ITMI992173A1 - Derivati isossazalcarbossamidici - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione avente per titolo:

"DERIVATI ISOSSAZOLCARBOSSAMMIDICI"

AMBITO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda derivati isossazolcarbossammidici, le composizioni farmaceutiche che li contengono e gli impieghi di tali derivati e composizioni. ARTE PRECEDENTE

Il brevetto US 5403842, Leonardi A. et al., e le sue "continuations" {US 5474994, Leonardi A. et al., ed US 5605896, Leonardi A. et al.,) rivendicano derivati eterobiciclici contenenti fenilpiperazine sostituite legate all'anello eterociclico attraverso vari gruppi distanzienti. Tra questi derivati il composto A (Es. Il; Ree 15/2739) riveste particolare interesse per la sua elevata attività' ed uroselettivita '.

Il composto A e' dotato di buona affinità’ per il recettore adrenergico ed e’ in grado di inibire selettivamente la contrattilità’ dell'uretra prostatica nel modello del cane senza effetti sostanziali sulla pressione arteriosa (Leonardi A. et al., J. Pharmacol . Exp. Therap. 281, 1272-1283 (1997).

Le N,ω-amminoalchilammidi dell'acido 5-metil-3-fenil-4-isossazolcarbossilico sono composti noti, ma le molecole dell'arte precedente possiedono una struttura molecolare alquanto diversa rispetto a quella rivendicata in questo brevetto ed un meccanismo d'azione completamente differente. Per esempio, EP 573883, Jeschke P. et al., prevede, come composto rappresentativo, 3-(2-cloro-6-fluorofenil)-N-[3-(2-clorofenilammino)propri] -5-metilisossazol-4-carbossammide ed altri derivati simili e la loro applicazione terapeutica rivendicata e' la cura delle endoparassitosi. EP 428434, Emmonds-Alt X. et al., rivendica 3-(2-clorofenil)-N-(2-(3,4-dicloro fenil)-4- [4-fenilmetil)-1-piperidinil]butil)-5-metilisossazol-4-carbossammide come antagonisti della sostanza P. Nessuno di questi brevetti rivendica derivati arilpiperazinilici attivi a livello del recettore adrenergico α1.

La presente invenzione riguarda la classe strutturale delle N-(fenilsostituite)-Ν'-[ω-(5-metil-3-fenil-4-isossazolcarbonilammino)alchil]piperazine. I composti di questa classe sono dotati di forte selettività' nei confronti del recettore adrenergico α1a, in particolare per quanto riguarda il recettore 5-HT1A, ed una migliore uroselettivita' in vivo anche rispetto al composto A, con effetti notevoli sul rilassamento dell'uretra prostatica ed un'attività' molto scarsa nell'abbassamento della pressione arteriosa. Tale profilo di attività' indicherebbe un uso piu' sicuro dei composti dell'invenzione nella terapia delle sindromi ostruttive delle basse vie urinarie, compresa l'iperplasia prostatica benigna (IPB), senza effetti collaterali associati ad attività' ipotensiva.

RIASSUNTO DELL’INVENZIONE

L'invenzione prevede composti di formula generale I

dove :

R rappresenta un gruppo alcossi, polifluoroalcossi, idrossi o trifluoro metansolfonilossi;

R1 e R2 rappresentano ciascuno separatamente un atomo di idrogeno o alogeno o un gruppo polifluoroalcossi o alcossi;

R3 rappresenta uno o piu' sostituenti costituiti da un atomo di idrogeno o alogeno od un gruppo alchile, alcossi, nitro, ammino, acilammino, ciano, alcossicarbonil, carbossammido ;

R4 rappresenta un atomo di idrogeno o un gruppo alchile; ed

n e' 0, 1 o 2.

L'invenzione prevede inoltre gli N-ossidi ed i sali farmaceuticamente accettabili di questi composti.

I gruppi alchili preferiti che possono essere rappresentati da R3 sono gruppi alchili inferiori, preferibilmente il gruppo metile. I gruppi alcossi preferiti che possono essere rappresentati da R, R1 , R2 ed R3 sono gruppi alcossi inferiori, preferibilmente il gruppo metossi. I gruppi polifluoroalcossi preferiti che possono essere rappresentati da R, R1 e R2 sono gruppi trif luorometossi o 2,2,2-trifluoroetossi. Il valore preferito di n e' 1.

L'invenzione riguarda inoltre le composizioni farmaceutiche che comprendono un composto di formula generale I o un N-ossido o sale farmaceuticamente accettabile di tale composto, miscelati con un diluente o veicolo farmaceuticamente accettabili.

Sotto un altro aspetto, l'invenzione riguarda i metodi per prevenire selettivamente le contrazioni (comprese le contrazioni indotte da noradrenalina) dell'uretra e delle basse vie urinarie, senza influenzare sostanzialmente la pressione arteriosa, mediante somministrazione ad un mammifero (compreso l'uomo) che necessiti di tale trattamento in quantità' efficaci per l'impiego particolare, di uno o piu' composti selezionati di formula generale I.

Sotto un ulteriore aspetto, l'invenzione riguarda metodi per bloccare i recettori α1, immettendo nell'ambiente di tali recettori, per esempio nel mezzo extracellulare, (o somministrando a un mammifero che possieda tali recettori) una quantità' efficace di un composto dell'invenzione, curando in tal modo i disturbi associati ad una superattivita' di questi recettori.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Tutti i brevetti, le domande di brevetto ed i riferimenti bibliografici richiamati in questa domanda si considerano incorporati per citazione nella loro interezza. L'attività' antagonistica adrenergica dei composti dell'invenzione li rende efficaci come agenti operanti sui tessuti organici particolarmente ricchi di recettori adrenergici α1 (come la prostata e l'uretra). Di conseguenza, i composti antiadrenergici dell'invenzione, accertati tali sulla base del loro profilo di legame recettoriale, possono costituire efficaci agenti terapeutici per il trattamento, per esempio, dei problemi di minzione associati a disturbi ostruttivi delle basse vie urinarie, compresa senza limitazioni l'iperplasia prostatica benigna (IPB).

L'IPB e' un patologia progressiva, caratterizzata da un ingrossamento nodulare del tessuto prostatico che determina l'ostruzione dell'uretra. Ciò' provoca un aumento della frequenza della minzione, nicturia, un mitto debole ed esitazione o ritardo dell'inizio del flusso urinario. Le conseguenze croniche dell 'IPB possono comprendere l'ipertrofia della muscolatura liscia della vescica, uno scompenso della vescica ed un aumento dell'incidenza delle infezioni delle vie urinarie. Le proprietà' biochimiche, istologiche e farmacologiche specifiche dell'adenoma prostatico che causa l'ostruzione dell'uscita vescicale non sono ancora note. Tuttavia, l'insorgenza dell'IPB e' considerata un fenomeno inevitabile dell'invecchiamento della popolazione maschile. L'IPB e' riscontrabile nel 70% circa dei maschi con piu' di 70 anni. Attualmente, il metodo elettivo specificato nel mondo intero per il trattamento dell'IPB e' l'intervento chirurgico. Un'alternativa farmacologica all'intervento chirurgico e' chiaramente molto auspicabile. Le limitazioni dell'intervento chirurgico per il trattamento dell'IPB sono il tasso di morbilità' di una metodica operatoria nell'uomo anziano, la persistenza o recidiva di sintomi ostruttivi e irritanti, nonché' il rilevante costo dell'intervento.

I recettori adrenergici a (McGrath J.C. et al., Med. Res. Rev. £, 407-533 (1989)) sono proteine neurorecettoriali specifiche localizzate nei sistemi nervosi periferico e centrale su tessuti e organi dell'intero l'organismo. Tali recettori rappresentano importanti bersagli per la regolazione di molte funzioni fisiologiche e quindi rappresentano bersagli importanti della ricerca farmacologica. Infatti, negli ultimi 40 anni sono stati realizzati molti principi attivi α-adrenergici. Ne sono esempi clonidina, fenossibenzammina e prazosin, terazosin, alfuzosin, doxazosin, tamsulosin (terapia dell'ipertensione), nafazolina (decongestionante nasale) e apraclonidina (per curare il glaucoma). I principi attivi a-adrenergici possono essere suddivisi in due classi distinte: gli agonisti (clonidina e nafazolina sono agonisti), che imitano le proprietà' di attivazione recettoriale del neurotrasmettitore endogeno noradrenalina, e gli antagonisti (fenossibenzammina e prazosin, terazosin, alfuzosin, doxazosin e tamsulosin sono antagonisti), che agiscono bloccando gli effetti della noradrenalina. Molti di questi principi attivi sono efficaci, ma producono anche effetti collaterali indesiderati (per esempio, la clonidina provoca secchezza della bocca e sedazione oltre ai suoi effetti antiipertensivi) .

I suddetti agonisti sono selettivi per il recettore adrenergico a2 mentre la maggior parte degli antagonisti sono selettivi per il recettore adrenergico α1, ad eccezione della tamsulosina che dimostra una notevole affinità' anche per il recettore 5-HTIA. Molti dei citati antagonisti α1 sono attualmente impiegati per la terapìa dell'IPB, ma, a causa della loro scarsa uroselettivita’, tendono a provocare effetti collaterali di tipo cardiovascolare.

Recenti studi farmacologici, biochimici e di legame con leganti radioattivi mettono in luce tre diversi sottotipi del recettore α1 dotati di elevata affinità' per il prazosin, ossia α1A- (α1a-), α1B- (α1b-) e α1D- (α1d-), con i deponenti minuscoli usati per i recettori ricombinanti e i deponenti maiuscoli per i recettori dei tessuti nativi (Hieble P. et al., Pha.rma.col . Rev. £7, 267-270, (1995)). Negli studi funzionali sono stati riconosciuti anche recettori α1 con bassa affinità' per il prazosin, chiamati recettori a1L (Flavahan N.A. et al., Trends Pharmacol . Sci . 7, 347-349, (1986); Muramatsu et al., Pharmacol. Conmt. 6, 23-28, (1995)).

Numerosi studi dimostrano la presenza di questi sottotipi del recettore adrenergìco α1 nei tessuti delle basse vie urinarie (Andersson K.E., 4<th >International Consultation in Benign Prostatlc Hyperplasia (BPH)" , Parigi, 2-5 luglio 1997, pag.

601-609).

Numerosi studi dimostrano che la prostata umana riceve innervazione sia dal sistema nervoso simpatico sia da quello parasimpatico.

I nervi adrenergici sono ritenuti responsabili del tono della muscolatura liscia prostatica mediante rilascio della noradrenalina, con stimolazione dei recettori adrenergici a2 che mediano la contrazione. Circa il 50% della pressione uretrale totale nei pazienti affetti da IPB può' essere dovuto al tono muscolare mediato dai recettori adrenergici α1. Gli studi funzionali evidenziano la presenza di importanti funzioni recettoriali adrenergiche nel tessuto prostatico adenomatoso e capsulare. Studi clinici con il prototipo degli antagonisti selettivi dei recettori adrenergici α1, il prazosin, ribadiscono il ruolo fondamentale dei recettori adrenergici α1 nel governo del tono della muscolatura liscia prostatica. Ciò' e' confermato anche in laboratorio da studi che dimostrano come, sebbene nella prostata umana possano essere trovati sia il recettore adrenergìco α1 sia quello a2, le proprietà' contrattili siano mediate principalmente dai recettori adrenergici α1. Molti studi clinici confermano che il blocco dei recettori adrenergici α1 migliora i sintomi nelle basse vie urinarie (SBVU), sia del tipo irritativo sia di quello ostruttivo, nei pazienti affetti da IPB.

E' stata ipotizzata la presenza nella prostata umana di due distinti sottotipi del recettore adrenergìco α1, uno con elevata (α1H) ed uno con scarsa (α1L) affinità' per il prazosin. Tutti e tre i sottotipi di recettore adrenergìco α1 dotati di affinità' elevata trovati negli studi di clonazione molecolare sono stati individuati nel tessuto stromale prostatico. Il sottotipo α1a risulta essere quello prevalente, rappresentando circa il 60-85% della popolazione di recettori adrenergici α1. Riscontri recenti fanno ritenere che possano esserci differenze di popolazione di sottotipi tra la prostata normale e quella iperplastica, con un rapporto tra sottotipi α1a:α1b:α1d di 85:1:14 nel tessuto affetto da IPB e 63:6:31 in quello non affetto.

E' stato trovato che il recettore adrenergico media la risposta contrattile della prostata umana in vitro. Ford A.P.D.W. et al., Br. J. Pharmacol. 114, 24 P (1995) hanno trovato che il recettore adrenergico potrebbe non mediare la risposta contrattile alla noradrenalina, e propongono come candidato il recettore adrenergico α1L. Le scoperte di Kenny B.A. et al., Br. J. Pharmacol . 118 , 871-878 (1996), suffragano l'opinione che il recettore adrenergico α1L, che sembra condividere molte delle caratteristiche del recettore adrenergico α1A, medi la risposta contrattile della prostata umana.

D'altro canto, e' stato anche ipotizzato che il recettore adrenergico e quello α1L possano rappresentare forme farmacologiche distinte dello stesso recettore.

L'affinità' dei composti dell'invenzione per ciascun recettore può' essere valutata mediante dosaggio del legame recettoriale, per esempio nel modo seguente:

(1)sottotipi del recettore adrenergico α1: usando il legante specifico <3>H-prazosin, conformemente a Testa R. et al., Pharmacol. Comm. 6, 79-86, (1995);

(2)recettori serotoninergici 5HT1A: usando il legante specifico <3>H-8-OH-DPAT conformemente a Fargin A. et al., Nature 335, 358-360, (1988).

Il recettore adrenergico α1L non e' ancora clonato e, di conseguenza, l'affinità' funzionale dei composti dell'invenzione su questo sottotipo può' essere valutata ricorrendo a un preparato di organo isolato come descritto da Testa R. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 281, 1284-1293, (1997).

La sperimentazione in vitro dei composti di questa invenzione sui suddetti recettori e' illustrata negli Esempi 8 e 9 seguenti.

I principi attivi con attività' antagonistica α1-adrenergica attualmente usati per la terapia sintomatica dell'IPB sono scarsamente selettivi nei confronti dei sottotipi e tendono a provocare rilevanti effetti collaterali a causa della loro attività' ipotensiva.

Si avverte quindi la necessita' di disporre di antagonisti selettivi che non espongano il paziente affetto da IPB agli effetti collaterali di tali terapie, in particolare di tipo cardiovascolare.

L'elevatissima uroselettivita' dei composti della presente invenzione e' stata verificata nel modello del cane riportato nell'Esempio 10, in cui viene dimostrata la loro efficacia nel contrastare le contrazioni dell'uretra prostatica in presenza di effetti molto limitati sulla pressione arteriosa rispetto al Composto A e a un altro ben noto antagonista α1, il prazosin.

Di conseguenza, uno dei principali oggetti della presente invenzione e' fornire un metodo per il trattamento dell'IPB in grado di evitare tutti gli inopportuni effetti collaterali dovuti all'ipotensione acuta.

Un altro oggetto della presente invenzione e' fornire composizioni farmaceutiche comprendenti composti isossazolici che siano antagonisti selettivi del recettore adrenergico α1a(L), composizioni efficaci per il trattamento dell'IPB.

E' pure un oggetto della presente invenzione fornire un metodo di trattamento dell'IPB per mezzo di composti isossazolici che siano antagonisti selettivi del recettore adrenergico α1a(L) .

Un altro aspetto dell'invenzione e' l'uso di nuovi composti per abbassare la pressione endooculare, inibire la sintesi del colesterolo, ridurre il dolore mediato dal sistema simpatico, e per il trattamento dell'aritmia cardiaca e delle disfunzioni sessuali.

Altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti a chi e' esperto nell'arte dalla seguente descrizione dettagliata e dalle rivendicazioni .

SINTESI DEI COMPOSTI DELL'INVENZIONE

I composti dell'invenzione possono generalmente essere preparati come segue:

Schema 1

La condensazione diretta del composto 1 con i derivati ω-amminoalchilici 2 (Schema 1) produce i composti dell'invenzione. La condensazione può' essere eseguita in presenza di un agente condensante (per esempio dicicloesilcarbodiimmide o dietil cianofosfonato) opzionalmente in presenza di un agente promotore (per esempio N-idrossisuccinimmide, 4-dimetilamminopiridina o N, N'-carbonildiimidazolo) in solvente aprotico o clorurato (per esempio dimetilformammide o cloroformio) a -10/140°C (Albertson N.F., Org. React . 12, 205-218 (1962); Doherty A.M. et al., J. Med. Chem. 35, 2-14 (1992); Ishihara Y. et al., Chem. Pharm. Bull . 39, 3236-3243 (1991)). In alcuni casi gli intermedi attivati esterei e ammidici (come gli O-(N-succinimmidil)esteri e le acilimmidazolidi) possono essere isolati e fatti ulteriormente reagire con 2 per essere convertiti nelle corrispondenti ammidi (I) in solvente aprotico o clorurato a 10/100°C. Questo tipo di condensazione e' ben illustrata negli Esempi. Un altro intermedio attivato che può' essere usato e' l'anidride mista di 1, ottenibile facendo reagire 1 con un alchil cloroformiato in presenza di un'ammina terziaria (per esempio trietilammina o N-metilmorfolina), poi fatta reagire con 2 a 0/80°C; opzionalmente si può' addizionare un agente promotore (per esempio 1-idrossipiperidina) prima dell'addizione dell'ammina (Albertson N.F., Org. React . 12, 157 (1962)).

Alternativamente la condensazione può' essere eseguita senza solvente a 150-220°C (Mitchell J.A. et al., J. Aia. Chem. Soc. 53, 1879 (1931)) o in solvente etereo ad alto punto di ebollizione (per esempio diglyme).

La condensazione può' essere inoltre eseguita mediante preparazione ed isolamento facoltativo di derivati reattivi di 1, quali gli alogenuri acilici. La preparazione e l'uso di questi ultimi derivati sono ben documentati nella letteratura e noti a chi e' esperto nell'arte.

Si possono usare anche derivati di 1 meno reattivi quali gli alchil esteri, che possono a loro volta essere convertiti in I in presenza di un agente condensante (per esempio trimetilalluminio) in solvente aprotico e/o clorurato (per esempio esano, diclorometano) a -10/80°C, o senza solventi a 80/180°C (Weinreb S. M. et al., Tetrahedron Lett . 4171 (1977); Lipton M. F. et al., Org. Synth. 59, 49 (1979)).

Con gli stessi metodi di condensazione riportati sopra ed usando H2NCH2 (CH2)nCH2X (con X = alogeno o OH) come reagente, 1 può' essere trasformato in 3. Nel caso di X =» OH, si esegue poi la conversione del gruppo alcolico in un idoneo gruppo uscente con metodi ben noti a chi e’ esperto nell'arte. I composti 3 (con X = gruppo uscente come alogeno o gruppo alchil/arilsolfonilossi) possono essere successivamente fatti reagire con una idonea fenilpiperazina 4. La sostituzione nucleofila e' eseguita preferibilmente, ma non necessariamente, a una temperatura compresa tra 20 e 200°C in solvente polare come dimetilformammide, acetonitrile e metanolo, o senza alcun solvente, in genere in presenza di una base come potassio carbonato. Si veda anche il capitolo di Gibson in Patai: "The Chemistry of thè Aramino Group", pag. 45, Wiley Int. Sci., N.Y., (1968).

La preparazione dei composti 2 e' descritta nella letteratura ed e' ben nota a chi e' esperto nell'arte, e prevede la sostituzione nucleofila di una fenilpiperazina 4 su una N- (ω-aloalchil)ftalimmide o idoneo ω-aloalchilnitrile o ammide col metodo descritto sopra per la condensazione dei composti 3 e 4 o mediante addizione di alchilnitrile o ammide α,β-insaturi in idoneo solvente (per esempio acetonitrile, Ν,Ν-dimetilformammide, un solvente clorurato o altro solvente polare aprotico), ad una temperatura compresa tra 0°C e la temperatura di riflusso del solvente. La successiva deprotezione standard del gruppo ftalimmido e la riduzione del gruppo ammido o ciano producono i composti 2.

I composti I dove R e' un gruppo trifluorometansolfonilossi possono essere sintetizzati partendo dai composti I dove R e' un gruppo idrossi mediante procedure note che prevedono l'impiego di anidride trifluorometansolfonica o N-feniltrifluorometansolfonimmide in solventi aprotici quali, per esempio, 1,2-dicloroetano o altri solventi clorurati, toluene, a temperatura compresa tra -20°C e la temperatura dì riflusso del solvente (Hendìckson J.B. et al., Tetrahedron Letters 4607-4610 (1973)).

Gli N-ossidi dei composti I possono essere sintetizzati mediante semplici procedimenti di ossidazione noti a chi e' esperto nell'arte. Il procedimento di ossidazione descritto da Brougham P., Synthesis, 1015-1017 (1987) consente di differenziare i due atomi di azoto dell'anello piperazinico e di ottenere sia gli N-ossidi sia l'N,N'-diossido .

La preparazione delle fenilpiperazine 4, non ancora note nella letteratura, e' ben documentata nella parte sperimentale ed usa procedure di sintesi ben note a chi e' esperto nell'arte, che prevedono la sintesi dell'idonea anilina mediante reazioni standard e la successiva ciclizzazione con bis-(2-cloroetilammina) per produrre la piperazina seguendo il metodo di Prelog V. et al., Collect . Czech. Chem. Cairn. 5, 497-502 (1933)) e le sue variazioni (Elworthy T. R., J. Med. Chem. 40, 2674-2687 (1997)).

SINTESI DETTAGLIATA

Vengono di seguito riportati alcuni Esempi a solo titolo illustrativo dell'invenzione cosi' come descritta nel testo senza alcuno scopo di limitazione della stessa.

ESEMPIO 1

N-{3- [4-(5-Cloro-2-metossifenil)-1-piparazinil]propil)-5-matil-3-fenilisossazol-4-oaxbossammide

a) 1-(5-Cloro-2-metossifenil)-4-[3-(N-ftalimmido )propil ]piperazina (Composto 1A) Si agita a ricadere per 8 ore una miscela di 28,64 g di 1-(5-cloro-2-

metossifenil)piperazina, 44,6 g di potassio carbonato anidro e 33,65 g di

N- (3-bromopropil)ftalimmide in 250 mL di acetonitrile. Dopo raffreddamento a

temperatura ambiente, si aggiungono sotto agitazione 800 mL di acqua e si filtra la

sospensione ottenuta per aspirazione ottenendo un solido giallognolo, che si lava

con 300 mL di acqua e si cristallizza da metanolo per ottenere 46,5 g (91%) del

composto del titolo, che fonde a 131-133°C.

Spettro <1>H-HMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shlft (δ)

7.78-7, 82 m 2H H3, H6 ftallmmidici

7.64-7, 78 m 2H H4, H5 ftallmmidici

6, 92 dd 1H H4 metossi fenilico

6.65-6, 78 m 2H H3, H6 metossi fenilici

3, 81 s 3H CH3O

3, 71 -3, 89 m 2H CH2N (CO) 2

2.78-3, 00 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 40-2, 65 m 6H 2 CH2 piperazinici, CH2CH2CH2N (CO) 2

1, 80-2, 03 m 2H CH2CH2CH2

b) 1- ( 3-Amminopropil) -4- (5-cloro-2-metossifenil)piperazina tricloridrato · 2 , 15

H2O (Composto 1B)

Si agita a ricadere per 3,5 ore una soluzione di 20,7 g del Composto 1A e 8,6 mL di

idrazina idrato all'85% in 300 mL di etanolo 95%. Successivamente si raffredda la

miscela di reazione a temperatura ambiente, si diluisce con 400 mL di acqua, si

acidifica con acido cloridrico al 37% (pH = 1) e si agita per 0,5 ore. Si raccoglie

il solido precipitato per filtrazione e si lava con acido cloridrico 1 N seguito da

acqua. Si concentra il filtrato per evaporazione sotto vuoto, si filtra, si rende

basico per addizione di sodio idrossido al 35% a 0-5°C e si estrae con etere

etilico. Si lava la fase organica con salamoia, si essicca su sodio solfato e si fa evaporare fino a secchezza sotto vuoto per ottenere 13,6 g (96%) del composto del titolo come base. L'acidificazione della soluzione della base in cloroformio con piu' di tre equivalenti di acido cloridrico etanolico 3 N seguita da evaporazione fino a secchezza sotto vuoto e cristallizzazione del residuo da etanolo:etere etilico 10:3 produce il composto del titolo, che fonde a 200-202°C.

Spettro <1>H-HMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (δ)

11, 20-11, 50 sa 1H NH<+>

8, 10-8, 40 sa 3H NH3<+>

6, 85-7, 10 m 3H H3, H4, H6 fenilici

5, 10 sa 5, 3H NH <+>, 2, 15 H2O

P, 79 s 3H CH3O

3, 35-3, 65 m 4H 2 CH2 piperazinici

3, 03-3, 35 in 6H 2 CH2 piperazinici , CH2CH2CH2NH3<+>

2, 80-3, 03 m 2H CH2CH2CH2NH3<+>

1, 95-2, 22 m 2H CH2CH2CH2NH3<+>

c) N-(3-[4-(5-Cloro-2-metossifenil)-1-piperazinil ]propil}-5-metil-3-fenil

isossazol-4-carbossammide

Ad una miscela di 1,22 g di acido 3-fenil-5-metilisossazol-4-carbossilico, 1,87 g del composto 1B base e 30 mL di dimetilformammide anidra, si aggiungono sotto agitazione a 0-5°C 1,08 g dì dietil cianofosfonato al 93% e 0,92 mL di trietilammina. Si lascia salire la temperatura a 20-25°C e dopo 3,5 ore di agitazione si versa la miscela in 300 mL di acqua e si estrae con etile acetato. Si lavano le fasi organiche riunite con sodio carbonato acquoso al 5% e acqua. Dopo essiccamento su sodio solfato, si elimmina il solvente sotto vuoto. Si cristallizza il grezzo da etanolo per ottenere 2,11 g (75%) del composto del titolo che fonde a 139-142 °C .

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (δ)

7, 60-7, 70 m 2H H2, H6 fenilici

7, 45-7, 55 m 3H H3, H4, H5 fenilici

6, 95 dd 1H H4 metossifenilico

6, 85 d 1H H6 metossifenilico

6, 75 1H H3 metossifenilico

6, 25 1H NH

3, 82 3H OCH3

3, 40 q 2H NHCH2

2, 80-2, 95 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 69 s 3H CH3

2, 40-2, 55 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 30 t 2H CONHCH2CH2CH2N

1 , 55-1, 70 m 2H CH2CH2CH2

ESEMPIO 2

N-{3-[4- (5-Cloro-2-idrossifenil)-1-piperazinil]propil}-5-metil-3-fenilisossazol-4-

carbossammide

a) 1-(5-Cloro-2-idrossifenil)piperazina dibromidrato (Composto 2A)

Si agita a ricadere per 30 ore una sospensione di 5,5 g di 1-(5-cloro-2-

metossifenil)piperazina in 40 mL di acido bromidrico al 62%. Dopo raffreddamento a

temperatura ambiente, si filtra la miscela sotto vuoto e si lava il solido su

imbuto con acetone ottenendo 6,02 g del composto del titolo. P.f. > 270°C

(etanolo).

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (δ)

9, 35-9, 80 sa 2H NH2 <+>

8, 60-9, 05 sa 2H NH <+>, OH

6, 70-6, 97 m 3H CH aromatici

3, 00-3, 38 m 8H CH2 pipera zini ci

b) N-(3-Cloropropil)-3-fenil-5-metilisossazol-4-carbossammide (Composto 2B)

Il composto del titolo e' sintetizzato seguendo la procedura descritta per il composto dell'Esempio 1c, ma sostituendo 3-cloropropilammina cloridrato al Composto 1B e raddoppiando la quantità' di trietilammina. Versando la miscela di reazione in acqua ghiacciata e filtrando il solido precipitato, che si lava su imbuto con una miscela 2:1 di acqua:dimetilformammide seguita da acqua, si ottiene, dopo essiccazione, il composto del titolo puro. P.f. 122-124°C.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) / Solvente: CDCl3; Chemical shift (δ)

7, 45-7, 60 m 5H CH fenilici

5, 50 sa 1H NH

3, 30-3, 45 m 4H CH2CH2CH2

2, 70 s 3H CH3

1, 80-1, 90 m 2H CH2CH2CH2

c ) N- {3- [4- (5-Cloro-2-idrossifenil)-1-piperazinil]propil)-5-metil-3-fenil

isossazol-4-carbossammide

Si riscalda a 160°C per 20 minuti una miscela di 0,28 g del Composto 2B, 0,21 g del Composto 2A e 0,14 g di potassio carbonato. Dopo raffreddamento a temperatura

ambiente, si riprende la miscela con 8 mL di cloroformio, e si elimmina la materia inorganica mediante filtrazione. Si fa evaporare il filtrato fino a secchezza e si purifica mediante cromatografia flash {cloroformio:metanolo 97,5:2,5) per ottenere 0,32 g (71%) del composto del titolo. P.f. 92-98°C.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (S)

7, 60-7, 75 m 2H H2 , H6 fenilici

7, 45-7, 60 m 3H H3, H4, R5 fenilici

7, 00-7, 10 m 2H H4, H6 Idrossifenilici

6, 85 d 1H H3 Idrossifenilico

6, 70 sa 1H OH

6, 02 t 1H NH

3, 35 q 2H NHCH2

2, 62-2, 75 m 7H 2 CH piperazinici e CH3

2,38-2,50 m 4H 2 CH2 piperazinici

2,30 t 2H CONHCH2CH2CH2N

1,55-1,70 m 2H CH2CH2CH2

ESEMPIO 3

5-Metil-3-fenil-N-{3- 14-[2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]-1-piperazinil]propil}-isossazol-4-carbossammide

Questo composto si prepara come descritto nell'Esempio 2c, sostituendo l-[2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil))piperazina (preparata come descritto in EP 748800, Bantle G.W. et al.) al Composto 2A. Si purifica il grezzo mediante cromatografia flash (etile acetato / metanolo 95:5) per ottenere il composto del titolo (47%). P.f.

124-125°C.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz); Solvente: CDCl3; Chemical shlft (δ)

7,60-7,70 m 2H H2, H6 fenilici

7,40-7,55 m 3H H3, H4, H5 fenilici

6,88-7,05 m 4H CH trifluoroetossifenilici

6.35 t 1H NH

4.35 q 2H OCH2CF3

3,40 q 2H NHCH2

2,80-2,95 m 4H 2 CH2 piperazinici

2,65 s 3H CH3

2,30-2,45 m 4H 2 CH2 piperazinici

2,30 t 2H CONHCH2CH2CH2N

1,55-1,70 m 2H CH2CH2CH2

ESEMPIO Λ

N-{3-[4- [2-Metossi-5-(2,2,2-trifluoroetossifenil)]-1-piperazinil]propil}-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide

a) 1-(t-Butossicarbonil)-4-(5-idrossi-2-metossifenil)piperazina (Composto 4A) Si fa evaporare fino a secchezza sotto vuoto una soluzione di 8 g di 1-(5-idrossi2-metossifenil)piperazina dibromidrato (preparato come descritto in US 5605896, Leonardi A. et al.) e 3,17 g di potassio carbonato anidro in 30 mL di acqua. Si aggiungono al residuo 100 mL di tetraidrofurano anidro e 5,18 g di di-t-butile dicarbonato (BOC2O) e si agita la miscela a temperatura ambiente per 2 ore, quindi si addizionano 100 mL di tetraidrofurano anidro. Si filtra la sospensione e si elimmina il solvente sotto vuoto. Si scioglie il residuo in 200 mL di cloroformio, si lava la soluzione con 3 x 50 mL di sodio bicarbonato al 5%, 2 x 50 mL di acqua e si essicca su sodio solfato. Si elimmina il solvente a pressione ridotta e si purifica il residuo mediante cromatografia flash (etere di petrolio / etile acetato 75:25) per ottenere 1,91 g (28,7%) del Composto 4A e 1,58 g (35,7%) di l-(tbutossicarbonil)-4- [5-(t-butossicarbonilossi)-2-metossifenil]piperazina. Si lascia per una notte a temperatura ambiente una soluzione di questo sottoprodotto, 40 mL di metanolo e 6 mL di sodio idrossido IN. Si neutralizza la miscela con acido acetico; si elimmina il solvente a pressione ridotta e si scioglie il residuo in 40 mL di cloroformio. Dopo lavaggio con 3 x 10 mL di acqua, si essicca la fase organica su sodio solfato e si fa evaporare il solvente sotto vuoto per recuperare altri 1,15 g (17,2%) del Composto 4A (tot. 45,9%).

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl 3; Chemical shift (δ)

6, 70 d 1H H3 fenilico

6, 45-6, 53 m 2H H4, H6 fenilici

5. 77 sa 1H OH

3. 78 s 3H CH3O

3, 48-3, 68 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 82-3, 05 m 4H 2 CH2 piperazinici

1, 48 s 9H (CH3) 3C

b) 1-(t-Butossicarbonil)-4-[2-metossi-5-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]piperazina (Composto 4B)

Si riscalda a ricadere per 16 ore sotto agitazione una miscela di 2,83 g del Composto 4A, 6,05 g di cesio carbonato e 2,95 g di 2,2,2-trifluoroetile ptoluensolfonato in 60 mL di acetonitrile. Si fa evaporare il solvente a pressione ridotta. Si aggiungono al residuo 90 mL di salamoia e si estrae la miscela con 3 x 40 mL di etile acetato. Si lava la fase organica con 3 x 20 mL di acqua e 20 mL di salamoia, e si essicca su sodio solfato. Si elimmina il solvente a pressione ridotta e si purifica il residuo mediante cromatografia flash (etere di petrolio / etile acetato gradiente da 95:5 a 80:20). Si elimminano i solventi sotto vuoto per ottenere 1,86 g (52%) del Composto 4B in forma di solido bianco. P.f. (98) 102-105°C.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shlft ( δ )

6, 77 d 1H H3 fenilico

6, 45-6, 63 m 2H H4 , H6 fenilici

4, 28 q 2H CF3CH2O

3, 84 s 3H CH3O

3, 53-3, 68 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 90-3, 06 m 4H 2 CH2 piperazinici

1, 48 s 9H (CH3) 3C

c) 1-[2-Metossi-5-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]piperazina ■ 1,9 HC1

(Composto 4C)

Ad una soluzione di 1,17 g del Composto 4B in 40 ml di diclorometano anidro si aggiunge per gocciolamento sotto agitazione a 3-5°C una soluzione di 2,42 mL di acido trifluoroacetico in 30 mL di diclorometano anidro. Si lascia la miscela per una notte a temperatura ambiente, si lava con 2 x 30 mL di sodio idrossido 2N e si estrae con 3 x 15 mL di acido cloridrico 2N. Si lava la fase acido acquoso con 2 x 20 mL di etere etilico, si alcalinizza con sodio idrossido al 37% a 5-10°C e si

estrae con 3 x 30 mL di etere etilico. Si essicca la fase organica su sodio solfato

e si elimmina il solvente sotto vuoto per ottenere 0,78 g (89%) della base del

composto 4C in forma di olio denso. Si riprende una soluzione di questa base in

etere etilico con carbone, si filtra e si acidifica per addizione di acido

cloridrico 3,6N in etere etilico per ottenere il sale cloridrato che viene

recuperato per filtrazione e cristallizzato da acetonitrile ed etanolo (7,5:1) a

dare il campione analitico. P.f. (188) 202-208°C (dee.).

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (S)

9, 18 sa 1, 9H NH2

6, 90 d 1H H3 fenilico

6, 67 dd 1H H4 fenilico

6, 59 d 1H H6 fenilico

6, 11 sa 1H N

4, 66 q 2H CF3CH2O

3, 74 s 3H CH3O

3, 18 sa 8H CH2 piperazinici

d) N-(3-(4-[2-Metossi-5- (2, 2, 2-trifluoroetossi)fen.il]-1-piperazinil]propil}-5-

metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide

Questo composto di prepara come descritto nell'Esempio 2c, sostituendo il Composto

4C al Composto 2A. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, si purifica il

grezzo mediante cromatografia flash (diclorometano / ammoniaca 2N in metanolo

97,5:2,5) per ottenere il composto del titolo (54%). P.f. 125°C.

Spettro (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (5)

7, 65-7, 75 m 2H H2, H6 fenilici

7.45-7, 55 m 3H H3, H4 , H5 fenilici

6, 75 d 1H H3 trifluoroetossifenilico

6.45-6,55 m 2H H4 , H6 tri fluoroetossi fenilici

6, 20 t 1H NH

4, 30 q 2H OCH2CF3

3, 80 s 3H OCH3

3, 35 q 2H NHCH2

2, 80-2, 95 m 4H 2 CH2 piperazinici

2 , 65 s 3H CH3

2, 35-2, 48 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 27 t 2H CONHCH2CH2CH2N

1, 52-1, 68 m 2H CH2CH2CH2

ESEMPIO 5

N-{3- [4- [5-Fluoro-2- (2 ,2 ,2-trifluoroatossi) fenil]-1-piperazinil]propil} -5-metil-3-

fenilisossazol-4-carbossammide

a) 5-Fluoro-2-(2,2,2-trifluoroetossi)nitrobenzene (Composto 5A)

Si riscalda a 100°C per 4 ore sotto agitazione una miscela di 3,14 g di 4-fluoro-2-nitrofenolo, 13 g di cesio carbonato e 20 mL di dimetilformammide anidra. Dopo questo tempo si aggiungono 6,65 g di 2,2,2-trifluoroetil p-toluensolfonato e si agita la miscela alla stessa temperatura per 40 ore. Successivamente si elimmina il solvente a pressione ridotta a 35°C e si aggiungono al residuo 50 mL di acqua. Si acidifica la miscela con acido cloridrico al 37% e si estrae con 3 x 40 mL di etile acetato. Si lava la fase organica con 20 mL di salamoia, si essicca su sodio solfato e si fa evaporare fino a secchezza sotto vuoto. Si purifica il residuo mediante cromatografia flash (etere di petrolio / etile acetato 100:7) per ottenere 1,53 g (32%) del Composto 5A in forma di olio.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (δ)

7, 65 dd 1H H6

7, 32 ddd 1H H4

7, 16 dd 1H H3

4, 42 q 2H CH2

b) 5-Fluoro-2-(2,2,2-trifluoroetossi)anilina (Composto 5B)

Si agita per 14 ore a 20-25°C una miscela di 0,66 g del Composto 5A e 0,07 g di nickel Raney in 20 mL di etile acetato; si separa la fase organica e si estrae la miscela con 2 x 40 mL di etile acetato. Si lavano le fasi organiche riunite con 20 mL di salamoia, si essicca su sodio solfato e si fa evaporare fino a secchezza sotto vuoto per ottenere 0,52 g (90,6%) del Composto 5B in forma di olio arancione. Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shlft (δ)

6, 70 dd 1H H6

6,28-6, 50 m 2H H3 e H4

4, 32 q 2H CH2

3, 92 sa 2H NH2

c) 1-[5-Fluoro-2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]piperazina (Composto 5C)

Si riscalda a ricadere per 32 ore sotto azoto sotto agitazione una miscela di 0,52 g del Composto 5B, 0,45 g di bis- (2-cloroetil)ammina cloridrato, 0,5 g di potassio ioduro, 0,34 g di potassio carbonato anidro e 20 mL di n-butanolo. Si elimmina il solvente a pressione ridotta. Si riprende il residuo con 10 mL di acqua e 10 mL di sodio carbonato acquoso al 20% e si estrae con 2 x 30 mL di etile acetato. Si lava la fase organica con salamoia, si essicca su sodio solfato e si fa evaporare fino a secchezza sotto vuoto. Si purifica il residuo mediante cromatografia flash (cloroformio:ammoniaca 2N in metanolo gradiente da 100:3 a 100:5) per ottenere 0,1 g (14%) del Composto 5A in forma di olio.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shlft (δ)

6, 80-6, 93 m 1H H3

6, 55-6, 71 m 2H H6, H4

4, 36 q 2H CH2CF3

3, 05 s 8H CH2 piperazinici

2, 38 s 1H NH

d) N-(3-[4-[5-Fluoro-2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]-1-piperazinil]propil}-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide

Questo composto si prepara come descritto nell'Esempio 2c sostituendo il Composto 5C al Composto 2A. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, si purifica il grezzo mediante cromatografia flash (diclorometano / ammoniaca 2N in metanolo 97,5:2,5) per ottenere il composto del titolo (59%). P.f. 123-125°C.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shlft (δ)

7, 60-7, 70 m 2H H2, H6 fenilici

7, 45-7, 55 m 3H H3, H4, H5 fenilici

6.80-6, 90 m 1H H3 trifluoroetossifenilico

6, 55-6, 70 m 2H H4, H6 trifluoroetossifenilici

6, 20 t 1H NH

4, 30 q 2H OCH2CF3

3, 35 q 2H NHCH2

2.80-2, 95 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 65 s 3H CH3

2, 35-2, 45 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 25 t 2H CONHCH2CH2CH2N

1, 50-1, 65 m 2H CH2CH2CH2

ESEMPIO 6

N-{3- [4-[4-Fluoro-2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]-1-piperazinil]propil}-5-metil-3-

f enil isos sazol - 4 -carbo s s ammide

Questo composto si prepara come descritto nell'Esempio 2, sostituendo l-(4-fluoro-2- (2,2,2-trifluoroetossi)fenil]piperazina (preparata come descritto in EP 748800, Bantle G.W. et al.) al Composto 2A. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, si purifica il grezzo mediante cromatografia flash (diclorometano / ammoniaca 2N in metanolo 98:2) per ottenere il composto del titolo (64%). P.f. 112-135°C.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shlft (δ)

7.60-7, 70 m 2H H2, H6 fenilici

7, 45-7, 55 m 3H H3, H4, H5 fenilici

6. 60-6, 85 m 3H H3, H5, H6 trifluoroetossi fenilici

6, 28 t 1H NH

4, 20-4, 40 m 2H OCH2CE3

3, 35 q 2H NHCH2

2, 75-2, 90 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 65 s 3H CH3

2, 35-2, 45 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 25 t 2H CONHCH2CH2CH2N

1 , 50-1, 65 m 2H CH2CH2CH2

ESEMPIO 7

N-{3-[4- (5-Cloro-2-trifluorometansolfonilossi)-1-piperazinil]propil}-5-metil-3-

fenilisossazol-4-carbossammide

Si aggiungono 0,07 mL di trietilaznmina a temperatura ambiente sotto agitazione ad. una miscela di 0,22 g del Composto dell'Esempio 2, 0,18 g di N-feniltriflimmide e 5 mL di diclorometano. Si agita la miscela per 10 giorni; durante questo periodo si aggiungono 2 ulteriori quantità' di N-feniltriflimmide (0,18 e 0,09 g) e di

trietilammina (0,07 e 0,04 mL). Si diluisce la miscela di reazione con 5 mL di diclorometano, si lava con sodio carbonato acquoso al 10%, acqua, si essicca su sodio solfato e si fa evaporare fino a secchezza sotto vuoto. Si purifica il grezzo

mediante cromatografia flash (etile acetato / metanolo 95:5) per ottenere 0,17 g (58%) del composto del titolo puro. P.f. 49-53°C.

Spettro <1>H-NMR (200 MHz) ; Solvente: CDCl3; Chemical shift (δ)

7, 65-7, 75 m 2H H2 , H6 fenilici

7, 50-7, 60 m 3H H3, H4, H5 fenilici

7 , 02-7, 10 m 3H H3, H4, H6 clorofenilici

6, 20 t 1H NH

3, 35 q 2H NHCH2

2, 75-2, 85 m 4H 2 CH2 piperà zini ci

2, 70 s 3H CH3

2, 40-2, 50 m 4H 2 CH2 piperazinici

2, 32 t 2H CONHCH2CH2CH2N

1, 55-1, 70 m 2H CH2CH2CH2

DATI FARMACOLOGICI

ESEMPIO 8

Determinazione dell'affinità' per il recettore adrenergico α1 e serotoninergico 5-HT1A aionati mediante saggio di legame radioreoettoriale

La determinazione dell'affinità' per i sottotipi clonati del recettore adrenergico α1 clonato si esegue con membrane di cellule trasfettate mediante elettroporazione con DNA esprimente i geni che codificano per tutti i sottotipi di recettore adrenergico α1.

La clonazione e l'espressione stabile del gene del recettore adrenergico α1 si eseguono come descritto in precedenza (Testa R. et al., Pharmacol . Comm. 6, 79-86, (1995) e citazioni). Le membrane delle cellule sono incubate in Tris 50 nM pH 7,4 con 0,2 nM di [<3>H]prazosin, in un volume finale di 1,02 mL, per 30 minuti, a 25°C, in assenza o presenza di principi attivi concorrenti (1 pM-10 μΜ). Si determina il legame non specifico in presenza di 10 μΜ di fentolammina. Si arresta l'incubazione mediante addizione di tampone Tris ghiacciato e filtrazione rapida su filtri Schleicher & Schuell GF52 pretrattati con polietileneimmina allo 0,2%.

Si trasfetta stabilmente il codice del clone genomico G-21 del recettore serotoninergico 5-HTm umano in una linea cellulare umana (HeLa) (Fargin A. et al., J. Blol . Chem. 284, 14848-14852 (1989)) e si coltivano le cellule HeLa come monostrati in terreno Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale di vitello e gentamicina (100 μg/rnL), 5% di CO2 a 37°C. Si staccano le cellule dal matraccio di coltura quando la confluenza e' del 95% usando un raschietto cellulare e si lisano in tampone ghiacciato di Tris 5 mM ed EDTA 5 mM (pH 7,4). Si centrifugano gli omogenati a 40.000 x g per 20 minuti e si risospendono le membrane in un piccolo volume di tampone ghiacciato contenente Tris 5 mM ed EDTA 5 mM (pH 7,4) congelando immediatamente e riponendo a -70°C fino al momento dell'uso.

Il giorno del test, si risospendono le membrane cellulari in tampone contenente 50 mM di Tris (pH 7,4), 2,5 mM di MgCl2, 10 μΜ di pargilina (Fargin A. et al., Nature 335, 358-360, (1988)). Si mettono le membrane in incubazione in un volume finale di 1 mL per 30 minuti a 30°C con 1,2 nM di [<3>H]8-OH-DPAT, in assenza o in presenza di molecole da saggiare, si determina il legame non specifico in presenza di 10 μΜ di 5-HT e si ferma l'incubazione per addizione di tampone Tris ghiacciato e filtraggio rapido su filtri Schleicher & Schuell GF52 pretrattati con polietileneimmina allo 0,2%.

Si valuta l'inibizione del legame specifico dei leganti radioattivi da parte dei principi attivi per calcolare il valore di CI50 mediante il programma di interpolazione non lineare della curva Allfit (De Lean A. et al., Am. J. Physiol .

235, E97-E102 (1978)).

Si converte il valore di CI50 in costante di affinità' (Ki) con l'equazione di Cheng Y.C. et al., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108 (1973). Si esprimono i dati come media Ki.

RISULTATI

I composti dell'invenzione evidenziano la potenza e selettività' desiderate a livello dei recettori adrenergici α1a, come riportato nella Tabella 1.

TABELLA 1

Affinità' (Ki, nM) dei diversi composti esamminati per i sottotipi di recettore adrenergico α1 e il recettore 5-HT1A ricombinanti

ESEMPIO 9

Valutazione in vitro dell'antagonismo funzionale per i recettori adrenergici α1L Si valuta l'attività' α1-antagonistica funzionale dei composti in esame contro le contrazioni indotte da noradrenalina (NA) dell'aorta di coniglio pretrattata con cloroetilclonidina (recettore α1L) col metodo di Testa R. et al., J. Pharmacol . Exp. Ther. 281, 1284-1293, (1997). Si sacrificano dei conigli New Zealand maschi adulti per lussazione cervicale. Si asporta l'aorta, si mette in tampone Krebs-Henseleit e si libera per dissezione dal tessuto aderente. Si preparano degli anelli di ciascuna arteria (8 anelli per aorta, larghi circa 4-5 mm) e si sospendono in 20 mL di bagno per organi contenente tampone bicarbonato di Krebs della seguente composizione (mM): NaCl 112,0, KCl 5,0, CaCl2 2,5, KH2PO4 1,0, MgSO4 1,2, NaHCO3 12,0 e glucosio 11,1, si equilibra a 37°C con 95% O2:5% CO2. Si aggiungono al tampone desmetilimiprammina (0,1 pm) e corticosterone (1 μΜ) per bloccare l'assorbimento neuronaie ed extraneuronale di NA, (±)-propanolo (1 pM) per bloccare i recettori adrenergici β e yohimbina (0,1 μΜ) per bloccare i recettori adrenergici a2. Si sottopongono i tessuti a un carico passivo di 2 g e si valuta la tensione creata mediante trasduttori isometrici (Basile 7003).

Si lasciano equilibrare le preparazioni per 60 minuti e poi si trattano ogni trenta minuti con 10 μΜ di NA per 3 volte. Si mettono poi gli anelli aortici in incubatrice con l'agente alchilante cloroetilclonidina (5 x 10<-5 >M) per 30 minuti e si lava poi abbondantemente per tre volte (in 0,5 ore) prima di costruire la curva concentrazione di NA-risposta. Dopo elimminazione della ΝΆ per lavaggio e riequilibramento del tessuto (45 minuti) si aggiunge il principio attivo da esamminare e, dopo 30 minuti, si costruisce una seconda curva concentrazione cumulativa di NA-risposta. Si valuta ogni concentrazione di antagonista con 2-3 anelli aortici di conigli diversi.

Si calcolano i rapporti dei dosaggi (ossia il rapporto tra le concentrazioni di noradrenalina necessaria per produrre la risposta mezzo massimale in presenza e in assenza dell'antagonista in esame) per tutte le concentrazioni dei composti. Si traccia il logaritmo di questi rapporti dei dosaggi -1 rispetto al logaritmo della concentrazione dei composti (tracciato di Schield) per valutare la costante di affinità' Kb.

Nel caso in cui si utilizzino solo una o due concentrazioni del composto in esame, il valore apparente di Kb e' calcolato con la formula Kb = [B]/(RAPPORTO DI D0SAGGI0-1), dove B e' la concentrazione dell'antagonista.

RISULTATI

I composti analizzati evidenziano una buona affinità' per il sottotipo α1L del recettore adrenergico.

I dati sono espressi come pKb nella Tabella 2.

TABELLA 2

Affinità* funzionale dei composti analizzati per il sottotipo α1L del recettore adrenergico

ESEMPIO 10

Effetti sulle contrazioni uretrali (indotte dall'iniezione di noradrenalina e dalla stimolazione del nervo ipogastrico) e sulla pressione arteriosa nel cane dopo somministrazione endovenosa

Gli esperimenti sono condotti con il metodo di Imagawa J. et al., J. Pharmacol . Methods, 22, 103-111 (1989), con modifiche sostanziali, come segue: si anestetizzano dei cani beagle maschi adulti, del peso di 8-10 kg, con pentobarbital sodico (30 mg/kg i.v. e 2 mg/kg/h i.v.), si intubano e si ventilano spontaneamente con aria ambientale. Per monitorare la pressione arteriosa sistemica (PA) si introduce un catetere di polietilene (PE) nell'arco dell'aorta attraverso l’arteria femorale sinistra. Si incannula un collaterale della vena femorale sinistra per l'infusione dell'anestetico, e si incannula la vena femorale destra per la somministrazione dei composti. Per l'iniezione intrarteriosa (i.a.) della noradrenalina (NA) si introduce un catetere di PE nella parte inferiore dell'aorta addominale attraverso l'arteria iliaca esterna destra. Con questa procedura, si distribuisce selettivamente la NA nelle basse vie urinarie. Si esegue un'incisione soprapubica verticale paramediana dalla base della pelvi alla regione medio addominale esponendo la vescica e la prostata. Si svuota manualmente la vescica con una siringa. Si libera il nervo ipogastrico dal tessuto circostante e lo si taglia a 1 cm dal ganglio mesenterico inferiore. Si mette l'estremità' distale del braccio destro o sinistro del nervo su un elettrodo di platino bipolare. Si monitorizza la pressione uretrale prostatica con un catetere Mikro-tip (5F) introdotto nella vescica attraverso il meato uretrale esterno ed arretrato finche' il trasduttore della pressione sia posizionato nella regione prostatica dell'uretra. Si esegue una legatura del collo della vescica e dell'uretra per isolare la risposta di quest'ultima ed evitare qualsiasi interazione con la vescica. Si esegue un'altra legatura del catetere Mikro-tip in corrispondenza del meato esterno, per fissare il catetere stesso. La stimolazione del nervo ipogastrico si esegue con un treno di impulsi rettangolari di 10-15 V, 10-30 Hz, ampiezza 5 rosee., durata 8 sec.

Dopo un periodo di stabilizzazione successivo all'intervento chirurgico (30 minuti), durante il quale si monitorizzano continuamente la pressione arteriosa e uretrale prostatica come valore basale, si eseguono alternativamente a intervalli di 10 minuti la somministrazione i.a. di NA o la stimolazione del nervo ipogastrico .

La dose di NA e il parametro di stimolazione del nervo ipogastrico scelti sono tali da produrre un aumento di almeno il 100% della pressione uretrale. I composti in esame sono somministrati per via endovenosa in modo cumulativo a intervalli di 15-20 minuti tra le somministrazioni. Si ripetono sia le iniezioni i.a. di NA sia la stimolazione del nervo ipogastrico 5 minuti dopo ogni somministrazione di composto in esame a intervalli di circa 5 minuti tra due stimolazioni. Per confrontare gli effetti del composto somministrato, si costruiscono curve dose-risposta calcolando, al picco dell'effetto, la riduzione percentuale della pressione diastolica e l'inibizione percentuale dell'aumento della pressione uretrale indotta da entrambi i tipi di stimolazione impiegati. Si ricorre poi a equazioni di regressione lineare per valutare l'efficacia teorica come DE25 {dose efficace che induce il 25% di riduzione della pressione diastolìca) e DI50 (dose inibente del 50% l'aumento della pressione uretrale).

RISULTATI

Gli effetti ottenuti con la somministrazione per via endovenosa dei composti degli esempi 1, 3 e 5 sono riportati nella Tabella 3. Anche gli effetti ottenuti dopo iniezione di prazosin e Ree 15/2739 sono riportati nella tabella.

TABELLA 3

I dati rappresentano le dosi attive (espresse in pg/kg) che inibiscono del 50% le contrazioni uretrali (CU) indotte da noradrenalina (NA) o da stimolazione del nervo ipogastrico (IPO), le dosi attive (espresse in pg/kg) nell'abbassamento della pressione diastolìca (PD) ed i rapporti (PD/CU) tra le dosi attive Ri ed R2).

Esempio CU PD R1 R2

DI50 MA DI50 IPO DE25 (PD/NA) (PD/IPO)

1 3,4 345,4 101,6

3 1,3 2,4 514,7 396 214

5 2,7 3,4 197,0 73 58

Prazosin* 3,6 10 6,6 10 1,83 1

Rec 15/2739* 2,4 6,7 243 177 101,2 26,4

* Dati da: Leonardi A. et al., J. Pharmacol . Exp. Therap. 281, 1272-1283 (1997)

I risultati farmacologici confermano che i composti dell'invenzione sono antagonisti del recettore adrenergico α1 con buona selettività' per il sottotipo α1a, in particolare contro il recettore 5-HT1A, e buona affinità' anche per il sottotipo α1L, per quanto riguarda i dati in vitro.

I risultati farmacologici in vivo confermano l'uroselettivita' estremamente elevata dei composti dell'invenzione e giustificano il loro possibile uso nel trattamento delle malattie ostruttive delle basse vie urinarie, quali l'IPB.

QUANTITÀ' EFFICACI

Quelle che seguono rappresentano linee guida per dosaggi orali, parenterali ed endovenosi efficaci, espressi in mg/kg di peso al giorno, da usare nei disturbi ostruttivi delle basse vie urinarie:

generale 0,001-20

preferiti 0,05-3

molto preferiti 0,5-2

I valori molto preferiti riguardano la somministrazione orale. Le dosi endovenose devono essere da 10 a 100 volte inferiori. Le dosi per uso selettivo, ossia le dosi che sono attive nelle basse vie urinarie senza effetto sostanziale sulla pressione arteriosa, dipendono dal particolare composto impiegato. In genere, nel caso di composto selettivo nell'inibire la contrazione uretrale, si può' somministrare fino a quattro volte la quantità' della DE50 usata per inibire le contrazioni uretrali senza effetto sostanziale sulla pressione arteriosa. Ulteriori affinamenti e ottimizzazioni delle dosi sono possibili ricorrendo a semplici esperimenti di routine. I composti attivi dell'invenzione possono essere somministrati per via orale, per esempio con un diluente inerte o con un veicolo commestibile, o possono essere racchiusi in capsule di gelatina, o possono essere pressati in forma di compressa. Ai fini della somministrazione terapeutica orale, i composti attivi dell'invenzione possono essere incorporati in eccipienti ed usati in forma di compresse, tavolette, capsule, elisir, sospensioni, sciroppi, wafer, gomme da masticare e simili. Questi preparati devono contenere almeno lo 0,5% di composto attivo, ma la quantità' del principio attivo può' variare a seconda della forma particolare e può' opportunamente variare tra il 5% e il 70% circa del peso dell'unita'. La quantità' di composto attivo in tali composizioni e' tale da consentire di ottenere un dosaggio adeguato anche quando il dosaggio desiderato sia ottenibile somministrando piu' forme di dosaggio. Le composizioni e i preparati preferiti dell'invenzione sono allestiti in modo che l'unita' di dosaggio orale contenga tra 1,0 e 300 milligrammi di composto attivo. Le compresse, pillole, capsule, tavolette e simili potranno contenere inoltre, per esempio, i seguenti ingredienti: un legante come la cellulosa microcristallina, la gomma adragante e la gelatina; un eccipiente come l'amido o il lattosio; un agente disgregrante come l'acido alginico, l'amido giocolato sodico, l'amido di mais e simili; un lubrificante come il magnesio stearato e l'olio di ricino idrogenato; un agente per favorire lo scorrimento come la silice colloidale; un' dolcificante come il saccarosio o la saccarina, e un aroma come la menta piperita, il metile salicilato e l'aroma di arancia. Quando la forma dell'unita' di dosaggio e' la capsula, oltre ai materiali del tipo suddetto può' contenere un veicolo liquido come un olio grasso. Altre forme di unita' di dosaggio possono contenere vari altri materiali che modificano la forma fisica dell'unita' stessa, per esempio i rivestimenti. Quindi, le compresse e le pillole possono essere rivestite di zucchero, gomma lacca e altri agenti per il rivestimento gastroresistente. Uno sciroppo può' contenere, oltre ai composti attivi, saccarosio come dolcificante e certi conservanti, coloranti e aromi. I materiali usati nella preparazione di queste varie composizioni devono essere farmaceuticamente puri e non tossici nelle quantità' usate. Ai fini della somministrazione terapeutica parenterale, i composti attivi dell'invenzione possono essere incorporati in una soluzione o sospensione. Questi preparati devono contenere almeno lo 0,1% di composto attivo, ma lo stesso può' variare tra lo 0,5 e il 30% circa del loro peso. La quantità' di composto attivo in tali composizioni e' tale da consentire di ottenere un dosaggio adeguato. Le composizioni e i preparati preferiti secondo la presente invenzione sono allestiti in modo che un'unita' di dosaggio parenterale contenga tra 0,2 e 100 milligrammi di composto attivo. Le soluzioni e le sospensioni possono inoltre includere i seguenti componenti: un diluente sterile come l'acqua per preparazioni iniettabili, soluzione fisiologica, oli fissi, glicoli polietilenici, glicerina, glicole propilenico e altri solventi sintetici; agenti antibatterici come l'alcol benzilico e i metil paraben, antiossidanti come l’acido ascorbico ed il sodio bisolfito, agenti chelanti come l'acido etilenediamminotetracetico; tamponi come gli acetati; citrati e fosfati e agenti per la regolazione della tonicità' come il sodio cloruro e il destrosio. I flaconi per dosi parenterali multiple possono essere di vetro o materiale plastico.

Rientrano nell'ambito dell'invenzione anche altre composizioni idonee per la somministrazione per diverse vie di somministrazione e contenenti composti conformi alla presente invenzione. Le forme di dosaggio, ulteriori ingredienti e vie di somministrazione qui previste sono quelle descritte nei brevetti statunitensi No. US 4089969, Muchowski J.M. et al., ed US 5091182, Ong J.T.H. et al., , entrambi incorporati per citazione nella loro interezza.

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un composto di formula generale I

   dove R rappresenta un gruppo alcossi, polifluoroalcossi, idrossi o trifluorometansolfonilossi; R1 e R2 rappresentano ciascuno separatamente un atomo di idrogeno o alogeno o un gruppo polifluoroalcossi o alcossi; R3 rappresenta uno o piu' sostituenti costituiti da un atomo di idrogeno o alogeno od un gruppo alchile, alcossi', nitro, ammino, acilammino, ciano, alcossicarbonil, carbossammido; R4 rappresenta un atomo di idrogeno o un gruppo alchile; ed n e’ 0, 1 o 2; o un N-ossido o sale farmaceuticamente accettabile di tale composto.
2. 2. Un composto secondo la rivendicazione 1, in cui R rappresenta un gruppo metossi, 2,2,2-trifluoroetossi, idrossi o trifluorometansolfonilossi.
3. 3. Un composto secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui R3 rappresenta un atomo di idrogeno o fluoro.
4. 4. Un composto secondo le rivendicazioni precedenti, in cui R2 rappresenta un atomo di idrogeno o cloro o un gruppo 2,2,2-trifluoroetossi.
5. 5. Un composto secondo le rivendicazioni precedenti, in cui n e' 1.
6. 6. I seguenti composti: • N-{3-[4-(5-Cloro-2-metossifenil)-1-piperazinil]propil]-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide, • N-{3-[4-(5-Cloro-2-idrossifenil)-1-piperazinil]propil)-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide, • 5-Metil-3-fenil-N-{3-[4-[2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]-1-piperazinil ]propil)isossazol-4-carbossammide, • N-{3-[4-[2-Metossi-5-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]-1-piperazinil]propil)-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide, • N-{3-[4-[5-Fluoro-2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]-1-piperazinil]propil)-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide, • N-{3-[4-[4-Fluoro-2-(2,2,2-trifluoroetossi)fenil]-1-piperazinil]propil}-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossainmide, e • N-{3-[4-(5-Cloro-2-trifluorometansolfonilossi)]-1-piperazinil]propil]-5-metil-3-fenilisossazol-4-carbossammide o un N-ossido o sale farmaceuticamente accettabile di tale composto.
7. 7. Una composizione farmaceutica comprendente un composto secondo le rivendicazioni precedenti o un N-ossido o sale farmaceuticamente accettabile di tale composto miscelati con un diluente o veicolo farmaceuticamente accettabile.
8. 8. Un metodo pe r la preparazione di un composto di formula generale I dove R rappresenta un gruppo alcossi, polifluoroalcossi, idrossi o trifluorometansolfonilossi; R1 e R2 rappresentano ciascuno separatamente un atomo di idrogeno o alogeno o un gruppo polifluoroalcossi o alcossi; R3 rappresenta uno o piu' sostituenti costituiti da un atomo di idrogeno o alogeno od un gruppo alchile, alcossi, nitro, ammino, acilammino, ciano, alcossicarbonil, carbossammido; R« rappresenta un atomo di idrogeno o un gruppo alchile; ed n e' 0, 1 o 2; metodo che comprende la condensazione di un 4-carbossi-5-alchil-3-arilisossazolo o un estere, ammide o anidride di tale composto con un derivato N-(ω-amminoalchil)-N'-fenilpiperazinico di formula generale 2

   dove n, R, R1 ed R2 sono come definiti sopra.
9. 9. Un metodo secondo la rivendicazione 8, in cui la condensazione e' eseguita in presenza di un agente condensante come dicicloesilcarbodiimmide o dietil cianofosfonato, opzionalmente in presenza di un agente promotore come N-idrossisuccinimmide o 4-dimetilamminopiridina o Ν,Ν'-carbonildiimidazolo, in solvente aprotico o in solvente clorurato ad una temperatura compresa tra -10 e 140°C
10. 10. Un metodo per la preparazione di un composto di formula generale I

    dove R rappresenta un gruppo alcossi, polifluoroalcossi, idrossi o trifluorometansolfonilossi; R1 e R2 rappresentano ciascuno separatamente un atomo di idrogeno o alogeno o un gruppo polifluoroalcossi o alcossi; R2 rappresenta uno o piu' sostituenti costituiti da un atomo di idrogeno o alogeno od un gruppo alchile, alcossi, nitro, armino, acilammino, ciano, alcossicarbonil, carbossammido; R4 rappresenta un atomo di idrogeno o un gruppo alchile; ed n e' 0, 1 o 2; detto metodo comprendente la condensazione di un 4-carbossi-5-alchil-3-arilisossazolo o un estere, ammide o anidride di tale composto con un ammina di formula generale H2NCH2 (CH2)nCH2X dove X rappresenta un atomo di alogeno o un gruppo idrossi ed n e' come definito sopra e, se X rappresenta un gruppo idrossi, la sua conversione in un gruppo uscente, come un gruppo alchilsolfonilossi o arilsolfonilossi, nel composto ottenuto di formula generale 3

    e la condensazione del composto di formula generale 3 con un derivato fenilpiperazinico 4

    dove R, R1 e R2 sono come definito sopra.
11. 11. Un metodo secondo la rivendicazione 10, in cui la condensazione di un 4-carbossi-5-alchil-3-arilisossazolo con l'ammina H2NCH2 (CH2)nCH2X e' eseguita in presenza di un agente condensante come dicicloesilcarbodiimmide o dietil cianofosfonato, opzionalmente in presenza di un agente promotore come N-idrossisuccinimmide o 4-dimetilamminopiridina o N,N'-carbonildiimmidazolo, in solvente aprotico o in solvente clorurato a una temperatura compresa tra 10 e 140°C.
12. 12. Un metodo secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui la condensazione del composto 3 con il derivato fenilpiperazinico 8 si esegue senza solvente, o alternativamente, in solvente polare come dimetilformammide o acetonitrile o metanolo, ad una temperatura compresa tra 20 e 200°C, preferibilmente in presenza di una base come potassio carbonato.
13. 13. Un metodo per prevenire le contrazioni (comprese le contrazioni indotte da noradrenalina) dell'uretra e delle basse vie urinarie o per prevenire selettivamente tali contrazioni, metodo che prevede la somministrazione di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o una composizione secondo la rivendicazione 7 a un mammifero (compreso l'uomo) che necessiti di tale trattamento in quantità' efficace per l'uso particolare.
14. 14. Un metodo secondo la rivendicazione 13, eseguito senza sostanzialmente influenzare la pressione arteriosa del mammifero.
15. 15. Un metodo per bloccare i recettori adrenergici α1, metodo che prevede l'immissione in prossimità' di tali recettori di una quantità' efficace di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o di una composizione secondo la rivendicazione 7, alleviando in tal modo i disturbi associati ad una superattivita' di detti recettori.
16. 16. Un metodo secondo la rivendicazione 15, in cui l'immissione del composto o della composizione nell'ambiente di detti recettori si ottiene somministrando il composto o la composizione ad un mammifero (compreso l'uomo) che possieda detti recettori.
17. 17. Un metodo per il trattamento di un paziente affetto da iperplasia prostatica benigna, metodo che prevede la somministrazione al paziente di una quantità' efficace di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o di una composizione secondo la rivendicazione 7.
18. 18. Un metodo per il trattamento di un paziente affetto da pressione endooculare alta, metodo che prevede la somministrazione al paziente di una quantità' efficace di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o di una composizione secondo la rivendicazione 7.
19. 19. Un metodo per il trattamento di un paziente affetto da aritmia cardiaca, metodo che prevede la somministrazione al paziente di una quantità' efficace di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o di una composizione secondo la rivendicazione 7.
20. 20. Un metodo per il trattamento di un paziente affetto da disfuzione sessuale, metodo che prevede la somministrazione al paziente di una quantità' efficace di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o di una composizione secondo la rivendicazione 7.
21. 21.. Un metodo per inibire la sintesi del colesterolo in un paziente, metodo che prevede la somministrazione al paziente di una quantità' efficace di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o di una composizione secondo la rivendicazione 7.
22. 22. Un metodo per ridurre il dolore mediato dal sistema simpatico in un paziente, metodo che prevede la somministrazione al paziente di una quantità' efficace di un composto secondo le rivendicazioni da 1 a 6 o di una composizione secondo la rivendicazione 7.