ITRM20000305A1 - Metodo per la rigenerazione di piante e suoi usi per la moltiplicazione e/o la trasformazione di piante. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale a titolo: “Metodo per la rigenerazione di piante e suoi usi per la moltiplicazione e/o la trasformazione di piante"

La presente invenzione concerne un metodo per la rigenerazione di piante per induzione di meristemi avventizi in espianti, nonché sue applicazioni per la moltiplicazione e trasformazione di specie vegetali.

Più in particolare l’invenzione concerne un metodo per la rigenerazione per caulogenesi da aggregati meristematici, indotti in espianti di tessuti somatici in vitro, tramite la rottura della dominanza apicale in germogli in proliferazione e uno stimolo iper-citochininico, che determina lo sviluppo iperplasico ed ipertrofico della base del germoglio, costituendo un aggregato cellulare dalla complessa struttura cellulare e tissutale. L'aggregato cellulare è caratterizzato dalla predominante presenza di cellule ad elevata competenza rigenerativa per caulogenesi.

Il metodo è applicabile sia per la propagazione e moltiplicazione vegetativa, che per la manipolazione genica (mediata o diretta) di diverse specie vegetali.

Il metodo permette una efficiente rigenerazione di germogli, e quindi di piante, da tessuti vegetali. Il metodo è di ampia applicabilità per la moltiplicazione e la trasformazione genetica vegetale.

La rigenerazione avviene da un tessuto ‘‘piattaforma”, caratterizzato da un elevato numero di cellule indotte ad una elevata competenza alla formazione di meristemi avventizi (Meristematic Platform). Questa metodologia è di particolare importanza per la possibilità di aumentare l’efficienza e/o di estendere a diverse specie di interesse agronomico sia le tecniche di moltiplicazione in vitro, che quelle di trasformazione genica. Pertanto la sua applicazione, migliorando l'efficienza dei metodi di moltiplicazione, insieme al suo uso per la trasformazione genetica, permette di implementare l’applicazione delle biotecnologie vegetali, anche a piante considerate recalcitranti, determinando una riduzione dei costi e una standardizzazione delle tecniche di produzione.

Stato dell’arte

Tecniche di coltura in vitro e rigenerazione

Le colture in vitro consistono nella crescita di cellule, tessuti o organi, isolati da una pianta madre, su substrati artificiali. Sono utilizzate sia per la propagazione vegetativa, che per il miglioramento genetico dei vegetali. Esse permettono una rapida moltiplicazione, anche in spazi molto ristretti, partendo da quantità minime di materiale di partenza, in modo indipendente dai cicli stagionali. Per le potenzialità nella creazione di variabilità genetica e nella selezione, oltre alla combinazione con tecniche di ' manipolazione genetica, le colture in vitro sono un valido strumento a sostegno delle tradizionali tecniche di miglioramento genetico. A questi vantaggi si affiancano però degli svantaggi, come la necessità di manodopera specializzata, i maggiori costi, la possibile comparsa di caratteri non desiderabili nelle piantine e le difficoltà di ambientamento in terreno.

La proliferazione di gemme apicali e ascellari è alla base della tradizionale tecnica di micropropagazione. Il differenziamento diretto o indiretto da tessuto dedifferenziato di gemme avventizie e/o di embrioni somatici fornisce possibili alternative, ma a causa dell'elevata variabilità genetica che spesso induce, risulta di difficile applicazione pratica nei sistemi di propagazione.

Colture di tessuti meristemàtici

I tessuti meristemàtici sono tessuti non differenziati responsabili del processo di accrescimento della pianta. Le cellule meristematiche si dividono attivamente, dando origine sia ad altre cellule meristematiche che a cellule differenziate. I meristemi possono derivare direttamente dallo zigote, oppure da cellule adulte che regrediscono ad uno stato dedifferenziato ; nel primo caso si definiscono “primari" (ad esempio gli apici vegetativi e radicali), mentre nel secondo caso “secondari’ (es. i meristemi del cambio, quelli avventizi e i meristemoidi). La propagazione, tradizionale e in vitro, basandosi su divisioni mitotiche di tessuto meristematico, permette di produrre, a meno di mutazioni, una popolazione clonale (gruppo di individui geneticamente identici).

Tecniche di propagazione

Il metodo più diffuso di micropropagazione è la coltura di germogli. La propagazione avviene grazie alla formazione di germogli ascellari, separati ed utilizzati come espianti per successive subcolture. Come espianti primari vengono in genere utilizzati apici o gemme laterali di 5-10 mm di lunghezza.

La coltura delle estremità terminali degli apici meristematici viene detta coltura di meristemi. Questa tecnica è solitamente utilizzata per sanare le piante dalla presenza di virus, spesso in combinazione con trattamenti al caldo. Gli espianti sono costituiti da porzioni minute (0.2-1 mm in lunghezza) di meristema apicale, con uno o due primordi fogliari.

La coltura di nodi è una tecnica derivata dalle colture di germogli, introdotta più recentemente (Wang, 1977), in cui i fusti sono disposti orizzontalmente su substrato solido. La propagazione, come nelle colture di germogli, avviene tramite gemme ascellari.

Le principali fasi della micropropagazione sono state definite da Murashige (1974). Debergh e Maene (1981) hanno proposto di aggiungere uno stadio 0, che comprende le fasi precedenti all’espianto. Fase 0: Selezione della pianta madre e preparazione.

Fase 1: Inizio della coltura.

Fase 2: Moltiplicazione.

Fase 3: Allungamento e induzione dello sviluppo delle radici.

Fase 4: Ambientamento.

Il passaggio dalla fase 3 alla 4 risulta critico in quanto le piantine sono adattate ad un ambiente sterile, ad umidità elevata, con una bassa intensità luminosa e supportato da una fonte esterna di carbonio (es. saccarosio). È pertanto necessario controllare, dopo il trapianto in un terreno ancora sterile, le condizioni di luce ed umidità fintanto che le piante non abbiano riacquisito l'autonomia strutturale e funzionale. Le rese dell’ambientamento dipendono dal tipo e dalla qualità del materiale prodotto nelle fasi precedenti.

Morfogenesi e differenziamento

Il processo di formazione di un nuovo organo da un tessuto vegetale è detto organogenesi o morfogenesi. Gli organi che si sviluppano a partire da tessuti somatici vengono detti avventizi.

Nelle piante la potenzialità di produrre organi, o addirittura un’intera pianta, non è posseduta solamente dalle cellule dei tessuti meristematici, ma anche dalle cellule dei tessuti somatici. Non tutte le cellule di una pianta mantengono tuttavia capacità morfogenetìche o organogenetiche: non cambiano il loro stato differenziato le cellule più specializzate di una pianta, come le cellule del tessuto vascolare e dello sclerenchima.

De-differenziamento e Callogenesi

Il passaggio di cellule e tessuti da uno stato differenziato ad uno non differenziato è detto de-differenziamento o callogenesi, e può essere indotto in vivo o in vitro in seguito a stimoli chimici, fisici o biologici.

I tessuti vegetali possono crescere in modo organizzato, in cui le cellule mantengono una ben definita struttura, oppure in modo non organizzato (callo). Il tessuto organizzato è composto da cellule differenziate (specializzate in senso morfologico e funzionale), mentre il tessuto non organizzato contiene un minimo numero di cellule differenziate.

il callo è un tessuto “amorfo” che si forma quando le cellule si dividono in modo disordinato. In vivo può essere indotto da ferite prodotte sulla pianta, dalla presenza di microrganismi, o da situazioni di stress. Durante la formazione del callo, il metabolismo cellulare passa da uno stato differenziato e quiescente ad uno stato meristematico, non specializzato ed in attiva divisione cellulare. L’induzione del callo in vitro sfrutta lo stesso fenomeno, che può essere amplificato o inibito attraverso l'applicazione di fattori chimici e fisici. La produzione di callo in vitro viene aumentata praticando tagli ulteriori sugli espianti prima di trasferirli sui substrati di ' induzione e attraverso la combinazione di regolatori di crescita aggiunti al substrato con la regolazione delie condizioni di luce e temperatura. Tre sono i fattori principali per l'induzione del callo: 1) il tipo di espianto, 2) la scelta del substrato e delle condizioni di coltura e 3) la separazione del callo dall’espianto e il suo mantenimento in coltura (Constabel, 1984).

Processi morfoqenetici

Le cellule de-differenziate capaci di generare nuovi organi o nuove piante, in risposta a determinati stimoli, sono dette competenti. Le cellule competenti possono essere indotte in uno stato determinato, nel quale si avviano a seguire una precisa via di sviluppo geneticamente stabilita; questa via può continuare nel differenziamento cellulare o nella morfogenesi (Christianson, 1987). L’assunzione dello stato determinato può essere aiutata dalla presenza di alcuni regolatori di crescita.

I principali processi morfogenetici da tessuto somatico, differenziato e non, possono portare alla formazione di strutture unipolari o bipolari. Rientrano nel primo caso la caulogenesi e fa rizogenesi, che consistono rispettivamente nella formazione di germogli e radia avventizie; mentre l'embriogenesi somatica porta alla formazione di embrioni somatici, che hanno uno sviluppo bipolare.

La morfogenesi può essere indiretta o diretta, a seconda che avvenga rispettivamente in presenza o in assenza di proliferazione di un tessuto non differenziato (Hicks, 1980). La maggior parte delle specie vegetali studiate è capace di formare radici e gemme avventizie da espianti di vari tessuti e organi della pianta, mentre la formazione di embrioni avventizi è molto meno comune.

Caulogenesi e rizogenesi

La caulogenesi diretta consiste nella formazione di germogli da un tessuto somatico, mentre in quella indiretta i germogli si formano da tessuto de-differenziato. Nella caulogenesi diretta, dopo circa 48 ore dal trasferimento di un espianto di tessuto sul substrato di coltura, iniziano delle mitosi che possono dare origine ai meristemi dei germogli. I meristemi possono formare primordi, la cui disposizione appare casuale, con una tendenza ad una disposizione equidistante.

L'assenza di chimere indica che i germogli si originano da una singola cellula dell'epidermide, o da poche cellule figlie, comunque derivanti da una sola cellula (Broertjes e Van Harten, 1978; Broertjes e Keen, 1980). Secondo altri (Norris e Smith, 1981) rinizio dei meristemi dei germogli coinvolge l'associazione e la possibile inclusione di cellule situate al di sotto dell’epidermide. La capacità di formare germogli avventizi è comunque dipendente dai genotipo della pianta e spesso anche dal tipo di tessuto dell’espianto.

La formazione indiretta di germogli segue una via simile a quella diretta: la rapida divisione di cellule porta alla formazione di centri meristematici o meristemoidi (Torrey, 1966) che possono svilupparsi in primordi (Bonnet e Torrey, 1966) e successivamente in germogli. Anche in questo caso è molto probabile l'origine unicellulare delle strutture del callo (Thorpe, 1982), ma cellule vicine a quella iniziale sono spesso indotte a dividersi e ad essere incorporate nelia nuova struttura (Chlyah, 1974; Smith e Thorpe, 1975).

I mezzi che favoriscono lo sviluppo del callo solitamente non favoriscono anche la morfogenesi. Tuttavia in alcuni casi, se il callo è mantenuto sullo stesso substrato per un lungo periodo, si osservano fenomeni di organogenesi. In altri casi, per indurre la caulogenesi, è necessario il trasferimento del callo su substrati idonei. Le cellule che andranno a formare gli organi derivano dalla hprogrammazione di cellule non differenziate, o da cellule che hanno mantenuto un potenziale morfogenetico già presente nell’espianto di tessuto. A parte qualche eccezione, la formazione di germogli è favorita in tessuti recentemente isolati e la potenzialità decresce col numero di subcolture. Talvolta linee di callo isolate dallo stesso espianto possono dare delle risposte rigenerative diverse. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che il callo primario è composto da cellule o tessuti competenti e non competenti (Street, 1979). Linee di callo morfogenetiche e non morfogenetiche possono mantenere le loro caratteristiche per anni. Talvolta è possibile, mediante l’uso di particolari fattori chimici o fisici, indurre germogli o radici da calli apparentemente non rigenerativi, ma spesso tali tentativi non hanno successo. Piante che hanno un’alta capacità rigenerativa e che presentano una bassa variabilità genetica possono essere propagate mediante germogli avventizi, piuttosto che ascellari.

La coltura di callo, con la successiva rigenerazione di piantine, può essere utilizzata se il fine della coltura non è la propagazione, ma l’induzione di nuova variabilità da utilizzare per il miglioramento genetico.

La rizogenesi è il processo di formazione di radici e, come la cauiogenesi, può avvenire in modo diretto, da tessuto somatico, o indiretto, attraverso una fase non organizzata. La rizogenesi procede inizialmente, fino all'induzione del primordio, in modo del tutto simile alla cauiogenesi. Successivamente i primordi possono differenziare in germogli o radici, in risposta a stimoli di diversa natura (Halperlin, 1969). Alti livelli di auxina solitamente stimolano la rizogenesi. Generalmente la rizogenesi in vitro si manifesta molto più facilmente della cauiogenesi.

La cauiogenesi diretta viene spesso utilizzata per la propagazione di numerose piante ornamentali e da raccolto. In passato alcune piante ornamentali come Fresia (Hussey e Hargreaves, 1974) e Pelargonium (Hoidgate, 1977) venivano propagate mediante la formazione indiretta di germogli avventizi. Tuttavia è oramai generalmente accettato che a questo procedimento è associata una variabilità troppo elevata per il mantenimento delle caratteristiche commerciali della pianta.

Radici e germogli avventizi si possono associare per formare una pianta seguendo tecniche diverse: 1) la caulogenesi è seguita dalla formazione di radici avventizie (Skoog, 1944); 2) le gemme avventizie si formano sulle radici avventizie (Earle e Torrey, 1965); 3) la rigenerazione indipendente di radici e gemme è seguita dalla loro integrazione in un unico asse (Steward et al., 1958; Pilet, 1961; Kato e Takeuchi, 1963).

Embriogenesi somatica

L’embriogenesi somatica può avvenire in modo diretto o indiretto. L’embriogenesi diretta in vitro consiste nella formazione di embrioni somatici su espianti di tessuto senza l’intervento di tessuto non differenziato. L’embriogenesi diretta in vitro è stata principalmente descritta in tessuti gametofitici o sporofitici, associati al gametofito o derivati dalla fertilizzazione del gametofito (Smith e Krikorìan, 1988). In pratica avviene solo in cellule predisposte a produrre embrioni, definite "cellule determinate pre-embriogeniche” (PEDC, pre-embryogenically determined cells), e il trasferimento sul terreno di coltura serve solo ad incrementare tale processo (Sharp et al., 1980; Evans et al., 1981 a e Sharp and Evans, 1982).

I! gametofito femminile di alcune specie, come di alcune varietà di Citrus, è in grado di dare origine naturalmente a embrioni somatici avventizi. Questa tendenza ad avere più embrioni, uno zigotico e vari avventizi, nello stesso gametofito è detta poliembrionia.

Gli embrioni somatici possono essere formati in modo indiretto, quando cellule di callo non differenziate vengono indotte verso la determinazione embriogenetica (Sharp et al., 1980). Tali cellule sono dette “cellule determinate indotte embriogeniche” (IEDC, induced embryogenic determined cells). Sebbene gli embrioni siano difficili da osservare, possono distinguersi dai germogli avventizi perché a differenza di questi sono bipolari, comprendendo sia un polo apicale che radicale, un asse del germoglio e cotiledoni, e non hanno connessioni vascolari con i tessuti parentali adiacenti. Gli embrioni (sia zigotici che somatici) sono infatti nuovi individui derivanti da singole cellule e non aventi connessioni vascolari con i tessuti parentali (Haccius, 1978).

Gli embrioni somatici possono svilupparsi da una sola cellula, direttamente dal tessuto somatico, su callo o sospensioni cellulari (Backs-HCisemann e Reinert, 1970; Nomura e Komamine, 1986a; Miura e Tabata, 1986) e da protoplasti (Miura e Tabata, 1986). La cellula embriogenicamente determinata può seguire una divisione periclinale formando una cellula terminale ricca di citoplasma, che darà origine all’embrione, e una cellula basale grande e vacuolata che può dividersi alcune volte dando luogo ad un sospensore. Se la cellula basale si divide secondo piani anticlinali o in maniera casuale può dare origine a complessi cellulari pro-embrionali o a embrioni anomali con sospensore multiseriato (Trigiano et al., 1989).

Nell’embriogenesi indiretta la maggior parte delle piante rigenerate è geneticamente normale; la variabilità più elevata è riscontrabile in embrioni somatici indotti in colture di callo o in sospensione dopo un lungo periodo di crescita in condizioni non ottimali (Orton, 1985). La propagazione attraverso embriogenesi somatica indiretta è applicata a poche specie, generalmente (monocotiledoni, come cereali e palme, in cui la propagazione attraverso la coltura di germogli o la caulogenesi è inefficace. In alcuni casi l’embriogenesi diretta è stata efficacemente utilizzata per la micropropagazione, come in Helianthus annuus L. ‘ (Pélissier et al., 1990) e Juglans regia L. (McGranahan et al., 1988b).

La possibilità di ottenere per le diverse specie di interesse efficienti protocolli di differenziamento risulta solitamente determinata dallo studio e conoscenza della risposta del genotipo (pianta, cellula, tessuto) ai diversi fattori che possono intervenire nella regolazione delle diverse fasi del processo morfogenetico (induzione, determinazione e sviluppo).

I fattori che risultano solitamente coinvolti in questo processo sono;

-regolatori di crescita (fitormoni, induttori di stress, oligosaccarìdi, etc.); -fattori fisici (luce e temperatura);

-metodo di rigenerazione.

In questo ambito assumono quindi particolare importanza gli studi relativi all'interazione di questi fattori, al fine di giungere alla definizione di metodi efficienti di rigenerazione di piante, caratterizzate anche da elevata stabilità genetica, soprattutto se l'applicazione è nella moltiplicazione o nella manipolazione genica.

Variabilità dei processi morfoqenetici

Le piante rigenerate mediante embriogenesi sono generalmente omogenee dal punto di vista genetico, mentre in taluni casi, nella rigenerazione mediante cauiogenesi o rizogenesi, è possibile produrre chimere. La spiegazione di tale fenomeno risiede nel fatto che gli organi avventizi possono facilmente avere origine multicellulare (Norris e Smith, 1981), ‘ mentre gli embrioni hanno generalmente un'origine unicellulare.

Da quanto detto risulta evidente il vantaggio di mettere a punto sistemi di propagazione vegetativa basati sulla produzione di cellule ad elevata competenza rigenerativa, senza un lungo periodo di induzione e di colture in fase de-differenziata, a garanzia di elevata stabilità genetica. E' altresì vantaggioso l'inserimento di geni in singole cellule e l'ottenimento per rigenerazione di piante omogeneamente trasformate per l’espressione di uno o più geni eterologhi.

La trasformazione genica

La trasformazione è un processo mediante il quale DNA esogeno è introdotto all'interno di una cellula vegetale. A metà degli anni '80 fu prodotta la prima pianta transgenica da protoplasti di Nicotiana plumbaginifolia attraverso la tecnica mediata da Agrobacterìum (Horsch et al., 1984; DeBlock et al., 1984). Da allora un numero elevato di specie è stato ingegnerizzato impiegando diverse metodologie (Gasser e Fraley, 1989). Una delle tecniche utilizza la trasformazione di cellule vegetali appartenenti ad un espianto di tessuto (protoplasti). L'ottenimento di piante transgeniche dipende essenzialmente dalla frequenza di introduzione del gene di interesse e dalla capacità delle cellule trasformate di rigenerare l'intera pianta, oppure germogli o radici. Entrambi gli aspetti possono essere dei fattori limitanti per le piante da frutto.

L'evidenza della avvenuta trasformazione si ha con l'espressione del DNA introdotto nelle cellule vegetali: per questo motivo nel vettore di trasformazione, si inserisce anche un gene marcatore che, se espresso, conferisce alla pianta un caratteristico fenotipo.

Per ottenere piante transgeniche occorre: a) isolare il gene di interesse; b) avere un sistema di vettori che ne consenta l'inserimento nella pianta; c) avere una buona tecnica di trasformazione; d) avere una buona tecnica di rigenerazione; e) avere una buona tecnica di selezione.

Tecniche di trasformazione genica

Le principali tecniche di trasformazione possono essere indirette, se sfruttano la naturale capacità di agenti patogeni batterici e virali di trasferire geni, o dirette, in cui il DNA esogeno viene direttamente inserito nella cellula, senza che ci sia nessun tipo di interazione con un agente patogeno.

I metodi indiretti utilizzano vettori di espressione di orìgine microbica. Il trasferimento del gene all'interno della cellula vegetale è facilitato dal naturale sistema di trasferimento genico di Agrobacterium tumefaciens (Gheysen et al., 1985; Fraley et al., 1986; Lichtenstein e Fuller, 1987; Zambryski et al., 1989; Schuerman e Dandekar, 1991). Anche virus a DNA (Gronenborg e Matzeit, 1989) e a RNA (French et al., 1986) sono stati modificati al fine di includere un gene esogeno, che rimpiazzi parte dei genoma virale, creando cosi una particella virale difettosa in grado di operare il trasferimento genico.

La tecnica di trasformazione mediata da Agrobacterium è stato il primo strumento per trasformare molte piante dicotiledoni. E' certamente il metodo privilegiato in tutte quelle specie vegetali in cui il trasferimento dei T-DNA è possibile, per la relativa facilità e precisione di trasferimento in espianti intatti e in grado di rigenerare.

Tuttavia, molte specie vegetali, tra le quali cereali di notevole importanza economica come il riso, mais e frumento, non sono facilmente trasformate dal normale metodo indiretto. Di conseguenza sono stati elaborati sistemi alternativi, in cui l'inserimento del DNA nella cellula ospite avviene sotto forma di DNA libero, a cui segue l'integrazione a caso nel genoma. Tra questi metodi quello ‘biolistico’ rappresenta un metodo meccanico di introduzione del DNA nella maggior parte delle specie vegetali. Risulta vantaggioso in tutte quelle situazioni che impediscono la trasformazione mediata da Agrobacterium e il trasferimento libero in protoplasti. La tecnica si basa sull'accelerazione di pesanti particelle del diametro di alcuni micrometri, principalmente di oro o di tungsteno, ricoperte di DNA, che possono penetrare la parete cellulare e la membrana piasmatica di cellule vegetali intatte, veicolando così il materiale genetico. Dato che i piccoli fori della parete e del piasmalemma si richiudono rapidamente da soli, le lesioni prodotte sono temporanee e non compromettono in modo irreversibile l'integrità della cellula.

La prima pianta transgenica ottenuta simultaneamente, mediante Agrobacterium (Hincee et al., 1988) e metodo biolistico (McCabe et al., 1988), è stata la soia, il risultato di maggiore interesse è stato l'ottenimento di piante transgeniche fertili di mais (Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990)

Sistemi di selezione

Molti geni che codificano per antibiotici o erbicidi possono essere usati come marcatori di selezione, di solito necessari per una efficiente produzione di piante transgeniche. Gli agenti di selezione differiscono fra loro per il diverso grado di tossicità nei confronti della pianta, tossicità influenzata dalle dimensioni e dallo stadio di sviluppo della cellula o dei tessuti. Le cellule indifferenziate reagiscono diversamente alla presenza dell'agente di selezione rispetto ad espianti di organi come foglie e cotiledoni. Inoltre la suscettibilità ai vari agenti varia al variare della specie. Pertanto, per ogni protocollo di trasformazione e rigenerazione, è necessario saggiare attentamente la concentrazione dell'agente di selezione, che permetta da un lato la crescita e lo sviluppo delle cellule trasformate e dall’altro inibisca la proliferazione delle cellule non trasformate. Gli erbicidi sono di solito più tossici per i tessuti vegetali rispetto agli antibiotici, tanto che il loro utilizzo avviene solo in un secondo momento, cioè quando si è sicuri che le cellule trasformate abbiano prodotto sufficiente quantità di enzimi da indurre resistenza (Donn et al., 1990).

Per molte specie erbacee, normalmente a propagazione gamica, sono stati messi a punto validi protocolli di rigenerazione, anche per embriogenesi somatica, in grado di fornire risultati efficienti per la moltiplicazione e per la trasformazione. Alcune tra le specie erbacee, e soprattutto molte delle specie arboree presentano ancora notevoli difficoltà nello sviluppo di validi protocolli di rigenerazione applicabili per la moltiplicazione e per la trasformazione genetica. In molti casi esistono specifici problemi anche neH’applicazione dei protocolli standard di trasformazione.

Il metodo dell'invenzione mira a risolvere questi problemi, fornendo un valido protocollo di trasformazione genetica, anche per piante recalcitranti con le normali tecniche utilizzate.

Base dell'invenzione

Le tecniche descritte risultano di efficiente applicazione solo per le specie con una costituzione cellulare dei diversi tessuti somatici caratterizzata da una elevata competenza cellulare ai processi di organogenesi ed embriogenesi somatica. I protocolli attualmente noti e/o utilizzati per la rigenerazione dipendono dalla competenza cellulare del genotipo della pianta di interesse (Genere-Specie-Varietà) e del tipo di tessuto (sia meristematico che somatico: foglie, stelo, stipole; etc.). Molte specie vegetali di elevato interesse agronomico hanno una competenza estremamente ridotta alla rigenerazione delle loro diverse tipologie cellulari. Questa caratteristica, evidente soprattutto in molte specie legnose, spesso risulta il fattore determinante nel limitare l’applicazione delle tecnologie di moltiplicazione in vitro, per la ridotta efficienza, e di manipolazione genica, per la difficoltà di giungere alla rigenerazione di piante modificate per il gene di interesse.

Il metodo dell'invenzione è in grado di ottenere la costituzione di tessuti, caratterizzati da una principale componente cellulare ad elevata competenza alla rigenerazione di gemme avventizie. Ad esempio, il metodo permette di razionalizzare il processo produttivo di ditte vivaistiche, in quanto può essere utilizzato sia per la moltiplicazione che per la trasformazione. In tal modo si abbattono i costi di produzione e i costi per implementare innovazioni di biotecnologia genetica vegetale.

Descrizione dell’invenzione

La presente invenzione consiste in un metodo di coltura di tessuti in vitro che, tramite l'induzione e la coltura di aggregati cellulari meristematici, permette di ottenere strati cellulari (piattaforme) caratterizzati da una elevata efficienza di rigenerazione, via caulogenesi, di nuove piante.

Il principio di base del metodo è l'induzione di aggregati cellulari in accrescimento ad elevata competenza rigenerativa da cui, tramite sezionamento, è possibile ottenere strati cellulari (piattaforme), sempre ad elevata efficienza rigenerativa. La scelta della concentrazione iniziale dei regolatori di crescita è definita secondo le indicazioni rilevate per le singole specie nella fase standard di proliferazione in vitro (proliferazione di gemme ascellari).

La disponibilità di germogli in proliferazione in vitro e la conoscenza delle combinazioni di regolatori di crescita (in particolare citochinine) necessarie per la proliferazione standard delle gemme ascellari, risultano essenziali per l’induzione e l'ottenimento di ammassi meristematici (meristematic bulks). Sono stati pertanto messi a punto substrati di coltura caratterizzati da più elevate concentrazioni di citochinine, cosi da indurre una più elevata proliferazione in vitro di gemme ascellari, che determina la formazione di aggregati cellulari compatti costituiti da tessuti meristematici di diversa natura. Questa evoluzione si ottiene normalmente nel corso di 3-4 subcolture successive nelle quali si arriva gradualmente a triplicare rispetto al valore iniziale la concentrazione di citochinine nel substrato. Contemporaneamente a questo trattamento ormonale, ad ogni subcoltura, vengono rimossi tutti gli apici dei germogli più sviluppati (cimatura) lasciando intatta la base. Pertanto il metodo dell'invenzione per l’ottenimento degli aggregati meristematici si basa sull’effetto combinato del trattamento chimico (ormonale), con quello meccanico (rottura della dominanza apicale: cimatura).

Il trattamento chimico consiste in un progressivo aumento del contenuto di citochinine nel substrato dei germogli in proliferazione, raggiungendo in poche subcolture (3-5) una concentrazione di citochinine presenti del substrato almeno 3 volte superiore a quanto inizialmente riportato per il substrato di proliferazione (1-3).

Il trattamento meccanico comprende, ad ogni trapianto dei germogli in proliferazione, senza la rimozione della base, l'eliminazione dell’apice dei singoli germogli (cimatura) originati dalle gemme ascellari. Questo trattamento favorisce un forte accestimento della base, che sempre più si caratterizza da una elevata presenza di diversi centri meristematici.

in questo modo la base dei germogli non rimossa diventa sempre più sviluppata ed ipertrofica, fino ad arrivare alla formazione di un ammasso caratterizzato da una base parenchimatica con cellule ad elevata competenza per il differenziamento di gemme avventizie. Istologicamente questi ammassi sono caratterizzati da una parte più interna di tessuto compatto, formata dalla base dei germogli concresciuta assieme alle gemme. Sezioni trasversali degli ammassi evidenziano la contemporanea presenza di meristemi primari e secondari e primordi promeristematici immersi in un parenchima riccamente vascolarizzato. In particolare, si nota l'elevata formazione, anche in porzioni di tessuto molto ristrette, di meristemi primari in diversi stadi evolutivi: da cellule parenchimatiche (callo) a un meristema primario completo (gemma avventizia) con tutti gli stadi intermedi (noduli, abbozzi meristematici). Questi aggregati cellulari risultano quindi ad elevata competenza alla rigenerazione che può essere mantenuta per sub-colture successive su substrati caratterizzati dalle concentrazioni di citochinine raggiunte nell’ultimo stadio di induzione dell’ammasso. La caratteristica più importante degli aggregati ottenuti è che dalla loro frammentazione si ottengono, dopo tre o quattro settimane di coltura, formazioni identiche. Infatti, questi aggregati meristematici (meristematic bulk) possono essere mantenuti in coltura e moltiplicati per sezionamento (sezioni omogenee di circa 2 mm di spessore), che risultano in nuove piattaforme di rigenerazione (meristematic platforms), caratterizzate dalla stessa efficienza rigenerativa.

Questo ciclo “meristematic bulk-platfòrm" risulta costante per le diverse specie analizzate, e utilizzabile sia per la moltiplicazione vegetativa (clonazione) che per il trasferimento genico.

Applicazione 1 - Moltiplicazione vegetativa

L’efficiente induzione e mantenimento degli ammassi meristematici (MB), e l'elevata efficienza rigenerativa di nuovi germogli avventizi delle sezioni (piattaforme meristematiche), costituiscono un efficiente metodo di moltiplicazione che permette la semplificazione delle tecniche di manipolazione del materiale vegetale in vitro (semplice sezionamento degli ammassi) e l'ottenimento di espianti che mantengono una elevata efficienza rigenerativa.

Il metodo è in grado di produrre grandi quantità di questi aggregati cellulari (sia su substrato liquido che solido), facilmente sezionabili ed utilizzabili per l’ottenimento e differenziamento di un numero molto elevato di nuovi germogli e piante. Gli aggregati meristematici così formati possono essere utilizzati per la produzione, per sezionamento regolare, di piattaforme cellulari (sezioni di circa 2 mm di spessore e un cm di larghezza e lunghezza) che mantengono la caratteristica di aggregati meristematico-vascolare, con un’elevata competenza a determinare la rigenerazione di nuovi germogli avventizi (caulogenesi).

L'applicazione del metodo ai fini della propagazione vegetale è dimostrato dalla efficiente e stabile proliferazione degli ammassi (via rigenerazione), e dalla efficiente rigenerazione che si ottiene dalle piattaforme cellulari preparate con la frammentazione meccanica degli stessi. L’elevata efficienza di tale tecnica può essere ulteriormente accresciuta da una eventuale meccanizzazione-robotizzazione di alcuni passaggi (bioreattore - frammentatore).

Applicazione 2 - Trasformazione genica

Le piattaforme cellulari ottenute con il metodo dell’invenzione trovano un'applicazione ‘ vantaggiosa nel trasferimento genico, sia mediato da Agrobacterium tumefaciens, che con tecniche dirette. In questo caso l’effetto combinato della ferita e dell’elevata frequenza di cellule competenti alla rigenerazione favoriscono una elevata efficienza anche di trasformazione.

Le caratteristiche delle cellule che costituiscono gli aggregati meristematici e il sezionamento di essi, che si opera nella fase di rigenerazione-moltiplicazione, concorrono a creare le condizioni ottimali per favorire eventi di trasformazione genica. I meristemi già formati, non competenti per la trasformazione, sviluppano germogli che sono eliminati con qualche ciclo di selezione.

In particolare, sono stati effettuati esperimenti utilizzando il ceppo di Agrobacterium tumefaciens EHA 105 contenente il plasmide disarmato pTi EHA105 (Hood et al., 1993) e diversi vettori, in particolare il vettore binario contenente il gene marcatore della neomicina fosforaste rasi (nptli), che conferisce resistenza alla kanamicina, sotto il controllo del promotore nopalina sintetasi (Pnos).

La prima operazione da eseguire nella preparazione degli espianti per la trasformazione è la rimozione di tutta la parte superficiale esterna, mettendo a nudo il tessuto interno fino ad arrivare alla formazione di un cubetto di un centimetro cubo circa, costituito da tessuto chiaro e compatto. A questo punto si procede al sezionamento del cubetto con la formazione delle piattaforme cellulari che presentano una elevata efficienza rigenerativa e una estesa superficie di ferita, considerata necessaria per favorire l'efficiente trasformazione. Infatti, soprattutto per la trasformàzione mediata da Agrobacterium, la capacità di infezione e di trasfdrmazione è influenzata datazione dei composti rilasciati dalla superficie delle cellule ferite nella preparazione delle sezioni.

Per la crescita e l'infezione dei ceppi batterici sono utilizzate le tecniche standard.

Per l'infezione, terminata la coltura del batterio, si procede con il metodo classico di infezione delle PM, comprendendo preferibilmente anche un trattamento con acetosiringone e siringaldeide (25μΙ), sostanze organiche note per la capacità di attivare l'espressione dei geni vir presenti sul plasmide disarmato e, conseguentemente, di mobilizzare il DNA presente sul plasmide binano.

Al termine dell'infezione gli espianti vengono asciugati su carta assorbente sterile 3MM e trasferiti in piastre Petri contenenti il substrato di rigenerazione caratterizzato dalla concentrazione ormonale definita per la rigenerazione delle PM. La trasformazione avviene comunque sempre su un numero di cellule estremamente ridotto e la fase successiva di selezione è estremamente importante per discriminare gli eventi stabili ed omogenei di trasformazione. A questo fine inizia un protocollo di rigenerazione continua in mezzo di selezione, basato su diversi passaggi delle PM su substrati addizionati con le stesse concentrazioni di regolatori di crescita e con dosi crescenti del fattore di selezione (Kanamicina), partendo da un livello minimo di 25 mg/l fino ad una concentrazione finale (dopo 4 subcolture) variabile da 50 a 100 mg/l a seconda della sensibilità alla kanamicina delle specie.

I primi germogli che si sviluppano dalle PM, sono di solito originati da meristemi già formati, quindi con ridotta probabilità di una origine transgenica stabile. E’ comunque estremamente importante non eliminare nessuna parte di tessuto o germogli in una fase iniziale della selezione, ciò al fine di conservare anche nuovi germogli parzialmente modificati (chimere transgeniche). Molto spesso in questi casi si ha la trasformazione solo di poche cellule del meristema o di una sezione del meristema. In questo modo si arriva alla formazione di individui chimerici. Mantenendo la pressione selettiva della kanamicina aumenta la probabilità di isolare la chimera a vantaggio del transgenico. Infatti anche nella coltura in vitro è difficile mantenere in equilibrio le chimere che normalmente si risolvono a vantaggio di uno dei due genotipi.

Questo si spiega con una diversa risposta alle condizioni di coltura in vitro dei due genotipi. Con una chimera trasgenico-non trasgenico, la pressione selettiva esercitata dalla kanamicina dà vantaggio selettivo alle cellule del transgenico.

Per le specie che radicano con facilità è preferìbile una selezione blanda in proliferazione e una successiva radicazione con kanamicina (in radicazione si riesce ad ottenere una migliore selezione) E’ estremamente importante procedere in rigenerazione continua per perìodi abbastanza lunghi e subcolture frequenti. Rigenerazione continua consiste nel mantenere continuamente in substrato di rigenerazione e selezione gli espianti dopo la prima rigenerazione. Si ritiene, infatti, che i primi eventi di rigenerazione normalmente siano legati a meristemi già formati e quindi raramente transgenici. In una fase successiva, continuando a mantenere il materiale in un substrato di rigenerazione-selezione, aumentano le probabilità di aumentare la frequenza di cellule trasformate il cui successivo differenziamento favorisce la rigenerazione e sviluppo di individui geneticamente modificati in modo stabile e omogeneo.

La continua rigenerazione in selezione dalle rigenerazioni ottenute dalle PM provoca una amplificazione dei tessuti differenziati con cellule geneticamente manipolate e di conseguenza una stabilizzazione delle chimere e un aumento della frequenza dei transgenici. A verìfica dell’omogeneità di trasformazione dei germogli isolati si effettua un passaggio finale in radicazione sempre in presenza del fattore di selezione. Infatti, la formazione delle radici in presenza di kanamicina è, con elevata probabilità, indice di avvenuta trasformazione.

La presente invenzione verrà ora descritta in sue forme d attuazione specifiche, da considerarsi esplicative, ma non limitative, in cui si farà riferimento alle seguenti figure:

Figura 1. Analisi per Southern Blot di DNA di vite cv Thompson”, transgenica per il transgene Defh9-iaaM su gel di agarosio 0.7 % in 0.5X TBE. Colonna 1, DNA del clone 4 digerito con Hindlll Colonna 2, DNA del clone 4 digerito con Hindlll/EcoRI.

Figura 2. Analisi per Southern Blot di DNA di due piante di vite cv Silcora (I.G 235023) transgeniche per il transgene DefH9-iaaM Colonna 1, DNA del clone 29 digerito con Hindlll. Colonna 2, DNA de clone 29 digerito con Hindlll/EcoRI. Colonna 3, DNA del clone 35 digerito con Hindlll. Colonna 4, DNA del clone 35 digerito con Hindlll/EcoRI. Colonna 5, DNA di controllo digerito con Hindlll. Colonna 6, DNA di controllo digerito con Hindlll/EcoRI.

Moltiplicazione vegetativa

Il metodo descrìtto per la rigenerazione attraverso la formazione di un tessuto a “piattaforma” caratterizzato da un elevato numero d cellule indotte in uno stato ad elevata competenza per la formazione d meristemi avventizi (Meristematic Platform) è stato provato e sviluppato in un numero elevato di specie di interesse agronomico e forestale. Descrizione del metodo applicabile a uva da tavola (ViVs vinifera : cvs Thompson Seedless e Silcora /I.G 235023))

Gli ammassi meristematici sono stati indotti utilizzando germog in proliferazione, stabilizzati in vitro in vasi tipo “Fidenza” da 500cc ne substrato A contenente macroelementi elencati neila Tabella 1 microelementi e vitamine secondo Murashige and Skoog (1962); com ormone la 6-Benziladenina 0.8 mg/l; Saccarosio 3%; Agar 0.7 %.

Gli ammassi meristematici vengono sottoposti, ad og subcoltura, ad una drastica cimatura per stimolare una proliferazion progressivamente sempre più accentuata alla base del duster, second lo schema illustrato in Tabella 2.

Tabella 2

I germogli vengono sollecitati contemporaneamente con un stimolo ormonale e uno stimolo meccanico con energiche cimature. I questo modo i germogli diventano sempre più ingrossati e ipertrofic sino ad arrivare aH’ottenimento di ammassi in cui gemme e germog sono concresciuti in un ammasso compatto ricco di callo e primord meristematici. Istologicamente le masse sono caratterizzate da un parte più interna di tessuto compatto formata dalla base dei germog concresciuta assieme alle gemme. In sezione trasversale appaion molte masse di meristemi primari e secondari e primord promeristematici immersi in un parenchima riccamente vascol arizzato.

Gli ammassi meristematici (Meristematic bulk) posson facilmente essere propagati per frammentazione manuale o meccanica Da questi ammassi si possono ottenere ulteriori ammassi sullo stess substrato con BAP a 3 mg/l utilizzato per l’induzione.

Rimuovendo la parte esterna degli ammassi, ricca di gemme meristemi già formati, si preparano sezioni di circa 1 cm<2 >e di 2 mm d spessore a costituire le MP utilizzabili per la moltiplicazione e per l trasformazione.

Risultati della rigenerazione per moltiplicazione

Il metodo descritto permette di giungere alla costituzione dell piattaforme meristematiche che possiedono una elevata capacit rigenerativa, risultante in una maggiore efficienza di produzione d germogli rispetto al tasso di proliferazione che solitamente si riscontra i una normale fase di proliferazione in vitro da gemme ascellari e anch al tasso di rigenerazione da tessuto somatico (solitamente foglia picciolo).

In Tabella 3 sono riportati i tassi di proliferazione ottenib mediamente per le due varietà di vite utilizzate applicando il metod della rigenerazione dalle PM, a confronto con i metodi classici d proliferazione da gemme ascellari e di rigenerazione da tess somatici.

Tabella 3

Tasso di Tasso di Tasso di proliferazione da rigenerazione da rigenerazione delle gemme ascellari tessuto fogliare o da PM

altri tessuti somatici

3-5 0.1-0.5 20-30

Utilizzazione del metodo per altre specie di interesse agronomico Il metodo è stato analogamente utilizzato in un numero eleva di altre specie, per le quali è stata dimostrata la possibilità di ottenere formazione degli ammassi meristematici. In particolare sono st ottenuti buoni dati sull’efficienza di rigenerazione dalle PM per le spec elencate in Tabella 4.

Tabella 4

Frutticole temperate Frutticole sub-tropicali Orticole Forestali arbu Pesco Mandorlo Carciofo Eucalipto Pero Arancio Fagiolo Noce Melo

Kiwi

Fragola

In Tabella 5 si riportano i tassi di proliferazione ottenuti per diverse specie esaminate, applicando il metodo della rigenerazion dalle PM a confronto con i metodi classici di proliferazione da gemm ascellari e di rigenerazione da tessuti somatici.

Tabella 5

Specie Tasso di Tasso di Tasso di proliferazione da rigenerazione da rigenerazione gemme ascellari tessuto fogliare o da delle PM altri tessuti somatici

Pesco 2-4 0.01-0.1 20-30 Pero 2-4 0.01-0.5 20-30 Melo 3-5 0.1-0.8 20-30 Kiwi 2-3 0.1 -0.8 10-15 Fragola 5-8 0.1-0.8 15-25 Mandorlo 3-5 0.01-0.1 20-25 Arancio 3-ó 0.01-0.1 10-15 Carciofo 3-5 0-0.01 20-25 Fagiolo 3-5 0-0.01 15-20 Eucalipto 4-6 0.01-0.1 20-30 Noce 2-4 0-0.2 20-30 Trasferimento genico

Utilizzando il metodo di rigenerazione da PM descritto e metodo di trasferimento genico mediato da Agrobacterium e d selezione si sono ottenuti germogli geneticamente modificati con un frequenza molto elevata (Si veda Tabella 6 in seguito). Descrizione del metodo per la vite

Le piattaforme meristematiche, dopo l'infezione e un periodo d cocoltura con Agrobacterium, sono poste nel substrato di rigenerazion costituito dal medesimo substrato utilizzato nella terza subcoltura nell fase di induzione con BAP 3 mg/i, cefotaxime 50 mg/l e kanamicina 50 mg/>. Questa fase è importante perché la trasformazione avviene su un numero ridotto di cellule e la rigenerazione, sotto la pressione selettiva della kanamicina, conferisce un vantaggio selettivo alle cellule e ai germogli transgenici ad ogni ciclo di rigenerazione.

La procedura, ripetuta per numerosi cicli di rigenerazione, porta aN’amplificazione degli eventi di trasformazione producendo una ridondanza di copie di individui transgenici, ma anche la stabilizzazione delle chimere e un aumento della frequenza dei transgenici. Il procedimento comporta la presenza di un numero elevato di “escape", cioè di germogli apparentemente transgenici che in realtà sono semplicemente sfuggiti per caso all’effetto dell'agente di selezione, e rende pertanto necessaria una drastica selezione finale.

Tutto il materiale è posto in radicazione su un substrato così composto: macroelementi (Quoirin and Lepoivre medium, 1977); microelementi e vitamine (Murashige and Skoog medium, 1962); Ormoni: IBA 1 mg/l e IAA 1 mg/l; saccarosio 3%; agar 0.7%; kanamicina 50 mg/l.

Analisi molecolari

La conferma deH’origine transgenica di germogli radicati su kanamicina è stata effettuata per le due varietà di vite tramite un’analisi Southern Biot.

La Figura 1 mostra un’analisi per Southern Blot di DNA di vite cv “Thompson”, transgenica per il transgene Defh9-iaaM . La sonda utilizzata, omologa al gene nptll, è di 544 bp, prodotta per PCR con primers:

La pianta contiene 4 copie del T-DNA inserite nel genoma. De quattro frammenti di circa 8.6, 7.5 e 2.8 Kb, uno solo è tagliato d EcoRI, come dedotto dalla scomparsa del frammento maggiore nell doppia digestione e dalla concomitante rilevazione di un frammento d 2.4 Kb. Poiché la distanza dal sito Hindlll, presente nel T-DNA al 5' de gene nptll, fino al bordo destro del T-DNA (RB) è di circa 2 kb, il sit EcoRI è presente nel DNA genomico della pianta transgenica di vite 400 bp dal sito di inserzione.

La Figura 2 mostra un'analisi per Southern Biot di DNA di du piante di vite cv Silcora (I.G 235023), transgeniche per il transgen DefH9-iaaM. La sonda utilizzata omologa alla regione codificante d gene iaaM è di 589 bp ed è stata prodotta per PCR con i prime

Il clone 29 contiene tre copie del T-DNA inserite nel genoma come dedotto dalla presenza di tre bande di circa 1.2, 3.5 e 6 K prodotte dalla digestione con l'enzima Hindlll ed omologhe alla sond ottenuta dal promotore del gene DefH9-iaaM. La pianta 35 contiene un sola copia del T-DNA, come dedotto dalla rilevazione di un'unica band di circa 2.1 Kb. In entrambi i casi la doppia digestione con Hindlll e EcoRI genera una banda di circa 0.8 Kb.

Tabella 6

Eventi stabili dì trasformazione da 100 espianti infettati con Agrobacterium

Specie Rigenerazione da Embriogenesi Rigenerazione delle foglia somatica PM Vite 0 2 10

Il metodo di rigenerazione descrìtto risulta già molto efficiente, ma può permettere l'ottenimento di ulteriori vantaggi nello sviluppo di nuove tecniche di propagazione vegetativa, se adattato a sistemi di coltura automatizzati (bioreattori). La frammentazione degli ammassi meristematici esita in un contìnuo accrescimento del tessuto associato al differenziamento di nuovi meristemi.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la produzione di aggregati cellulari vegetali ad elevat capacità di rigenerazione comprendente un trattamento chimico ed u trattamento meccanico, in cui il trattamento chimico comprende: a) coltivare in vitro germogli in proliferazione in un primo substrato nutrimento comprendente citochinine, fino aH'ottenimento germogli da trapiantare; b) trapiantare i germogli ottenuti secondo a) in un secondo substra di nutrimento comprendente citochinine ad una concentrazion maggiore del primo substrato, fino all’ottenimento di germogli d trapiantare; c) eventualmente trapiantare i germogli ottenuti secondo b) in u terzo substrato di nutrimento comprendente citochinine ad un concentrazione maggiore del secondo substrato, fino all’ottenimen di germogli da trapiantare; d) eventualmente trapiantare ί germogli ottenuti secondo c) in u quarto substrato di nutrimento comprendente citochinine ad un concentrazione maggiore del terzo substrato, fino aH'ottenimento germogli da trapiantare; e in cui il trattamento meccanico consiste essenzialmente nella fase di e) asportare ai germogli da trapiantare a ciascuna delle fasi da a) a d) l'apice senza la rimozione della base. f) eventualmente coltivare in vitro gli aggregati così ottenuti.
2. 2. Metodo per la produzione di aggregati cellulari vegetali ad elevata capacità di rigenerazione secondo la rivendicazione 1 in cui (e citochinine comprendono BAP.
3. 3. Aggregati cellulari vegetali ad elevata capacità di rigenerazione ottenibili secondo il metodo delle rivendicazioni 1 o 2.
4. 4. Metodo per la produzione di piattaforme meristematiche ad alta capacità di rigenerazione comprendente le fasi di: a) ottenere gli aggregati secondo le rivendicazioni 1 o 2; b) sezionarli in piattaforme; c) eventualmente coltivare in vitro le piattaforme meristematiche cos ottenute.
5. 5. Metodo per la produzione di piattaforme meristematiche ad alta capacità di rigenerazione secondo la rivendicazione 4 in cui le piattaforme ottenute hanno uno spessore di circa 2 mm.
6. 6. Piattaforme meristematiche ad alta capacità di rigenerazione ottenibil secondo il metodo delle rivendicazioni 4 o 5.
7. 7. Metodo per la moltiplicazione vegetativa di una pianta comprendente le fasi di: a) ottenere le piattaforme meristematiche secondo le rivendicazioni 4 o 5; b) indurre nelle piattaforme meristematiche la rigenerazione di germogl avventizi per caulogenesi; c) ottenere dai germogli avventizi ottenuti in b) una pianta.
8. 8. Metodo per l'ottenimento di una pianta trasformata geneticamente con un transgene comprendente le fasi di: a) ottenere le piattaforme meristematiche secondo le rivendicazioni 4 o 5; b) trasformare con il transgene le cellule delle piattaforme meristematiche; c) mantenere le piattaforme meristematiche trasformate in terreno selettivo per almeno 3 cicli di rigenerazione, in maniera da ottenere un aumento del numero di cellule trasformate geneticamente nella piattaforma; d) rigenerare la pianta da dette piattaforme mantenute in terreno selettivo.