ITPD20090134A1 - Nuovi medicamenti ad uso topico a base di acido ialuronico solfatato come agente attivante o inibente l'attivita' citochinica - Google Patents

Description

"Nuovi medicamenti ad uso topico a base di acido ialuronico solfatato come agente attivante o inibente l’attività citochinica â€

CAMPO DELL’INVENZIONE E DESCRIZIONE

La letteratura scientifico/brevettuale, da molti anni ormai studia e descrive Facido ialuronico solfatato che si ottiene partendo dalTacido ialuronico (HA) opportunamente solfatato secondo quanto descritto allo stato delTarte (EP0940410B1 e EP0702699B1), al quale si ascrivono soprattutto effetti anticoagulanti. L’HAS si può anche ottenere tramite de-acetilazione e successiva solfatazione della glucosammina dell’HA (definito come HA-NS) (EP0971961B1), per la produzione di articoli chirurgici e composizioni farmaceutiche. Risultano inoltre noti i brevetti EP0754460B1 e EP1385492B1 in cui si descrive l’utilizzo dell’HAS in patologie come, ad esempio, l’ARDS (grave insufficienza respiratoria), il reumatismo articolare e l’artrite reumatoide. Oggetto della presente invenzione à ̈ il nuovo e sorprendente uso cutaneo dell’HAS come agente regolatore dell’attività citochinica, poiché la Richiedente ha scoperto l’esclusiva capacità dell’HAS di modulare l’attività di particolari citochine (sia pro-infiammatorie che anti- infiammatorie), ne ha studiato il meccanismo d’azione ed evidenziato la sostanziale differenza tra i due tipi di solfatato, (HAS e HA-NS), ma soprattutto la Richiedente ha sorprendentemente scoperto un’inaspettata altissima attività vs diversi tipi e ceppi di Herpes virus, del Cytome gaio virus e del virus della stomatite vescicolare. Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈, infine, l’utilizzo di HAS come promotore dell’assorbimento cutaneo di farmaci a carattere anti-infiammario ed ormonale.

Dal 1970 gli scienziati hanno capito che selezionate popolazioni di cellule linfoidi possono produrre e liberare nel letto circolatorio molecole di natura proteica non

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assimilabili agli anticorpi, definite col termine di “ citochine Esse rappresentano una nuova tipologia di '†̃ormone†, capace di agire su target cellulari diversi in molteplici distretti corporei.

La progressione del bagaglio di conoscenze scientifiche relative alla sintesi e alle funzioni biologiche/biochimiche di queste proteine, ha alterato la “vecchia†visione di sistema immunitario (S.l.) propria del mondo scientifico, ed ha aperto nuovi orizzonti nella comprensione delle sue molteplici funzioni, creando così nuove prospettive per la cura di differenti patologie, topiche e/o sistemiche, comprendenti anche nuove possibilità terapeutiche relative all’ immunoterapia del cancro.

La cellula centrale del S.l. à ̈ il linfocita, costituisce circa il 20% di tutti i globuli bianchi e, sulla base delle sue varie funzioni, forma 3 classi: il linfocita B, il linfocita T e il linfocita “killer†. Molte citochine sono proteine solubili prodotte da linfociti e/o monociti, capaci d’agire vs altre cellule/tessuti situati anche molto lontano dal luogo di loro produzione. Possiedono infatti funzioni immunitarie e funzioni di regolazione nella sintesi di altre citochine da parte di diverse cellule del S.l. o di cellule bersaglio coinvolte nella cascata di reazioni iniziata dal S.l.

Fino ad oggi sono state studiate molteplici differenti citochine, aventi anche diverse molteplici sigle, ma quelle studiate in particolare dalla Richiedente sono: Interleuchina 1 e 2, Interleuchina 6, 7 e 12, di seguito definite come 1L-1, 1L-2, 1L-6, IL-7 e IL- 12 che, con il TNF, sono definite citochine a carattere infiammatorio, mentre l’Interleuchina 10 (IL- 10) al contrario à ̈ una citochina con proprietà fortemente anti-infiammatorie.

La prima citochina ad essere studiata à ̈ stata sicuramente IL-1 : presente in due forme a e β, à ̈ un potente induttore dei processi pro-infiammatori (sistemici e/o cutanei). Viene prodotta principalmente dai linfociti B, T e dai macrofagi dopo stimolo batterico o stimolazione da parte di altri agenti comprese altre citochine; viene anche secreta dai neutrofili periferici, dalle cellule endoteliali, epiteliali e muscolari lisce, dai fibroblasti, dalle cellule del Langerhans della pelle, dagli osteoclasti, dai sinoviociti e dal molti altri tipi di cellula. Entrambe le forme legano lo stesso recettore e posseggono attività biologiche, se non identiche, molto simili. Molte delle loro funzioni pro-infiammatorie sono legate alla stimolazione di altre citochine, come 1L-6 e 1L-8, e la loro stessa sintesi può essere indotta da citochine come il TNF, l’Interferone, le endotossine batteriche, i virus e differenti tipi di altri antigeni. E coinvolta nello shock settico ma à ̈ anche da sottolineare come studi recenti abbiano dimostrato come IL- 1 sia in grado d’attivare l’espressione di alcuni oncogeni e, quindi, di partecipare alla patogenesi delle neoplasie. In combinazione con altre citochine, IL- 1 rappresenta quindi uno dei maggiori mediatori dei processi infiammatori: stimola infatti le T-cells a produrre IL-2 e le B-cells a produrre immunoglobuline. Risulta inoltre coinvolta nella patogenesi dell’artrite reumatoide e dell’artrosi: infatti, elevate quantità di IL-1 sono state trovate nel liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite reumatoide e/o osteoartrosi. È anche attiva in molteplici patologie a carattere prevalentemente cutaneo, come le dermatiti in generale, la dermatite atopica e la psoriasi. Infine, partecipa all’istaurarsi del danno vascolare come la trombosi venosa ed à ̈ presente in tutti i vasi con patologie di tipo arterio/aterosclerotiche. Attualmente, per questa citochina sono già in uso clinico (e in sperimentazione) antagonisti recettoriali in quanto il blocco del recettore si sta rivelando un efficace modo per curare quelle patologie in cui 1L-1 à ̈ tra i protagonisti.

TNF: Il fattore di necrosi fa parte di quel gruppo di citochine che promuove la reazione di fase acuta dell’infiammazione. Il TNF à ̈ quindi coinvolto in numerosissimi processi come la proliferazione, il differenziamento e l’apoptosi cellulare, la cancerogenesi e la replicazione virale.

E’ prodotto in massima parte dai macrofagi e da una serie di altri tipi cellulari inclusi mastociti, cellule linfoidi, cellule muscolari e endoteliali, fibroblasti e cellule nervose. La sua sintesi può essere stimolata dalle endotossine batteriche, da altre citochine come IL-2, Interferone e IL-1, ed essere inibita dagli steroidi.

Agendo su numerosi organi e sistemi, generalmente assieme ad altre citochine, partecipa all’instaurazione e alla regolazione di molti processi patogenetici :

-modula l’espressione di molte proteine ed importanti citochine, come IL-I e IL-6; -stimola la sintesi di collagenasi nei sinoviociti e, per questo motivo, grandi quantità di TNF sono state riscontrate nei liquidi sinoviali di pazienti sofferenti di artrosi e di artrite reumatoide;

-attiva gli osteoclasti e quindi induce il riassorbimento dell’osso;

-attrae potentemente i neutrofili e li aiuta ad agganciarsi alle cellule endoteliali per ex travasare;

-stimola la produzione macrofagica di molecole ad azione ossidante;

-Ã ̈ coinvolto in particolari patologie del Sistema Cardiocircolatorio partecipando alla formazione di trombi venosi, alla patogenesi deirarteriosclerosi e delle vasculiti.

Il TNF à ̈ capace di legarsi a due recettori, il TNF-R1 (recettore per il TNF di tipo 1) e il TNF-R2 (recettore per il TNF di tipo 2), che sono espressi in tutte le cellule somatiche esclusi gli eritrociti. Riassumendo, il TNF promuove la risposta infiammatoria sia sistemica che cutanea, che a sua volta accende molte patologie anche a carattere autoimmunitario, come l’artrite reumatoide, il morbo di Crohn, la psoriasi e l’asma. La ricerca scientifica ad oggi ha quindi cercato di perfezionare farmaci “biologici†(come, ad esempio, anticorpi monoclonali) che inibiscano la sintesi del TNF e/o ne blocchino il recettore.

IL-2 : à ̈ una citochina altamente pro-infiammatoria, aterogenica, principalmente prodotta da linfociti T, la cui sintesi viene inibita da steroidi e ciclosporine. 1L-2 ha un ruolo centrale nella regolazione della risposta immunitaria: stimola infatti la sintesi di IFN nei leucociti periferici ed induce la produzione di IL- 1 e TNF. IL-2, inoltre, può danneggiare la barriera emato-encefalica e l’integrità dell’endotelio dei vasi cerebrali, causando disordini neuropsichiatrici come disorientamento e depressione.

Quindi, molte sono le patologie che sono state messe in relazione con una produzione aberrante di IL-2, come il linfoma di Hodgkin, la sclerosi multipla, l’artrite reumatoide e il Lupus eritematoso.

IL-6: prodotto da molti tipi cellulari soprattutto del S.I., con il TNF à ̈ tra i più importanti membri del gruppo dei mediatori chimici della fase acuta del processo infiammatorio, ed à ̈ perciò coinvolto in patologie con una forte componente infiammatoria, come l’asma (dove partecipa alla nascita e al mantenimento del processo infiammatorio), l’infiammazione cronica intestinale ( morbo di Crohn), l’artrite reumatoide e l’artrosi. Infatti, come precedentemente affermato, citochine come il TNF, IL- 1 e IL-6 sono risultate essere pesantemente coinvolte nel processo degenerativo di osteoartrosi articolare poiché svolgono un ruolo primario nella regolazione dell’espressione delle metalloproteasi (responsabili della degradazione cartilaginea), nella produzione di prostaglandine e nell’attivazione osteoclastica e, per questo motivo, alti livelli citochinici sono stati registrati nei liquidi sinoviali dei pazienti artrosici e sofferenti di artrite reumatoide (R.A.). Queste scoperte sono state da stimolo nell’utilizzo di inibitori delle suddette interleuchine e/o di antagonisti recettoriali come nuova strategia di cura della patologia artrosica.

Infine, recenti studi hanno messo in relazione il cancro con la longevità ed evidenziato come alcuni tumori sono influenzati dalla situazione quali/quantitativa delle proteine citochiniche proprie del paziente: nella sostanza, recenti evidenze hanno legato un profilo di bassa produzione di IL- 10 e alta secrezione di 1L-6 ad un peggioramento della sopravvivenza clinica del paziente affetto da patologia tumorale, mentre un genotipo capace di produrre e mantenere alti livelli di IL- 10 può facilitare la sopravvivenza (Caruso C. et al., AnnN.Y. Acad. SCI., 2004, 1028:1-13).

IL-7: citochina principalmente prodotta dalle cellule stromali del midollo osseo, à ̈ secreta anche dal timo e dai cheratinociti. IL -7 induce la sintesi di citochine infiammatorie come IL- 1 , IL-6 e TNF, partecipando così alla patogenesi di alcune malattie della pelle (come la psoriasis e il linfoma cutaneo) e del sistema osteoarticolare, infatti, alti livelli di LL-7 sono stati rilevati in pazienti sofferenti di R.A.

IL-12: anche questa proteina gioca un ruolo centrale nella regolazione della funzioni del S.I. Agisce infatti sul differenziamento dei linfociti, induce la sintesi di Interferone e TNF, e la sua produzione può essere inibita da IL- 10. L’over-produzione di questa proteina entra nella patogenesi di malattie a carattere autoimmune come la colite, l’artrite, il diabete insulino-dipendente, l’encefalomielite, la psoriasi e la sclerosi multipla (Brahmachari S. et al., Minerva Med., 2008, 99(2): 105-118).

IL-10: prodotta principalmente dai linfociti, à ̈ una citochina a carattere antiinfiammatorio, capace d’inibire la sintesi di 1L-2 e dell’interferone prodotti dai linfociti T. L’azione anti-infi animatori a di IL- 10 si manifesta anche nella capacità d’inibire la sintesi di 1L-1, IL-6, 1L-8, IL- 12 e TNF nei macrofagi stimolati con endotossine batteriche. Deficit di IL-10 sono associati a patologie come il diabete mellito ed infiammazioni intestinali croniche, come il morbo di Crohn. Recenti evidenze hanno portato a sperimentare IL-10 anche come nuovo approccio terapeutico per il trattamento del Lupus eritematoso. È da sottolineare come sia i corticosteroidi che la ciclosporina aumentino la produzione e/o il rilascio di questa interleuchina dalle relative cellule competenti durante le convenzionali terapie di immunosoppressione per il trattamento delle infiammazioni e del rigetto d’organo (Zhou X. Et al., Current Drug Targets-Immune, Endocrine & Metabolic Disorders, 2005, 5(465475). Dati sperimentali hanno inoltre dimostrato la sua efficacia nella riduzione del rilascio di prostaglandine e di cicloossigenasi indotti in vitro da TNF su sinoviociti umani, dimostrando così la capacità di IL-10 di ridurre i processi infiammatori che coinvolgono le articolazioni affette da degenerazione osteoartrosica (Alaaeddine N. et al., Arthritis & Rheumatism, 1999, 42:710-718). Studi recenti hanno confermato la sua efficacia terapeutica verso la patologia asmatica in modelli sperimentali animali di iper-reattività bronchiale, dimostrando come questa citochina possegga elevate potenzialità terapeutiche nel diminuire l’infiammazione che caratterizza le vie aeree dei pazienti asmatici, nei quali alte concentrazioni di TNF, IL-1, IL-5, iL-6 e IL-8 sono state rilevate nel liquido di bronco lavaggio e/o a livello serico e/o a livello tissutale (Stankiewicz W. et al., Mediatore of Inflammation, 2002, 11:307-312). Per questa interleuchina à ̈ stato quindi ipotizzato l’importante ruolo di citochina regolatrice del mantenimento dell’ omeostasi immunologica.

L’asma può essere una malattia fortemente invalidante di cui circa 200 milioni di persone nel mondo soffrono, con più di 5000 morti all’anno. È una patologia che si basa su un’alterata risposta del S.l. ai fattori ambientali, legata quindi ad una esacerbata produzione di citochine pro-infiammatorie per la crescita e il differenziamento di mast cells ed eosinofili con altri tipi di cellule proprie del S.l. Non sono ancora del tutto note le cause di questo out-of-balance attività del sistema immunitario, tuttavia esistono motivazioni genetiche, ambientali, virali ed infine anche nutrizionali, che partecipano in modo diverso all’ instaurarsi della suddetta patologia. Trovare quindi una sua efficace terapia (sistemica e/o a carattere locale) di prevenzione e/o cura che permetta la sospensione o la riduzione dell’uso di steroidi (terapia di cura convenzionale), potrebbe rappresentare una valida soluzione sia per le forme più gravi (in quanto permetterebbe comunque la riduzione degli steroidi) che per quelle meno gravi, poiché la sospensione della terapia steroidea potrebbe essere totale.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Oggetto della presente invenzione à ̈ il nuovo e sorprendente utilizzo topico dell’HAS come agente regolatore dell’attività citochinica, poiché la Richiedente ha scoperto la sua esclusiva capacità nel modulare l’attività di particolari citochine, ne ha studiato il meccanismo d’azione ed evidenziato la sostanziale differenza tra i diversi tipi di solfatato noti allo stato dell’arte, ma soprattutto la Richiedente ha scoperto un’inaspettata attività vs diversi tipi e ceppi di Herpes virus, del Cytomegalovirus e del virus della stomatite vescicolare. Infine, ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ l’utilizzo di HAS come promotore dell’assorbimento cutaneo di farmaci prevalentemente a carattere anti- infiammarlo, come agente fibrino litico, ed anche come agente altamente idratante per la terapia di cura di tutte quelle patologie cutanee caratterizzate da secchezza, irritazione e rossore, infiammazione e desquamazione. L’acido ialuronico solfatato adatto agli scopi della presente invenzione viene preparato secondo il processo descritto in EP 702699 B 1 : la solfatazione viene effettuata mediante il complesso S03-piridina e coinvolge gli ossidrili alcolici presenti nella catena polisaccaridica a partire da un HA derivato da qualsiasi fonte, ad esempio, per estrazione da creste di gallo, per via fermentativa o per via biotecnologica, ed avere un peso molecolare compreso tra i 400 e 3xl0<6>Da, in particolare tra lx 10<4>Da e lx 10<6>Da, ancor più in particolare tra 10.000 e 50.000 Da, i 150.000 e i 250.000 Da e i 500.000 e 750.000 Da.

Il derivato che si ottiene mantiene inalterate tutte le caratteristiche fisiche del polimero di partenza, in modo particolare il peso molecolare delI’HA di partenza non viene diminuito dal procedimento di solfatazione permettendo, quindi, il mantenimento di tutte le caratteristiche chimico/fisiche del polisaccaride di partenza. La solfatazione coinvolge i diversi gruppi ossidrilici dell’unità disaccaridica ed à ̈ quindi possibile ottenere diversi gradi di solfatazione, da 0,5 a 3,5, (inteso come numero di gruppi solfato per unità disaccaridica), variando la quantità di S03-piridina introdotta come noto allo stato dell’arte.

Il derivato utilizzato in tutte le sperimentazioni eseguite, possiede mediamente grado 1 o grado 3 di solfatazione e di seguito à ̈ definito come HAS1 e HAS3. Tutti i gruppi carbossilici liberi dell’HA possono essere salificati con cationi di origine organica e/o inorganica.

Entrambi i gradi di HAS sono solubili in acqua ed, inoltre, si possono sterilizzare con le normali tecniche note all’esperto del ramo, tuttavia, à ̈ preferibile una sterilizzazione mediante autoclave.

La Richiedente descrive e rivendica il nuovo utilizzo di HAS per la preparazione di un medicamento ad uso topico:

o per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie cutanee associate al deficit delle difese immunitarie e, in modo particolare, al deficit di IL-IO, stimolando la sintesi di citochine anti-infìammatorie;

o per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie cutanee associate all’ aumento/attivazione di IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 e del TNF; o per la prevenzione e/o il trattamento topico dell’asma associata all’ attivazione di 1L-1, IL-6 e del TNF mediante inalazione; o per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie cutanee associate al danneggiamento dell’endotelio e/o della parete dei vasi sanguinei per, ad esempio, trauma, emorragie vascolari di carattere superficiale e/o di media profondità con conseguente formazione di coagulo ed edema; o per la prevenzione e/o il trattamento cutaneo delle malattie della pelle come, ad esempio, le dermatiti, la dermatite atopica, le fotodermiti, le orticarie, tutte le irritazioni cutanee (anche gengivali) legate all’ attivazione di citochine pro-infiammatorie, l’eczema;

o per la prevenzione e/o il trattamento cutaneo delle malattie a carattere autoimmune come la psoriasi, l’asma e la manifestazione cutanea del Lupus eritematoso sistemico (LES) e discoide;

o per la prevenzione e/o il trattamento topico di neoplasie cutanee come, ad esempio, il basalioma, il sarcoma di Kaposi, il carcinoma spino cellulare, il linfoma cutaneo, la micosi fungoide e la cheratosi attinica; o per la prevenzione e/o il trattamento topico di patologie vascolari come, ad esempio, le vasculiti e la sclerodermia, associate all’attivazione del TNF, di IL- 1 e IL-6.

Infatti, la Richiedente, nelle sperimentazioni di seguito riportate, ha dimostrato come:

• l’HAS sia capace sia di stimolare la produzione di nuovo mRNA che la sintesi proteica di citochine a carattere anti-infiammatorio (come, ad esempio, IL- 10), aumentando così la capacità di difesa immunitaria delle cellule e, quindi, di tutto Γ organismo. L’azione anti-infiammatoria delle suddette citochine si manifesta nella capacità d’inibire la sintesi di IL- 1 , IL-6, TL-8, IL-12 e TNF, tutte proteine altamente pro-infiammatorie coinvolte in molteplici patologie cutanee.

• l’HAS sia efficace sia nel diminuire la sintesi di nuovo mRNA che nel diminuire in modo significativo la sintesi proteica di IL-2, IL-7 e IL-12, in situazioni in cui non viene sollecitata una risposta immunitaria e in quei particolari eventi di stress infiammatorio in cui le cellule rispondono producendo una cascata citochinica: soprattutto in questo caso, i dati presentati evidenziano il maggior effetto dell’HAS.

• l’HAS sia efficace nell’inibire il bindine del TNF, di IL- 1 e di IL-6 al loro recettore. Questi risultati sono di fondamentale importanza poiché provano che il comportamento del solfatato à ̈ del tutto simile a quello di anticorpi monoclonali specifici per i recettori delle suddette proteine pro-infiammatorie, capace quindi di bloccarne la funzione non possedendo, tuttavia, questa specificità anticorpale. Questo blocco recettoriale rappresenta il modo più efficace per antagonizzare gli effetti pro-infiammatori e tumorali del fattore TNF, di IL- 1 e di IL-6 aprendo così nuove frontiere alla sperimentazione clinica, permettendo il perfezionamento di nuovi approcci terapeutici nella cura e/o prevenzione di un numero elevatissimo di patologie considerato il ruolo che il TNF, IL- 1 e IL-6 svolgono nell’insorgenza e nella progressione di molteplici malattie sia sistemiche che cutanee.

La Richiedente, inoltre descrive e rivendica il nuovo uso di HAS per la preparazione di un medicamento ad uso topico :

• per la prevenzione e/o il trattamento dell’Herpes Simplex labiale e dell’ Herpes genitalis;

• per la prevenzione e/o il trattamento del virus della stomatite vescicolare; • per la prevenzione e/o il trattamento del Cytomegalovirus.

La Richiedente ha infatti dimostrato, nelle sperimentazioni di seguito riportate, la potente azione antivirale dell’HAS vs differenti tipi di virus:

• I dati sperimentali dimostrano l’azione antivirale sia di HAS1 che HAS3 vs l’Herpes Simplex virus- 1 e 2 e vs il virus della stomatite vescicolare (VSV). La prima forma, notevolmente diffusa, à ̈ responsabile della comparsa di vescicole febbrili caratteristiche che di norma interessano la cute facciale (labbra, narici); à ̈ detto anche herpes simplex labiale. L'infezione provocata dall'herpes labiale può ricomparire con facilità poiché il virus sopravvive all'interno delle cellule e non viene eliminato neppure con l'impiego di farmaci efficaci. La seconda forma à ̈ un'infezione genitale, nota anche come herpes zenitalis. Entrambe si contraggono col contatto fisico e sessuale. Data la collocazione dei virioni nei gangli nervosi, dove possono rimanere quiescenti per molto tempo, l'infezione erpetica ha caratteristiche recidivanti in corrispondenza di eventi stressanti del sistema immunitario e solitamente ricompare nella sede primaria. Il virus della stomatite vescicolare à ̈ un RNA-virus, colpisce i mammiferi e viene usato in laboratorio per studiare Io sviluppo del ciclo di vita degli RNA-virus. Il confronto tra HA-NS1 e HAS1 dimostra come non tutti gli acidi ialuronici solfatati siano equivalenti, poiché ΓΗΑ-NSl non si à ̈ rivelato attivo in alcun caso, mentre l’HAS sia 1 che 3 dimostra una potentissima attività antivirale sia vs l’Herpes Simplex che vs il VSV. Tutti i campioni testati non risultano citotossici verso la cellula ospite, infatti, la minima concentrazione citotossica ottenuta à ̈ uguale a quella dei farmaci di riferimento normalmente usati nella pratica clinica per la cura dell’Herpes, ed à ̈ risultata essere mediamente 100 volte superiore a quella dimostratasi attiva nell’ inibizione della replicazione virale.

• I dati sperimentali ottenuti sia per HAS 1 che HAS3 hanno evidenziato un chiaro e significativo risultato antivirale vs il Cvtomegalovirus : à ̈ un particolare tipo di virus che entra in alcuni tipi di cellule del nostro organismo dentro le quali si replica in modo parassitario determinandone la morte. Appartiene alla stessa famiglia dell'herpes labiale e genitale, della varicella e della mononucleosi infettiva. Sono sede di infezione primaria multipla le cellule epiteliali, le mucose, i linfonodi. Permane in forma latente per tutta la vita nel sangue periferico, nell'epitelio dei tubuli renali e nell'epitelio delle ghiandole salivari. Si riscontrano forme gravi negli immunocompromessi (come gli affetti da AIDS e i soggetti trapiantati in terapia immunosoppressiva). La terapia di cura consiste nella somministrazione di farmaci quali ganciclovir, valganciclovir e foscamet (inibitori della sintesi di DNA virale). Anche in questo caso l’HA-NSl non si à ̈ rivelato attivo nell’inibizione della proliferazione del virus confermando l’assoluta diversità, come capacità antivirale, tra i due tipi di solfatato.

Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ l’utilizzo dell’HAS come agente fibrinolitico per la degradazione dei coaguli di fibrina che si formano a livello cutaneo (superficiali e/o profondi) in seguito alla rottura dell’endotelio e/o della parete di capillari e/o piccoli vasi, per traumi meccanici e/o emorragie di media/lieve entità. La Richiedente, nelle sperimentazioni di seguito riportate, ha infatti dimostrato:

• che l’HAS à ̈ efficace come la Plasmina nella fibrinolisi/sbrigliamento dei coaguli e dei trombi. La plasmina à ̈ un importante enzima, appartenente alla classe delle idrolasi capace di degradare molte proteine del plasma sanguigno, ed in particolare la fibrina dei trombi. La degradazione della fibrina à ̈ chiamata fibrinolisi. Una deficienza di plasmina può portare alla trombosi, poiché i trombi non sono adeguatamente degradati. E da sottolineare la sostanziale diversità tra il processo anticoagulante e quello fibrinolitico: nel primo caso l’agente anticoagulante deve evitare la formazione del coagulo, nel secondo caso, l’agente fibrinolitico deve invece intervenire in una situazione in cui à ̈ già presente il coagulo, che deve quindi essere degradato per la sua totale eliminazione.

Ulteriore oggetto della presente invenzione consiste nel nuovo utilizzo di HAS come promotore dell’assorbimento cutaneo di farmaci come, ad esempio, quelli a carattere anti- infiammano ed, infine, come agente altamente idratante per la terapia di cura di tutte quelle patologie cutanee caratterizzate da secchezza, licheni fi cazione, irritazione, prurito e rossore, infiammazione e desquamazione.

La Richiedente ha infatti dimostrato che:

• la solfatazione dell’acido ialuronico ne aumenta sostanzialmente l’assorbimento cutaneo, conseguentemente,

• il potere idratante dell’HAS à ̈ risultato significantemente superiore a quello dell’HA non solfatato e, quindi, ha determinato l’importante diminuzione della ruvidità delle superfici cutanee trattate rispetto all’HA e alle formulazioni topiche di controllo, evidenziando così la capacità di trattare e proteggere in modo efficace, superfici cutanee caratterizzate da secchezza, irritazione, lichenifìcazione, prurito e rossore, infiammazione e desquamazione con tutte quelle altre patologie cutanee che rendono la pelle maggiormente sensibile agli agenti esterni;

• l’HAS à ̈ un potente ed efficace promotore dell’assorbimento cutaneo di farmaci.

La capacità di HAS di penetrare lo spessore cutaneo in modo così efficiente à ̈ la base scientifica su cui fonda questa sorprendente ed inaspettata nuova proprietà,

che rende possibile la sua formulazione con agenti farmacologici di varia natura,

come, ad esempio, anti-infiammatori non steroidei (in modo particolare

diclofenac ed ibuprofene) o steroidei, ormoni, vasodilatatori, colinergici,

antibiotici ed altri ancora, formulati in varie forme, preferibilmente in gel, creme

o patch per un assorbimento dermico e/o transdermico.

Infine, la Richiedente descrive la preparazione di diverse formulazioni/composizioni

farmaceutiche topiche contenenti l’HAS come unico principio attivo, oppure in

associazione con altri agenti farmacologicamente e/o biologicamente attivi quali, ad

esempio, steroidi, ormoni, proteine, fattori trofici, vitamine, farmaci antinfiammatori

non steroidei (FANS) come, ad esempio, il diclofenac o l’ibuprofene o i loro sali,

chemioterapici per uso topico, antibiotici, antivirali, anestetici locali, anticoagulanti e/o

fibrinolitici, enzimi come, ad esempio, la collagenasi e/o la ialuronidasi e/o altre

proteasi; può essere formulato con polimeri come l’acido ialuronico e i suoi derivati, la

carbossimetilcellulosa (CMC) e/o altri polimeri di origine naturale (come il collagene) o

sintetica.

La composizione farmaceutica in oggetto può essere formulata come unguento, lipogel,

idrogel, lipstick, crema, ovulo e candelette vaginali, schiuma, gel mucosale,

preparazioni oftalmiche, lavande vaginali, colluttorio, patch per un assorbimento

dermico e/o transdermico, soprattutto di FANS ed ormoni, soluzioni, può essere quindi

somministrata per applicazione topica o mediante inalazione per il trattamento delle

patologie dell’apparato respiratorio come, ad esempio, l’asma.

Particolare attenzione hanno le composizioni contenenti enzimi come la ialuronidasi ( nella formulazione di un medicamento per il trattamento degli ematomi cutanei, e quelle contenenti farmaci anti-infiammatori non steroidei o ormoni, in forma di gel, creme e patch per l’assorbimento dermico e/o transdermico del farmaco.

A scopo puramente descrittivo e non limitativo vengono riportati alcuni esempi di preparazione di HAS di grado 1 e 3, di formulazioni farmaceutiche che lo contengono, assieme ai risultati ottenuti dalla sperimentazione in vitro.

Esempio 1

Preparazione del sale di tetrabutilammonio deiracido ialuronico (HAj di peso molecolare medio pari a 200KD (compreso tra 150.000 e i 250.000 Dal

5.00 g di acido ialuronico di origine fermentativa sale sodico (200 KD) sono disciolti in 250 mi di acqua e la soluzione risultante à ̈ fatta percolare attraverso una colonna di vetro preriempita con 100 cm di resina Dowex in forma di tetrabutilammonio (TBA). La soluzione di HA sale di TBA eluita viene raccolta e liofilizzata. Si ottengono 7,50 g di prodotto.

Esempio 2

Sintesi di HA solfatato a partire da HA di peso molecolare medio di 200KD. e grado di solfatazione pari a 3 eruppi solfato per unità ripetitiva.

Metodo A

10.0 g del sale TBA di acido ialuronico di peso molecolare medio 200KD preparati secondo Esempio 1, vengono solubilizzati in 300ml di dimetilsolfossido (DMSO); 26. Og del complesso S03-piridina (triossido di zolfo e piridina, di seguito abbreviato come PyS03) vengono dispersi in 150 mi di DMSO, quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21°C la reazione viene interrotta addizionando 0.1 volumi di acqua; il grezzo di reazione si isola per precipitazione dopo aggiunta di 2 volumi di etanolo. Il solido ottenuto viene disperso in 150 mi di acqua, ed il pH portato a neutralità con NaOH 1 M. Si dializza esausti vamente contro acqua attraverso membrana con cutoff 12-14000 Da. Il dializzato viene sottoposto a liofilizzazione. Si ottengono 9.7g di prodotto con grado di solfatazione pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva (resa=88%).

Metodo B

32.0 g del sale di TBA di acido ialuronico di peso molecolare medio 200KD preparato secondo Esempio 1, vengono solubilizzati in 900ml di N-Metil-Pirrolidone (NMP); lOOg di PyS03sono dispersi in 600 mi di NMP, quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21 /- 1 °C la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. Il pH, inizialmente inferiore a 2.5, viene portato a neutralità per aggiunta di una mole di NaOH (in soluzione). Il grezzo di reazione à ̈ isolato per precipitazione tramite aggiunta di 2.5 volumi di metanolo e lavato con 2 volumi di miscela metanolo/acqua 8/2. 11 solido à ̈ ridissolto e dializzato esaustivamente contro acqua utilizzando membrana con cutoff 12-14000 Da. Si ottengono 30.4 g di prodotto con grado di solfatazione pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva (resa=86%).

Esempio 3

Sintesi di HA solfatato a partire da HA di peso molecolare medio 200KD e grado di solfatazione pari a I gruppo solfato per unità ripetitiva.

Utilizzando la procedura illustrata nell’esempio 1 si preparano 10.0 g del sale di TBA di HA, che vengono disciolti in 350ml di DMSO. lO.Og del complesso PyS03vengono dispersi in 100 mi di DMSO, quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21 °C la reazione viene interrotta addizionando 0.1 volumi di acqua; il grezzo di reazione si isola per precipitazione dopo aggiunta di 2.5 volumi di etanolo. Il solido ottenuto viene disperso in 150 mi di acqua ed il pH portato a neutralità con NaOH 1 moli/l. Si dializza esaustivamente contro acqua attraverso membrana con cutoff 12-14000 Da. Il dializzato viene sottoposto a liofilizzazione. Si ottengono 7.54g di prodotto con grado di solfatazione pari a 1.0 gruppo solfato per unità ripetitiva (resa=93%).

Esempio 4

Sintesi di HA solfatato a partire da HA a basso peso molecolare fPM medio di 10KD, compreso tra 5.000 e 30.000 DI. e grado di solfatazione pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva.

Utilizzando la procedura illustrata nell’esempio 1, si preparano 12.4 g del saie di TBA di acido iaiuronico a basso peso molecolare che vengono solubilizzati in 300ml di NMP; 40g di PyS03sono dispersi in 100 mi di NMP quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica alla temperatura di 21°C, la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. Il pH, inizialmente inferiore a 2.5, viene portato a neutralità per aggiunta di una mole NaOH 4M. 11 grezzo di reazione à ̈ isolato per precipitazione tramite aggiunta di 2.5 volumi di metanolo e lavato con 2 volumi di miscela metanolo/acqua 8/2. 11 solido à ̈ ridissolto e dializzato esaustivamente contro acqua utilizzando membrana con cutoff 3500 Da. Si ottengono 12.0 g di prodotto con grado di solfatazione pari a 3.0 gruppi solfato per unità ripetitiva (resa=85%).

Esempio 5

Sintesi di HA solfatato a partire da HA di basso peso molecolare, e grado di solfatazione pari a 1 gruppo solfato per unità ripetitiva.

Utilizzando la procedura illustrata nell’esempio 1 si preparano 12.4 g del sale di TBA di HA che vengono disciolti in 300ml di DMSO. 16.0g di PyS03vengono dispersi in 100 mi di DMSO quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 21°C la reazione viene interrotta addizionando 0.1 volumi di acqua; il grezzo di reazione si isola per precipitazione dopo aggiunta di 2.5 volumi di etanolo. Il solido ottenuto viene disperso in 150 mi di acqua, ed il pH portato a neutralità con NaOH 1 moli/l. Si dializza esaustivamente contro acqua attraverso membrana con cutoff 3500 Da. Il dializzato viene sottoposto a liofilizzazione. Si ottengono 9.04g di prodotto con grado di solfatazione pari a 1 .0 gruppo solfato per unità ripetitiva (resa=90%).

Esempio 6

Sintesi di HA solfatato a partire da HA di peso molecolare compreso tra 500-730KD e grado di solfatazione pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva.

21 ,0g di acido iaiuronico di origine estrattiva sale sodico (500-730 KD) sono disciolti in 1.5 I di acqua e la soluzione risultante à ̈ fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 450 cm<3>di resina Dowex in forma diTBA. La soluzione di HA sale di ΤΒΑ eluita, viene raccolta e liofilizzata. Si ottengono 32.0 g di prodotto che vengono solubilizzati in 1.35 1 di NMP; lOOg di PyS03sono dispersi in 650 mi di NMP e quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 23 /- 1 °C, la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. Il pH, inizialmente inferiore a 2.5, viene portato a neutralità per aggiunta di NaOH (in soluzione a concentrazione 4 moli/l). Il grezzo di reazione à ̈ isolato per precipitazione tramite aggiunta di 2.5 volumi di metanolo e lavato con 3.5 volumi di miscela metanolo/acqua 8/2. Il solido à ̈ ridissolto e dializzato esaustivamente contro acqua utilizzando membrana con cutoff 12-14000 Da. Si ottengono 30.3 g di prodotto con grado di solfatazione pari a 3 gruppi solfato per unità ripetitiva (resa=83%).

Esempio 7

Sintesi di HA solfatato a partire da HA di peso molecolare 500-730KD e grado di solfatazione pari a 1 gruppo solfato per unità ripetitiva.

21. Og di acido ialuronico di origine estrattiva sale sodico (500-730 KD) sono disciolti in 1.5 1 di acqua e la soluzione risultante à ̈ fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 450 cm<3>di resina Dowex in forma diTBA. La soluzione di HA sale di TBA, eluita viene raccolta e liofilizzata. Si ottengono 32.0 g di prodotto che vengono solubilizzati in 1.65 1 di NMP; 40g di PyS03sono dispersi in 350 mi di NMP quindi aggiunti alla soluzione di HA. Dopo 20 ore sotto agitazione meccanica a temperatura di 25 /- 1 °C, la reazione viene interrotta addizionando 0.5 volumi di acqua. Il pH, inizialmente inferiore a 2.5, viene portato a neutralità per aggiunta di NaOH (in soluzione a concentrazione 4moli/l). Il grezzo di reazione à ̈ isolato per precipitazione tramite aggiunta di 3.5 volumi di metanolo e lavato con 3.5 volumi di miscela metanolo/acqua 8/2. II solido à ̈ ridissolto e dializzato esaustivamente contro acqua utilizzando membrana con cutoff 12-14000 Da. Si ottengono 22.5 g di prodotto con grado di solfatazione pari a 1.0 gruppo solfato per unità ripetitiva (resa=87%).

Esempio 8

Valutazione dell’effetto reaolatorio di HAS di grado 1 e grado 3 sull’espressione genica di IL-10 e IL-12

Sinoviociti umani precedentemente espansi in vitro e mantenuti in coltura a 37°C con terreno DMEM contenente il 10% di FCS, sono stati seminati ad una concentrazione di 20.000 cellule per pozzetto (i sinoviociti sono cellule capaci di produrre citochine di diverso tipo, quindi normalmente utilizzate per questa tipologia di test sperimentali). Al medium di coltura à ̈ stato quindi aggiunto ΓΗΑ solfatato di grado 1 (HAS1) e di grado 3 (HAS3) preparati come descritto in Esempi 1-3, alle concentrazioni di 0,1 e 0,5 mg/ml (per entrambi i campioni), mentre il trattamento di controllo à ̈ rappresentato da HA non solfatato con peso molecolare (PM) medio di 200KD. Dopo 3 giorni di trattamento, à ̈ stata eseguita la PCR Reai Time per valutare l’espressione genica di IL- 10 e IL- 12: I’RNA cellulare à ̈ stato estratto utilizzando il metodo “Trizol†, seguendo le indicazioni del fornitore (TRIZOL reagent, LIFE Techonologies, GIBCO BRL). Brevemente, le cellule sono state Usate mediante Faggiunta di LO mi di Trizol e si à ̈ proceduto a quantificare FRNA totale misurandone l’assorbanza a 260nm. Per ogni gene da amplificare sono stati scelti gli opportuni prìmer utilizzando il software Primer3 (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA, USA). L’espressione genica à ̈ stata valutata mediante la PCR Reai Time condotta con Rotor-gene TM5500 (Corbett research, Sydeny, Australia). Le reazioni di PCR sono state condotte utilizzando primer a 300nm e SYBR Green (lnvitroge, Carlsbad, CA, USA) a 40 cicli di 15 s a 95°C, e 1 min a 60°C. Il valore di “ Fluor escence thresholds (Ct)†à ̈ stato determinato automaticamente dal software valutando un coefficiente di amplificazione per i geni studiati tra il 92 e 110%. Per ogni campione di cDNA il valore di espressione genica à ̈ stato espresso in termini di rapporto tra il ct del gene house keeping (cioà ̈ il gene per la proteina beta actina che rappresenta il gene di controllo poiché presente in ogni cellula e non assoggettato all’influenza di HAS) e il ct del gene di interesse (cioà ̈ il gene per IL- 10 e IL- 12), quindi nell’asse delle ordinate viene riportato il valore di ct house keeoine/ct gene, che conseguentemente indica la quantità di mRNA espresso dal gene che si sta studiando. I risultati ottenuti sono espressi in Figura 1 e 2:

Fig. 1: il trattamento dei sinoviociti umani con HAS1 e HAS3 ha determinato l’aumento significativo dell’ espressione genica della citochina IL- 10 vs il controllo trattato con HA non solfatato.

Fie. 2:

Anche in questo esperimento, entrambi i gradi di solfatazione (grado 1 e grado 3) dell’HAS si sono dimostrati capaci di diminuire in modo altamente significativo l’espressione genica di IL- 12 dimezzando la sintesi del suo mRNA vs il controllo trattato con HA non solfatato. Quindi, Γ acido ialuronico solfatato si à ̈ dimostrato:

• capace di stimolare la produzione di nuovo mRNA per la sintesi di citochine anti-infiammatorie, aumentando così la capacità di difesa della cellula e, quindi, di tutto l’organismo, vs quelle patologie precedentemente descritte in cui Γ IL-IO à ̈ risultata essere di fondamentale importanza per la risoluzione e/o il miglioramento di malattie come l’asma e tutte quelle infiammazioni in cui IL-IO risulta coinvolta;

• efficace nel diminuire la sintesi di nuovo mRNA della citochina IL- 12 altamente pro-infiammatoria, dimostrandosi valido agente anti-infiammatorio capace di intervenire sull’espressione di proteine coinvolte nella patogenesi di malattie invalidanti come la psoriasi e tutte quelle precedentemente descritte. Esempio 9

Inibizione del binding del TNF al suo recettore espresso in linee monocitarie: valutazione dell’efficacia di 1IAS di grado 1 e grado 3 a diversi PM

Questi esperimenti sono stati effettuati per valutare l’efficacia dei campioni testati (preparati secondo Esempi 1-4) sulla capacità d’inibire il binding del TNF al suo recettore espresso da cellule del S.I. normalmente utilizzate in vitro per questo tipo d’esperimenti, eseguiti con componenti citochinici iodinati per una valutazione in Radioligand Binding assays.

La procedura sperimentale à ̈ stata eseguita come descritto in Baglioni C. et al., J Biol Chem, 1985, 260:13395-13397.

Brevemente, à ̈ stata utilizzata la linea di istiociti umani di linfoma U937, con caratteristiche di monociti sensibili all’ attività citotossica del TNF in quanto esprimenti il relativo recettore. Le cellule sono state inizialmente incubate con di<l2S>I-TNF 0,028nM (veicolato in acqua) contemporaneamente con i campioni da analizzare (alla concentrazione di lmg/ml che si à ̈ dimostrata essere la più bassa concentrazione che determina la massima inibizione), in tampone di incubazione formato da 50 mM Tris-HCL pH 7,4, 0,5 mM EDTA, a 4°C per 3 ore,.

Al termine dell’incubazione le cellule sono state centrifugate con dibutilftalato/dinonilfialto 2/1 e il pellet ottenuto à ̈ stato contato in un γ-counter.

I risultati ottenuti sono espressi in Figura 3:

i risultati ottenuti dimostrano Γ efficacia delfHAS nell’inibire al 100% il bindìng del TNF al suo recettore, sia per il grado 1 che per il grado 3, a medio e basso PM. Questi risultati sono di fondamentale importanza poiché provano che il comportamento del solfatato à ̈ del tutto simile a quello di un anticorpo monoclonale specifico per il recettore del TNF, capace quindi di bloccarne la funzione. Questo blocco recettoriale rappresenta quindi il modo più efficace per antagonizzare gli effetti pro-infiammatori e tumorali del fattore TNF.

Esempio 10

Inibizione del bindine della citochina IL-1 al suo recettore espresso in linee fibroblastiche: valutazione dell’ efficacia di HAS di grado 3 a diversi PM

Questi esperimenti sono stati effettuati per valutare l’efficacia dei campioni testati (preparati secondo Esempi 1-3 e 4) sulla capacità d’inibire il bìnding di IL- 1 al suo recettore espresso da cellule 3T3 di topo, normalmente utilizzate in vitro per questo tipo d’esperimenti, eseguiti con componenti citochinici iodinati per una valutazione in Radioligand Binding assays.

La procedura sperimentale à ̈ stata eseguita come descritto in Chin J et al., J Exp Med, 1987, 165:70-86.

Brevemente, à ̈ stata utilizzata la linea di fibroblasti murini 3T3 sensibili all’attività citotossica di IL- 1 in quanto esprimenti il relativo recettore. Le cellule sono state inizialmente incubate con di<l23>I-IL-l 10 pM (veicolato in acqua) contemporaneamente con i campioni da analizzare (alla concentrazione di lmg/ml che si à ̈ dimostrata essere la più bassa concentrazione che determina la massima inibizione), in tampone di incubazione formato da RPM1 1640 contenente 20 mM HEPES pH 7,2 e 1% BSA, a 37°C per 2 ore. Al termine dell’incubazione le cellule sono state lavate con tampone fosfato, quindi solubilizzate in 2,5 M NaOH e contate in un γ-counter.

I risultati ottenuti sono espressi in Figura 4:

i risultati ottenuti dimostrano l’efficacia dell’HAS (sia a medio che basso PM) nell’ inibire per il 30% il binding di IL-1 al suo recettore. Questi risultati sono estremamente significativi poiché provano che il comportamento del solfatato à ̈ del tutto simile a quello di un anticorpo monoclonale specifico per il recettore della citochina in oggetto, capace quindi di bloccarne la funzione e questo blocco recettoriale rappresenta il modo più efficace per antagonizzare gli effetti pro-infiammatori e tumorali di IL- 1 , come precedentemente descritto.

Esempio 11

Inibizione del binding della citochina 1L-6 al suo recettore espresso in cellule di mieloma umano: valutazione dell’ efficacia di HAS di grado 3 a diversi PM

Questi esperimenti sono stati effettuati per valutare l’efficacia dei campioni testati (preparati secondo Esempi 1-3 e 4) sulla capacità d’inibire il binding di 1L-6 al suo recettore espresso in mieloma umano U266, normalmente utilizzate in vitro per questo tipo d’esperimenti, eseguiti con componenti citochinici iodinati per una valutazione in Radioligand Binding assays.

La procedura sperimentale à ̈ stata eseguita come descritto in Taga T. et al., J Exp Med, 1987, 166:967-981.

Brevemente, à ̈ stata utilizzata la linea di mieloma umano U266 sensibili all’attività citotossica di IL-6 in quanto esprimenti il relativo recettore. Le cellule sono state inizialmente incubate con di T-IL-1 0,08 nM (veicolato in acqua) contemporaneamente con i campioni da analizzare (alla concentrazione di lmg/ml che si à ̈ dimostrata essere la più bassa concentrazione che determina la massima inibizione), in tampone di incubazione formato da RPMI 1640 contenente 25 mM HEPES pH 7,1 e 10% BSA, a 4°C per 16 ore. Al termine del l’incubazione le cellule sono state lavate con tampone fosfato, centrifugate a 9.000 rpm ed il pellet contato in un γ-counter.

I risultati ottenuti sono espressi in Figura 5:

i risultati ottenuti dimostrano l’efficacia dell’HAS, sia a medio che basso PM, nell’inibire fino al 100% il binding di IL-6 al suo recettore. Questi risultati quindi provano che il comportamento del solfatato, anche in questo caso, à ̈ del tutto simile a quello di un anticorpo monoclonale specifico per il recettore della citochina in oggetto, capace di bloccarne la funzione, e questo blocco recettoriale rappresenta il modo più efficace per bloccare gli effetti pro-infiammatori di IL-6.

Esempio 12

Valutazione dell’effetto inibitorio di HAS di grado 1 e grado 3 sulla sintesi proteica delle citochine IL-2, IL-7, IL- 10 e IL-12 in PBMC umani

Per queste sperimentazioni sono state utilizzate cellule mononucleate di sangue periferico umano (PBMC) derivanti da diversi donatori per valutare l'effetto di HAS sulla produzione delle citochine sopra elencate, utilizzando:

HA non solfatato (PM medio: 200KD),

HAS1 e HAS3 preparati come descritto in Esempi 1-3.

La separazione dei PBMC (Boyum A., Scand J Clin Lab Invest 21 Suppl, 1968, 97:77 89) à ̈ stata effettuata utilizzando il prodotto Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare), seguendo il protocollo indicato dal fornitore. Al giorno zero sono state piastrate 100.000 cellule per pozzetto (utilizzando piastre da 96 pozzetti) in 200 Î1⁄4Î di terreno RPMI 1640 addizionato di 10% di siero fetale bovino, HEPES lOmM, Glutammina 2mM, 1% Penicillina-Streptomicina 100 U/ml. L'effetto di tutti i campioni à ̈ stato valutato su PBMC non trattati, oppure stimolati con Lipopolisaccardide LPS (10 pg/ml) (altamente pro-infiammatorio) o con Phytoemoagglutinina PHA (10 pg/ml) (sostanza capace di stimolare i linfociti a dividersi), entrambi agenti capaci di stimolare la sintesi di citochine. Le cellule sono state trattate separatamente con i tre composti alla concentrazione di 0.1 mg/ml o 1 mg/ml. Dopo 24 ore di incubazione a 37°C (5% C02), da ciascun pozzeto sono stati prelevati 100 Î1⁄4Ι di surnatante allo scopo di analizzare la produzione IL-2, IL-7, IL-10 e IL- 12.

La quantificazione dei mediatori deirinfiammazione à ̈ stata effetuata mediante tecnologia SearchLight<®>, utilizzando una piastra Custom Human 9-Plex Array seguendo il protocollo indicato dal fornitore nella scheda tecnica.

I risultati ottenuti sono espressi in Figura 6- 9:

questi grafici evidenziano chiaramente come l’HAS sia di grado 1 che di grado 3 sia in grado di diminuire in modo significativo la sintesi di IL-2, IL-7 e IL- 12 da parte dei monociti, sia quando le cellule non sono stimolante che quando, al contrario, vengono sollecitate da specifici e potenti fattori infiammatori e/o mitogeni. L’HAS quindi si dimostra molecola con precise caratteristiche farmacologiche, capace di modulare/regolare la sintesi di citochine con spiccata attività anti-infiammatoria, sia in quelle situazioni in cui non viene sollecitata una risposta immunitaria, che in quei particolari eventi di stress infiammatorio in cui la cellula immunitaria risponde producendo una cascata citochinica e, sopratuto in questo caso, i dati presentati evidenziano il maggior effeto modulatorio dell’HAS.

Figura 9 conferma invece il chiaro stimolo alla produzione di IL-10 anche per cellule appartenenti al Sistema Immunitario. Viene quindi nuovamente confermato come l’HAS sia in grado di modulare la sintesi delle citochine stimolando quelle antiinfiammatorie e inibendo la sintesi di quelle pro-infiammatorie.

Esempio 13

Valutazione dell’azione antivirale di HAS di grado 1 e grado 3 vs HA-NS :

Herpes Simplex virus- 1, Herpes Simplex virus-2, Vesicular stomatitis virus

L’attività dei campioni testati à ̈ stata determinata valutando l’inibizione della citopatogenicità determinata dal virus dell’Herpes Simplex Virus-1, (HSV-1: KOS, F e Mclntyre strain ) e dai virus dell’Herpes Simplex Virus-2, (HSV-2: G, 196 e Lyons stram) in cellule fibroblastiche E6SM che derivano da tessuto musco lare/cute embrionale. Inoltre, l’attività anti-virale à ̈ stata testata sempre vs cellule E6SM infettate dal virus della stomatite vescicolare (Vesicular stomatitis virus: VSV). L'HSV-l à ̈ il virus che preferenzialmente infetta la mucosa orale, mentre l’HSV-2 attacca le mucose genitali. La procedura sperimentale à ̈ stata eseguita come descritto in Baba M. et al., ANT1M1CROB. AGENTS CHEMOTHER., 1988, 32:1742-1745.

In breve, colture cellulari confluenti sono state esposte a dosi infettive dei virus sopra elencati in presenza dei campioni HS-NS1 (EP0971961), HAS1 e HAS3 preparati come descritto in Esempi 1-3. Dopo un periodo di incubazione di Ih a 37 °C, il terreno di coltura à ̈ stato sostituito con terreno fresco contenente solamente i campioni da testare. La citopatogenicità dei virus à ̈ stata testata al 2° giorno di incubazione. La misurazione dell’inibizione della citopatogenicità virale à ̈ stata valutata determinando l’inibizione della sintesi di DNA e RNA nelle cellule “infettate†e sottoposte a trattamento come sopra scritto: le cellule sono state seminate in micro pozzetti in terreno di coltura contenente diverse concentrazioni dei campioni da testare con 2,5pCi di 3H-timidina e 3H-uridina per mi. Dopo 16h a 37°C, le cellule sono state trattate con acido Tricloroacetico, lavate in etanolo, lasciate asciugare e contate in 7,5 mi di liquido per scintillazione. L’attività antivirale dei campioni testati à ̈ espressa come la minima concentrazione richiesta per inibire per il 50% la citopatogenicità del virus: 1C50.

Inoltre, per valutare anche la citotossicità dei campioni testati, sono state determinate le minime concentrazioni necessarie per causare un danno morfologico (osservabile al microscopio ottico) alle cellule utilizzate. Il confronto à ̈ stato effettuato vs il destranosolfato (DS) e il farmaco Acyclovir, (entrambi molecole con nota efficacia antivirale, utilizzate quindi come controllo positivo).

1 risultati ottenuti sono espressi in Figura 10:

i dati sperimentali dimostrano la potente azione antivirale sia di HAS1 che HAS3 : il confronto tra HA-NS1 e HAS1 prova come non tutti gli acidi ialuronici solfatati siano equivalenti poiché l’HA-NSl non si à ̈ rivelato attivo, e questa diversità d’efficacia non dipende dal peso molecolare né dal grado di solfatazione dell’acido ialuronico, quindi, risiede nella struttura stessa di HA-NS1 vs HAS1. Infatti, l’HAS dimostra un’efficacia pari a quella del destrano-solfato e comparabile a quella dell’acyclovir, farmaco di riferimento per la cura dell’Herpes Simplex. Inoltre, à ̈ da sottolineare come l’acyclovir sia inattivo vs l’VSV, mentre l’HAS sia 1 che 3 dimostra una potentissima attività antivirale vs il VSV.

Tutti i campioni testati non risultano citotossici verso la cellula ospite, infatti, la minima concentrazione citotossica ottenuta à ̈ uguale a quella dei farmaci di riferimento normalmente usati nella pratica clinica per la cura delTHerpes, ed à ̈ risultata essere mediamente 100 volte superiore a quella dimostratasi attiva nell’ inibizione della replicazione virale.

Cvtomeealo virus

L’attività dei campioni testati à ̈ stata determinata valutando T inibizione della citopato genie ita determinata dal Cytomegalovirus (CMV: AD- 169 e Davis strairì) utilizzando il protocollo precedente. L’attività anti-virale à ̈ stata testata vs HEL cells (cellule embrionali polmonari) ed à ̈ stata espressa come la concentrazione richiesta per inibire del 50% il numero di placche formate dal suddetto virus.

I risultati ottenuti sono espressi in Figura 11 :

la tabella evidenzia il chiaro e significativo risultato positivo ottenuto sia per HAS1 che HAS3 che li conferma nuovamente come efficaci agenti antivirali. Anche in questo caso l’HA-NSl non si à ̈ rivelato attivo nell’inibizione della proliferazione del virus, confermando l’assoluta diversità tra i due tipi di solfatato di grado 1 come capacità antivirale.

Esempio 14

Valutazione in vitro delle proprietà fibrinolitiche di acido HAS di grado 3 a diversi PM La valutazione delle proprietà fibrinolitiche dei prodotti sottoposti a test à ̈ stata confrontata con l’attività fibrinolitica riconosciuta della plasmina. In particolare à ̈ stata valutata la velocità di dissoluzione del reticolo di fibrina e la formazione dei prodotti solubili della degradazione della fibrina (FDP).

I campioni di plasma utilizzati provenivano da sangue intero di soggetti sani, senza alcun trattamento farmacologico in corso.

Per testare l’efficacia fìbrinolitica dei prodotti sottoposti a test, i campioni di sangue sono stati distribuiti in diverse provette in cui à ̈ stata indotta la formazione del coagulo.

È stata quindi valutata la formazione di FDP in seguito ad aggiunta di:

• plasmi na, quale trattamento di controllo

• HAS3 preparato secondo Esempio 1 e 2

• HAS3 preparato secondo Esempio 4.

Esecuzione dello studio

I campioni di sangue appena prelevati venivano distribuiti in provette contenenti citrato di sodio in rapporto 9:1. Le provette sono quindi state immediatamente centrifugate a 3000 rpm per 5 min. 11 plasma ottenuto à ̈ stato trasferito in una nuova provetta e subito utilizzato per effettuare la valutazione di FDP.

Ai campioni di plasma à ̈ stata aggiunta trombina (300 mU/ml), pre-riscaldata a 37°C, quale attivatore del fibrinogeno nell’induzione della formazione del coagulo.

Nelle diverse cuvette contenenti il coagulo di fibrina sono stati aggiunti:

- soluzione di plasmina 0.5 mU, 5 mU, 50 mU, 500 mU e 1 U

- soluzioni di HAS3 alle concentrazioni 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml e 200 mg/ml.

Per ogni cuvetta à ̈ stata valutata spettrofotometricamente la variazione di assorbanza a 405 nm per 60 sec. La reazione à ̈ stata lasciata procedere fino alla completa dissoluzione del coagulo.

Plasma coagulato, soluzione di plasmina e soluzione di HAS3 200KD e di HAS3 20KD sono stati mixati in rapporto 1:1 v/v e mantenuti alla temperatura di lavoro di 37°C. Tabella 1. Attività fibrinolitica della PLASMINA

Nella tabella sono stati riportati i valori medi di mAbs/min registrati nelle couvette contenenti plasma coagulato addizionato con plasmina alle diverse concentrazioni. 1 valori riportati indicano la velocità con cui il coagulo di fibrina viene sciolto e di conseguenza la velocità con cui i FDP vengono prodotti. L'attività fibrinolitica della plasmina risulta proporzionale alla sua concentrazione.

Successivamente, i valori medi di mAbs/min registrati per ogni concentrazione di plasmina sono stati poi plottati contro le rispettive Unità di enzima per stabilire la funzione matematica che correla i valori di mAbs/min con le Unità di enzima.

PLASMINA: attività fìbrinolitica (mAbs/min)

1 u SOOmU 50mU 5mU 0,5mU

190 178 126 68 1

Tabella 2. Attività fìbrinolitica di HAS3 a diversi PM

Sono stati calcolati i valori di mAbs/min registrati nelle couvette contenenti plasma coagulato addizionato con HAS3 alle diverse concentrazioni. I valori indicavano la velocità con cui il coagulo di fibrina veniva sciolto e di conseguenza la velocità con cui i FDP erano prodotti. L’attività fìbrinolitica di HAS3 à ̈ risultata proporzionale alla sua concentrazione. Nella tabella l'attività fibrinolitica di HAS3 viene espressa come Unità equivalenti di Plasmina.

HAS3 (200KD) attività fìbrinolitica (espressa in mU equivalenti di Plasmina)

200 mg/ml 1 SO mg/ml 100 mg/ml SO mg/ml 25 mg/ml

1,1 U 50mU lOmU 3mU 0,5mU

HAS3 (10KD) attività fibrinolitica (espressa in mU equivalenti di Plasmina)

200 mg/ml 150 mg/ml 100 mg/ml SO mg/ml 25 mg/ml

400mU 25mU 2mU 0,3mU 0,25mU

Risultati:

la sperimentazione eseguita ha dimostrato come FHAS sia un potente agente fibrinolitico, con efficacia paritaria alla Plasmina. La plasmina à ̈ un importante enzima, appartenente alla classe delle idrolasi. che degrada molte proteine del plasma sanguigno ed, in particolare, la fibrina dei trombi. La degradazione della fibrina à ̈ chiamata fibrinolisi. Una deficienza di plasmina può portare quindi alla trombosi, poiché i trombi non sono adeguatamente degradati. L’HAS, pur non essendo un enzima, si à ̈ dimostrato attivo in modo equivalente al controllo enzimatico, permettendo così l’utilizzo del solfatato come nuovo agente fibrinolitico, avendo tutti i vantaggi di una molecola non enzimatica come, ad esempio, stabilità a temperatura ambiente con tempi di conservazione molto più lunghi, e facilità di formulazione.

Esempio 15

Valutazione della permeazione cutanea di HAS1 e di HAS3 con diversi PM. Valutazione dell’assorbimento cutaneo di diclofenac formulato in associazione con HAS vs HA

La pelle utilizzata per compiere gli esperimenti à ̈ ottenuta dall’addome di pazienti fra i 30 e i 50 anni, sottoposti a riduzioni chirurgiche addominali. Le sezioni di pelle a tutto spessore sono congelate dopo l’intervento chirurgico e conservate a -20°C fino al momento dell’esperimento, in cui i campioni sono fatti scongelare a temperatura ambiente e sono separati accuratamente dal tessuto adiposo. La pelle à ̈ divisa in sezioni quadrate di 2.5cm , immersa per un minuto in acqua alla temperatura di 60°C e con l’aiuto di apposite pinzette, strato corneo ed epidermide (SCE) sono separati accuratamente dai tessuti sottostanti. 1 campioni ottenuti sono analizzati al microscopio ottico e scartati nel caso siano rilevate forature. SCE à ̈ montato nella parte inferiore di una cella di Franz con Fepidermide rivolta verso il basso e lo strato corneo a contatto con la soluzione donatrice che si trova in alto. L’area di permeazione à ̈ una superficie circolare di 0.636 cm<2>. La parte inferiore e superiore della cella di Franz sono accuratamente fissate all’ SCE a separare il comparto donatore (volume soluzione donatrice: 0.50ml) ed accettore (volume soluzione ricevente: 5.00ml), i cui volumi sono esattamente calibrati. I solventi da impiegare sono degasati di modo da scartare la formazione di bolle, che deve essere evitata specialmente per la soluzione ricevente, la quale à ̈ termostatata a 37°C per mezzo di un bagno termostatico circolante; in queste condizioni l’SCE si trova ad una temperatura di 31-33 °C. Ciascun esperimento à ̈ eseguito in triplo ed il risultato à ̈ inteso come la media dei 3, espresso come quantità di analita che ha attraversato l’unità di superficie di nelle dopo 24 ore.

La permeazione di HA e HAS1 e HAS3 di entrambi i PM, à ̈ stata effettuata da soluzioni al 3% (peso/volume), con rivelazione dell’ ammontare permeato rispettivamente attraverso saggio al glucuronico e spettrometria ICP (Inductively Coupled Plasma) sullo zolfo.

La permeazione di diclofenac sale sodico à ̈ stata effettuata sul sale tal quale in soluzione acquosa, sul sale in presenza di HA 200KD al 3% (peso/volume) e sul sale in presenza di HAS3 preparato secondo Esempio 1-2, al 3% (peso/volume). In tutti e 3 i casi la concentrazione di diclofenac sale sodico nella soluzione permeanda à ̈ pari all’1% (peso/volume). La concentrazione di diclofenac à ̈ stata determinata attraverso analisi HPLC a fase inversa su apparecchio Agilent 1200 Series e rivelazione UV (254 nm), colonna CI 8, eluente acetonitrile/acqua/acido acetico 50/46/4 con un flusso di 1.2 ml/min.

I risultati ottenuti sono stati graficati in Figura 12 e in Figura 13:

Figura 12 evidenzia come la solfatazione dell’HA abbia aumentato in modo significativo la sua permeazione attraverso la cute e, come questo risultato sia particolarmente evidente per il medio PM.

Figura 13 dimostra invece come FHAS si comporti da promotore dell’ assorbimento cutaneo del principio attivo diclofenac, raddoppiandone la quantità totale permeata nelle 24h rispetto al controllo e all’associazione con HA.

Esempio 16

Valutazione delFattività idratante e protettiva ottenuta con HAS vs HA e crema base di controllo

20 soggetti umani di età compresa tra i 18 e i 70 anni, in assenza di patologie cutanee e di trattamenti farmacologici in corso, sono stati trattati giornalmente con determinate e costanti quantità dei prodotti testati, a livello dell’avambraccio.

1 prodotti sperimentati sono stati:

controllo: costituito da una crema base idratante

• crema base (come controllo) contenete HA 200KD 01%

• crema base (come controllo) contenete HAS3 01%, preparato secondo Esempio 1-2.

Crema Base: composizione

ACQUA DEIONIZZATA 85, 10 %

DERMOL 88 ETHYL HEXYL ETHYLHEXANOATE 6,50

PO L Y G LYCERY L- 10

PENTASTEARATE BEHENYL

ALCOHOL, SODIUM STEAROYL

NIKKOMULESE 41 LACTYLATE 5,00

POLYACRYLAMIDE C 13- 14

SEPIGEL 305 ISOPARAFFIN LAURETH 7 2,50

PHENOXYETHANOL,

METHYLPARABEN,

ETHYLPARABEN,

PROPYLPARABEN,

ISOCIDE PF PROPYLENE GLYCOL 0,50

KEMIPURE 100 IMIDAZOLIDINYL UREA 0,30

DISODIUM EDTA DISODIUM EDTA 0, 10

Metodo di Produzione

Caricare 90% di acqua e disodium edta e isocide PF. Scaldare a 65-70°C; in un contenitore appropriato sciogliere scaldando a 65-70°C nikkomulese, dermol 88: unire la fase grassa a quella acquosa sotto azione di turbina. Lasciare raffeddare a 30-35°C, aggiungere kemipure 100 sciolto nel restante 10% acqua, aggiungere sepigei per regolare la viscosità e raffreddare a 25 °C.

E’ stata valutata la differenza dei valori di idratazione ottenuti mediante comeometro CM825 da una media di 3 punti ed à ̈ stata anche effettuata l’analisi profilometrica della superficie cutanea mediante videocamera Visioscan VC98 al tempo T0 (valore basale) e T7, dopo 7 giorni di utilizzo dei prodotti.

I risultati ottenuti sono stati graficati in Figura 14 e 15:

Figura 14 evidenzia il maggior effetto idratante della cute dopo trattamento con HAS3, sia vs la crema base che vs quella contenente HA. Figura 15 prova invece come Γ indice di ruvidezza cutaneo, dopo 7 giorni di trattamento, sia significantemente diminuito rispetto ai controlli. Questi dati dimostrano chiaramente l’efficacia di HAS nel migliorare in modo evidente l’indice di idratazione cutanea, dimostrando un’efficace attività idratante e protettiva sulla cute riducendo la traspirazione dell’acqua transdepidermica.

Esempio 17

Preparazione di una formulazione in forma di SOLUZIONE per inalazioni contenente HAS di grado 1

In un flacone in vetro da 50 mi vengono introdotti 40 mg (o 20 mg se l’HAS ha PM di 500-730KD) di acido ialuronico solfatato di grado 1 di basso o medio PM, dopodiché vengono aggiunti 15 mi di PBS 0.2M a pH 7.4 sterile. La miscela viene sottoposta ad agitazione per circa 30 minuti, sino a completa dissoluzione della polvere. A solubilizzazione ottenuta, vengono aggiunti 2 mi di glicole propilenico e altra PBS 0.2M a pH 7.4 sterile sino al raggiungimento del volume totale di 20 mi. La soluzione viene mantenuta in agitazione per pochi minuti.

Esempio 18

Preparazione di una formulazione in forma di SOLUZIONE per inalazioni contenente HAS di grado 3

In un flacone in vetro da 50 mi vengono introdotti 100 mg di acido ialuronico solfatato grado 3 (HAS3) ottenuto da HA 200 KD, dopodiché vengono aggiunti 15 mi di PBS 0.2M a pH 7.4 sterile. La miscela viene sottoposta ad agitazione per circa 30 minuti, sino a completa dissoluzione della polvere. A solubilizzazione ottenuta, vengono aggiunti 2 mi di glicole propilenico e altra PBS 0.2M a pH 7.4 sterile sino al raggiungimento del volume totale di 20 mi. La soluzione viene mantenuta in agitazione per pochi minuti.

Esempio 19

Preparazione di una formulazione in forma di GEL IDROFILO contenente HAS, HA e CMC

Si solubilizzano metil- e propil-parabene in acqua purificata a 80°C. Dopo raffreddamento della soluzione a temperatura ambiente, si introduce sotto agitazione sodio ialuronato fino a dissoluzione e quindi HAS1 (o HAS3) mantenendo l’agitazione fino a completa dissoluzione. Si aggiunge quindi glicerolo e glicole propilenico sotto agitazione fino a completa dissoluzione. Si incorpora infine carbossimetilcellulosa (CMC) sodica e si miscela fino ad ottenimento di soluzione gelificata.

Esempio 20

Preparazione di una formulazione in forma di GEL IDROFILO ad uso mucosale (senza conservanti) contenente HAS e HA

Si solubilizza sotto agitazione sodio ialuronato e quindi HAS1 (o HAS3) in una quantità d’acqua circa il 90% del previsto in formula. Si aggiunge glicole propilenico, Symdiol 68 e quindi MP Diol Glicol miscelando fino a completa dissoluzione dei vari componenti. Si introduce quindi il carbomer 974P mantenendo l’agitazione fino a dispersione omogenea di quest’ultimo. Si discioglie sodio idrossido perle nel restante 10% di acqua, si aggiunge lentamente e in agitazione tale soluzione a quella precedentemente ottenuta e si miscela ad ottenere la gelificazione della fase acquosa. Esempio 21

Preparazione di una formulazione in forma di GEL IDROFILO contenente HAS e laluronidasi

Si solubilizzano metil- e propil- parabene in acqua purificata a 80°C. Dopo raffreddamento della soluzione a temperatura ambiente, si introduce sotto agitazione l’enzima laluronidasi e quindi l’HAS3 mantenendo l’agitazione fino a completa dissoluzione dei due componenti. Si introduce il carbomer 974P mantenendo l’agitazione fino a dispersione omogenea di quest’ultimo. Si aggiunge quindi TEA ad ottenere la gelificazione della fase acquosa. Si incorpora infine, sotto agitazione, glicerolo e quindi glicole propilenico.

Esempio 22

Preparazione di una formulazione in forma di CREMA IDROFILA (Emulsione 0/A) contenente HAS e laluronidasi

Si prepara la fase oleosa per fusione sotto agitazione a 50°C di paraffina liquida, acido stearico e Tefose 1500. Separatamente si prepara la fase acquosa mediante iniziale solubilizzazione a 80°C di metil-parabene, successivo raffreddamento a temperatura ambiente e incorporazione finale di glicerolo, Ialuronidasi e quindi di HAS3 sotto agitazione fino a completa dissoluzione dei vari componenti.

Si unisce la fase acquosa a quella oleosa e si procede all’emulsionamento, quindi si raffredda l’emulsione O/A ottenuta sotto agitazione a temperatura ambiente.

Esempio 23

Preparazione di una formulazione in forma di una SCHIUMA contenente HAS e Ialuronidasi

Si solubilizzano metil- e propil- parabene in acqua purificata a 80°C. Dopo raffreddamento della soluzione a temperatura ambiente, si introduce sotto agitazione la Ialuronidasi e quindi l’HAS3 mantenendo l’agitazione fino a completa dissoluzione. Si introduce glicole propilenico e si miscela fino a completa dissoluzione; si incorpora successivamente polivinilpirrolidone miscelando fino a completa dissoluzione e infine polisorbato 80 mantenendo l’agitazione fino a dissoluzione.

Si procede quindi alla fase di ripartizione della soluzione ottenuta in bombola, procedendo alla pressurizzazione con propellente isobutano, n-butano, propano.

Esempio 24

Preparazione di una formulazione in forma di UNGUENTO contenente HAS3 e Ialuronidasi

Si prepara l’unguento base per fusione sotto agitazione a 70°C di paraffina liquida leggera e vaselina bianca. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente si incorpora sotto agitazione la Ialuronidasi, quindi l’HAS3 e si miscela fino ad ottenimento di sospensione omogenea.

Esempio 25

Preparazione di una formulazione in forma di LIPOGEL contenente HAS3 e Ialuronidasi

Si fondono sotto agitazione a 90°C paraffina liquida leggera, vaselina bianca e l’alcool cetilstearilico. Si aggiunge sotto agitazione l’agente lipogelificante olio di ricino idrogenato fino a soluzione omogenea, e si procede quindi al raffreddamento lento fino a temperatura ambiente. Si incorporano infine la Ialuronidasi, THAS3 e si miscela fino ad ottenimento di sospensione omogenea.

Esempio 26

Preparazione di una formulazione in forma di LIPSTICK contenente HAS e HA

Si carica in apposito contenitore la quantità corretta di liquida paraffina indicata nella formula di fabbricazione.

Si scalda a 88 - 92°C, quindi si aggiungono sotto agitazione white soft paraffin, paraffin hard, white beeswax, ceresin, arlacel, mantenendo l’agitazione fino a fusione completa dei vari componenti, Si incorpora quindi all-rac-a-tocopheryl acetate, allantoina, butylhydroxytoluene, propyl p-hydroxybenzoate e si miscela fino a completa solubilizzazione, mantenendo la massa a 88 - 92°C.

Si carica separatamente in apposito contenitore la quantità di acqua purificata prevista in formula, si aggiunge sotto agitazione sodio ialuronato, HAS1 (o HAS3) fino a completa dissoluzione, quindi Disodium Edetate mantenendo l’agitazione fino solubilizzazione. Si trasferisce sotto agitazione la fase acquosa nel contenitore contenente la massa fusa, mantenendo il sistema a 88 - 92°C e l’agitazione fino a ottenimento di soluzione limpida. Si aggiungono quindi sotto agitazione i due aromatizzanti e si miscela per pochi minuti, per 10’. Si cola la massa fusa negli stampi e si procedere immediatamente al raffreddamento a T < 0°C fino all’ottenimento di stick solidi.

Esempio 27

Preparazione di una formulazione in forma di OVULI VAGINALI contenenti HAS e HA

Si lascia rigonfiare la gelatina nel 70% dell’acqua purificata a 85°C; si scioglie sodio ialuronato e HAS1 (o HAS3) nella restante quantità d’acqua e tale soluzione viene miscelata alla glicerina portata alla medesima temperatura. Si aggiunge la soluzione di glicerina alla soluzione rigonfiata di gelatina e si mantiene l’agitazione fino a completa dissoluzione della gelatina. Si cola la massa negli stampi e si procede al raffreddamento T < 0°C fino all’ottenimento di ovuli solidi.

Esempio 28

Preparazione di una formulazione in forma di CREMA IDROFILA (Emulsione O/A) contenente HAS e HA

Si prepara la fase oleosa per fusione sotto agitazione a 50°C di paraffina liquida, acido stearico e Tefose 1500. Separatamente si prepara la fase acquosa mediante iniziale solubilizzazione a 80°C di metil-parabene, successivo raffreddamento a temperatura ambiente e incorporazione di glicerolo, sodio ialuronato e quindi di HAS1 (o HAS3) sotto agitazione fino a completa dissoluzione dei vari compomenti.

Si unisce la fase acquosa a quella oleosa e si procede all’emulsionamento, quindi si raffredda l’emulsione O/A ottenuta sotto agitazione a temperatura ambiente.

Esempio 29

Preparazione di una formulazione in forma di UNGUENTO contenente HAS

Si prepara l’unguento base per fusione sotto agitazione a 70°C di paraffina liquida leggera e vaselina bianca. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente si incorpora sotto agitazione l’HASl (o HAS3) e si miscela fino ad ottenimento di sospensione omogenea.

Esempio 30

Preparazione di una formulazione in forma di GEL IDROFILO contenente HAS3. HA e diclofenac

Si solubilizzano metil- e propil- parabene in acqua purificata a 80°C. Dopo raffreddamento della soluzione a temperatura ambiente, si introduce sotto agitazione diclofenac sodico, sodio ialuronato e quindi l’HAS3 mantenendo l’agitazione fino a completa dissoluzione dei due componenti. Si introduce il carbomer 974P mantenendo l’agitazione fino a dispersione omogenea di quest’ultimo. Si aggiunge quindi TEA ad ottenere la gelifìcazione della fase acquosa. Si incorpora infine, sotto agitazione, glicerolo e quindi glicole propilenico.

Esempio 31

Preparazione di una formulazione in forma di CREMA IDROFILA (Emulsione 0/ΑΊ contenente HAS3 e diclofenac

Si prepara la fase oleosa per fusione soto agitazione a 50°C di paraffina liquida, acido stearico e Tefose 1500. Separatamente si prepara la fase acquosa mediante iniziale solubilizzazione a 80°C di metil-parabene, successivo raffreddamento a temperatura ambiente e incorporazione finale di glicerolo, diclofenac sodico e quindi di HAS3 sotto agitazione fino a completa dissoluzione dei vari componenti.

Si unisce la fase acquosa a quella oleosa e si procede all’emulsionamento, quindi si raffredda Γ emulsione O/A otenuta soto agitazione a temperatura ambiente.

Esempio 32

Preparazione di una formulazione in forma di SCHIUMA contenente HAS e diclofenac Si solubilizzano metil- e propil- parabene in acqua purificata a 80°C. Dopo raffreddamento della soluzione a temperatura ambiente, si introduce soto agitazione diclofenac sodico e quindi THAS3 mantenendo l’agitazione fino a completa dissoluzione. Si introduce glicole propilenico e si miscela fino a completa dissoluzione; si incorpora successivamente polivinilpirrolidone miscelando fino a completa dissoluzione e infine polisorbato 80 mantenendo l’agitazione fino a dissoluzione.

Si procede quindi alla fase di ripartizione della soluzione ottenuta in bombola, procedendo alla pressurizzazione con propellente isobutano, n-butano, propano.

Esempio 33

Preparazione di una formulazione in forma di PACTH cutaneo contenente HAS e diclofenac

Quest’esempio riguarda la preparazione di una matrice polimerica contenente HAS per il rilascio controllato di farmaci ad uso topico, e in questo caso del FANS diclofenac sale sodico, che migliori l’assorbimento dermico e/o transdermico del principio attivo contenuto, grazie all’azione promotrice dell’HAS. La matrice in oggetto preferenzialmente comprende copolimeri dell’acido acrilico e dei suoi esteri acrilici e/o metacrilici con una temperatura (T) di transizione vetrosa inferiore alla T ambiente, preferenzialmente inferiore a 0°C, i cui gruppi carbossilici liberi presenti lungo la catena polimerica sono salificati con basi organiche (per esempio, ammoniaca, copolimero dell’ammonio metil acrilati, etilendiammina) o inorganiche, (per esempio, idrossidi di metalli alcalini e di transizione) come noto all’esperto del ramo. I copolimeri normalmente impiegati in accordo con la presente invenzione, sono costituiti da 2 o più monomeri in % variabili; esempi di detti monomeri sono:

• acido acrilico

• butil e/o metil acrilato

• 2-etil esil acrilato

• GlicidiI metacrilato

• vinil acetato.

Molti copolimeri sono disponibili in commercio (come il Duro-tak®) disciolti in solventi organici, con una percentuale di gruppi carbossilici liberi compresa tra lo 0,1 e il 15% che devono essere salificati con quantità stechiometriche di basi organiche o inorganiche, come sopra scritto.

Secondo le tecniche note all’esperto del ramo, possono essere aggiunti alle formulazioni anche agenti reticolanti, scelti tra acidi policarbossilici come l’acido laurico e adipico o loro miscele, con una % variabile tra Γ1 e il 20 del peso secco.

La suddetta matrice polimerica all’intemo della formulazione finale à ̈ compresa nell’intervallo tra il 10-90% sul peso secco. La quantità del principio attivo incorporato varia in funzione della sua natura e dell’effetto terapeutico dermico o transdermico desiderato. Normalmente à ̈ presente tra lo 0,1 e il 30% del peso secco della composizione finale.

La formulazione può inoltre contenere eccipienti, lenitivi, emollienti, emulsionanti, modulatori dell’adesione, conservanti, plastificanti, acidificanti/tamponanti.

Promotore dell’assorbimento cutaneo con proprietà lenitive antiprurito e antiarrossamento, à ̈ l’HAS di grado 1 o di grado 3, preferenzialmente di grado 3, presente in concentrazione tra lo 0,1 e il 30% del peso secco della composizione finale. La suddetta matrice assicura: permeazione del principio attivo in modo controllato e costante, assenza di irritazione e adesività alla pelle.

Metodo di preparazione:

sotto agitazione meccanica, si aggiunge al copolimero di metacrilato scelto (ad esempio, il copolimero metacrilato butilato precedentemente salificato), un secondo copolimero come, ad esempio, acrilato-vinil acetato. Quindi, si aggiunge il principio attivo (diclofenac sale sodico) e l’HAS3 precedentemente solubilizzato in soluzione acquosa. Si lascia in agitazione fino alla completa dissoluzione.

Si stende poi la miscela sopra un film di poliestere/carta siliconato/a e si procede con l’essicamento per l’evaporazione dei solventi residui. La matrice così ottenuta viene poi accoppiata ad un tessuto-non tessuto di poliestere o ad un film di polietilene per la formazione finale del pacth.

La composizione finale di ogni singolo pacth contiene 140mg di diclofenac e 40mg di HAS3.

GEL IDROFILO (Esempio 19)

Componenti Quantità (mg/lg di idrogel) HAS1 (HAS3) 40 mg (10 mg)

CMC 20 mg

Glycerol 100 mg

Propylene Glycol 66,75 mg

Sodi urti Hyaluronate 2 mg

Methyl p-hydroxybenzoate 2 mg

Propyl p-hydroxybenzoate 0,2 mg

Purified Water q.s to lg

GEL IDROFILO ad uso mucosale (Esempio 20)

Componenti Quantità (mg/lg di idrogel) HAS1 (HAS3) 10 mg

Carbomer 974P 15 mg

Propylene Glycol 100 mg

Sodium Hydroxyde 0,33 mg

Sodium Hyaluronate 2 mg

MP-Diol Glycol 37,5 mg

SymDiol 68 90 mg

Purified Water q.s to lg

GEL IDROFILO (Esempio 21)

Componenti Quantità (U.I o mg/lg di idrogel) HAS3 10 mg Hyaluronidase 150 U.I Carbomer 974P 15 mg Glycerol 100 mg Propylene Glycol 66,75 mg Triethanolamine 13,25 mg Methyl p-hydroxybenzoate 2 mg

Propy] p-hydroxybenzoate 0,2 mg

Purified Water q.s to lg

CREMA IDROFILA (Emulsione O/A) (Esempio 22)

Componenti Quantità (U.I o mg/lg di crema) HAS3 10 mg Hyaluronidase 150 U.I

Tefose 1500 1 10 mg Glycerol 80 mg

Stearic Acid 33 mg

Liquid Paraffm 40 mg

Methyl p-hydroxybenzoate 1 mg

Purified Water q.s to lg

SCHIUMA (Esempio 23)

Componenti Quantità (U.I o mg/lg di soluzione) HAS3 10 mg Hyaluronidase 150 U.I Polysorbate 80 40 mg

Prolylene Glicol 40 mg Polyvinylpyrrolidone 30 mg

Methyl p-hydroxybenzoate 2mg

Propyl p-Hydroxybenzoate 0,3mg

Purified Water q.s to lg

Una bombola contiene circa il 94% di

soluzione e il 6% di propellente (Isobutano, n-Butano, Propano)

UNGUENTO (Esempio 24)

Componenti Quantità (U.I o mg/lg di unguento) HAS3 20 mg Hyaluronidase 200 U.I

Light Liquid Paraffin 200 mg

White Petrolatum q.s to lg

LIPOGEL (Esempio 25)

Componenti Quantità (U.I o mg/lg di lipogel) HAS3 20 mg Hyaluronìdase 200 U.I Hydrogenated Castor Oil 10 mg Cetostearyl Alcohol 50 mg White Petrolatum 365mg Light Liquid Paraffin q.s to lg

LIPSTICK (Esempio 26)

Componenti Quantità (mg/lg lipstick) HAS 1 (HAS3) 30 mg (10 mg) Liquid Paraffin 253,2 mg White Soft Paraffin 326,2 mg Hard Paraffin 144,3 mg Beeswax white 96 mg Ceresin 28,2 mg Arlacel 582 95,8 mg Sodium Hyaluronate 2 mg Allantoin 1 , 1 mg all-rac-a Tocopheryl Acetate 1, 1 mg Propyl p-hydroxybenzoate 0,4 mg Butylhydroxyto luene 0,4 mg Purified Water 19,2 mg Disodium Edetate 1 , 1 mg Vanilla Flavour 0,5 mg Sweet Flavour 0,5 mg

OVULI VAGINALI (Esempio 27)

Componenti Quantità (mg/lg di ovulo) HAS1 (HAS3) 10 mg Glycerin 580 Gelatin 200 Sodium Hyaluronate 2 Purified Water q.s to lg

CREMA IDROFILA (Emulsione O/A) (Esempio 28)

Componenti Quantità mg/lg di crema) HAS1 (HAS3) 10 mg Tefose 1500 1 10 mg Glycerol 80 mg Stearic Acid 33 mg Sodium Hyaluronate 2 mg Liquid Paraffin 40 mg Methyl p-hydroxybenzoate 1 mg Purifìed Water q.s to Ig

UNGUENTO (Esempio 29)

Componenti Quantità (mg/lg di unguento) HAS1 (HAS3) 20 mg

Light Liquid Paraffin 200 mg White Petrolatum q.s to lg

GEL IDROFILO (Esempio 30)

Componenti Quantità (mg/lg di idrogel) Diclofenac sodium (*) 30 mg Carboni er 974 P 15 mg Glycerol 100 mg

HAS3 20 mg

Sodio laluronato 2mg Propylene Glycol 66,75 mg Triethano lamine 13,25 mg Methyl p-hydroxybenzoate 2 mg

Propyl p-hydroxybenzoate 0,2 mg

Puri ti ed Water q.s to l g

(*): diclofenac sodico 3%

CREMA IDROFILA (Emulsione O/A) (Esempio 3 1 )

Componenti Quantità (mg/lg di crema) Diclofenac sodium 10 mg Tefose 1500 1 10 mg Glycerol 80 mg

HAS3 30 mg Stearic Acid 33 mg Liquid Paraffin 40 mg Methyl p-hydroxybenzoate 1 mg Purifìed Water q.s to lg

(*): diclofenac sodico 1 %

SCHIUMA (Esempio 32)

Componenti Quantità (mg/lg di soluzione) Diclofenac sodium 40 mg

Po Iy sorbate 80 40 mg Prolylene Glicol 40 mg HAS3 10 mg

Po lyviny 1 py rro 1 idone 30 mg Methyl p-hydroxybenzoate 2mg

Propyl p-Hydroxybenzoate 0,3mg

Purified Water q.s to l g

Una bombola contiene circa il 94% di

soluzione e il 6% di propellente (Isobutano, n-Butano, Propano)

(*): diclofenac sodico 4%

Essendo Γ invenzione così descritta, à ̈ chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell’invenzione e tutte le modifiche che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni.

Claims (20)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie cutanee associate al deficit delle difese immunitarie.
2. 2. Uso di acido ialuronico solfatalo per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie cutanee associate al l’attivazione di IL- 1. IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 e del TNF.
3. 3. Uso di acido ialuronico solfatato per Sa preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento dell' asma associata alE attivazione di IL-l, IL-6 e del TNF mediante inalazione.
4. 4. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento delle patologie cutanee associate al danneggiamento dell’ endotelio e/o della parete dei vasi sanguinei.
5. 5. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento delle malattie della pelle come le dermatiti, la dermatite atopica, le fotodermi ti, le orticarie, tutte le irritazioni cutanee legate all’attivazione di citochine pro-infiammatorie, i’eczema.
6. 6. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento delle malattie a carattere autoimmune come la psoriasi, l’asma e la manifestazione cutanea del Lupus eritematoso sistemico e discoide.
7. 7. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento di neoplasie cutanee.
8. 8. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento di patologie vascolari come, ad esempio, le vasculiti e la sclerodermia associate all<†̃>attivazione del TNF, di IL- 1 e IL-6.
9. 9. Uso di acido ialuronico solfatato per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la prevenzione e/o il trattamento dell’ Herpes Simplex labiale e dell’ Herpes genitalis, del Virus della Stomatite Vescicolare e del Cytomegalovirus.
10. 10. Uso di acido ialuronico solfatato come agente fibrinolitico per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la fìbrinolisi/sbrigliamento dei coaguli di fibrina e dei trombi che sì formano a livello cutaneo.
11. 11. Uso di acido ialuronico solfatato come promotore dell’assorbimento cutaneo di farmaci per la preparazione di un medicamento ad uso topico contenente agenti farmacologicamente e/o biologicamente attivi.
12. 12. Uso di acido ialuronico solfatato come agente idratante per la preparazione di un medicamento ad uso topico per la terapia di cura delle patologie cutanee caratterizzate da secchezza, lichenificazione, irritazione, prurito e rossore, infiammazione e desquamazione.
13. 13. Composizione farmaceutica ad uso topico contenente acido ialuronico solfatato secondo le rivendicazioni precedenti eventualmente associato ad agenti farmacologicamente e/o biologicamente attivi.
14. 14. Composizione farmaceutica secondo rivendicazione precedente contenente steroidi, ormoni, proteine, fattori trofici, vitamine, farmaci antinfiammatori non steroidei, chemioterapici per uso topico, antibiotici, antivirali, anestetici locali, anticoagulanti e/o fibrinol itici, enzimi e/o altre proteasi.
15. 15. Composizione farmaceutica secondo rivendicazione 14 contenente ialuronidasi.
16. 16. Composizione farmaceutica secondo rivendicazione 13 contenente polimeri come l’acido ialuronico e i suoi derivati, la carbossimetil cellulosa e/o altri polimeri di origine naturale o sintetica.
17. 17. Composizione farmaceutica secondo rivendicazioni 13-16 in forma di unguento, lipogel, idrogel, lipstick, crema, patch, ovulo e candelette vaginali, schiuma, gel mucosale. preparazioni oftalmiche, lavande vaginali, colluttano, soluzioni, per applicazione topica o inalazione.
18. 18. Composizione farmaceutica secondo rivendicazione 14 contenente acido ialuronico solfatato come promotore deH<'>assorbimento cutaneo di farmaci in forma di unguento, lipogel, idrogel, lipstick, crema, patch, ovulo e candelette vaginali, schiuma, gel mucosale, preparazioni oftalmiche, lavande vaginali, colluttano, soluzioni,
19. 19. Composizione farmaceutica secondo rivendicazione 18 in forma di patch contenente acido ialuronico solfatato in associazione con farmaci anti-infiammatori non steroidei.
20. 20. Composizione farmaceutica secondo rivendicazione 19 contenente diclofenac.