ITMI981866A1

ITMI981866A1 - Derivati di rantes e loro applicazioni terapeutiche

Info

Publication number: ITMI981866A1
Application number: IT98MI001866A
Authority: IT
Inventors: Paolo Lusso; Simona Polo
Original assignee: San Raffaele Centro Fond
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2000-02-07
Also published as: ITMI981866A0; IT1302012B1

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per ti "DERIVATI DI RANTES E LORO APPLICAZIONI TERAPEUTICHE"

La presente invenzione ha per oggetto mutanti di RANTES con ridotta attività pro-infiammatoria ed aumentata attività soppressiva di HIV, ovvero con attività antagonistica nei confronti delle chemiochine native.

Le chemiochine sonò piccole proteine implicate nei meccanismi dell'infiammazione e nella circolazione fisiologica delle cellule ematopoietiche. Diversi studi hanno dimostrato un ruolo primario delle chemiochine nel reclutamento dei leucociti in corso di processi infiammatori e autoimmuni,come l'artrite reumatoide, ed allergici come l'asma (Schall, TJ. The chemokines. In: The cytoklne handbook, A Thompson ed.Academic Press, New York, 1994,p.419-460). Inoltre, alcune chemiochine sono state recentemente identificate come potenti inibitori naturali dell'infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV) (Science 270, 1811-1815, 1995). L'attività delle chemiochine è dovuta alla loro interazione con recettori a differente specificità, espressi sulla membrana della superficie cellulare. Alcuni di questi recettori fungono da co-recettori per il virus HIV (Science 272, 872-877, 1996; Science 272, 1955-1958, 1996).L'uso differenziale di tali co-recettori, in particolare di CCR5, il recettore di RANTES, MIP-1α e MIP-iβ, e di CXCR4, il recettore di SDF-1, è un importante determinante della diversità biologica fra i ceppi di HIV. Le varianti di HIV-1 incapaci di infettare linee continue di linfociti T CD4+, comunemente implicati nella trasmissione virale e predominanti durante la fase asintomatica dell'infezione, usano per lo più CCR5 come co-recettore e sono invariabilmente sensibili all'inibizione da parte delle chemiochine che si legano a CCR5 (Nat.Med., 3: 1259-1265, 1997). Fra queste,RANTES è la più efficace ed è pertanto studiata per lo sviluppo di nuove terapie anti-HIV (Nature, 383: 400, 1996). RANTES è una chemiochina appartenente alla famiglia C-C costituita da 68 amminoacidi, la cui sequenza è stata riportata in J. Immunol., 141:1018-1025 (1988).

WO 96/17935 descrive RANTES modificati all'estremità N-terminale per aggiunta di un amminoacido quale metionina, leucina o glutammina, come antagonisti di RANTES o MIP-Ια. In particolare, ne viene descritto l'uso per il trattamento di asma, rinite allergica, dermatite atopica, ateroma-aterosclerosi,o artrite reumatoide.

Inoltre, Elsner J. Et al. in "European Journal of Immunology, Voi.

27, 2892-2898 (1997)", e WO 96/17934 descrivono l'attività antagonista del peptide Met-RANTES.

L'uso di RANTES non modificato e di altre chemiochine della stessa famiglia nel trattamento delle malattie allergiche, è stato inoltre descritto in WO 94/07521 e WO 94/21277.

WO 97/25350 descrive mutanti disaggregati di MIP-Ια o LD78 dotati di attività HIV soppressiva, mentre WO 98/13495 descrive mutanti della proteina RANTES umana, incapaci di aggregare in condizioni di forza ionica fisiologiche e dotati di attività antivirale. Gli autori della presente domanda di brevetto hanno recentemente descritto in M alcuni mutanti di RANTES con attività antagonistica nei confronti di HIV.

Si è ora sorprendentemente trovato che la sostituzione, per lo più di tipo non conservativo, di almeno un amminoacido nella regione N-terminale, compresa tra 1'amminoacido 1 e l’amminoacido 11 della chemiochina RANTES umana nella sua forma matura, e/o nella regione dell’N-loop, conpresa tra 11aireninoacido 12 e l'amminoacido 19 della sequenza di RANTES,e/o nella regione del "40's-loop", che conprende gli amminoacidi da Thr 43 ad Asn 46, conporta un'efficacia notevolmente aumentata contro diversi isolati di HIV-1, sia in cellule primarie mononucleate sia in macrofagi, oltre a una ridotta attività proinfiammatoria e ad una potente attività antagonistica rispetto alla molecola nativa. In particolare, i mutanti dell'invenzione sono in grado di antagonizzare in modo competitivo la molecola nativa RANTES, MIP-Ια o ΜΙΡ-Ιβ, oppure di antagonizzare l'interazione tra virus HIV ed un recettore per le chemiochine. Preferibilmente, le mutazioni sono a carico di uno o più degli amminoacidi Ser 1, Ser 4, Ser 5,Tyr 3,Asp 6, Arg 17, Arg 44 e Lys 45, rispetto alla forma umana "wild type" come descritta in J. Immunol. 141:1018-1025, 1988. Sono preferite le sostituzioni di Ser 1, Ser 4, Ser 5, Tyr 3 con un amminoacido neutro o idrofobico,di Asp 6 con un amminoacido carico positivamente,di Arg 17 con un amminoacido di piccola dimensione e idrofobico, e di Arg 44 e Lys 45 con un amminoacido carico negativamente.Ancora più preferite sono le seguenti sostituzioni: Ser 1 con Cys, Ser 4 con Cys, Ser 5 con Cys, Tyr 3 con Ala, Asp 6 con Arg, Arg 17 con Ala, Arg 44 e Lys 45 c

primo gruppo di mutanti secondo l'invenzione è caratterizzato da una tripla mutazione che può essere a) Ser 1 con Cys; Ser 5 con Cys; Asp 6 con Arg, oppure b) Ser 1 con Cys; Ser 5 con Cys; Arg 17 con Ala oppure c) Ser 1 con Cys; Ser 5 con Cys; Arg 44 con Giu. Un secondo gruppo è caratterizzato da mutanti con doppia mutazione scelta tra a)Ser 1 e Ser 5 con Cys oppure b)Ser 1 e Ser 4 con Cys oppure c) Ser 1 con Cys e Arg 44 con Giu oppure d)Asp 6 con Arg e Arg 44 con Giu. Un terzo gruppo è caratterizzato da una singola mutazione scelta tra a) Ser 1 con Cys,b) Tyr 3 con Ala, c)Asp 6 con Arg,d) Arg 17 con Ala, e) Arg 44 con Giu, f) Lys 45 con Giu. Inoltre, ai mutanti sopra definiti possono essere aggiunti fino a due amminoacidi all'N-terminale, preferibilmente scelti tra Leu, come descritto in WO 96/17935 oppure Ala, Cys e Trp. Per esempio, la Ser 4 può essere sostituita con una Cys e contemporaneamente una Cys aggiunta all'N-terminale. Oppure, la Ser 5 può essere sostituita con una Cys ed una Cys aggiunta all'N-terminale. In particolare il mutante singolo cisteina 1 o -1 potrebbe altresì costituire un substrato ottimale per successive modificazioni chimiche, contenendo un gruppo -SH libero.

E' plausibile che le proprietà di alcuni dei mutanti dell'invenzione, in particolare di quelli che portano all'introduzione di due nuove cisteine, siano determinate da modificazioni strutturali dovute alla formazione di un nuovo ponte disolfuro. E' altresì plausibile,tenuto conto dei dati strutturali su RANTES stesso (Biochem.

1995, 34:9307-9314) o su molecole omologhe quali SDF-1 (EMBO J.

16:6996:7007, 1997) che le regioni dell'N-terminale e d concorrano a costituire il sito tridimensionale di interazione con il recettore specifico di membrana.

Un altro aspetto dell'invenzione riguarda peptidi corrispondenti a porzioni della sequenza di RANTES nella regione N-terminale,dell'N-loop e/o del "40's-loop", contenenti le mutazioni descritte ed in grado di antagonizzare in modo competitivo la molecola nativa RANTES, MIP-Ια o MIP-1β, oppure di antagonizzare l'interazione tra virus HIV ed un recettore per le chemiochine.

Altri aspetti dell'invenzione si riferiscono alle sequenze nucleotidiche codificanti per i mutanti descritti, ai vettori di espressione comprendenti tali sequenze nucleotidiche, alle proteine chimeriche o di fusione conprendenti una sequenza corrispondente ai mutanti dell'invenzione e una sequenza "carrier" in grado di migliorare ad esempio le caratteristiche farmacocinetiche delle molecole, e all'uso dei mutanti come agenti anti-HIV o come agenti anti-inflaminatori o antiallergici o anti-asmatici.

Come qui usato, il temine RANTES definisce un qualsiasi polipeptide che sia funzionalmente equivalente a RANTES umano o di specie cross-reattive, sue varianti e forme alleliche che differiscano aventualmente dalla sequenza "canonica" riportata in J. Immunol.

141:1018-1025, 1988.

I mutaulti dell'invenzione possono essere preparati con metodi convenzionali di DNA ricombinante e di espressione in vitro,utilizzando oligonucleotidi sintetici opportuni, ad esempio con tecniche di mutagenesi sito-specifica o con reazioni di polimerizzazione

catena (PCR). Il DNA ottenuto viene poi inserito in un opportuno vettore di espressione per un ospite procariota o eucariota (ad es. E.coli o Baculovirus). Alternativamente, i mutanti o i peptidi possono essere preparati con metodi convenzionali di sintesi peptidica. Per i previsti impieghi terapeutici, i mutanti o i peptidi secondo la presente invenzione saranno somministrati sotto forma di adatte conposizioni farmaceutiche per via parenterale,subcutanea, sublinguale, intranasale, inalatoria o topica, preparate secondo tecniche convenzionali, comunque idonee per principi attivi di natura polipeptidica o proteica. La quantità di polipeptide da somministrare sarà tale da provocare una significativa inibizione dell'infezione da HIV o di processi infiammatori e allergie quali artrite reumatoide, malattie degenerative quali aterosclerosi o malattie allergiche quali asma, rinite e dermatiti. Il dosaggio in particolare sarà determinato sulla base di prove cliniche e dipenderà da vari fattori quali condizioni, sesso, età e peso del paziente e gravità della patologia. I mutanti e i peptidi dell'invenzione sono inoltre utilizzabili anche per la prevenzione dell'infezione da HIV in individui a rischio. Inoltre tali mutanti, che corrispondono a proteine naturali e non richiedono alcuna modificazione chimica della proteina espressa dall'ospite eucariota, possono essere inseriti in vettori di terapia genica (basati ad es. su retrovirus murini o_umani, come MuLV o HIV, oppure su un herpes virus, come HHV-7) che ne permettono la produzione direttamente nel tessuto del paziente trattato.

I seguenti esempi illustrano l'invenzione in maggior detta Esempio 1:

Clonaggio e mutagenesi della sequenza di_EMTES

E' stato estratto l'RNA totale secondo metodologie classiche (Sambrook,J. et al., 1989.Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York), da linfociti T CD8+ umani purificati mediante adsorbimento con 1'anticorpo anti CD8 (Sigma C7423) legato a biglie magnetiche. Il cDNA, prodotto attraverso trascrizione inversa, utilizzando come pr-imer un oligo-dT, è stato utilizzato per una reazióne di PCR (Polymerase Chain Reaction) con 2 primers oligonucleotidici in grado di amplificare l'intera regione codificante per RANTES (434 paia di basi):

I primers sono stati disegnati in modo da contenere i siti di restrizione sottolineati nelle sequenze PI e P2, rispettivamente EcoRI al 5'(PI) e BamHI al 3'(P2). Dopo amplificazione, il prodotto di PCR è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e BamHI, purificato da gel mediante colonnina QIAEX (Promega) e riligato al DNA del vettore pUC18 (PROMEGA),digerito nel polilinker con gli stessi enzimi.

II DNA rilegato è stato quindi usato per trasformare cellule competenti di Escherichia coli (JM109). Dopo selezione di alcuni cloni resistenti all'anpicillina, il DNA è stato sequenziato per confermare l'identità della sequenza clonata.

Il DNA così controllato è stato utilizzato per la mutagenesi mediante PCR, secondo una modificazione della metodica rip letteratura (Gene, 1991, 67:70), e definita di "overlap extension". Questa tecnica permette di creare diverse mutazioni in uno stesso gene a partire da tre primers comuni (A, B, C, che si appaiano alla sequenza del vettore)ed un primer specifico per ciascuna delle varie mutazioni.

Le sequenze dei primers comuni utilizzati nella metodica descritta sono le seguenti:

Per la costruzione del plasmide pVU5 è stato usato l'oligo specifico cysl . Tale primer contiene una singola sostituzione di base (C al posto di G), che determina la modificazione di Ser in Cys, in posizione 1.

Per la costruzione del plasmide pVU14 è stato usato l'oligo specifico tyr3 Tale primer porta una doppia sostituzione di base (GC al posto di TA), che determina la modificazione di Tyr in Ala, in posizione 3.

Per la costruzione del plasmide pVU15 è stato usato l'oligo cyslcys5 , che porta una doppia sostituzione di base (GC al posto di CG), addizionata alla stessa sostituzione del primer cysl (C al posto di G). Questo determina una doppia modificazione amminoacidica, serina in cisteina, in posizione 1 e 5.

Per la costruzione del plasmide pVU24 è stato usato l'oligo specifico alal7 Ta

porta una doppia sostituzione di base (GC al posto di CG), che determina la modificazione di arginina in alanina, in posizione 17.

Per la costruzione del plasmide pVU38 è stato usato l'oligo specifico arg6 Tale primer porta una doppia sostituzione di base (CG al posto di TG), che determina la modificazione di aspartato in arginina, in posizione 6.

Per la costruzione del plasmide pVU26 è stato usato l'oligo specifico arg44 . Tale primer porta una doppia sostituzione di base (TC al posto di CG), che determina la modificazione di arginina in acido glutammico, in posizione 44.

Per la costruzione del plasmide pVU43 è stato usato l'oligo specifico lys45 Tale primer porta una singola sostituzione di base (C al posto di T), che determina la modificazione di lisina in acido glutammico, in posizione 45.

Altri mutanti sono stati costruiti con i seguenti oligo:

- oligo cysl-cys4: con la sostituzione di due C (sottolineate) al posto di due G, si ottiene la sostituzione di due serine (posizione 1 e 4)con due cisteine;

Oligo cys0-cys4: con la sostituzione di una C (sottolineata) al posto di una G si ottiene la sostituzione di una serina (posizione 4) con una cisteina e con l'inserzione della tripletta GCA si ottiene l'inserimento di una cisteina addizionale in posizione 0;

- oligo leu-ala: mediante inserzione di 6 nucleotidi (GGCTAA) prima del codone per la serina 1 s l'inserimento di leucina e alanina rispettivamente in posizione -2 e -1.

Di nuovo, i prodotti di PCR sono stati purificati e clonati nei siti BglII-BamHI del vettore pUC18. I diversi ricombinanti sono stati sequenziati per controllare che non vi fossero mutazioni indesiderate dovute ad errori introdotti accidentalmente, ad esempio dall'enzima Taq polimerasi.

Esempio 2:

Espressione e purificazione delle molecole ricombinanti in Baculovirus Il sistema di espressione di Baculovirus è noto da diversi anni e sfrutta la possibilità di sostituire in un vettore di baculovirus ricombinante il gene di interesse a quello codificante per la poliedrina, gene non essenziale del virus, ma espresso a livelli molto alti durante la fase tardiva dell'infezione da AcNPV (Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus). La scelta di questo sistema comporta diversi vantaggi tra cui i principali sono:

1) alto livello di espressione;

2) funzionalità della proteina ricombinante che viene correttamente processata e prodotta (la maggior parte dei sistemi di modificazione, processamento e trasporto corrispondono a quelli della cellula umana); 3) secrezione extracellulare della proteina di interesse grazie al peptide segnale (O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, "Baculovirus expression vectors- A laboratory manual", Oxford University Press, 1994).

Al fine di esprimere RANTES e i suoi mutanti in questo sistema, i DNA corrispondenti sono stati clonati nei siti BamHI-EcoRI del

del polylinker del plasmide pVL1392 (Pharmingen), sotto il controllo del promotore per la poliedrina. Questo plasmide contiene inoltre a valle della sequenza clonata una regione di omologia ad AcNPV.

Una linea cellulare continua di Autographa californica (SF9, Pharmingen) è stata trasfettata, secondo il metodo della precipitazione calcio-fosfato,contemporaneamente con il DNA dei plasmidi così prodotti e con il DNA di Baculovirus contenente una delezione letale (BaculoGoldTM DNA, Pharmingen). Solo una ricombinazione omologa che porti alla sostituzione dei gene della poliedrina con il DNA dei mutanti di interesse permette la produzione di particelle virali vitali (Gruenwald S., Heitz, J., "Baculovirus expression vectors: procedures and methods manual", Pharmingen. 1993). Il sopranatante delle colture trasfettate è stato quindi raccolto al 3“ giorno, diluito e utilizzato per infettare nuove colture di SF9, in modo da ottenere la progenie virale da singole particelle infettanti (end-point dilution). La proteina RANTES ed i vari mutanti vengono secreti come atteso ed il loro livello di espressione può essere valutato utilizzando un test ELISA commerciale (R&D).Dai potenziali ricombinanti, identificati con il test ELISA, è stato estratto il DNA virale, che è stato sottoposto a sequenziamento mediante POR (Cycle Sequencing, Amersham) per confermare la presenza delle mutazioni anche nella progenie virale.

Lo stock virale prescelto è stato successivamente sottoposto a diversi cicli di infezione e amplificazione in cellule SF9, in modo da ottenere supematante ad alto titolo virale. Il supernatante così preparato è stato quindi utilizzato per la produzione su l

delle chemiochine ricombinanti, infettando una linea cellulare continua di Trichoplusia ni (High Five, Invitrogen).Queste cellule sono in grado di crescere in terreno senza siero e questo facilita la successiva purificazione delle proteine secrete di interesse. 1,5 x 10<8 >cellule sono state infettate con 1,5 x 10<9 >particelle virali vitali in un volume finale di 200 ml di terreno. Al 4’ giorno di infezione il supernatante è stato raccolto, sottoposto a filtrazione (0,45 μ) e passato su colonne di eparina.Dopo alcuni lavaggi con PBS la colonna è stata eluita con PBS NaCl 1,5 M in 10 mi.

Una aliquota dell'eluato è stata sottoposta ad elettroforesi su gel di acrilammide SDS-PAGE e successiva colorazione con Coomassie blue. Questo ha permesso di valutare il grado dì purezza delle proteine ricombinanti al 90%. L'eluato è stato successivamente diafiltrato per eliminare i sali presenti e concentrato (Centricon, cut-off 3000, Millipore). La quantificazione finale di RANTES e dei mutanti presenti in soluzione è stata fatta mediante un kit ELISA per la determinazione quantitativa di RANTES (R&D) e confermata mediante Western blot e elettroforesi capillare.

Esempio 3

Inibizione dell'infezione virale

L'abilità dei mutanti, ottenuti come descritto nell'Esempio 2, di inibire l'infezione da parte del ceppo prototipico macrofago-tropico, HIV-lBaL, è stata misurata in culture primarie di cellule mononucleari attivate da sangue periferico. La metodica utilizzata per infettare PBL e per valutare la produzione di antigene p24 è stata de

letteratura (Scarlatti et al. Nat. Med. Nov. 3:111259-65, 19971. La dose capace di inibire del 90% la proliferazione virale (ID90) erano nettamente inferiore per pVU15 rispetto al RANTES nativo che aveva una ID90 di 96 ng/ml (Figura 1).Lo stesso effetto soppressivo nei confronti di HIV-lBaL da parte di pVU5, pVU14, pVU15 era confermato anche su un altro ceppo di HIV-1 isolato da un paziente con infezione asintomatica (HIV-16366) e precedentemente passato solo una volta in cellule mononucleari di sangue periferico (Figura 2): come il ceppo BaL questo isolato era dipendente dal co-recettore CCR5 (ibid.). L’attività antivirale dei polipeptidi dell'invenzione, espressa come potenza relativa rispetto al RANTES nativo (ID90 di RANTES/ID90 di mutante) è riportata nella Tabella .

Tabella , Attività antivirale di mutanti di RANTES.

PBMC MDM

*L' attività antivirale dei mutanti pVU26 e pVU43 è espr potenza relativa rispetto al RANTES nativo ( ID50 di RANTES/ID50 di mutante ) .

Come atteso, non è stato osservato effetto inibitorio ne' con RANTES nativo ne' con i polipeptidi dell' invenzione sul ceppo promiscuo di HIV-1 No. 6195.

Esempio 4:

Attività pro-infiammatoria

E' stata studiata la capacità dei mutanti di RANTES di mobilizzare il calcio intracellulare, indotto dalla attivazione del recettore accoppiato alla proteina-G e legato alla efficienza di trasduzione del segnale dei diversi ligandi. Le cellule sono state caricate con Fura-2 per un'ora e stimolate con i mutanti a diverse concentrazioni. La risposta è stata misurata al fluorimetro e calcolata come % di aumento del calcio intracellulare. RANTES nativo ha indotto una mobilizzazione del calcio dose-dipendente in U87-CD4 esprimenti CCR5 ma non in cellule CCR5 negative usate come controlli.Tra i mutanti testati: pVU5, pVU14, pVU15,pVU24,pVU38,pVU26 e pVU43, solo pVU38 e pVUl5 non hanno indotto mobilizzazione del calcio. Per pVU5 e pVU14 e pVU43 l'efficienza era minore rispetto alla molecola nativa (RANTES wt), come illustrato nella Figura 3.

Si è inoltre misurata la capacità dei polipeptidi dell'invenzione di indurre chemiotassi di monociti umani primari, capacità che può essere mediata da diversi recettori di RANTES e principalmente da CCR1.

La migrazione di monociti è stata saggiata utilizzando una modificazione della camera di Boyden (48-well TRANSWELL', Cos

2h di incubazione in presenza dei mutanti a diverse concentrazione, il filtro è stato rimosso e le cellule migrate sono state contate al FACS. L'indice di chemiotassi rappresenta il rapporto tra il No. di cellule migrate in presenza di mutanti e quello dovuto alla migrazione spontanea. Tutti i mutanti tranne due, pVU5 e pVU14, sono risultati in grado di indurre la chemiotassi dei monociti seppure soltanto a concentrazioni elevate, comprese tra 100 e 500 ng/ml. Il mutante pVU38 aveva un'efficienza nettamente ridotta rispetto al RANTES nativo. (Figura 4).

Pertanto, mentre per il mutante pVU15 il rapporto fra la minima dose chemotattica e la dose HIV-soppressiva 90% in PBMC era all'incirca 4, per RANTES nativa il medesimo rapporto era conpreso fra 1,0 e 2,9. Esempio 5

Effetto antagonista nei confronti di RANTES

E' stata studiata la capacità del mutante pVU15 di antagonizzare la molecola nativa di RANTES nell'attivazione dei recettori CCR3 e CCR5, misurata come mobilizzazione del calcio intracellulare.

Quando veniva aggiunto immediatamente prima della molecola nativa, pVU15 riduceva la risposta al RANTES nativo con effetto dose-dipendente; nei confronti di CCR5 ad una concentrazione di 500 ng/ml si otteneva la massima inibizione dell’attività del RANTES nativo (Figura 5). Nei confronti di CCR3 la desensibilizzazione del recettore non era completa. Il segnale di fluorescenza, indotto dai cambiamenti di Cà++ intracellulare,è stato monitorato al fluorimetro.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Mutante di RANTES caratterizzato dalla sostituzione, rispetto alla forma "wild type" umana, di almeno un amminoacido nella regione N-terminale, nella regione dell'N-loop o nella regione del "40's-loop" o in tutte e tre le regioni, in grado di antagonizzare in modo competitivo la molecola nativa RANTES, ΜΙΡ-Ια o ΜΙΡ-1β, oppure di antagonizzare l'interazione tra virus HIV ed un recettore per le chemiochine.
2. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la sostituzione è a carico di uno o più dei seguenti amminoacidi: Ser 1,Tyr 3, Ser 4, Ser 5,Asp 6,Arg 17,Arg 44, Lys 45.
3. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detta sostituzione è scelta dal gruppo comprendente: a) sostituzione della Ser 1 con un amminoacido neutro o idrofobico b) sostituzione della Ser 4 con un amminoacido neutro o idrofobico c) sostituzione della Ser 5 con un amminoacido neutro o idrofobico d) sostituzione della Tyr 3 con un amminoacido neutro o idrofobico e) sostituzione dell'Asp 6 con un amminoacido carico positivamente f) sostituzione della Arg 17 con un amminoacido di piccola dimensione e idrofobico g) sostituzione della Arg 44 con un amminoacido carico negativamente h) sostituzione della Lys 45 con un amminoacido carico negativamente.
4. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che dette sostituzioni sono scelte dal gruppo costituito da: a) Ser 1 con Cys b) Ser 4 con Cys c) Ser 5 con Cys d) Tyr 3 con Ala e) Asp 6 con Arg f) Arg 17 con Ala g) Arg 44 con Giu h) Arg 45 con Giu.
5. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto di comprendere una tripla mutazione scelta dal gruppo comprendente: a) Ser 1 con Cys; Ser 5 con con Cys; Asp 6 con Arg b) Ser 1 con Cys; Ser 5 con Cys;Arg 17 con Ala c) Ser 1 con Cys; Ser 5 con Cys;Arg 44 con Giu.
6. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto di comprendere una doppia mutazione scelta dal gruppo comprendente: a) Ser 1 con Cys; Ser 5 con Cys b) Ser 1 con Cys; Ser 4 con Cys c) Ser 1 con Cys e Arg 44 con Glu d) Asp 6 con Arg e Arg 44 con Glu.
7. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto di comprendere una singola mutazione scelta dal gruppo comprendente: a) Tyr 3 con Ala b) Ser 1 con Cys c) Asp 6 con Arg d) Arg 17 con Ala e) Arg 44 con Giu f) Lys 45 con Giu.
8. Mutante di RANTES secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato inoltre dall’aggiunta di uno o due amminoacidi all'N-terminale.
9. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che che detti amminoacidi sono scelti tra Leu,Ala,Cys e Trp.
10. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che viene aggiunta una Cys all'N-terminale e viene sostituita la Ser 4 con Cys.
11. Mutante di RANTES secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che viene aggiunta una Cys all'N-terminale e viene sostituita la Ser 5 con Cys.
12. Peptide derivato dalla sequenza di RANTES nella regione N-terminale, dell'N-loop o del "40's-loop" contenente almeno una delle mutazioni o aggiunte delle rivendicazioni 1-11, in grado di antagonizzare in modo competitivo la molecola nativa RANTES, MIP-Ια o MIP-1-β, oppure di antagonizzare l'interazione tra il virus HIV ed un recettore per le chemiochine.
13. Sequenza nucleotidica codificante per un mutante di RANTES delle rivendicazioni 1-11.
14. Vettore di espressione in cellule eucarlotiche o procariotiche comprendente la sequenza della rivendicazione 13.
15. Composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo una dose HIV-inibente o inibente reazioni allergiche, asmatiche o infia di un mutante delle rivendicazioni 1-11.
16. Composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo una dose HIV-inibente o inibente reazioni allergiche, asmatiche o infiammatorie, di un peptide della rivendicazione 12.
17. Procedimento per la preparazione dei derivati di RANTES delle rivendicazioni 1-11 che conprende la coltura di cellule eucariote trasfettate con vettori di espressione contenenti porzioni di DNA codificanti per detti derivati.
18. Procedimento secondo la rivendicazione 17, in cui detto vettore di espressione è un vettore di espressione di baculovirus.
19. Procedimento secondo la rivendicazione 17, in cui detto vettore di espressione è un vettore di espressione in E. coli.