di una idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco e funzionalizzata con lattoferrina.
14. 14. Processo per rivestire un dispositivo medico impiantabile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, che comprende: predisporre un bagno elettrolitico comprendente ioni calcio, ioni fosfato e ioni zinco; immergere in detto bagno elettrolitico un catodo e un anodo, detto catodo comprendendo il dispositivo medico impiantabile; far passare corrente elettrica continua attraverso detto bagno elettrolitico così da ottenere una deposizione elettrolitica sul dispositivo medico impiantabile di una idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco; depositare lattoferrina sul dispositivo medico impiantabile rivestito con la idrossiapatite nanostrutturata drogata con ioni zinco.
15. 15. Processo secondo la rivendicazione 13 o 14, in cui all'inizio della deposizione il bagno elettrolitico ha un pH compreso tra 3,0 e 4,5, preferibilmente tra 3,5 e 4,0, detto pH innalzandosi in prossimità del catodo ad un valore superiore a 8, generalmente compreso tra 10 e 12, durante il processo di deposizione senza aggiunta di composti alcalini.
16. 16. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 13 a 15, in cui l’elettrodeposizione viene condotta con una corrente continua sostanzialmente costante, con una intensità compresa tra 10 mA e 100 mA, preferibilmente tra 20 mA e 60 mA.
17. 17. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 13 a 16, in cui si realizza una pluralità di fasi di deposizione elettrolitica della idrossiapatite nanostrutturata realizzate in successione.
18. 18. Processo secondo la rivendicazione 17, in cui ciascuna fase di deposizione elettrolitica ha una durata compresa tra 3 secondi e 60 secondi, preferibilmente tra 10 secondi e 20 secondi.
19. 19. Processo secondo la rivendicazione 17 o 18, in cui il numero di fasi di deposizione in successione è da 4 a 50, preferibilmente da 6 a 30. Barzanò & Zanardo Milano S.p.A.