ITMI971406A1 - Dispositivo immunocromatografico a fissazione dell'analita - Google Patents
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Description
Domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:
"Dispositivo immunocromatografico a fissazione dell'analita. "
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un nuovo dispositivo di analisi immunocromatografica, particolarmente vantaggioso in quanto consente di effettuare determinazioni semiquantitative di uno o più analiti, presenti in campioni biologici.
STATO DALLA TECNICA
Sono noti nello stato dell'arte diversi test diagnostici immunocromatografici per la determinazione della presenza di analiti. basati sul principio di seguito riportato.
Il liquido biologico in esame, generalmente sangue, plasma, siero, urine o liquor, viene depositato presso un'estremità di una striscia cromatografica (generalmente di acetato o nitrato di cellulosa) e migra attraverso tutta la striscia per diffusione cromatografica.
L'analita da evidenziare (antigene) si muove con il liquido biologico e viene catturato immunologicamente da un anticorpo specifico, previamente immobilizzato alla membrana cromatografica in forma di banda.
Un secondo anticorpo specifico per l'analita, marcato con un metallo colloidale o altre sostanze colorate, è deposto, ma non immobilizzato, poco a valle rispetto al punto di deposizione del campione. Esso viene trascinato nella migrazione cromatografica del campione stesso; legandosi all'analita da evidenziare, se questo è presente nel campione; il complesso così fermatosi, durante la migrazione lungo la striscia cromatografica, viene quindi bloccato dall'anticorpo catturante immobilizzato e dà luogo alla formazione di una banda colorata {banda di rilevamento). Il brevetto americano USP 4,855.240 (estratto Derwent) descrive un dispositivo a fase solida per la determinazione qualitativa della presenza di vari analiti, che sfrutta il principio sopra esposto.
Generalmente l'agente marcante è costituito da una sostanza colorata, di cui è possibile rilevare visivamente la presenza in modo agevole e senza l'ausilio di ulteriori apparecchiature.
Ad esempio, il brevetto americano USP 4,703.017 (estratto Derwent) descrive un test immunologico in fase solida (non cromatografico) in cui l'anticorpo marcato, specifico per l'analita da ricercare, è coniugato con particelle di sostanze colorate, osservabili facilmente ad occhio nudo.
Tali sostanze colorate possono essere particelle di metallo colloidale rivestite dall'agente coniugato (si veda ad esempio USP 4,313.734, estratto Derwent), oppure possono essere sostanze colloidali non metalliche (ad esempio selenio, tellurio e zolfo), legate o rivestite dall'anticorpo coniugato (quali quelle descritte in USP 4,954,452, estratto Derwent), o infine sono particelle di lattice colorato, alle quali è adeso 1'anticorpo marcato.
Tali metodi diagnostici presentano tuttavia lo svantaggio di consentire solo delle analisi qualitative "cut off", ossia consentono solo di ottenere un esito positivo o negativo in merito alla presenza od all'assenza dell'analita ricercato; non sono invece in grado di effettuare una determinazione quantitativa o semiquantitativa degli analiti.
Il brevetto americano USP 4,435.504 (estratto Derwent) descrive un metodo di determinazione semiquantitativa di un analita mediante l'uso di tecniche immunoenzimatiche che utilizzano una pluralità di agenti catturanti, specifici per detto analita, ed un coniugato marcato (mediante marcatura enzimatica). Più specificamente, gli agenti catturanti vengono immobilizzati su una striscia cromatografica in bande progressivamente più lontane dall'estremità della striscia cromatografica su cui applicato il coniugato marcato. Dopo aver messo in contatto detta estremità con il campione liquido in esame, in associazione con un opportuno solvente, 1'analita ivi contenuto si lega all'agente marcato ed il complesso a due originatosi migra lungo la striscia cromatografica, fino ad incontrare le varie bande di agente catturante, con cui interagisce. Il livello del fronte della marcatura così ottenuto, rilevabile mediante analisi delle radiazioni elettromagnetiche, è direttamente correiabile alla quantità di analita presente nel campione in esame. Ovviamente, la marcatura con enzimi non dà luogo ad una rilevazione ad occhio nudo, ma richiede metodiche ed apparecchiature complesse.
Tutti i suddetti metodi immunodiagnostici presentano lo svantaggio di necessitare della presenza, oltre che di un agente marcato, anche di uno o più agenti catturanti specifici per 1'analita ricercato, generalmente anticorpi monoclonali. Tali catturanti devono essere immobilizzati sulla membrana cromatografica in modo uniforme e limitatamente alla precisa zona in cui dovrà avvenire la rilevazione; l'immobilizzazione comporta l'uso di tecniche costose e notevoli difficoltà operative.
SOMMARIO
Il Richiedente ha trovato un dispositivo immunocromatografico, per la determinazione in vitro di uno o più analiti, comprendente una membrana cromatografica supportata, ad una estremità della quale è applicato (non immobilizzato), eventualmente mediante un pad assorbente a contatto con detta membrana cromatografica, un agente marcato specifico per detto analita. Tale dispositivo è caratterizzato dal fatto di non presentare alcun agente catturante, specifico per l'analita, immobilizzato sulla membrana cromatografica; non necessita infatti dell'uso di agenti in grado di bloccare l'analita in concomitanza della zona di rilevamento, come richiesto invece dai dispositivi noti nello stato dell'arte. Detto dispositivo può eventualmente presentare uno o più assorbenti in contatto con la seconda estremità della membrana cromatografica; può inoltre presentare una banda di controllo posta a monte di detta seconda estremità della membrana cromatografica.
Il presente dispositivo consente l'impiego diretto da parte dall ’utilizzatore , in modo rapido e semplice, ed offre la possibilità di effettuare analisi semiquantitative di elevata sensibilità ed accuratezza, anche partendo da quantità molto piccole di campione biologico da analizzare.
La presente invenzione riguarda inoltre un metodo immunocromatografico per la determinazione di uno o più analiti che utilizza il suddetto dispositivo; tale metodo comprende: i) l'applicazione di un campione biologico, eventualmente contenente l'analita da ricercare, sul dispositivo dell'invenzione, in una zona intermedia della membrana cromatografica;
ii) l'eluizione dell'agente marcato, applicato ad una estremità della membrana cromatografica, eventualmente tramite un pad assorbente, mediante un opportuno eluente, in grado di far migrare detto agente marcato fino alla zona intermedia in cui è stato applicato l'analita;
iii) la rilevazione del complesso originatosi dall'interazione tra detto analita e detto agente marcato, nella zona intermedia in cui è stato applicato l’analita.
Infine, la presente invenzione riguarda un kit immunocromatografico comprendente il suddetto dispositivo, un opportuno eluente ed, eventualmente, una soluzione di controllo positivo ed un depositatore per l'applicazione del campione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Le caratteristiche ed i vantaggi del dispositivo immunocromatografico, del metodo per il suo utilizzo e del relativo kit, secondo la presente invenzione, saranno maggiormente illustrati nel corso della seguente descrizione dettagliata.
Gli analiti rilevabili mediante il dispositivo dell'invenzione possono essere lipopolisaccaridi, proteine piasmatiche o provenienti da altri campioni biologici, quali ormoni, enzimi, immuno-globuline, allergeni, virus, subunità virali, estratti batterici, tossine, estratti di mitocondri, di nuclei e di membrane cellulari, oppure altri protidi quali DNA, RNA, cromosomi e geni.
Il dispositivo dell'invenzione può essere usato per la rilevazione di ormoni quali hCG (test di gravidanza), FSH (test di pre-ovulazione), LH (test di ovulazione), TSH, T3, T4, prolattina (hPRL) ecc.
Il test può inoltre determinare la presenza di infezioni, nella diagnosi di HIV (II e II), HCV, HBV (rilevando HBcAb, HBclgM, HBeAb, HBeAg, HBsAb o HBsAg), tubercolosi e mononucleosi e della presenza di Salmonella, Escherichia Coli, H. Pylori (rilevando IgG o IgA), Rubella (rilevando IgG o IgM), Clamidia, Streptococchi (Gruppo A e B) ecc.
Inoltre, possono venire rilevati vari aneliti proteici, ad esempio alfa fetoproteina (AFP), antigene prostatico specifico (PSA), markers cardiaci e tumorali, nella diagnosi di varie forme cancerogene, oltre alla presenza di emoglobina occulta nelle feci.
Il dispositivo dell'invenzione si dimostra particolarmente vantaggioso nella determinazione della presenza nelle urine della proteina di Bence Jones, delle catene leggere Kappa e Lambda o miscele di esse, nella diagnosi della proteinuria di Bence Jones; infatti, ad oggi non sono noti nello stato dell'arte dei test immunocromatografici in grado di determinare la presenza di tali proteine.
Inoltre, il dispositivo dell'invenzione consente di rilevare, senza necessità di particolari apparecchiature, farmaci, metaboliti, pesticidi e sostanze inquinanti; è possibile ad esempio verificare l'uso di sostanze stupefacenti o l'abuso di farmaci, quali anfetamine, metanfetamina, barbiturici, benzodiazepine, cannabinoidi, mariuana (THC), cocaina, metadone, morfina, eroina, oppiacei, fenciclidina e loro metaboliti.
I suddetti analiti sono preferibilmente contenuti in liquidi corporei quali urine, liquor, sangue, plasma e siero, o altri campioni biologici quali muco e feci. I campioni possono venire applicati come tali al dispositivo secondo la presente invenzione o possono subire degli opportuni trattamenti preventivi, quali ad esempio estrazioni, nel caso in cui il campione biologico sia costituito da feci.
Tale dispositivo consente anche l'analisi di sostanze colorate o torbide, siano esse in forma di soluzione o di sospensione, senza causare alcuna interferenza con il sistema di rilevamento.
Il dispositivo dell'invenzione non necessita di grandi quantità di campioni da analizzare, essendo talvolta sufficienti quantità dell'ordine del μΐ. La quantità di campione viene opportunamente variata a seconda della dimensione e forma del dispositivo utilizzato.
Con il termine "agente marcato" si indica una sostanza colorata o comunque rilevabile ad occhio nudo, in grado di riconoscere e legarsi in modo specifico all'analita da ricercare. Più specificamente, detto agente può essere costituito da un componente immunologico coniugato con sostanze colorate, legato direttamente o indirettamente a dette sostanze.
Detto componente immunologico è scelto preferibilmente nel gruppo costituito da apteni, antigeni ed anticorpi (preferibilmente monoclonali).
Dette sostanze colorate possono essere particelle colloidali di metalli, quali oro, argento e platino, o di derivati metallici. Oppure dette sostanze colorate possono essere carbone, lattici colorati o particelle colloidali non metalliche, costituite da zolfo, selenio o tellurio.
L'agente marcato è preferibilmente applicato al mezzo cromatografico mediante un pad assorbente, quale ad esempio una carta assorbente o un tessuto di vetro, sovrapposto ed in contatto con la membrana cromatografica stessa. Il pad assorbente non ha soltanto lo scopo di supportare il coniugato marcato ma funge anche da veicolo per l'eluente che ne dovrà provocare l'avanzamento lungo la striscia cromatografica.
Con "membrana cromatografica" si intende un supporto solido poroso, in grado di garantire il passaggio dell 'eluente , e preferibilmente è costituito da una membrana di acetato di cellulosa, nitrocellulosa, nylon o altri materiali adatti alla cromatografia su strato sottile; tali materiali sono supportati, secondo tecniche note nello stato dell'arte.
Alla seconda estremità di detta membrana cromatografica supportata è eventualmente sovrapposto un assorbente a contatto con essa, preferibilmente costituito da carta assorbente, utile per favorire la migrazione cromatografica dell'eluente e dei vari reagenti lungo la membrana cromatografica stessa.
Il dispositivo analitico dell'invenzione può essere realizzato in forma di dipstick, senza alcun involucro rigido, da immergere direttamente nel tampone contenuto in un apposito contenitore. Tale dispositivo può essere inoltre realizzato in forma di striscia alloggiata in un opportuno contenitore rigido, ad esempio di plastica, avente un pozzetto per l'introduzione dell'eluente , da utilizzare orizzontalmente facendo scorrere l’agente marcato lungo la membrana cromatografica supportata (card); il coperchio di detta card presenta preferibilmente un'apertura intermedia per l'applicazione sulla striscia cromatografica del campione biologico e per il controllo dello scorrimento dei reagenti.
I suddetti dispositivi, sia in forma di card che di dipstick, possono venire vantaggiosamente conservati in opportuni involucri e possono venire contrassegnati con i dati dell'utilizzatore o altre annotazioni utili.
In Figura la è riportata una vista in pianta della parte esterna del dispositivo l'invenzione, in forma di card secondo un modo preferito di realizzazione, mentre in Figura 1b è riportata una vista in pianta della parte interna della card. Il dispositivo è costituto da una membrana cromatografica supportata 1 in forma di striscia, fissata su un supporto rigido 2 mediante delle guide laterali interne 3; l'agente marcato (banda 4) è applicato al pad assorbente 5, in contatto con una prima estremità della membrana cromatografica 1, che presenta inoltre una membrana assorbente 6, in contatto con la sua seconda estremità. Su detto supporto rigido 2 è sigillato un coperchio 7, presentante una finestra rettangolare 8, che consente la deposizione del campione da analizzare in concomitanza della banda 9 (banda di rilevamento) ed il controllo dello scorrimento dei reagenti, ed un pozzetto rotondo 10, che consente l'applicazione dell'eluente sulla striscia cromatografica 1; è inoltre presente inoltre una banda di controllo 11.
Infatti, il dispositivo dell'invenzione può presentare una banda di controllo posta tra la zona intermedia di deposizione del campione e la seconda estremità della membrana cromatografica supportata; su detta banda viene immobilizzato un analita od un suo analogo, in grado di dare sicuramente una risposta positiva al contatto con l'agente marcato. Al termine dell'effettuazione del test, l'assenza di colorazione della banda di controllo è indice di deterioramento della membrana e pertanto del mancato funzionamento del dispositivo dell'invenzione.
Il dispositivo dell'invenzione può presentare un applicatone, nel’la zona intermedia della membrana cromatografica supportata in cui verrà depositato il campione da esaminare; detto applicatone può servire per alloggiare il materiale biologico (sangue, muco ecc.) in cui è contenuto il campione liquido da analizzare. Sulla membrana cromatografica supportata può inoltre essere posto un filtro, per evitare l'accumulo di materiale particellare sul mezzo cromatografico.
Il dispositivo secondo la presente invenzione presenta numerosi vantaggi rispetto alle tecniche note nello stato dell'arte.
Innanzitutto, non necessita dell'uso di agenti catturanti, indispensabili nei dispositivi ad oggi noti; nello stato dell'arte tali catturanti, immobilizzati sul mezzo cromatografico in concomitanza della banda test, sono necessari per poter bloccare l'eventuale complesso analita/agente marcato, durante la migrazione lungo la striscia cromatografica. L'eliminazione dell'agente catturante comporta un notevole risparmio economico, oltre ad evitare laboriose e complesse tecniche di immobilizzazione.
In secondo luogo, l'invenzione rende possibile l'effettuazione di determinazioni semiquantitative, senza l'ausilio di ulteriori strumenti o calibrazioni. Infatti, è possibile depositare il campione da analizzare in diverse zone (bande) intermedie della membrana cromatografica supportata, a diluizioni crescenti; la positività a diluizione maggiore rappresenta l'indice della concentrazione dell'analita nel campione. Infatti, conoscendo la sensibilità del test diagnostico, sarà nota la concentrazione di analita corrispondente alla banda fino alla quale è possibile rilevare la marcatura. Tale determinazione non è consentita dai metodi cromatografici noti nello stato dell'arte, se non utilizzando contemporaneamente diversi test.
Il test può essere impiegato direttamente ed in modo semplice e rapido da qualsiasi utilizzatore, anche non esperto, dando luogo a risultati chiari e facilmente interpretabili, accurati e riproducibili. L'effettuazione del test, dotato di elevata sensibilità, richiede un tempo variabile da 5 a 10 minuti. Non è richiesto l'uso di speciali contenitori o mezzi di trasferimento dei campioni liquidi da analizzare e l'operazione di semina del campione sul mezzo cromatografico risulta particolarmente semplice e rapido.
Infine, per la suddetta analisi sono sufficienti quantità molto piccole del campione biologico da analizzare, dell'ordine anche del μl; pertanto, tale metodo è vantaggiosamente applicabile anche nel caso in cui non siano disponibili grandi quantità di campione.
Il metodo immunocromatografico secondo la presente invenzione sfrutta l'uso del dispositivo analitico sopra descritto, su cui l'agente marcato è stato preventivamente depositato (e non immobilizzato), ad una prima estremità della membrana cromatografica supportata.
Durante l'effettuazione dell'analisi, una determinata quantità del campione da esaminare viene depositata, direttamente dall 'utilizzatore , in una zona intermedia della membrana cromatografica, dove sarà rilevata la banda di rilevamento colorata, in caso di esito positivo.
Dopo la semina del campione, questo viene preferibilmente essiccato, ad esempio mediante un getto d'aria calda (riscaldando con-un phon).
L'utilizzatore stesso deposita quindi un'opportuna quantità di eluente alla prima estremità della membrana cromatografica supportata, in modo che l'eluente migri lungo la striscia cromatografica dalla prima estremità alla seconda estremità, trascinando con sè l'agente marcato.
Detto eluente può essere un tampone organico o inorganico (borato, PBS, Tris-HCl ecc.) contenente uno o più tensioattivi quali Triton (Rohm and Haas Company), Tween 20@ (ICI Americas Ine.). PVP, PVA e Brij® (ICI PLC). La scelta del tampone varia in funzione dell'analita da ricercare e dell'agente marcato, in modo che entrambi avanzino lungo la striscia cromatografica in modo omogeneo. Nel caso venga determinata la presenza della proteina di Bence Jones nelle urine, viene preferibilmente utilizzato un tampone PBS a pH fisiologico, contenente Tween 20 allo 0,5-55%. Triton X allo 0~53⁄4P e PVP allo 0-5%P-La quantità di eluente varia opportunamente a seconda della dimensione e forma del dispositivo utilizzato.
Quando l'agente marcato raggiunge la zona intermedia, ove è stato depositato il campione biologico contenente l'analita ricercato, esso interagisce con quest'ultimo, generando una banda colorata rilevabile ad occhio nudo (risultato del test positivo). Nel caso invece il campione biologico non contenga l'analita ricercato, non si osserva la formazione di alcuna banda di rilevamento (risultato negativo).
Nel caso di risposta positiva, l'intensità della colorazione sviluppatasi sulla banda di rilevamento è proporzionale alla concentrazione del complesso analita/agente marcato (dipendente dalla quantità di analita presente nel campione analizzato).
Come sopra descritto, tale metodo offre la possibilità di effettuare non solo la tradizionale analisi qualitativa a "cut off", ma anche determinazioni semiquantitative: in questo caso, 1'utilizzatore dovrà seminare più volte il campione da analizzare in diverse zone intermedie (bande) della membrana cromatografica.
a diluizioni progressivamente crescenti e comunque ben determinate; osservando fino a che banda è rilevabile la marcatura, sarà direttamente determinata la concentrazione dell'analita nel campione in esame (conoscendo a priori la sensibilità del test analitico).
Secondo tale metodo, il campione biologico può subire degli opportuni pretrattamenti, prima della semina, quale ad esempio una fase di estrazione, utile nel caso in cui il campione sia costituito da feci o muco non direttamente applicabili come tali al dispositivo dell'invenzione.
Infine, la presente invenzione riguarda un kit immunocromatografico comprendente il dispositivo analìtico sopra descritto, un opportuno eluente ed, eventualmente, una soluzione di controllo positivo.
Detto kit può inoltre contenere un depositatore, quale un microcapillare, una micropipetta o un depositatore "tipo elettroforesi" (costituito da una doppia lamina metallica), per seminare il campione sul dispositivo dell'invenzione poiché devono venire seminate piccole quantità di campione.
Nel caso in cui i campioni'biologici da analizzare debbano subire dei pretrattamenti, quale ad esempio una fase di estrazione, detto kit può vantaggiosamente contenere un opportuno tampone per prelevare il campione biologico (utile nel caso il campione debba essere prelevato dalla gola, dalla vagina, dal canale cervicale o uretrale); in questo caso, il kit può comprendere anche una provetta munita di gocciolatore, contenente un opportuno liquido di estrazione in cui viene immerso il tampone con cui è stato prelevato il campione.
A scopo illustrativo ma non limitativo della presente invenzione, viene riportato il seguente esempio.
Determinazione della proteina di Bence Jones e delle catene Kappa e Lambda nelle urine.
E' stata effettuata un'analisi immunocromatografica utilizzando il dispositivo ed il metodo secondo la presente invenzione, allo scopo di determinare la presenza in un campione di urine della proteina di Bence Jones o singolarmente delle catene Kappa e Lambda.
Materiali e Metodi
Campione: il test è stato effettuato con urina diluita, senza preventiva centrifugazione o filtrazione (l'urina presenta generalmente una stabilità pari a 7 gg a 2-8°C, mentre è stabile per diversi mesi a -20°C).
Fase solida: una membrana cromatografica di nitrato di cellulosa è stata incollata ad un supporto solido di polivinilcloruro (PVC). Ad una prima estremità della membrana è stato incollato un pad di tessuto di vetro, su cui è stato successivamente depositato 1'anticorpo coniugato, marcato con oro colloidale (miscela di Goat anti-human Kappa conjugated to colloidal gold, cod. CG 1589. e Goat anti-human Lambda conjugated to colloidal gold, cod. CG 1599. American Qualex, 1997)·
Prima della deposizione dell'anticorpo coniugato marcato, la carta è stata imbevuta con PBS a pH circa fisiologico e quindi essiccata. Dopo deposizione del coniugato marcato, questo è stato essiccato.
Alla seconda estremità della membrana è stata posta della carta assorbente che ha la funzione di assorbire il materiale cromatografico .
La fase solida così ottenuta è stata utilizzata come tale, immergendone la prima estremità in un pozzetto contenente un'opportuna quantità di tampone (dipstick); in un secondo caso, la fase solida sopra descritta è stata allocata in una scatola prestampata (card), presentante un apposito foro per l'aggiunta del tampone (il dispositivo ottenuto è analogo a quello riportato in -Figura 1).
Banda di controllo: alla membrana filtrante, in corrispondenza della parte terminale della finestra nel caso della card, è stato depositato 1'anticorpo Antisheep goat, IgG fraction, SILENUS, cod. UC, 1997. capace di legare l'agente marcato.
Eluente : come eluente è stato utilizzato un tampone comprendente PBS pH = 7,4 (±3), Tween 20 allo 1,5%P. Triton X 100 allo 0,5%p e PVP al 2,5%p.
Depositatore del campione: è stato utilizzato un depositatore costituito da una doppia lamina metallica alla quale è stato legato per capillarità 1 pi di urina, successivamente depositato sulla membrana cromatografica.
Procedimento
I reattivi ed i campioni sono stati utilizzati a temperatura ambiente. 1 μΐ di urina in esame è stato depositato al centro della finestra della card, come riportata in figura 1, o al centro del dipstick, al di sotto della banda di controllo; per ottenere una buona sensibilità, la deposizione è stata effettuata ad un'umidità relativa non inferiore al 40-45%· Il campione depositato è stato quindi seccato mediante il getto d’aria calda di un phon.
Nel caso della card, sono state aggiunte 5 gocce di eluente nel pozzetto e la card è stata posta su un piano orizzontale per 10 minuti. Nel caso del dipstick, 5 gocce di eluente sono state poste in un opportuno contenitore ed il dipstick è stato immerso in tale contenitore in posizione verticale a 70-80 gradi, per un tempo di 10 minuti.
Procedimento per analisi contrastografiche
Per poter effettuare analisi contrastografiche, è generalmente richiesta dal radiologo una concentrazione urinaria della proteina di Bence Jones non superiore a 50-100 mg/dl. Il campione di urina è stato pertanto diluito 1/10 (1 parte di urina 9 parti di fisiologica); mediante una micropipetta o un depositatone lineare l'urina è stata quindi seminata sulla membrana cromatografica, appena al di sotto della banda di controllo. Si è quindi proceduto come sopra descritto. La sensibilità ottenuta è stata di circa 50-100 mg/dl.
Procedimento a doppio "cut off"
Per ottenere sia alte che basse sensibilità, sono stati depositati 1 pi di urina diluita come descritto precedentemente ed 1 pi di urina indiluita, appena sopra alla deposizione dell'urina diluita. Si è quindi proceduto come sopra descritto. Risultati
La formazione di un'unica banda corrispondente alla parte terminale della finestra (banda di controllo) è stata indicativa del fatto che la concentrazione delle catene Kappa e Lambda nelle urine è inferiore alla soglia (esito negativo).
L'eventuale presenza della proteina di Bence Jones nel campione analizzato ha determinato invece la formazione di una banda colorata (banda test) nella zona intermedia della striscia cromatografica in cui il campione di urine è stato seminato. Più specificamente, se la concentrazione di catene Kappa e Lambda nelle urine era superiore a 5 mg/ml (urine indiluite) o superiore a 50 mg/ml (urina diluita 10 volte), si è assistito alla formazione entro 10 minuti di una banda colorata ove era stato seminato il campione.
Sensibilità: per le urine non trattate, la sensibilità è risultata pari a circa 5-10 mg/dl; per le urine diluite 10 volte con fisiologica, la sensibilità è risultata pari a 50-100 mg/dl. Valori attesi
Urine normali hanno dato un segnale negativo anche quando il test è stato utilizzato per.analisi ad alta sensibilità. In caso di positività per danno renale (specie di natura tubulare) o per superamento del carico tubulare massimo (presenza di mieloma) è stata rilevata invece la doppia banda (esito positivo).
Nel caso di analisi effettuate ai fini contrastografici, la negatività deve risultare con la diluizione 1:10.
Claims (23)
- RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo immunocromatografico per la determinazione in vitro di uno o più analiti, comprendente una membrana cromatografica supportata, ad una estremità della quale è applicato un agente marcato, specifico per detto analita, caratterizzato dal fatto di non presentare alcun agente catturante, specifico per l'analita, immobilizzato sulla membrana cromatografica.
- 2. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto agente marcato è applicato su un pad assorbente a contatto con l'estremità della membrana cromatografica supportata.
- 3. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di presentare uno o più assorbenti in contatto con la seconda estremità della membrana cromatografica.
- 4. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di presentare una banda di controlla posta a monte della seconda estremità della membrana cromatografica supportata.
- 5. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta membrana-cromatografica è costituita di acetato di cellulosa, nitrocellulosa o nylon.
- 6. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto agente marcato è un componente immunologico coniugato con sostanze colorate e che detto pad assorbente è costituito di carta assorbente o tessuto di vetro.
- 7- Il dispositivo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto componente immunologico è scelto nel gruppo costituito da apteni, antigeni ed anticorpi e che dette sostanze colorate sono particelle colloidali di oro, argento, platino, derivati metallici, zolfo, selenio o tellurio, oppure sono carbone o lattici colorati.
- 8, Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere in forma di card o dipstick.
- 9- Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di presentare sulla membrana cromatografica supportata un applicatore per il campione biologico da analizzare ed eventualmente un filtro.
- 10. Metodo immunocromatografico per la determinazione di uno o più analiti, comprendente: i) l'applicazione di un campione biologico, eventualmente contenente detto analita, su un dispositivo come descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9. in una zona intermedia della membrana cromatografica supportata; ii) l'eluizione dell'agente marcato, applicato ad una estremità della membrana cromatografica supportata, con un opportuno eluente in grado di fare migrare detto agente marcato fino alla zona intermedia in cui è stato applicato l'analita; iii) la rilevazione del complesso originatosi dall'interazione tra detto analita e detto agente marcato, nella zona intermedia in cui è stato applicato 1'analita.
- 11. Il metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto analita è scelto nel gruppo costituito da lipopolisaccaridi , sostanze proteiche, protidi, farmaci, pesticidi, sostanze inquinanti e loro metaboliti.
- 12. Il metodo secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che dette sostanze proteiche sono scelte nel gruppo costituito da ormoni, enzimi, immuno-globuline, allergeni, virus, subunità virali, estratti batterici, tossine, estratti di mitocondri, di nuclei e di membrane cellulari, e che detti protidi sono scelti nel gruppo costituito da DNA, RNA, cromosomi e geni.
- 13· Il metodo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detti ormoni sono scelti nel gruppo costituito da hCG, FSH, LH, TSH, T3, T4 e hPRL.
- 14. Il metodo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detti farmaci sono scelti nel gruppo costituito da anfetamine, metanfetamina , barbiturici, benzodiazepine , cannabinoidi, mariuana (THC), cocaina, metadone, morfina, eroina, oppiacei e fenciclidina.
- 15·. Il metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto analita è costituito dalla proteina di Bence Jones, dalle catene Kappa e Lambda o loro miscele.
- 16. Il metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detti analiti sono anticorpi specifici per HIV (II e II), HCV. HBV, tubercolosi, mononucleosi, Salmonella, Escherichia Col-i, H. Pylori, Rubella, Clamidia e Streptococchi.
- 17. Il metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto campione biologico è un liquido corporeo scelto tra urine, liquor, sangue, plasma e siero, oppure è costituito da muco o feci.
- 18. Il metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che, dopo lo stadio (i), il campione biologico applicato sul dispositivo viene opportunamente essiccato.
- 19. Il metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (ii), detto eluente è un tampone organico o inorganico, contenente uno o più tensioattivi.
- 20. Il metodo secondo le rivendicazione 19. caratterizzato dal fatto che detto tampone è costituito da PBS a pH fisiologico, contenente Tween 20 allo 0,5-5%P. Triton X allo 0-5%P e PVP allo
- 21. Il metodo secondo la rivendicazione 10, per la diagnosi della proteinuria di Bence Jones.
- 22. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 10 a 21, caratterizzato dal fatto che, nello stadio (i), detto campione biologico viene applicato in diverse bande intermedie della membrana cromatografica supportata, a diluizioni progressivamente crescenti, per la determinazione semiquantitativa dell'analita.
- 23. Kit immunocromatografico comprendente un dispositivo come descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9. un opportuno eluente ed, eventualmente, una soluzione di controllo positivo ed un depositatone per l’applicazione del campione.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| IT97MI001406A IT1292163B1 (it) | 1997-06-13 | 1997-06-13 | Dispositivo immunocromatografico a fissazione dell'analita |
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Applications Claiming Priority (1)
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| IT97MI001406A IT1292163B1 (it) | 1997-06-13 | 1997-06-13 | Dispositivo immunocromatografico a fissazione dell'analita |
Publications (3)
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| IT1292163B1 IT1292163B1 (it) | 1999-01-25 |
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