ITRM990719A1

ITRM990719A1 - Uso di ubichinone q10 per il trattamento locale e la prevenzione di patalogie aftalmologiche secondarie alla terapia fotorefrattiva, chirurg

Info

Publication number: ITRM990719A1
Application number: IT1999RM000719A
Authority: IT
Inventors: Marco Fabrizio Saettone; Rosario Brancato; Sergio Capaccioli; Nicola Schiavone
Original assignee: Simonelli Giuseppe
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 1999-11-25
Publication date: 2001-05-25
Also published as: US6787572B2; IT1307281B1; EP1231909B1; DE60005992D1; ES2208434T3; AU1301001A; DE60005992T2; US20030236239A1; WO2001037851A2; ATE251905T1; EP1231909A2; WO2001037851A3; ITRM990719A0

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:

“USO DI UBICHINONE Q10 PER IL TRATTAMENTO LOCALE E LA PREVENZIONE DI PATOLOGIE OFT ALMOLOGICHE SECONDARIE ALLA TERAPIA FOTOREFRATTIVA, CHIRURGIA REFRATTIVA ED ESPOSIZIONE A RAGGI ULTRAVIOLETTI.”

DESCRIZIONE

Campo dell’invenzione

La presente invenzione si riferisce all’uso del chinone Q10 (ubichinone) come principio attivo da utilizzare in una composizione farmaceutica ad uso topico oculare per la cura di patologie oftalmologiche e per la prevenzione degli effetti collaterali indesiderati nella cornea, conseguenti ad un trattamento di chirurgia re fratti va con laser ad eccimeri ed alla esposizione alle radiazioni ultraviolette della luce solare e di altre sorgenti. Nel termine chirurgia refi-attiva vanno intesi, a titolo di esempio, la cheratectomia fotorefrattiva (PRK) e la cheratomileusi laser in-situ (LASIK).

Retrospettiva dell’invenzione

Negli ultimi anni si è affermata e diffusa un nuovo tipo di tecnica chirurgica, la cheratectomia fotorefrattiva (PRK) che corregge i vizi refrattivi, quali miopia, ipermetropia e astigmatismo attraverso l’impiego di un laser ad eccimeri. Tale procedura chirurgica prevede una prima fase di disepitelizzazione corneale che consente, se pure con tecniche differenti, l’asportazione del primo strato corneale che è l’epitelio e l’esposizione del sottostante stroma corneale.

Il laser ad eccimeri agisce attraverso un’azione fotoablativa proprio a livello della superficie stromale anteriore causandone un suo rimodellamento. Ciò comporta in ultima analisi un rimodellamento della superficie anteriore corneale poiché l'epitelio che si riforma nei primi giorni dopo l’intervento, segue il profilo della superficie stromale anteriore fotoablata.

Le problematiche legate alla PRK sono rappresentate dai possibili effetti collaterali indesiderati che producono la possibile regressione del risultato refrattivo e, oppure, la formazione di una lieve opacizzazione corneale (haze) che, se presente in misura importante, causa un forte decadimento quantitativo e qualitativo della funzionalità visiva, in questo caso non correggibile neppure con gli occhiali. La regressione e l' haze hanno entrambi una eziologia dovuta ad una pluralità di fattori.

I primi fattori sono di carattere individuale (predisposizione genetica) e come tali non sono influenzabili. Ha poi importanza il tipo di meccanismo fotoablativo e l’ampiezza della zona fotoablata; zone di ablazione più ampie e più regolari sembrerebbero infatti aumentare la stabilità del risultato refrattivo. Il miglioramento delle tecniche fotoablative è però pertinente alla tecnica dei laser ad eccimeri.

Un ultimo importante fattore eziologico è legato al ruolo della apoptosi. (Wilson SE, et al., Exp.Eye Res., 1996,62:325-328; Helena BC, Inv. Ophthal.& Visual Science, 1988,39:276-283).

L’apoptosi è una morte cellulare programmata che, contrariamente ai normali processi necrotici, è accompagnata da una scarsa risposta infiammatoria e dalla mancata liberazione delle componenti di degradazione cellulare che altrimenti indurrebbero dei danni nel tessuto circostante. E’ stata osservata nella cornea una apoptosi dei cheratociti stromali sia a seguito di infezioni da herpes simplex, sia in risposta ad un insulto epiteliale quale è quello che si realizza in un intervento di cheratectomia fotorefrattiva durante la prima fase di disepitelizzazione corneale. Tale disepitelizzazione, sia che essa avvenga per azione meccanica, sia per altra tecnica, comporta la liberazione da parte delle cellule epiteliali danneggiate di citochine (ad esempio la interleuchina-1) che si legano ai cheratociti stromali sottostanti mediando quindi la loro apoptosi. La morte cellulare programmata di questi cheratociti stromali comporta un’attivazione dei cheratociti circostanti che ha lo scopo di ripopolare lo stroma anteriore ed è associata ad una aumentata deposizione di collagene e ad una sua disorganizzazione, entrambi fenomeni ritenuti responsabili della comparsa di haze (opacità corneale) e di regressione dopo intervento di cheratectomia fotorefrattiva (per una rassegna vedi Wilson SE,J.Refractive Surgery,1997, 13:171-175). Il ruolo della apoptosi in un’ampia gamma di patologie oculari è stato ampiamente dimostrato (vedi Capaccioli S. et al., in Bisantis C. and Carella G. “Vascular systems of thè optic nerve and perioptic area.” I.N.C Editor, Rome, Italy, 1998)

Come è noto, sono vari gli agenti che innescano l’apoptosi e possono essere di natura chimica (per esempio farmaci genotossici), fisica (radiazioni, insulto meccanico) o biologica(per esempio virus).(Capaccioli et al., in: Monografie della Socoità Italiana di Oftalmologia, Casa editrice I.N.C., Roma, 1998).

Per quanto riguarda i raggi ultravioletti è ormai accertato che essi inducono, nei pazienti operati di cheratectomia refrattiva, a livello corneale dei processi ossidativi implicati sia nella formazione del “haze” che nella regressione. Non infrequente è infatti, nei pazienti operati di PRK e LASIK, il riscontro di una maggiore incidenza di haze al termine della stagione estiva, cioè alla fine di quel periodo dell’anno in cui massima è l’esposizione ai raggi solari. Tali processi ossidativi implicano la liberazione di radicali liberi già dimostrata in preprarati laboratoriali da epitelio di animali da esperimento trattati con laser ad eccimeri, radicali liberi potenzialmente in grado di innescare il processo di apoptosi e di danno cellulare diretto.

Il chinone Q10 svolge in natura un ruolo essenziale in quanto fa parte della catena di trasporto mitocondriale degli elettroni ed è noto come un efficace antiossidante.

Sommario della invenzione

Il problema a base della presente invenzione è quindi di fornire un farmaco per contrastare l’apoptosi dei cheratociti stromali corneali nella cheratectomia fotorefrattiva (PRK e LASIK), nonché di ridurre i processi ossidativi indotti da esposizione a raggi ultravioletti della luce solare.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione l’uso del coenzima ubichinone Q10, sotto forma di collirio per uso topico oftalmico, per la produzione di un farmaco per il trattamento di patologie oculari in generale ed, in particolare, efficace nella prevenzione e nel trattamento di opacità corneali secondarie a traumi corneali, chirurgia generale e chirurgia refrattiva; prevenire la regressione degli effetti correttivi dopo chirurgia reffattiva eseguita con chirurgia convenzionale o con radiazione laser; per la protezione dell’occhio dai dannni determinati dalle radiazioni della luce solare e dalle radiazioni ultraviolette.

Rientra inoltre nel campo dell’invenzione l’uso topico oftalmico dell’ ubichinone Q10 per la prevenzione e il trattamento di patologie, oppure di traumi accidentali o post-operatori, della camera anteriore dell’occhio, inclusi l’iride e il cristallino.

Più in particolare forma anche oggetto della presente invenzione una formulazione sotto forma di collirio e un procedimento per la sua preparazione per l’applicazione oftalmica di ubichinone, per la protezione della cornea nei confronti dell’apoptosi dei cheratociti stromali corneali che potrebbe innescarsi a seguito del trattamento di chirurgia refrattiva e/o con laser ad eccimeri e di esposizione a radiazione ultravioletta solare.

E’ noto che l’apoptosi è un fenomeno di morte cellulare programmata e in quanto tale caratterizzata da ben precisi percorsi segnalatori all’interno della cellula. Benché gli eventi fondamentali siano stati ad oggi individuati e raggruppati in compartimenti operativi virtuali (compartimento iniziatore, modulatore, effettore) i precisi meccanismi molecolari che ne stanno alla base sono estremamente complessi, e la loro comprensione è tuttora ampiamente lacunosa. Certo è che mentre il compartimento modulatore ed effettore possono essere ricondotti a un numero limitato di vie segnalatone alternative, il compartimento iniziatore risponde ad una molteplicità di stimoli assai diversi fra loro, pur essendo tutti di natura potenzialmente apoptotica. Fra questi sono stati individuati agenti biologici, fra cui i virus , l’ipossia e una varietà di agenti chimici e fìsici fra cui agenti genotossici, agenti ossidanti, radiazioni eccitanti, ionizzanti ed elettromagnetiche, insulti meccanici, stimolazione da parte di citochine, difetto di fattori trofici, ecc.

Anche se sono note da tempo le proprietà antiossidanti del Q10, la sua caratterizzazione in quanto agente avente influenza sulla apoptosi dei cheratociti straniali corneali nella cheratectomia fotoreffattiva non è conosciuta allattale stato dell’arte. Vi sono infatti esclusivamente indizi indiretti su un co involgi mento del Q10 nel meccanismo della apoptosi. Per esempio quando veicolato nel siero il Q10 è risultato apportare beneficio nella terapia dell’insulto da ischemia da riperfusione, patologia in cui è nota essere implicata l’apoptosi (Sharov et al., Am J. Pathol. 148(1): 141-9, 1996). In questa patologia comunque si ritiene che il ruolo del Q10 sia anche quello di mantenere integra la catena di trasporto degli elettroni al fine di produrre una quantità di ATP sufficiente per un’attività cardiaca ottimale. Il ruolo del Q10 sarebbe quindi visto in generale non solo come molecola antiossidante ma anche come componente chiave della catena respiratoria, ove tale coenzima partecipa come componente di ben tre complessi multienzimatici, processo che si riflette nella produzione di energia chimica sotto forma di ATP.

Un terzo ruolo che l’ubichinone è risultato recentemente rivestire è quello di regolatore del cosiddetto microporo di transizione di permeabilità mitocondriale (Permeability Transition Pore, PTP) presente nella membrana mitocondriale interna, nel quale il Q10 si inserisce legandosi ad un suo specifico sito di legame. Lo stato funzionale del suddetto microporo è regolato dal complesso I della catena respiratoria di cui Q10 fa parte. A questo livello il Q10 agisce inibendo l’apertura del microporo, un evento precoce del programma apoptotico in quanto consente la fuoriuscita del citocromo c nel citoplasma e il suo legame ad APAFI che innesca il processo di di attivazione delle caspasi (Fontaine E. et al. J.Biol. Chem.

271:6746-6751, 1998).

Quanto sopra riportato non consente tuttavia di asserire che quanto osservato nel modello cardiaco sia estendibile tout court al modello corneale.

Viene riportato qui di seguito l’unico lavoro a noi noto in cui il Q10 è associato direttamente a una molecola coinvolta nella via segnalatoria del processo apoptotico (Barroso M.P. et al, J. Bionerg. Biomembr., 1997, 29:259-67). Pare infatti che il Q10 presente nella membrana piasmatica abbassi i livelli di ceramide, prodotto di degradazione della sfingomielina e noto trasduttore del segnale apoptotico.

Con riferimento alla PRK, benché sia stato appurato che gli effetti indesiderati della tecnica sono da riferire in larga parte alla morte cellulare per apoptosi, non sono noti gli effetti immediati del laser a eccimeri sui meccanismi di citotossicità dello stesso.

E’ stato dimostrato che altri antiossidanti come l’acido ascorbico, il pirrolidinditiocarbammato (PDTC), la Vitamina E, e simili, hanno effetti contrastanti sull’apoptosi indotta da vari stimoli. Per esempio l’acido ascorbico è stato dimostrato essere efficace nell’inibire l’apoptosi indotta da stress ossidativo a concentrazioni piuttosto alte, (Witenberg B et al.,Biochem. Pharmacol., 1999, 57:823-32) ma i suoi derivati si sono dimostrati tossici in presenza di H202 (Iwasaka K., Biochem.Anticancer Res., 1998, 18:4333-7).

Il PDTC è risultato protettivo nei confronti deH’apoptosi indotta da Tumor Necrosis Factor (TNF) (Higuchi M.,et al. Oncogene, 1998, 17:2515-2524), ma al pari della Vitamina E è risultato indurre apoptosi in una linea cellulare di cancro del colon retto (CRC) (Chinery R, et al. Nat. Med. 1997, 11 : 1233-41).

Pertanto non era da prevedere sulla sola base delle sue caratteristiche antiossidanti, che l’impiego del Q10 come agente preventivo e terapeutico nella chirurgia corneale refrattiva potesse avere un effetto vantaggioso nella prevenzione e nella cura di effetti collaterali indesiderabili nella chirurgia fotorefrattiva (PRK e LASIK) e nella esposizione alle radiazioni ultraviolette.

Analogamente non era da prevedere quanto l’impiego di Q10 possa proteggere le cellule dall’apoptosi in quelle malattie oftalmologiche in cui tale processo di morte cellulare appare rivestire un ruolo chiave nei meccanismi patogenetici.

D’altra parte, il fatto che per il Q10 non si hanno notizie di effetti citotossici alle concentrazioni sino ad oggi impiegate in ricerche in vitro, è a favore della innocuità del farmaco nei riguardi di effetti tossici.

RELAZIONE SPERIMENTALE

E’ stato sperimentato in laboratorio l’effetto protettivo del Q10 nei confronti della apoptosi e della necrosi indotta dalla radiazione ultravioletta (sia con laser a eccimeri ArF 193 nm, che con radiazioni a 254 nm) su cheratociti corneali di conoglio in coltura. La apoptosi è stata valutata mediante marcatori precoci e tardivi quali analisi dello stato di ossidoriduzione del citoplasma (saggio della malonaldeide), livelli di ATP, microscopia confocale e elettronica a trasmissione, espressione del gene p53, analisi quali/quantitativa delle modificazioni morfologiche delle cellule mediante videomicroscopia a intervalli di tempo.

I dosaggi da impiegare dovrebbero essere compresi neirintervallo tra 2 μΜ e 500 μΜ, preferibilmente 10 μΜ.

E’ stata inoltre messa a punto una preparazione accettabile dal punto di vista farmaceutico per la somministrazione topica in collirio di Q10.

Nei disegni:

la figura la è un diagramma che illustra i livelli di malonaldeide secondo l’esempio 2 a seguito di trattamento con UV a 254 nm e nel confronto diretto con o senza l’impiego di vitamine, di Q10 o entrambi; la figura lb è un diagramma che illustra i livelli di malonaldeide secondo l’esempio 2 a seguito di trattamento con laser a eccimeri a 193 nm e nel confronto diretto con o senza impiego di Q10;

le figure 2a e 2b sono diagrammi che illustrano i livelli di ATP secondo l’esempio 3 a seguito di trattamento rispettivamente con laser a eccimeri e con UV;

la figura 3 riporta tre fotogrammi A, B e C presi a 24 ore dal tarttamento di cellule esposte alla dose indicata di radiazione laser 193 nm, con riferimento all ’esempio 5;

la figura 4 è un diagramma della curva dose UV/risposta delle cellule vitali con riferimento all’esempio 4;

le figure 5a e 5b illustrano gli effetti protettivi del Q10 secondo l’Esempio 4, nei confronti rispettivamente del trattamento con radiazione UV 254 nm e con laser a eccimeri; e

le figure 6a e 6b sono diagrammi che illustrano il conteggio delle cellule vitali secondo quanto descritto nell’esempio 4, in seguito rispettivamete a trattamento con radiazione UV e con laser a eccimeri. Esempio 1

Solubilizzazione del PIO in solvente idoneo alla somministrazione in terreno di coltura.

In una formulazione di collirio per la somministrazione del Q10, un passo essenziale è la messa a punto di un veicolo, in quanto la molecola è dotata di alta idrofobicità. A questo scopo è stata preparata una soluzione madre di Q102316 μΜ

(0,2%) in Lutrol FI 27™ 10% in acqua, mediante agitazione. La soluzione è stata poi ripartita in aliquote da 500 μΐ ciascuna e le aliquote sono state saturate facendovi gorgogliare azoto gassoso e conservate a 4°C. Al momento dell’uso la soluzione madre viene ulteriormente diluita mediante terreno di coltura per ottenere una soluzione figlia 100X (1000 pm). Questa soluzione è stata utilizzata per trattare le colture cellulari in piastra alla concentrazione finale di Q10 di 10 μΜ. In tal modo la concentrazione finale del veicolo (Lutrol F127™) nel mezzo di coltura è di circa 0,04%.

Esempio 2

Valutazione, indiretta della produzione di radicali liberi in seguito a tratamento con laser a eccimeri a 193nm

e ultravioletti a 254nm mediante misurazione dei livelli di malondialdeide e dell’efficacia del PIO nel prevenirla.

La malondialdeide è un prodotto della perossidazione dei lipidi che avviene in seguito ad esposizione degli acidi grassi poliinsaturi a radicali liberi. La produzione di malondialdeide viene pertanto assunta routinariamente come indice di produzione dei radicali stessi ad opera di trattamenti con radiazioni elettromagnetiche o sostanze ossidanti. Il Q10, in quanto antiossidante, abbassa la produzione di malondialdeide indicando una sua azione che inibisce la formazione dei radicali liberi. Per eseguire il saggio della malondialdeide, cellule RCE (Rabbit Comeal Epithelial Cells che sono cheratociti corneali di coniglio immortalizzati con SV40) sono state piastrate alla densità di 5xl0<5 >cellule/piastra in 10 piastre di Peti da IO cm di diametro e incubate per tutta la notte in atmosfera di C02 al 5%, 37°C. Successivamente le piastre sono state preincubate 2 ore con Q10 10 μΜ, Vit.E, Vit. C sciolti in Lutol F127™, da soli oppure in combinazione e con solo Lutol F127™ come indicato in Figura 1. Successivamente le cellule sono state lavate con 8 mi di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) sterile, addizionato di Ca<+4 >e Mg** per evitare il distacco delle cellule dal supporto, e le piastre prosciugate sono state sottoposte a tratamento con laser ad eccimeri (λ = 194 nm) a varie dosi (come indicato in figura la) o a radiazione ultravioletta a 254 nm (15.000 pj/cm<2>) come indicato in figura lb. Successivamente il PBS è stato sostituito con terreno fresco addizionato dei reagenti di cui sopra e le piastre sono state incubate per ulteriori 2 ore. Al momento del saggio le cellule sono state staccate con tripsina secondo procedure standard e contate mediante camera contaglobuli. Successivamente le cellule dei vari campioni vengono Usate mediante aggiunta di acido tricloroacetico (TCA) e centrifugate per 20 minuti a 12.000 RPM per far precipitate le proteine.

A 300 μΐ di sovranatante di ciascun campione sono stati aggiunti 300 μΐ di acido tiobarbiturico (TBA) 1%. Le miscele sono state incubate a 95°C per 30 minuti centrifugate 20 minuti a 12.000 RPM ed è stato valutato l’assorbimento ottico del sovranatante risultante mediante analisi spettrofotometrica a λ = 532 nm.

I valori ottenuti sono stati confrontati con una curva standard di taratura e normalizzati per il numero di cellule.

In figura la è riportato l’effetto protettivo del Q10 da solo o in combinazione con altri antiossidanti in seguito a trattamento con radiazione UV.

I valori ottenuti riportati nel grafico di figura lb mostrano l' effetto riduttivo del Q10 nei confronti della produzione di malondialdeide in seguito a trattamento con varie dosi di radiazione laser ad eccimeri di 193 nm.

La sperimentazione dimostra quindi mediante confronto diretto con altri mezzi della tecnica nota, il contenimento operato dal Q10 sul livello di perossidazione degli acidi grassi da parte dei radicali liberi ed indirettamente l’effetto protettivo nei confronti dei radicali liberi stessi prodotti dal trattamento laser.

Esempio 3

Valutazione dei livelli di adenosina trifosfato (ATP) in seguito a trattamento con laser a eccimeri e a -ultravioleti a 254 nm. e deireffetto del PIO su detti livelli·

I livelli di ATP sono strettamente correlati al modello di morte cellulare che si realizza in seguito a danno biochimico. Per esempio un livello di ATP inferiore al 20% rispetto al normale è responsabile della necrosi mentre i livelli superiori consentono ancora la realizzazione dell’apoptosi che è notoriamente un processo che necessita di energia.

Mentre è stato verificato che i livelli di ATP vanno incontro ad una drastica riduzione in seguito al trattamento con radiazioni, è risultato che, secondo la presente invenzione, il Q10 è in grado di prevenire tale riduzione.

Per eseguire il saggio dell’ATP cellule RCE sono state piazzate alla densità di 5 x IO<5 >cellule/piastra in 10 piastre di Petri da 10 cm di diametro e incubate per tutta la notte in atmosfera di C02 al 5%, 37°C. Successivamente le piastre sono state preincubate 2 ore con Q10 a 10 μΜ sciolto nella soluzione di Lutrol F127™ oppure con solo Lutrol F127™. Il terreno è stato poi rimpiazzato con 8 mi di PBS sterile, addizionato di Ca** e Mg<++ >per evitare il distacco delle cellule dal supporto e le piastre sono state sottoposte al trattamento con laser a eccimeri (λ = 193 nm) come indicato in figura 2a o a ultravioletti 254 nm, come indicato nella figura 2b. Successivamente il PBS è stato sostituito con terreno fresco addizionato dei reagenti di cui sopra e le piastre sono state incubate per ulteriori 2 ore. Al momento del saggio le cellule sono state staccate con tripsina secondo procedure standard e contate mediante camera contaglobuli. Le cellule sono state quindi risospese in H20 distillata alla concentrazione di 6 x IO<4 >cellule/1000 mi bollite immediatamente 5 minuti e congelate a -20°C per successiva analisi. La quantificazione dell’ATP negli estratti è stata effettuata mediante il kit “ATP Determination Kit” (Molecular Probes, USA), basato sulla luciferasi di lucciola secondo le istruzioni del fornitore. Per la rivelazione della fluorescenza è stato utilizzato un analizzatore per scintillazione liquida (Camberra Packard, USA) predisposto per l’analisi della bioluminescenza.

L’esperimento dimostra quantitativamente l' effetto protettivo del Q10 che contrasta l’abbassamento del livello di ATP prodotto dalle radiazioni UV, nei confronti di una morte cellulare del modella necrotico. Ciò avvalora il fatto che il modello di morte cellulare in presenza di Q10 si sposta verso eziologie diverse da quelle che si manifestano in sua assenza.

Esempio 4

Conteggio delle cellule vitali in seguito a trattamento con laser a eccimeri ArF a 193 nm e radiazione UV 254 nm e valutazione dell’effetto protettivo del PIO mediante saggio d’esclusione del trypan blu su cellule RCE*

Il conteggio delle cellule vitali dopo un certo tempo del trattamento è un parametro essenziale nella valutazione dell’effetto delle radiazioni anche se preliminare perché non dice nulla riguardo al destino cui vanno incontro le cellule (blocco del ciclo cellulare, apoptosi, necrosi). Il fatto però che il Q10 abbia un effetto di protezione generale nei confronti della morte da radiazioni è un dato importante nella prevenzione di effetti collaterali della PDK. Per eseguire il saggio del trypan blu cellule RCE sono state piastrate alla densità di 5 x IO<5 >cellule/piastra da 10 cm di diametro incubate tutta la notte a 37°C, C02 19%. Successivamente le piastre sono state preincubate 2 ore con Q10 10 μΜ sciolto nella soluzione di Lutrol FI 27 oppure con solo Lutrol F127™. Il terreno è stato poi rimpiazzato con 8 mi di PBS sterile, addizionato di Ca<++ >e Mg<++ >per evitare il distacco delle cellule dal supporto, e le piastre sono state sottoposte a trattamento con laser ad eccimeri e radiazione UV λ =254 in un apparecchio Stratalinker modello 1800 (Stratagene). Successivamente il PBS è stato sostituito con terreno fresco addizionato dei reagenti di cui sopra.

Le piastre sono state incubate per i tempi indicati in figura 6a e in figura 6b e successivamente staccate con tripsina secondo procedure standard e risospese in PBS. Alla sospensione cellulare è stata aggiunta una soluzione di tryplan blu in PBS alla concentrazione dell’1% immediatamente prima del conteggio effettuato mediante camera contaglobuli. Il numero di cellule vive è stato riportato nelle figure 4, 5a e 5b in percentuale del campione non trattato.

In figura 4 è riportata la curva dose UV/risposta grazie alla quale è stata scelta una dose di 15.000 pJ/cm per i successivi trattamenti con UV in modo tale da ottenere i maggiori effetti apoptotici senza discostarsi dal range di linearità. Per il laser ad eccimeri si è operato con una dose paragonabile a quella che raggiunge in vivo gli strati corneali ineressati dai fenomeni descritti precedentemente a carico dell’occhio. Nelle figure 5a e 5b sono riportati gli effetti protettivi del Q10 nei confronti rispettivamente del danno da radiazione UV 254 nm e da laser a eccimeri.

L’esperimento dell’esempio 4 dimostra in modo quantitativo diretto l’effetto protettivo del Q10 sulla vitalità delle cellule trattate con laser ad eccimeri e ad UV 254 nm.

Esempio 5

Analisi quantitativa in microscopia ottica dell’effetto protetttivo del PIO nei confronti dell’apoptosLÌndotta_da_laser a eccimeri 193 nm.

Cellule RCE sono trattate come descritto nel l’esempio 6 successivo. Nelle figure 3A, 3B e 3C sono riportati fotogrammi presi a 24 ore dal trattamento di cellule esposte alla dose indicata di radiazione laser 193 nm. Le cellule rotondeggianti rifrangenti sono cellule collassate e staccate con la tipica morfologia apoptotica.

Esempio 6

Valutazione degli effetti antiapoptotici del PIO mediante videomicroscopia a intervalli di tempo in seguito a trattamento di cellula RCE con laser a eccimeri 193 nm e radiazione UV 254 nm.

La videomicroscopia ad intervalli di tempo è a tutt’oggi una delle poche tecniche, se non l’unica, che consente di avere, oltre alla caratterizzazione del tipo di morte cellulare, anche la sua esatta quantificazione. Infatti riprendendo in continuo la popolazione cellulare è possibile calcolare il numero di morti cumulative senza perdere alcun evento di morte a causa della disintegrazione del corpo cellulare che tipicamente si verifica in corso di apoptosi.

Per realizzare l’esperimento cellule RCE sono state piastrate alla densità di 5 x IO<5 >cellule/piastra da 10 cm di diametro e incubate tutta la notte a 37°C, C02 10%. Successivamente le piastre sono state preincubate 2 ore con Q10 10 μΜ sciolto nella soluzione di Lutrol FI 27™ oppure col solo Lutrol F127™. Il terreno è stato poi rimpiazzato con 8 mi di PBS sterile, addizionato di Ca++ e Mg++ per evitare il distacco delle cellule dal supporto, e le piastre sono state sottoposte a trattamento laser a eccimeri e a radiazione UV λ = 254 in un apparecchio Stràtalinker modello 1800 (stratagene) a varie dosi. Successivamente il PBS è stato sostituito con terreno fresco addizionato degli agenti di cui sopra. Il conteggio degli eventi apoptotici individuali, sulla base della peculiare morfologia della cellula apoptotica, è stato condotto in continuo mediante videomicroscopia a intervalli di tempo impiegando una apparecchiatura autoassemblata in cui sono stati utilizzati microscopi Zeiss modello Televai 31, videoregistratori tipo time lapse Panasonic BR90300 e videocamere Panasonic in un arco di 24-72 ore dal trattamento con radiazioni. I conteggi delle morti apoptotiche cumulative sono stati effettuati sempre dallo stesso operatore e riportati in grafico in funzione del tempo (figura 6)

L’esempio 6 dimostra in modo quantitativo e con riferimento diretto al modello di morte apoptotica l’effetto protettivo del Q10 su cellule trattate con laser ad eccimeri 193 nm e radiazione UV di 254 nm. Le modificazioni biochimiche rilevate negli estratti dei cheratociti trattati con Q10 (livelli di ATP e malonaldeide), nonché gli effetti fenotipici, indicano bona fide l’awanuta captazione della molecola in oggetto da parte delle cellule.

Formulazione topica per la somministrazione oftalmica di ubichinone. Considerazioni generali.

Come è noto, la scarsa solubilità in acqua che si riscontra in molte sostanze farmacologicamente attive porta spesso a notevoli difficoltà formulati ve, particolarmente nel caso in cui siano desiderate soluzioni acquose facilmente somministrabili. Ciò si verifica in modo particolare nei campo dei preparati liquidi per uso topico oftalmico e per l'uso sulle mucose orali.

Considerando in modo specifico il campo oftalmico, un principio attivo, per essere terapeuticamente efficace, deve poter penetrare attraverso la cornea e raggiungere i siti di azione situati all 'interno dell'occhio. La cornea è una struttura a carattere idrofilo, contenente circa il 78% di acqua, collageno (12-15%) e proteoglicani (1-3%), proteine solubili, glicoproteine ed una piccola parte di lipidi. E' quindi comprensibile come un principio attivo, se somministrato in un veicolo acquoso, più affine alla struttura corneale, penetri più velocemente ed in maggiore quantità all' intemo dell'occhio, portando ad una più pronta e duratura attività terapeutica.

D’altra parte, esistono numerosi principi attivi scarsamente idrosolubili che invece sarebbero estremamente vantaggiosi ed efficaci se somministrati per via topica in forma di colliri. Quali esempi si possono citare agenti antiglaucoma (dapiprazolo, forskolina), antiinfiammatori non steroidei (piroxicam, indometacina), agenti antiossidanti (ubichinone, tocoferolo), antibatterici (anfotericina B, rufloxacina). In tutti questi casi la solubilità in acqua del principio attivo è talmente scarsa da renderne impossibile o sconveniente la commercializzazione sottoforma di collirio, oppure da limitarne drasticamente le concentrazioni nei preparati realizzabili.

Nel tempo sono state studiate e messe a punto varie metodiche per aumentare la solubilità, e di consequenza anche la formulabilità e la biodisponibilità di farmaci scarsamente idrosolubili. Tali metodiche comprendono modificazioni chimiche della molecola insolubile, solubilizzazione mediante tensioattivi (soluzioni micellari), introduzione in vescicole liposomiali, complessazione mediante polimeri.

La trasformazione del principio attivo in un derivato ionico o ionizzabile (ad esempio un estere) è un metodo di solubilizzazione molto comune. Innumerevoli pubblicazioni scientifiche hanno avuto come soggetto la solubilizzazione micellare di farmaci mediante tensioattivi. Le micelle, per il loro doppio carattere lipofilo-idrofilo, sono capaci di mantenere in soluzione acquosa prodotti lipofili inglobati. Un meccanismo simile si verifica con l'uso di liposomi, i quali sono vescicole capaci di incapsulare e contenere nel loro interno vari tipi e quantità di molecole, anche particolarmente lipofile. Il guscio esterno dei liposomi presenta invece spiccate caratteristiche idrofile, è quindi facilmente disperdibile in soluzione acquosa. La formazione di complessi, soluzioni e dispersioni solide mediante l'uso di adatti polimeri è un'altra metodica per aumentare la solubilità in acqua di sostanze farmacologicamente attive.

E’ noto che il coenzima Q10 è una sostanza non idrosolubile e pertanto la sua applicazione topica alla cornea sotto forma di collirio acquoso non ha finora trovato applicazione nella tecnica corrente.

L’agente attivo ubichinone Q10 può per esempio venire veicolato attraverso una soluzione di polivinilpirrolidone o tramite un lipide cationico sotto forma di liposoma.

Secondo la presente invenzione, è stata sorprendentemente realizzata una forma farmaceutica di carattere innovativo per la veicolazione dell’ubichinone, sia dal punto di vista della via di somministrazione che della composizione. Al presente stato della tecnica nessun preparato a base di ubichinone è mai stato formulato per uso topico oftalmico, ma le vie di somministrazione si limitano alla topica cutanea (in preparati cosmetici) od alla sistemica orale.

La formulazione messa a punto permette la somministrazione sotto forma di collirio, come soluzione acquosa limpida, sterile e resa isotonica con il fluido lacrimale. Nella formulazione è stata introdotta anche una vitamina liposolubile (in particolare tocoferolo o vitamina E), con attività antiossidante, che può aumentare la stabilità del principio attivo ubichinone.

Per la solubilizzazione del principio attivo, secondo la presente invenzione, è stata impiegata una composizione contenente tensioattivi non ionici.

Tale composizione comprende: 0,01 fino a 2,0% p/p di ubichinone Q10; 0,005 fino a 0,1% p/p di tocoferolo; e una miscela includente un olio di ricino modificato e un copolimero a blocchi da ossido di etilene idrofilo e ossido di propilene lipofilo avente una proporzione prevalente di poliossietilene, un peso molecolare medio compreso tra 10.000 e 13.000 Dalton e un valore di HLB (equilibrio idrofilo/lipofilo) superiore a 15, in una quantità sufficiente a solubilizzare detti componenti in soluzione acquosa, generalmente compresa tra 10 e 15% p/p..

La miscela di questi due tensioattivi (poliossietilenepoliossipropilene) ed un olio di ricino modificato (poli-etilenglicole gliceriltriricinoleato), porta alla solubilizzazione micellare completa dei componenti della forma farmaceutica.

Un esempio particolare del sopra menzionato copolimero a blocchi è un prodoto commerciale denominato Lutrol FI 27.

Le concentrazioni di ubichinone impiegabili per la formulazione di soluzioni oftalmiche sono comprese fra 0.01 e 2.0% parti in peso (p/p); più preferibilmente fra 0.1 e 1.0% p/p, ferma restando la concentrazione ideale come "anti opacizzante" corneale dello 0.2% p/p. Le concentrazioni di tocoferolo in queste preparazioni sono generalmente comprese fra 0.005 e 0.1% p/p; più preferibilmente fra 0.01 e 0.5% p/p.

In modo più particolare, una composizione preferita comprende: circa 0,2% p/p di ubichinone Q10; 0,02 fino a 0,04% p/p di tocoferolo; e la miscela includente polietilenglicole gliceril-triricinoleato e un copolimero a blocchi da ossido di etilene e ossido di propilene avente una proporzione di circa 70% di poliossietilene, un peso molecolare medio di circa 12.000 Dalton e un valore di 22 HLB.

L'ingrediente da aggiungere necessariamente alle formulazioni è un prodotto che porti la soluzione ai giusto valore di osmolarità. La soluzione contenente soltanto il principio attivo infatti, risulta ipotonica rispetto al fluido lacrimale, Altri ingredienti che possono essere aggiunti sono correttori di pH (compresi sali che formino un tampone nella soluzione), prodotti con proprietà antisettiche, complessanti e conservanti, antiossidanti e sinergizzanti.

Il procedimento per la produzione del collirio comprende un procedimento per la solubilizzazione in acqua ed in veicoli acquosi dell'ubichinone (coenzima Q10). In particolare mediante il procedimento è possibile aumentare notevolmente la solubilità in acqua di tale composto al fine di ottenere soluzioni acquose aventi concentrazioni terapeuticamente e commercialmente utili.

Ancora più in dettaglio il procedimento permette di introdurre nella stessa preparazione acquosa una vitamina liposolubiie, la quale presenta di per sè una solubilità in acqua praticamente nulla.

Secondo tale procedimento, ubichinone, tocoferolo, copolimero a blocchi, olio di ricino modificato vengono fusi ad una temperatura compresa tra 40 e 80°C, preferibilmente di 60°C. Alla massa fusa viene aggiunta, sotto agitazione, acqua alla stessa temperatura (intorno a 60°C). La dispersione viene lasciata agitare fino a completa solubilizzazione dei componenti, quindi vengono aggiunti gli eventuali additivi.

A titolo di esempio vengono elencate alcune realizzazioni di formulazioni:

Tampone fosfato Sorensen pH 7.4 q.b. a 100.00

Pur avendo descritto in dettaglio la presente invenzione, si intende che varianti e modifiche ne possono essere derivate senza uscire dal campo e dallo spirito della invenzione stessa.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Uso del coenzima ubichinone Q10 per la produzione di un farmaco per uso topico oftalmico per la prevenzione e il trattamento di patologie, oppure di traumi accidentali o post-operatori, della camera anteriore del rocchio.
2. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 1, in cui detto trattamento comprende la prevenzione e la cura di opacità corneali secondarie a traumi corneali, chirurgia generale e chirurgia refrattiva; la prevenzione della regressione degli effetti correttivi dopo intervento di chirurgia refrattiva eseguita con chirurgia convenzionale o con radiazione laser; e la protezione dell’occhio dai danni determinati dalle radiazioni della luce solare e dalle radiazioni ultraviolette.
3. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 1 oppure 2, in cui detto trattamento è diretto alla protezione delle cellule dell’occhio nei confronti di danno reversibile o irreversibile indotto da detto intervento chirurgico e, oppure laser e da esposizione alle radiazioni solari e ultraviolette.
4. Uso di ubichinone Q10 secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il danno irreversibile di dette cellule è la apoptosi.
5. Uso di ubichinone Q10 secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette cellule sono i cheratociti stromali corneali.
6. Uso di ubichinone Q10 secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta chirurgia corneale è la cheratectomia fotoreffattiva (PRK) e la cheratomileusi in situ (LASIK).
7. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 6, in cui detta cheratectomia fotorefrattiva (PRK) e detta cheratomil elisi in situ (LASIK) sono condotte mediante sorgenti laser.
8. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 7, in cui dette sorgenti laser sono laser ad eccimeri.
9. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 8, in cui detta sorgente laser è un laser ad eccimeri ArF a 193 nm.
10. Uso di ubichinone Q10 secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto farmaco comprende una composizione per applicazione topica alla cornea, includente ubichinone Q10 in una quantità efficace agli effetti di detto trattamento e un veicolo farmaceuticamente compatibile.
11. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 10, in cui detto veicolo è una soluzione acquosa di una miscela comprendente: un copolimero a blocchi di ossido di etilene idrofilo e ossido di propilene lipofilo, avente una proporzione prevalente di poliossietilene, un peso molecolare medio compreso tra 10.000 e 13.000 Dalton e un valore di HLB superiore a 15; e un olio di ricino modificato.
12. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 11, in cui detto copolimero comprende circa' 70% di poliossietilene ed ha un valore di HLB di circa 22.0
13. Uso di ubichinone Q10 secondo la rivendicazione 11 oppure 12, in cui detto olio di ricino modificato è polietilenglicole gliceriltriricinoleato.
14. Composizione di collirio per uso topico oftalmico comprendente, come componenti: 0,01 fino a 2,0% p/p di ubichinone Q10; 0,005 fino a 0,1% p/p di tocoferolo; e una miscela includente un olio di ricino modificato e un copolimero a blocchi da ossido di etilene idrofilo e ossido di propilene lipofilo avente una proporzione prevalente di poliossietilene, un peso molecolare medio compreso tra 10.000 e 13.000 Dalton e un valore di HLB superiore a 15, in una quantità sufficiente a solubilizzare detti componenti in soluzione acquosa.
15. Composizione secondo la rivendicazione 14, comprendente 0,1 fino a 1,0% p/p di ubichinone.
16. Composizione secondo la rivendicazione 14, comprendente circa 0,2% p/p di ubichinone.
17. Composizione secondo la rivendicazione 14, comprendente 0,01 fino a 0,05% p/p di tocoferolo.
18. Composizione secondo qualsiasi elle rivendicazioni da 14 a 17, in cui detto olio di ricino modificato è polietilenglicole gliceriltriricinoleato.
19. Composizione secondo qualsiasi elle rivendicazioni da 14 a 18 comprendente in un veicolo acquoso, come componenti: circa 0,2% p/p di ubichinone Q10; 0,02 fino a 0,04% p/p di tocoferolo; e 10 fino a 15% di una miscela includente polietilenglicole gliceril-triricinoleato e un copolimero a blocchi da ossido di etilene e ossido di propilene avente una proporzione di circa 70% di poliossietilene, un peso molecolare medio di circa 12.000 Dalton e un valore di 22 HLB.
20. Composizione secondo qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 19, comprendente inoltre, quali ingredienti ausiliari, correttori di pH, sali tampone, antisettici, complessanti, antiossidanti, sinergizzanti e conservanti.
21. Procedimento per la produzione di una composizione come rivendicata in qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 20, comprendente la operazioni di: fondere l' ubichinone, il tocoferolo, il copolimero a blocchi e l'olio di ricino modificato, ad una temperatura di 40 fino a 80°C fino ad ottenere una massa fusa; aggiungere acqua alla massa fusa alla stessa temperatura fino ad ottenere una dispersione; sotto agitamento, lasciare solubili zzare completamente detti componenti.
22. Procedimento secondo la rivendicazione 21, in cui detta temperatura è di 60°C.
23. Procedimento secondo la rivendicazione 21 o 22, in cui detti ingredienti ausiliari vengono aggiunti dopo la solubilizzazione.