ITRM20110646A1 - Metodo e kit diagnostico. - Google Patents

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ITRM20110646A1
ITRM20110646A1 IT000646A ITRM20110646A ITRM20110646A1 IT RM20110646 A1 ITRM20110646 A1 IT RM20110646A1 IT 000646 A IT000646 A IT 000646A IT RM20110646 A ITRM20110646 A IT RM20110646A IT RM20110646 A1 ITRM20110646 A1 IT RM20110646A1
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virus
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IT000646A
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Sandro Drago
Giuseppe Stampone
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Description

"METODO E KIT DIAGNOSTICO"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un metodo per la rivelazione di patogeni in campioni cellulari immunopurificati su membrana per immunocromatografia mediante RT-PCR e/o Real Time RT-PCR in cui detto metodo non prevede passaggi di estrazione di acidi nucleici, kit e dispositivi per la realizzazione di detto metodo.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
Nelle metodiche di diagnostica di agenti patogeni, quali virus, funghi e batteri, una delle tecniche più precise e sensibili à ̈ rappresentata dalla RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) e dalla Real Time RT-PCR, che à ̈ la tecnica di amplificazione dell’RNA più utilizzata da differenti tipologie di laboratori (laboratori di ricerca, diagnostica, analisi agro-alimentari, ambientali) per l’identificazione di microorganismi presenti in diversi campioni.
Il passaggio di estrazione e purificazione dell’RNA à ̈ un passaggio fondamentale per effettuare analisi di biologia molecolare sull’RNA. Questo passaggio à ̈ estremamente sensibile e spesso soggetto a problematiche non irrilevanti a causa dell’estrema stabilità dell’enzima RNAsi, ovvero l’enzima che di fatto digerisce le molecole di RNA degradandole. Le RNasi resistono infatti a trattamenti drastici (ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono attive entro un ampio intervallo di pH.
Il risultato dell’attività di questo enzima, à ̈ normalmente un RNA estratto che presenta evidenti strisciature a seguito di elettroforesi, indice di una parziale degradazione delle molecole di RNA. Tale degradazione rende ovviamente poco attendibili i risultati di analisi su RNA dove l’assenza di rivelazione di particolari molecole di RNA può essere semplicemente dovuta alla degradazione delle stesse piuttosto che alla loro assenza nel campione iniziale.
E’ evidente che, in un test diagnostico, tale problematica può portare alla presenza di falsi negativi e ad una diagnosi totalmente errata. Inoltre, le problematiche relative all’estrazione dell’RNA sono ancora più accentuate quando la molecola à ̈ ricercata in un campione eterogeneo dove essa può trovarsi in quantitativi estremamente ridotti rendendo di fatto difficile l’ottenimento di una diagnosi attendibile anche in base alla selezione dei primer di amplificazione la cui specificità deve essere estrema e le condizioni di amplificazione possono dover essere altamente stringenti.
Capote e colleghi descrivono nella pubblicazione (Direct sample preparation methods for the detection of Plum pox virus by real-time RT-PCR. International Microbiology (2009) 12:1-6) quattro metodi alternativi di preparazione di campioni per analisi del plum pox virus in cui à ̈ menzionato anche l’uso della IC-RT-PCR (immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction) secondo tecniche assolutamente standard (in cui il campione di interesse à ̈ immunocomplessato con un anticorpo e normalmente si effettua l’estrazione di RNA dal campione e la successiva RT-PCR). In particolare, la pubblicazione descrive in dettaglio un metodo in cui un estratto grezzo di pianta à ̈ fissato su membrana e successivamente analizzato, dopo estrazione di RNA come indicato nei materiali e metodi, evitando il passaggio di purificazione degli acidi nuleici, mediante RT-PCR.
Esiste anche un kit diagnostico per le piante “Immunocapture PCR kit†(AC Diagnostic): utilizzato esclusivamente per la determinazione della presenza di virus in piante, basato sulla combinazione delle tecniche ELISA e RT-PCR, contenente al suo interno tubi di PCR sulla cui parete vengono immobilizzati direttamente gli anticorpi specifici per il virus da ricercare, evitando i passaggi di estrazione dell’RNA e le manipolazioni pre e post PCR, che richiede dei passaggi di lavaggio del campione con conseguenti numerose possibilità di contaminazione della provetta per la RT-PCR e aumento di possibili falsi positivi dovuti a contaminazione del campione.
Non sono descritti metodi in letteratura che permettono un isolamento selettivo del campione e un processamento dello stesso che permetta di evitare passaggi intermedi che possono contaminare il campione o portare alla degradazione dell’RNA totale.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione descrive un metodo diagnostico basato su RT-PCR e/o Real Time RT-PCR che prevede i seguenti passaggi:
a) il campione da analizzare à ̈ sospeso in una opportuna soluzione e caricato su di una membrana atta ad immobilizzare un anticorpo comprendente spot preferibilmente pretagliati su cui sono immobilizzati anticorpi specifici contro la cellula o il virus di interesse,
b) detto campione caricato su detta membrana fluisce per capillarità e viene fatto adsorbire da un tampone assorbente posto all’estremità opposta alla zona di carica del campione di detta membrana
c) detti spot sono prelevati da detta membrana e sono sottoposti a RT-PCR e/o Real Time RT-PCR con oligonucleotidi di amplificazione specifici per l’RNA di interesse diagnostico e kit diagnostici atti a realizzare il metodo qui descritto comprendenti un dispositivo (1) (figure 1, 2 e 3) appositamente predisposto alla realizzazione di detto metodo.
Come evidente dalla descrizione dettagliata il metodo ed il kit qui descritto (qui indicato anche con il nome breve di “RNA Capture System†rappresentano un sistema che permette di effettuare analisi di RNA totale ed à ̈ ottimizzato per effettuare la ricerca di cellule, microrganismi o virus in diversi campioni contaminati, infettati o patologici come ad esempio campioni biologici umani ed animali, campioni agroalimentari, liquidi e superfici contaminate, beni culturali o reperti archeologici.
RNA capture system consente di immobilizzare la cellula o il microorganismo o virus di interesse in maniera specifica e di conservarlo a temperatura ambiente per alcuni giorni o a -20/-80°C per lunghi periodi di tempo.
Il sistema secondo l’invenzione permette di rivelare contaminazioni in prodotti agroalimentari e nell’ambiente, di diagnosticare malattie correlate a microorganismi patogeni o a cellule con fenotipo alterato con marcatori sulla superficie esterna della membrana cellulare, di determinare la presenza di specifici microorganismi in reperti archeologici e beni culturali.
E’ evidente che le diverse applicazioni sono realizzate modificando l'anticorpo immobilizzato sulla membrana in funzione della sua specificità per il tipo di analisi. In sintesi, il sistema dell’invenzione permette di isolare, catturare e immobilizzare, su un apposita membrana, esclusivamente le eventuali cellule (es. cellule tumorali) o gli eventuali microorganismi (virus, batteri o funghi) che devono essere ricercati nel campione in esame, eliminando completamente tutti gli step necessari per l’estrazione dell’ RNA a partire dal campione in toto. Lo spot pretagliato viene poi inserito direttamente all’interno di un tubo sterile in cui verrà effettuata la RT-PCR e/o la Real Time RT-PCR. Rispetto all’ immunocapture PCR kit (Ac Diagnostic), attualmente presente, il sistema RNA capture system consente di rilevare la presenza di vari tipi cellulari o di microorganismi (virus, batteri e funghi) su campioni diversi, riducendo i passaggi operativi eseguiti dall’operatore (un singolo passaggio) e la necessità di effettuare lavaggi del campione prima della RT-PCR che aumentano la probabilità di inquinamento del campione e quindi la possibilità di ottenere falsi positivi.
In pratica l’invenzione consente, nelle sue varie forme di realizzazione, di:
• annullare il rischio di degradazione del RNA da parte delle RNasi e di sollecitazioni meccaniche (vortex, pipettamento), in quanto elimina completamente tutti i passaggi necessari per l’estrazione dell’ RNA
• effettuare analisi di RNA totale, grazie all’immobilizzazione dell’intero microorganismo ricercato
• aumentare la sensibilità di rilevamento e la resa della RT-PCR e della Real Time RT-PCR, perché consente l’immobilizzazione e l’isolamento dei soli microrganismi/cellule/virus di interesse presenti nel campione da analizzare ed appartenenti alla stessa specie di interesse
• ridurre il rischio di contaminazioni e ridurre le manipolazioni pre e post PCR, dato che l’intero sistema elimina completamente i passaggi relativi all’estrazione dell’RNA, à ̈ pronto all’uso ed il kit à ̈ completo di tutti i reagenti necessari
• ridurre gli errori operatore dipendente perché tutti i componenti sono pronti all’uso
• effettuare la ricerca di microrganismi/cellule/virus diversi semplicemente cambiando il tipo di anticorpo immobilizzato sulla membrana
• effettuare la ricerca di microrganismi/cellule/virus diversi sullo stesso campione utilizzando coppie di primer specifiche per i diversi microrganismi
• lavorare a temperatura ambiente poiché il processo di legame anticorpomicrorganismi/cellule/virus non richiede l’utilizzo di temperature controllate
• non utilizzare particolare strumentazione di laboratorio perché la reazione anticorpo- microrganismi/cellule/virus avviene direttamente sulla membrana oggetto di invenzione
• conservare il campione (a temperatura ambiente per alcuni giorni o a -20/-80°C per lunghi periodi di tempo) e/o inviarlo a laboratori perché à ̈ eliminato il rischio di degradazione del campione
• eliminare l’utilizzo di reagenti tossici poiché le soluzioni utilizzate dal sistema (soluzione di legame e tampone RT-PCR e/o REal Time RT-PCR) non contiene sostanze tossiche.
• ridurre i tempi operativi in quanto à ̈ necessario un singolo passaggio (legame anticorpo- microrganismi/cellule/virus)
• ridurre i costi per l’esecuzione del test di RT-PCR e Real Time RT-PCR poiché à ̈ utilizzato solo il sistema oggetto di invenzione e vengono eliminati tutti i reagenti necessari per effettuare l’estrazione dell’RNA
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
La figura 1 rappresenta una visione d’insieme dall’esterno di una forma di realizzazione del dispositivo (1) comprendente un supporto (2) con una prima faccia (12) descritto nel kit della presente invenzione, con indicazione di una apertura (Sample Port, 11) per l’immissione del campione da analizzare su detta membrana (3), uno dei componenti dei mezzi di separazione rappresentato dalla zona almeno parzialmente cedevole da premere per espellere gli spot (Push Zone, 5) e della finestra da cui à ̈ possibile visualizzare la linea che si deve colorare in caso di corretto funzionamento del sistema (Control Line, 16).
La figura 2 rappresenta una visione laterale sezionata di una forma di realizzazione del dispositivo (1) in cui à ̈ visibile la membrana interna (3), la seconda faccia (13) di detto supporto (2), l’apertura in cui deve essere dispensato il campione (11), due componenti dei mezzi di separazione rappresentati dalla zona almeno parzialmente cedevole da premere per espellere gli spot (5) e uno o più elementi di spinta (6) connessi a detta porzione cedevole (5) in corrispondenza di rispettive porzioni di membrana da separare e le rispettive aperture di espulsione (7) realizzate sulla faccia (13) del dispositivo e anche uno o più tratti (15) su cui sono immobilizzati anticorpi secondari di controllo che si legano agli anticorpi coniugati compresi nella soluzione di sospensione del campione o assorbiti ma non bloccati sulla membrana stessa .
La figura 3 mostra un’immagine particolareggiata della membrana (3) interna al dispositivo (1) con l’indicazione dei vari componenti, spot (4) a cui à ̈ legato l’anticorpo specifico per il microorganismo/virus/cellula da diagnosticare, tampone assorbente (8) e uno o più tratti (15) su cui sono immobilizzati anticorpi secondari di controllo che si legano agli anticorpi coniugati compresi nella soluzione di sospensione del campione o assorbiti ma non bloccati sulla membrana stessa.
La figura 4 mostra uno spaccato della membrana (3) comprendente uno spot mobile (4).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione descrive un metodo diagnostico basato su RT-PCR e/o Real Time RT-PCR come sopra descritto e un kit che permette l’attuazione facilitata di detto metodo.
Il metodo, come descritto sopra, prevede sostanzialmente i seguenti passaggi:
a) il campione da analizzare à ̈ sospeso in una opportuna soluzione e caricato su di una membrana atta ad immobilizzare un anticorpo comprendente spot preferibilmente pretagliati su cui sono immobilizzati anticorpi specifici contro la cellula o il virus di interesse,
b) detto campione caricato su detta membrana fluisce per capillarità e viene fatto adsorbire da un tampone assorbente posto a contatto con detta membrana, preferibilmente posto all’estremità opposta alla zona di carica del campione di detta membra
c) detti spot sono prelevati da detta membrana e sono sottoposti a RT-PCR e/o Real Time RT-PCR con oligonucleotidi di amplificazione specifici per l’RNA di interesse diagnostico e kit diagnostici atti a realizzare il metodo qui descritto comprendenti un dispositivo (1) (figure 1, 2 e 3) appositamente predisposto alla realizzazione di detto metodo.
La membrana su cui fare assorbire il campione da analizzare sarà pretrattata in modo da fissare in spot individuali, uno o più anticorpi o frammenti di anticorpi specifici per il microorganismo/virus/cellula di interesse, la cui presenza o assenza nel campione si intende diagnosticare.
In una forma di realizzazione la membrana comprenderà spot con anticorpi o frammenti di anticorpi specifici per un unico microorganismo/virus/cellula di interesse mentre in altre forme di realizzazione la membrana potrà avere vari spot su cui sono fissati anticorpi o frammenti di anticorpi specifici per microorganismi/virus/cellule di interesse diversi, permettendo in tal modo una diagnosi multipla.
Secondo l’invenzione la membrana potrà essere una qualsiasi membrana atta ad immobilizzare un anticorpo, come ad esempio di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon.
Un esempio non limitativo di membrane idonee ad attuare l’invenzione, comprende:la Immunopore® Diagnostic Membranes e la AE Diagnostic Membranes della Whatman, la Vividâ„¢ Lateral Flow Nitrocellulose Membranes della Pall Corporation o la Hi-Flow Plus Membranes della Millipore Corporation.
Il bloccaggio degli anticorpi sulla membrana potrà essere realizzato secondo tecniche note all’esperto del settore, ad esempio, l’immobilizzazione degli anticorpi sugli spot della membrana (e sulla linea di controllo) potrà essere realizzata diluendo gli anticorpi in un opportuno tampone, quale ad esempio PBS alle molarità e al pH comunemente utilizzati in letteratura, come ad esempio 20 mM pH ca. 7,4 in un intervallo di concentrazione compreso tra 0,5 e 2 mg/ml (in base al tipo di applicazione da realizzare), e dispensati opportunamente sugli spot (preferibilmente pretagliati) della membrana e sulla linea di controllo quando tale linea di controllo à ̈ presente.
La membrana viene lasciata ad asciugare secondo metodi standard, come ad esempio a 37°C per 45-60 minuti.
Preferibilmente, al fine di evitare fondo sulla membrana, si effettuerà anche un bloccaggio della stessa in modo da occupare i siti della membrana che restano liberi ed evitare che ad essi si leghino materiali aspecifici. Qualsiasi tecnica di bloccaggio standard potrà essere utilizzata. In una forma di realizzazione alcuni siti di legame della membrana rimangono liberi quindi devono essere bloccati, incubando la membrana per 5 minuti a temperatura ambiente con una soluzione di PBS contenente 1% di BSA o con una soluzione già pronta all’uso presente in commercio. Successivamente la membrana viene sciacquata con una soluzione di PBS contenente 0,05% di Tween 20 e poi lasciata ad asciugare a 37°C per 60 minuti.
La membrana comprenderà quindi delle zone distinte opportunamente preparate ovvero, zona di carica del tampone, spot e opzionalmente regione di controllo comprendente anticorpi secondari specifici per gli anticorpi coniugati a fonti di colore. Le tre parti potranno essere porzioni di membrana distinte tra loro e montate in sequenza, a contatto tra di loro, nel dispositivo descritto sotto, oppure potranno essere zone della stessa membrana direttamente trattate.
A monte o a valle della regione comprendente gli spot vi potrà essere una regione o porzione distinta di membrana su cui sono assorbiti ma non legati gli anticorpi coniugati al colore (biglie colorate o oro colloidale) in alternativa alla presenza di questi ultimi nella soluzione di sospensione del campione sotto descritta.
La membrana o l’insieme delle porzioni di membrana a contatto tra loro sopra descritte saranno posti a contatto con un tampone di assorbimento (ad esempio un tampone di cellulosa o altri tamponi idonei noti al tecnico del settore) che permetterà alla soluzione di attraversare la membrana. In una forma di realizzazione, il tampone sarà posto dopo al termine della membrana o della sequenza di porzioni di membrana rispetto alla zona di carica in modo da premettere alla soluzione comprendente il campione di fluire per capillarità e permettere quindi di eliminare rumori di fondo dalla membrana prebloccata come sopra descritto.
Il campione sarà sospeso in una soluzione, che consente il legame tra il microorganismo/cellula/virus di interesse e l’anticorpo specifico per esso bloccato sulla Tale soluzione à ̈ pronta all’uso e stabile a temperatura ambiente e contiene sali, detergenti e conservanti alle opportune concentrazioni;sono idonei ad esempio i tamponi comunemente utilizzati per cromatografia su membrana descritti comunemente nei manuali di utilizzo della membrana e in manuali di laboratorio standard, come ad esempioo una soluzione a pH 8,2 circa, contenente Tris-HCl, PEG, PVP, Tween 20 e NaN3.
Esempi non limitativi di tali soluzioni sono:
Una soluzione a pH circa 8,2 composta per esempio da Tris-HCl e Trizma Base oppure una soluzione composta da 0.5 M Trizma base, pH 8.2; 0.14 M NaCl; 10% PVP-40; 1% albumina di siero bovino; 0.05% Tween 20 and 0.7% Na2SO3.
Tale soluzione, comprendente il campione da analizzare, che potrà essere un campione biologico animale, vegetale, umano, agroalimentare o anche un campione di reperti archeologici e simili, sarà versata nella misura di poche gocce nell’apposita zona (11) del dispositivo descritto nelle figure 1, 2 e 3 ed il liquido fluisce per capillarità attraverso la membrana (3) e viene assorbito (in modo tale che non restino componenti indesiderate sulla membrana) da un apposito tampone posto a contatto con detta membrana.
In una particolare forma di realizzazione, tale soluzione potrà comprendere anticorpi che preferibilmente non legano la cellula, il virus o il microorganismo di interesse (e qualora lo legassero devono essere specifici per un epitopo diverso da quello riconosciuto dall’anticorpo bloccato sulla membrana) coniugati ad esempio con biglie di latex o vetro, appositamente colorate o a particelle di oro colloidale o a qualsiasi altra forma nota comunemente nello stato della tecnica per produrre colorazione del sistema di reazione quando tali anticorpi si legano ad anticorpi secondari specifici per essi bloccati sul sistema di reazione.
Tali anticorpi potrebbero essere, ad esempio anticorpi anti IgG o specifici per l’organismo ospite da cui si preleva il campione.
Alternativamente, gli anticorpi coniugati sopra descritti potranno essere, invece che in soluzione, assorbiti sulla membrana su cui sono legati gli anticorpi specifici per il microorganismo, virus o cellula di interesse ma non ad essa legati in modo da poter fluire per capillarità verso la zona su cui sono legati gli anticorpi secondari di controllo. In questa forma di realizzazione, la membrana su cui sono bloccati gli anticorpi per il microorganismo/virus/cellula di interesse e su cui verrà fatto passare il campione sospeso nella soluzione suddetta, comprenderà una o più zone (ad esempio una o più linee), separate dagli spot su cui sono legati gli anticorpi per il microorganismo/virus/cellula di interesse, su cui sono legati anticorpi secondari specifici per gli anticorpi legati ai sistemi di colorazione sopra indicati, presenti nella soluzione per sospendere il campione o assorbiti ma non bloccati sulla membrana stessa. Quando detti anticorpi coniugati sono assorbiti sulla membrana, potranno essere collocati in una regione della membrana immediatamente precedente la linea di controllo, prima o dopo gli spot diagnostici, su cui sono legati gli anticorpi secondari specifici per essi, in modo da formare una sorta di “tampone coniugato†.
In questo modo, il sistema dell’invenzione permetterà di avere un controllo visibile per la verifica del funzionamento del dispositivo (1).
La porzione di membrana contenente la o le regioni di controllo potrà anche essere una parte di membrana separata giustapposto alla membrana.
Il metodo della presente invenzione ed il kit ad esso associato, permettono di diagnosticare la presenza di cellule, microorganismi e/o virus che sono riconosciuti in modo specifico da uno o più anticorpi. Secondo l’invenzione, le cellule di interesse potranno essere cellule tumorali, quindi cellule patogene endogene all’organismo analizzato, oppure potranno essere cellule di patogeni esterni come cellule fungine, cellule batteriche e virus in cui detti virus potranno essere virus a DNA o virus a RNA. Per esempio può essere diagnosticata la presenza di rotavirus nelle feci, di virus o funghi in prodotti agroalimentari, di batteri responsabili del biodeterioramento delle opere d’arte come per esempio il batterio Pseudomonas. Può essere anche diagnosticata la presenza in campioni biologici (plasma, sangue, biopsie) di cellule tumorali che presentano marcatori di superficie specifici e riconoscibili mediante anticorpo.
La scelta degli anticorpi, e degli oligonucleotidida utilizzare si potrà basare su dati già presenti in letteratura per la cellula, microorganismo o virus di interesse senza bisogno di ulteriori dettagli nella presente descrizione per realizzare l’invenzione. Secondo quello che si intende diagnosticare, l’esperto del settore troverà anticorpi in letteratura o commerciali a disposizione e indicazione delle sequenze rilevanti da amplificare mediante RT-PCR e/o Real Time RT-PCR. In una forma di realizzazione potranno essere utilizzati oligonucleotidi già noti per amplificazione con RT-PCR e/o Real Time RT-PCR del bersaglio di interesse oppure potranno essere utilizzati semplici programmi di disegno di primer e sonde partendo da sequenze note nelle banche dati pubbliche.
Gli per “anticorpi specifici†per un microorganismo, virus o cellula di interesse sono intesi, ai fini della presente invenzione anticorpi mono o policlonali o loro frammenti con attività di anticorpo, specifici per un particolare microorganismo, cellula o virus o potranno essere specifici per la famiglia, genere o specie a cui tale microorganismo, cellula o virus appartengono. Nel caso in cui varie specie di un microorganismo o di un virus siano ad esempio ugualmente importanti da diagnosticare, l’anticorpo potrà essere un anticorpo che riconosce un epitopo comune a tutti gli individui del genere o della famiglia. Inoltre, gli anticorpi legati agli spot secondo l’invenzione potrebbero essere anticorpi specifici per il genere o la famiglia in uno o più spot, e anticorpi specie specifici o addirittura sottospecie specifici in altri spot.
Gli oligonucleotidi secondo l’invenzione potranno essere primer universali per RT-PCR da usare in combinazione con primer specifici per il microorganismo, virus o cellula di interesse oppure potranno essere utilizzati direttamente primer specifici disegnati in modo da ottenere comunque una RT-PCR.
Nel caso in cui si effettui una Real-Time RT PCR, detti oligonucleotidi comprenderanno anche sonde interne all’amplificato opportunamente marcate con fluorofori comunemente utilizzati in letteratura per Real Time.
La tecnica Real Time RT-PCR à ̈ una tecnica comunemente utilizzata che non richiede ulteriori insegnamenti in quanto descritta anche nei libri di testo di genetica molecolare.Gli anticorpi da fissare agli spot potranno essere anticorpi mono o policlonali o loro frammenti con attività anticorpale noti in letteratura, specifici per marcatori di cellule tumorali o per epitopi di virus, batteri o funghi patogeni di interesse. Ciascuno spot potrà contenere un singolo anticorpo o una mix di anticorpi specifici per un particolare virus, microorganismo o cellula bersaglio.
Ovviamente, il metodo ed il kit dell’invenzione potranno essere utilizzati per diagnostica umana, veterinaria o agraria.
L’invenzione, oltre a fornire il metodo sopra descritto fornisce anche un kit diagnostico per la rivelazione di cellule o virus di interesse mediante RT-PCR e/o Real Time RT-PCR comprendente
- una soluzione idonea alla sospensione del campione da analizzare
-un dispositivo (1) illustrato in forma esemplificativa nelle figure 1-4 per la preparazione di un campione biologico fluido da analizzare comprendente:
un supporto (2) una membrana (3) atta ad assorbire il campione da analizzare, in cui detta membrana (3) comprende una o più porzioni di membrana (4) legate ad un anticorpo specifico per la cellula o il virus di interesse, detto dispositivo comprendendo mezzi per la separazione (5, 6, 7) di detta una o più porzioni di membrana (4) da detta membrana (3); un tampone assorbente (8) posto a contatto con detta membrana (3) e una apertura (11) per l’immissione del campione da analizzare su detta membrana (3). -reagenti per RT-PCR e/o Real Time RT-PCR comprendenti oligonucleotidi idonei all’amplificazione mediante PCR specifici per il bersaglio da analizzare e/o oligonucleotidi universali idonei alla retrotrascrizione, e opzionalmente, oligonucleotidi (sonde) idonei alla rivelazione di materiale genetico specifico della cellula o del virus di interesse mediante Real Time PCR, tampone di reazione per RT-PCR e/o Real Time RT-PCR e opzionalmente gli enzimi Retrotrascrittasi inversa e/o DNA polimerasi in aliquote separate o in miscele pronte all’uso comprendenti detto tampone di reazione e uno o più di detti reagenti.
I reagenti potranno essere aliquotati separatamente oppure il kit potrà comprendere provette o micropiastre già comprendenti la miscela di reazione specifica per la RT-PCR e/o Real Time RT-PCR del microorganismo/virus/cellula la cui presenza o assenza deve essere diagnosticata nel campione a concentrazioni pronto uso.
In una forma di realizzazione dell’invenzione il kit prevederà aliquote pronto uso a cui dovranno essere aggiunti unicamente gli spot estromessi dalla membrana e gli enzimi per la RT-PCR e/o Real Time RT-PCR.
Il dispositivo dell’invenzione potrà comprendere un supporto (2) che comprende una prima faccia (12) ed una seconda faccia (13) opposta a detta prima faccia (12), con la membrana (3) essendo posta tra dette due facce (12, 13) come esemplificato nelle figure.
I mezzi per la separazione (5, 6, 7) delle porzioni di membrana (4) legate all’anticorpo specifico per la cellula, il microorganismo o il virus di interesse (ovvero la cui presenza o assenza si intende diagnosticare nel campione) di detto supporto (2) comprendono: - una porzione (5) almeno parzialmente cedevole di detta prima faccia (12), posta sostanzialmente in corrispondenza di dette porzioni di membrana (4) da separare;
- uno o più elementi di spinta (6) connessi a detta porzione cedevole (5) in corrispondenza di rispettive porzioni di membrana (4) da separare;
- una o più aperture di espulsione (7) realizzate su detta seconda faccia (13) in corrispondenza di rispettive porzioni di membrana (4) da separare.
In una forma di realizzazione, la porzione almeno parzialmente cedevole potrà essere fatta in modo tale da spingere detti elementi di spinta, in forma sostanzialmente di cilindretti o chiodini, in modo da spingere fuori dalle aperture di espulsione sull’altra faccia della membrana gli spot di membrana su cui si à ̈ legato il microorganismo, cellula o virus di interesse.
Gli spot potranno essere conservati direttamente nel dispositivo in modo da mantenerli separati dall’ambiente circostante fino all’utilizzo.
Il kit potrà anche comprendere dei contenitori sterili per conservare il dispositivo fino al momento dell’uso, come ad esempio dei sacchetti o delle scatoline sterili di dimensioni idonee.
Secondo la descrizione, il dispositivo potrà avere ciascuna di dette porzioni di membrana (4) di detto dispositivo (1) delimitata da una rispettiva linea di rottura facilitata (14), lo spot legato all’anticorpo specifico per l’organismo o la cellula di interesse potrà quindi essere sostanzialmente pretagliato.
Il dispositivo potrà anche comprendere una o più finestre che permettano di monitorare il corretto funzionamento dello stesso, in cui quindi la soluzione idonea alla sospensione del campione da analizzare comprenderà anticorpi coniugati con biglie di latex appositamente colorate o particelle di oro colloidale o in cui detti anticorpi coniugati saranno già pre assorbiti ma non legati alla membrana (3) nel dispositivo e in cui detta membrana (3) nel dispositivo comprenderà anche uno o più tratti (15) su cui sono immobilizzati anticorpi secondari di controllo che si legano a detti anticorpi coniugati compresi in detta soluzione e detto dispositivo (1) comprenderà una o più finestre (16) atte alla visualizzazione di detti uno o più tratti di membrana su cui sono immobilizzati detti anticorpi secondari di controllo.
In una particolare forma di realizzazione, il kit diagnostico potrà permettere una diagnosi simultanea di più cellule, microorganismi o virus di interesse, in quei casi in cui, ad esempio, può essere utile avere un quadro clinico relativamente alla presenza di più patogeni e/o di più fenotipi cellulari.
In questo caso il kit comprenderà tra i reagenti anche distinte aliquote di oligonucleotidi per RT-PCR e/o Real Time RT-PCR specifici per ciascuna delle cellule o dei patogeni da diagnosticare e gli spot saranno suddivisi in gruppi sulla membrana e ciascun gruppo comprenderà spot che legano uno o più anticorpi o frammenti di anticorpo specifici per un singolo microorganismo, cellula o virus di interesse.
In questo caso quindi si avrà un Kit diagnostico in cui le porzioni di membrana (4) sono disposte in uno o più gruppi tra loro separati in cui ciascuno di detti gruppi comprende porzioni di membrana legate ad uno o più anticorpi specifici per un particolare microorganismo, cellula o virus, in cui detti particolare microorganismo, cellula o virus sono diversi per ciascuno di detti gruppi, detti mezzi per la separazione (5, 6, 7) di dette porzioni di membrana (4) essendo distinti per ciascuno di detti gruppi, detto kit ulteriormente comprendente reagenti per RT-PCR e/o Real Time RT-PCR comprendenti:
, oligonucleotidi idonei all’amplificazione mediante PCR specifici per il bersaglio da analizzare e/o oligonucleotidi universali idonei alla retrotrascrizione, e opzionalmente, oligonucleotidi (sonde) idonei alla rivelazione mediante Real Time di materiale genetico specifico per ciascuna cellula ciascun microorganismo o ciascun virus legato da detti anticorpi legati a detti gruppi di porzioni di membrana, tampone di reazione per RT-PCR e/o Real Time RT-PCR e opzionalmente gli enzimi Retrotrascrittasi inversa e/o DNA polimerasi in aliquote separate o in miscele pronte all’uso comprendenti detto tampone di reazione e uno o più di detti reagenti.
ESEMPI
Come esempio rappresentativo ma non limitativo dell’utilizzo dell’oggetto di invenzione e della sua realizzazione, vengono di seguito riportate alcune applicazioni.
1. Dispositivo per la rilevazione di virus responsabili delle virosi della vite Le malattie virali nella vite sono numerose e molto diffuse. Le virosi causano deperimenti e riduzioni quali-quantitative della produzione, oltre che danni alle foglie, ai tralci ed ai frutti.
Una delle virosi della vite più diffuse à ̈ l’accartocciamento fogliare che provoca uno scadimento qualitativo delle uve e del vino e causa il ritardo e la non uniformità nella maturazione dei grappoli. I virus responsabili di questa patologia sono i Grapevine Leaf Roll associated virus, di cui se ne conoscono diversi sottogruppi. Spesso la concentrazione del virus può essere così bassa da non manifestare sintomi visibili, quindi per la sua rilevazione si ricorre a metodiche di biologia molecolare (RT-PCR) che prevedono l’estrazione dell’RNA virale.
Per sviluppare questa applicazione, la membrana contenuta nel dispositivo viene realizzata immobilizzando sugli spot pretagliati gli anticorpi rivolti contro la proteina capsidica dei virus GLRaV-1 e GLRaV-3.
Il campione pretrattato con l’apposita soluzione, contenuta nell’oggetto di invenzione, viene dispensato sulla membrana attraverso la zona di applicazione presente sul dispositivo (figure 1, 2, 3) e, dopo essere fluito per capillarità, viene a contatto con gli anticorpi immobilizzati sugli spot della membrana membrana.
Dopo la cattura del microrganismo, gli spot pretagliati vengono espulsi dalla membrana mediante pressione nell’apposita zona del dispositivo (figure 1, 2, 3), raccolti dalla parte inferiore del dispositivo ed utilizzati direttamente per la reazione di identificazione molecolare di RT-PCR, che ha confermato la presenza del virus nel campione analizzato, mediante l’utilizzo di appositi primer specifici e rispettiva sonda che amplificano e rilevano il gene virale che codifica per la proteina Hsp70.
I primer e le sonde idonei sono noti in letteratura e sono disponibili per l’esperto del settore ad esempio in Gambino G. and Gribaudo I.; 2006; Phythopatology; 96; 1223-1229; Osman et al.; 2008; Journal of Virological Methods; 149; 292-299.
Lo stesso tipo di procedura à ̈ stata eseguita applicando sugli spot della membrana gli anticorpi specifici per altri tipi di virus responsabili delle principali virosi della vite:
• virus della degenerazione infettiva della vite (GFLV) e del mosaico dell'arabis (ArMV)
• virus GVA e GVB associati ai sintomi delle sindromi del legno riccio • virus della maculatura infettiva o fleck (GFkV)
• virus GLRaV-2 associato all’accartocciamento fogliare
Anche in questi casi, la presenza del virus à ̈ stata confermata mediante RT-PCR, grazie all’utilizzo di primer e sonde specifici per ciascun virus.
La rivelazione del test à ̈ stata effettuata sia su gel di agarosio al 2% sia mediante un lettore di fluorescenza.
2. Dispositivo per la rilevazione del virus responsabile della virosi delle drupacee
La vaiolatura delle drupacee (Sharka) Ã ̈ una virosi molto diffusa che colpisce le piante appartenenti al genere Prunus (pesco, susino, albicocco, ciliegio, mandorlo ed i portinnesti comunemente utilizzati per le drupacee) e altre specie di drupacee ornamentali e spontanee.
I frutti delle piante infette, indipendentemente dalla specie, maturano irregolarmente, hanno caratteristiche organolettiche scadenti ed hanno una irregolare pigmentazione dell’epidermide, con conseguente deprezzamento del prodotto; inoltre la polpa sottostante l’anulatura può andare incontro a marcescenza. Il virus responsabile di questa patologia à ̈ il Plum Pox Virus (PPV),di cui sono stati individuati diversi ceppi. L’allevamento, la produzione, la commercializzazione del materiale di moltiplicazione della drupacee in relazione alla Sharka sono regolamentate da diversi provvedimenti normativi.
Per la sua rilevazione, oltre che a metodi sierologici, si ricorre a metodiche di biologia molecolare (RT-PCR) che prevedono l’estrazione dell’RNA virale.
Per sviluppare questa applicazione, la membrana contenuta nel dispositivo viene realizzata immobilizzando sugli spot pretagliati gli anticorpi rivolti contro la proteina capsidica del PPV
Il campione pretrattato con l’apposita soluzione, contenuta nell’oggetto di invenzione, viene dispensato sulla membrana attraverso la zona di applicazione presente sul dispositivo (figure 1, 2, 3) e, dopo essere fluito per capillarità, viene a contatto con gli anticorpi immobilizzati sugli spot della membrana.
Dopo la cattura del microrganismo, gli spot pretagliati sono espulsi dalla membrana mediante pressione nell’apposita zona del dispositivo (figure 1, 2, 3), raccolti dalla parte inferiore del dispositivo ed utilizzati direttamente per la reazione di identificazione molecolare di RT-PCR, che ha confermato la presenza del virus nel campione analizzato, mediante l’utilizzo di appositi primer specifici e rispettiva sonda (Wetzel et al, 1991. Journal of Virological Methods, 33, 355-365 ; Olmos et al., 2005. Journal of Virological Methods, 128, 151-155)
La rivelazione del test à ̈ stata effettuata sia su gel di agarosio al 2% sia mediante un lettore di fluorescenza.
Dispositivo per la rilevazione di un virus responsabile della virosi degli agrumi
La "Tristezza" à ̈ una delle virosi più gravi che colpisce gli agrumi, in particolare le specie ed ibridi dei generi Citrus e Fortunella. L’agente causale à ̈ il Citrus Tristezza Virus (CTV) che provoca nelle piante infette il disseccamento dei rami, la defogliazione, la riduzione di sviluppo e il progressivo deperimento della pianta fino alla morte. La lotta contro il virus della tristezza degli agrumi à ̈ obbligatoria nel territorio della Repubblica italiana ed à ̈ regolamentata dal D.M.22 novembre 1996.
Per la sua rilevazione, oltre che a metodi sierologici, si ricorre a metodiche di biologia molecolare (RT-PCR) che prevedono l’estrazione dell’RNA virale.
Per sviluppare questa applicazione, la membrana contenuta nel dispositivo viene realizzata immobilizzando sugli spot pretagliati gli anticorpi rivolti contro la proteina capsidica del CTV.
Il campione pretrattato con l’apposita soluzione, contenuta nell’oggetto di invenzione, viene dispensato sulla membrana attraverso la zona di applicazione presente sul dispositivo (figure 1, 2, 3) e, dopo essere fluito per capillarità, viene a contatto con gli anticorpi immobilizzati sugli spot della membrana.
Dopo la cattura del microrganismo, gli spot pretagliati vengono espulsi dalla membrana mediante pressione nell’apposita zona del dispositivo (figure 1, 2, 3), raccolti dalla parte inferiore del dispositivo ed utilizzati direttamente per la reazione di identificazione molecolare di RT-PCR, che ha confermato la presenza del virus nel campione analizzato, mediante l’utilizzo di appositi primer specifici e rispettiva sonda (Saponari M et al.; 2008; Journal of Virological Methods; 147; 43-53;Malandraki I. et al.; 2011; New Disease Reports; 23; 2.)
La rivelazione del test à ̈ stata effettuata sia su gel di agarosio al 2% sia mediante un lettore di fluorescenza.
Per tute le applicazioni sopra previste à ̈ stato inoltre effettuato un test di confronto, utilizzando l’RNA estratto con un kit commerciale presente in commercio (NucleoSpin RNA Plant-Nacherey Nagel)
I dati ottenuti sono risultati paragonabili in termini di amplificabilità dell’RNA estratto, ma il sistema oggetto di invenzione richiede minori tempi di esecuzione e nessun tipo di accorgimento particolare rispetto alla classica estrazione dell’RNA.
Di seguito sono riportate le ditte o gli enti di ricerca presso cui sono stati acquistati i principali reagenti per la realizzazione delle applicazioni del sistema:
• Millipore Corp o Whatman: tutti i componenti per assemblare la membrana
• Bioreba: bustine plastica per campioni vegetali
• Sigma Aldrich: sonde, primers e reagenti vari
• Applied Biosystem: TaqMan One step RT- PCR Master Mix
• CNR-IVV Istituto di Virologia Vegetale del CNR Sezione di Bari: cessione di campioni infetti e sani e dei vari anticorpi specifici per i virus.
Esempio di Preparazione del dispositivo
• Membrana
La membrana, delle dimensioni di circa 1 cm x 10 cm, à ̈ realizzata in nylon/nitrocellulosa e deve avere una misura dei pori compresa tra 0,2 e 20 micron. Su di essa vengono pretagliati 12 spot (4) su cui vengono immobilizzati, in modo irreversibile, gli anticorpi specifici per il tipo di microrganismo target ricercato. La zona in cui vengono fissati gli anticorpi si trova a circa 5 cm dalla zona di deposizione del campione. . A circa 1 cm dalla zona degli spot si trova una linea su cui viene fissata una soluzione di anticorpi secondari rivolti contro quelli assorbiti sul “conjugate pad 15†, per verificare il corretto funzionamento del dispositivo.
Il dispositivo viene realizzato preparando, una zona iniziale di carica del campione (che potrà essere una porzione di un’unica membrana o che potrà essere una porzione separata di membrana da mettere in contatto con una porzione di membrana comprendente gli spot) che sarà seguita dalla porzione di membrana comprendente gli spot (nella stessa membrana o in una porzione di membrana separata ma posta a contatto). La porzione terminale del dispositivo comprenderà la linea di controllo e, infine, il tampone di assorbimento (di cellulosa) che permetterà alla soluzione di attraversare la membrana dalla zona di carica fino al tampone fluendo mediante capillarità. Il tampone faciliterà la corsa cromatografica del campione ed assorbirà il liquido contenete tutte le molecole che non si sono legate all’anticorpo.
La membrana viene fissata sulla parte posteriore interna del dispositivo con un mezzo adesivo.
• Anticorpi
Gli anticorpi specifici per il target di analisi, devono essere fissati sulla membrana negli appositi spot, mentre quelli rivolti contro la soluzione assorbita sul “conjugate pad†vengono fissati sull’apposita linea. Le procedure operative di immobilizzazione sono le medesime indipendentemente dal tipo di microrganismo ricercato e dall’anticorpo utilizzato. Gli anticorpi selezionati sono caratterizzati da elevata affinità e specificità di legame per il target di analisi. Per la realizzazione del dispositivo vengono utilizzati anticorpi policlonali o moclonali in base al tipo di applicazione di utilizzo. Gli anticorpi utilizzati devono avere le seguenti caratteristiche:
reattività anche dopo immoblizzazione sulla membrana
Integratità strutturale dopo essiccamento
Instantanea reattività dopo reidratazione a contatto con il campione
• Dispositivo
Il dispositivo, che può essere realizzato in materiale plastico o comunque avente caratteristiche di idrorepellenza e facilmente sterilizzabile, normalmente idoneo a dispostivi di tipo diagnostico monouso già noti, serve per alloggiare la membrana e presenta:
nella porzione superiore, una zona in cui viene inserito il campione, una zona, dotata di denti in plastica, su cui viene esercitata manualmente una pressione per espellere gli spot dopo il legame tra anticorpo e microrganismo e una zona in cui à ̈ presente una finestra che consente di verificare il corretto funzionamento del dispositivo
nella porzione inferiore, una finestra da cui vengono raccolti gli spot espulsi
• Soluzione per il prettatamento del campione
La soluzione per il pretrattamento del campione da analizzare consente la reazione anticorpo-microrganismo. Questa soluzione à ̈ interamente pronta all’uso ed à ̈ stabile a temperatura ambiente.
La soluzione acquosa à ̈ composta da Trizma-base, NaCl, Tween 20, PVP, PEG e NaN3.
Materiali e metodi
Il procedimento di realizzazione del dispositivo à ̈ schematizzabile come segue: -Immobilizzazione degli anticorpi sugli spot della membrana e sulla linea di controllo -Gli anticorpi vengono diluiti in un opportuno buffer (PBS 20 mM pH 7,4), in un intervallo di concentrazione compreso tra 0,5 e 2 mg/ml (in base al tipo di applicazione da realizzare), e dispensati opportunamente sugli spot pretagliati della membrana e sulla linea di controllo.
-La membrana viene lasciata ad asciugare a 37°C per 45-60 minuti.
Bloccaggio della membrana
Alcuni siti di legame della membrana rimangono liberi quindi devono essere bloccati, incubando la membrana per 5 minuti a temperatura ambiente con una soluzione di PBS contenente 1% di BSA o con una soluzione già pronta all’uso presente in commercio. Successivamente la membrana viene sciacquata con una soluzione di PBS contenente 0,05% di Tween 20 e poi lasciata ad asciugare a 37°C per 60 minuti.
Assemblaggio della membrana all’interno del dispositivo (figure 1, 2, 3)
Vengono inseriti il sample pad più il tampone coniugato* ed il tampone assorbente rispettivamente ai due lati della membrana con una sovrapposizione di circa 1-2 mm. La membrana viene poi fissata sulla parte posteriore interna del dispositivo (figure 1, 2, 3) con l’ausilio di un apposito nastro adesivo. Le due parti del dispositivo (figure 1, 2, 3) (porzione inferiore e superiore) vengono assemblate tra loro. ;* preparato seguendo le istruzioni riportate sul foglietto di accompagno della ditta fornitrice delle particelle colorate.
Stoccaggio
Il dispositivo (figure 1, 2, 3) assemblato viene inserito all'interno di un foil pouches (bustina impermeabile, argentata) con essiccante e, dopo sigillatura a caldo, conservata a 4°C.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo diagnostico basato su RT-PCR e/o Real Time RT-PCR che prevede i seguenti passaggi: a) il campione da analizzare à ̈ sospeso in una opportuna soluzione e caricato su di una membrana atta ad immobilizzare un anticorpo comprendente spot preferibilmente pretagliati su cui sono immobilizzati anticorpi specifici contro la cellula o il virus di interesse, b) detto campione à ̈ caricato su detta membrana e viene fatto adsorbire da un tampone assorbente posto all’estremità opposta alla zona di carica del campione di detta membrana c) detti spot sono prelevati da detta membrana e sono sottoposti a RT-PCR e/o Real Time RT_PCR con oligonucleotidi specifici per l’RNA di interesse diagnostico e opzionalmente oligonucleotidi universali per retrotrascrizione dell’RNA.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui dette cellule di interesse sono cellule tumorali, cellule fungine, cellule batteriche.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detti virus sono virus a DNA o virus a RNA.
  4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detti anticorpi sono anticorpi mono o policlonali o loro frammenti con attività anticorpale, specifici per epitopi di marcatori di cellule tumorali o per epitopi di virus, batteri o funghi patogeni.
  5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 per diagnostica umana, veterinaria o agraria.
  6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui detta soluzione comprende anticorpi coniugati con biglie colorate o particelle di oro colloidale o in cui anticorpi coniugati con biglie di latex appositamente colorate o particelle di oro colloidale sono assorbiti su detta membrana ma non legati ad essa, e in cui detta membrana comprende anche uno o più tratti su cui sono immobilizzati anticorpi secondari di controllo che si legano a detti anticorpi coniugati.
  7. 7. Kit diagnostico per la rivelazione di cellule o virus di interesse mediante RT-PCR e/o Real Time RT-PCR comprendente - una soluzione idonea alla sospensione del campione da analizzare -un dispositivo (1) per la preparazione di un campione biologico fluido da analizzare comprendente: un supporto (2), una membrana (3) atta ad assorbire il campione da analizzare, in cui detta membrana (3) comprende una o più porzioni di membrana (4) legate ad un anticorpo specifico per detti cellula o il virus di interesse, detto dispositivo comprendendo mezzi per la separazione (5, 6, 7) di detta una o più porzioni di membrana (4) da detta membrana (3); un tampone assorbente (8) posto a contatto con detta membrana (3) e una apertura (11) per l’immissione di detto campione da analizzare su detta membrana (3); e -reagenti per RT-PCR e/o Real Time RT-PCR comprendenti tampone di reazione per RT-PCR e/o tampone di reazione per Real Time RT-PCR, uno o più oligonucleotidi scelti tra oligonucleotidi idonei alla retrotrascrizione di RNA, oligonucleotidi idonei all’amplificazione di materiale genetico specifico della cellula del microorganismo o del virus di interesse cellula e oligonucleotidi marcati con ono o più fluorofori per Real Time RT-PCT specifici per detto microorganismo, cellula o virus di interesse; e opzionalmente gli enzimi Retrotrascrittasi inversa e/o DNA polimerasi in aliquote separate o in miscele pronte all’uso comprendenti detto tampone di reazione e uno o più di detti reagenti.
  8. 8 Kit diagnostico secondo la rivendicazione 7, in cui detto supporto (2) di detto dispositivo (1) comprende una prima faccia (12) ed una seconda faccia (13) opposta a detta prima faccia (12), detta membrana (3) essendo posta tra dette due facce (12, 13).
  9. 9. Kit diagnostico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 o 8, in cui detti mezzi per la separazione (5, 6, 7) di dette porzioni di membrana (4) di detto supporto (2) comprendono: - una porzione (5) almeno parzialmente cedevole di detta prima faccia (12), posta sostanzialmente in corrispondenza di dette porzioni di membrana (4) da separare; - uno o più elementi di spinta (6) connessi a detta porzione cedevole (5) in corrispondenza di rispettive porzioni di membrana (4) da separare; - una o più aperture di espulsione (7) realizzate su detta seconda faccia (13) in corrispondenza di rispettive porzioni di membrana (4) da separare.
  10. 10. Kit diagnostico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 9, in cui ciascuna di dette porzioni di membrana (4) di detto dispositivo (1)Ã ̈ delimitata da una rispettiva linea di rottura facilitata (14).
  11. 11. Kit diagnostico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 10 in cui detta soluzione idonea alla sospensione del campione da analizzare comprende anticorpi coniugati con biglie di latex appositamente colorate o particelle di oro colloidale o in cui anticorpi coniugati con biglie colorate o particelle di oro colloidale sono assorbiti su detta membrana (3) ma non legati ad essa e in cui detta membrana (3) comprende anche uno o più tratti (15) su cui sono immobilizzati anticorpi secondari di controllo che si legano a detti anticorpi coniugati e detto dispositivo (1) comprende una o più finestre (16) atte alla visualizzazione di detti uno o più tratti di membrana su cui sono immobilizzati detti anticorpi secondari di controllo.
  12. 12. Kit diagnostico in cui dette porzioni di membrana (4) sono disposte in uno o più gruppi tra loro separati in cui ciascuno di detti gruppi comprende porzioni di membrana legate ad uno o più anticorpi specifici per un particolare microorganismo, cellula o virus, in cui detti particolare microorganismo, cellula o virus sono diversi per ciascuno di detti gruppi, detti mezzi di detti mezzi per la separazione (5, 6, 7) di dette porzioni di membrana (4) essendo distinti per ciascuno di detti gruppi, detto kit ulteriormente comprendente reagenti per RT-PCR e/o Real Time RT-PCR comprendenti: tampone di reazione per RT-PCR e/o tampone di reazione per Real Time RT- PCR; uno o più oligonucleotidi scelti tra oligonucleotidi idonei alla retrotrascrizione di RNA, oligonucleotidi idonei all’amplificazione di materiale genetico specifico per ciascun microorganismo o ciascun virus o ciascuna cellula legato da detti anticorpi legati a detti gruppi di porzioni di membrana e oligonucleotidi marcati con fluorofori per Real Time RT-PCT specifici per ciascun microorganismo o ciascun virus o ciascuna cellula legato da detti anticorpi legati a detti gruppi di porzioni di membrana e opzionalmente, gli enzimi Retrotrascrittasi inversa e/o DNA polimerasi in aliquote separate o in miscele pronte all’uso comprendenti detto tampone di reazione e uno o più di detti reagenti.
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