ITMI940921A1 - Derivati di combretastatine ad attivita' anti-tumorale e procedimento per la loro preparazione - Google Patents

Derivati di combretastatine ad attivita' anti-tumorale e procedimento per la loro preparazione Download PDF

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ITMI940921A1
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Barbara Bellini
Francesca Pelizzoni
Marco Prosdomici
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Univ Degli Studi Milano
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Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
Derivati di combretastatine ad attività anti-tumorale e procedimento per la loro preparazione.
1. Campo dell'invenzione
L'invenzione si riferisce a derivati β-glucopiranosidici delle combretastatine ad attività anti-tumorale, al procedimento per la loro preparazione e alle composizioni farmaceutiche che li contengono.
2. Stato della tecnica
Le Combretacee sono delle piante diffuse nelle aree tropicali e subtropicali dove vengono utilizzate nella pratica medica indigena. Diversi composti sono stati ottenuti dal genere Combretum, in particolare triterpenoidi da C. molle. C. padoides. e C. eleagnoides. fenantreni da C. hereroense. C. psidioides, C. apiculatum. e C. caffrum, amino acidi da C. zeyheri .Negli ultimi anni sono state isolate da C. caffrum. due combretastatine. definite Al e B1 {Pettit et al., Journal of Naturai Products, voi. 50. No. 1, pp. 119-131. 1987) mostranti un'attività antitumorale, in vitro. Dette combretastatine Al e B1 inibiscono la crescita cellulare in test in vitro. Esse inibiscono, inoltre, la polimerizzazione della tubulina e quindi l'assemblamento dei microtubuli. Chem. Abst. 115. l89740y descrive la combretastatine A-4, isolata da C. caffrum, come un composto ad azione antitumorale. Detta combretastatina è un inibitore della polimerizzazione della tubulina. La struttura molecolare di detta combretastatina è stata determinata mediante tecniche spettrali e confermata mediante sintesi.
Sono noti alcuni derivati 2'-Ο-β-glucopiranosidici di combretastatine aventi attività antitumorale {F. Pelizzoni et al., Naturai Products lette rs. Voi. 1(4), pag. 273-280, 1993)·
Il problema tecnico
La continua necessità di disporre sul mercato di nuovi farmaci per la terapia anti-tumorale conduce alla ricerca e alla individuazione di sempre più numerose sostanze che possano trovare applicazione nella lotta contro i tumori.
Sommario
La presente invenzione si riferisce a derivati 3,-0-β
dove = H oppure CH3, R2 ed R3. uguali o diversi fra loro, possono essere H oppure -CO-B, dove B è un alchile saturo C1-C6, lineare o ramificato, e A è un radicale bivalente a due atomi di carbonio scelto tra -CH2-CH2- e -CH=CH-.
1 composti contenenti il residuo etilenico possono essere sia gli isomeri "E", che gli isomeri "Z".
Nel presente testo i legami β-glicosidici sono indicati in grassetto, mentre i legami α-glicosidici sono indicati a linee tratteggiate.
I derivati secondo l'invenzione hanno una interessante attività anti-tumorale e quindi sono particolarmente utili come principi attivi per la preparazione di composizioni farmaceutiche aventi tale scopo.
In particolare, i derivati dell'invenzione mostrano una significativa attività in vitro nell’inibire la crescita di cellule tumorali di topo L1210 ed una inattesa selettività di azione antitumorale nei confronti dell 'adenocarcinoma intestinale.
I derivati glucopiranosidi di formula (I) in cui R2=H sono facilmente solubili in soluzione acquosa, e questo è un aspetto vantaggioso dal punto di vista della loro somministrazione terapeutica.
I presenti derivati glucopiranosidi delle combretastatine presentano presumibilmente un meccanismo di azione diverso da quello delle combretastatine agluconate.
I suddetti derivati di formula (I) sono preparati secondo un procedimento che costituisce un ulteriore aspetto fondamentale della presente invenzione, che prevede la glicosilazione dell'aglicone corrispondente con opportuni derivati dell'α- o βglucopiranosio.
In particolare, i presenti derivati di formula (I) possono essere preparati secondo la variante A''), facendo reagire l'aglicone di formula (II)
in cui A e hanno il significato sopra visto, con il solfossido del β-tioglucopiranoside di formula (III)
in cui R2 è -CO-B, dove B è un alchile saturo lineare o ramificato C1-C6, e Ar è un residuo idrocarburico aromatico.
Si ottiene così il composto di formula (I) in cui R2 è -CO-B, dove B è un alchile saturo lineare o ramificato C1-C6.
Il residuo Ar è generalmente un gruppo aromatico il cui anello ha da 6 a 10 atomi di carbonio, ad esempio un fenile o un naftile, eventualmente sostituito con uno o più gruppi che non interferiscono con le successsive condizioni di reazione, quali ad esempio residui alchilici saturi C1-C6, lineari o ramificati. Tipicamente, Ar è fenile.
La reazione fra l'aglicone di formula (II) e il composto di formula (III) è condotta in presenza di una anidride di acido alcansolfonico e di una base organica, in un solvente organico aprotico anidro, in atmosfera di gas inerte, mettendo a contatto in una prima fase i reattivi di formula (II) e (III), la base e l'anidride ad una temperatura compresa fra -78°C e -60 °C, ed riscaldando in una seconda fase la miscela di reazione a temperatura ambiente (tipicamente fra 20° e 30°C).
In genere, la prima fase a bassa temperatura ha una durata di 0,5-3 ore. mentre la seconda fase di 12-24 ore.
Nella prima fase a bassa temperatura si attiva il solfossido con l'anidride di acido alcansolfonico.
La lavorazione della miscela di reazione è generalmente effettuata per lavaggio con acqua alcalina, ed il prodotto isolato per evaporazione della fase organica.
La reazione di glicosilazione può essere effettuata secondo una variante A', facendo reagire l'aglicone di formula (II) con l'a-D-alogeno glucopiranosil derivato di formula (IV)
in cui R2 è CO-B, e B è un alchile saturo o ramificato C1-C6, e X è un gruppo uscente scelto fra Br e Cl, in presenza di una base inorganica forte, in solvente organico aprotico, a temperatura ambiente (generalmente compresa fra 20° e 30°C).
Per ottenere i derivati di formula (I) in cui R2 è H, si sottopongono i derivati acilati ottenuti,secondo le varianti A' o A'' ad un passaggio B di deacilazione, effettuato in ambiente alcalino anidro, mediante trattamento con un alcossido alcalino in solvente alcoolico, a temperatura ambiente {generalmente compresa fra 20° e 30°C), neutralizzando a fine reazione la eventuale base in eccesso mediante aggiunta di un acido.
La neutralizzazione della base in eccesso è preferibilmente effettuata con una resina a carattere acido.
E' interessante notare che la preparazione dei presenti derivati 3'-Ο-β-glucopiranosidici secondo la variante A' porta al loro ottenimento in miscela con i corrispondenti isomeri 2*-0-glucopiranosidici, mentre questi ultimi non sono si riscontrano operando secondo la variante A''.
I presenti derivati possono essere separati dai loro isomeri mediante le tecniche di purificazione più avanti indicate.
Un'ulteriore caratteristica fondamentale della presente invenzione è costituita da una composizione farmaceutica ad attività anti-tumorale comprendente come principio attivo una dose efficace di almeno uno dei composti di formula generale (I) sopra riportata, in combinazione con adatti eccipienti e diluenti farmaceuticamente accettabili.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
I presenti composti di formula (I) sono derivati 3'-0-βglucopiranosidici delle combretastatine Al, B1 e B5, la cui struttura è riportata sotto:
FORMULA II
- combretestatina Al: R1CH3; A= -CH=CH-;
- combretastatina B1: R1=CH3; A= -CH2-CH2-;
- combretastatina B5: R1=H; A= -CH2-CH2-.
I derivati della presente invenzione sono gli isomeri 3,-0-β-D-glucopiranosidici dei derivati 2'-Ο-β-D-glucopiranosidici di combretastatine descritti in Naturai Products letters. Voi. 1(4), pag. 273-280, 1993-I derivati di formula (I) in cui, oltre ai gruppi R2, anche i gruppi R-j sono residui acilici -C0B, in cui B ha il significato sopra visto, possono essere preparati dai corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 e R3 sono H, oppure dai corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 è -C0B e è H, ottenuti dai passaggi A' o A’', per trattamento con un alogenuro (cloruro o bromuro) o con una anidride dell'acido carbossilico corrispondente (B-COOH, dove B è definito come sopra), conducendo la reazione in presenza di una base, (ad esempio trietilammina, piridina), in quantità catalitica quando si usa una anidride ed in quantità almeno stechiometrica quando si usa detto alogenuro, eventualmente in presenza di un diluente o solvente inerte nelle condizioni di reazione (ad esempio etere etilico, toluene, solventi alogenati), a temperature tipicamente comprese fra -20° e 60°C.
Ad esempio, i derivati di formula (I) in cui R2 = R3= -COCH3 possono essere preparati deli corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 e R3 sono H, oppure dai corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 è -COCH3, per trattamento con anidride acetica, preferibilmente in eccesso rispetto allo stechiometrico, in piridina (utilizzata come solvente), a temperatura ambiente (ad esempio, fra 20’ e 30'C).
Nel presente testo sono descritti in particolare i seguenti derivati di formula (I):
- derivato di formula (I) in cui A è R1 è CH3 e R2=R3=H;
- derivato di formula (I) in cui A è -CH2-CH2-, Rl è CH3, R2 è -COCH3 e R3 è H; - derivato di formula (I) in cui A è -CH2-CH2-, R1 è CH3, R2=R3= -COCH3.
Gli agliconi di formula (II) sono composti noti e possono essere preparati con metodologie già descritte in letteratura (F. Pelizzoni et al., Naturai Products lettera, Voi. 1(4), pag. 273-280, 1993).
Il solfossido di formula (III) in cui R2 è acetile è un composto noto e può essere preparato, analogamente agli altri derivati acilati di formula (III), seguendo il procedimento descritto da N. Ikemoto, S.L. Schreiberg in J. Am. Chem. Soc., il4, 2524-2536, 1992.
L'uso di solfossidi in reazioni di glicosilazione è noto ed è stato descritto da D. Kahne, S. Walker, Yuan Cheng, D. Van Engen, J. Am. Chem. Soc.. 111. 6881-6882, 1989.
L'anidride di acido alcansolfonico preferibilmente utilizzata è l'anidride triflica.
Le basi organiche preferibilmente utilizzate sono basi eterocicliche aromatiche non nucleofile, preferibilmente piridine sostituite nelle posizioni adiacenti all'azoto con gruppi stericamente ingombranti quali i gruppi ter-butilici, quali la 2,6-di-tert-butil-4-metilpiridina. Possono essere altresì utilizzate altre basi non nucleofile.
I solventi organici aprotici utilizzabili nel procedimento dell'invenzione sono in genere solventi di media o bassa polarità, in cui i reattivi hanno buona solubilità anche alle basse temperature richieste nella prima fase della reazione.
Sono preferiti i solventi aprotici alogenati, in particolare cloruro di metilene, cloroformio ed altri solventi quali idrocarburi alifatici (n-esano, eptano) o aliciclici (cicloesano), oppure nitrili (acetonitrile).
In condizioni preferite del presente processo, la reazione secondo la variante A è effettuata utilizzando il solfossido di formula (III) in cui Ar = fenile (Ph); l'anidride è l’anidride trifluorometansolfonica {anidride triflica), la base è 2,6-ditert-butil-4-metilpiridina; il solvente aprotico è cloruro di metilene. In condizioni tipiche, il solfossido è quello in cui R2= -CH3CO.
La glicosilazione secondo la variante A' è in particolare effettuata aggiungendo l'anidride di acido alcansolfonico, generalmente sciolta nell’opportuno solvente, al solfossido di formula (III), anch'esso in forma di soluzione, ad una temperatura compresa fra -78" e -60°C. Alla miscela cosi ottenuta si aggiunge l'aglicone di formula (II), generalmente in soluzione nel solvente aprotico prescelto, e in ultimo la base organica, mantenendo sempre la temperatura della miscela di reazione fra -78" e -60 °C, e si riscalda quindi a temperatura ambiente (in genere dopo circa due ore).
Questa modalità di aggiunta dei reattivi è critica per la buona riuscita della reazione.
Il solfossido di formula (III), la base e l'anidride sono preferibilmente usati in quantità almeno stechiometrica rispetto all'aglicone, generalmente compresa fra 1,1 e 2,0 moli per mole. Nella condensazione secondo la variante A', la scelta del gruppo X del derivato β-glucopiranosidico e delle condizioni generali di reazione (polarità del solvente, tipo di base) è critica, in quanto la sostituzione del gruppo X con il residuo dell'aglicone deve verificarsi con inversione di configurazione al carbonio che porta il gruppo X.
In condizioni preferite della presente invenzione si utilizza il derivato di formula (IV) in cui X è Br.
Si utilizza ad esempio il derivato di formula (IV) in cui X è Br e R2 è -COCH3, che è un composto noto (The Merck Index, Merck & Co., Ine., Rahway N.J. USA, llth Ed., 1989) .
Come basi si utilizzano preferibilmente idrossidi alcalini (NaOH, KOH), idruri alcalini (NaH, KH) o alcalino-terrosi.
La reazione può essere condotta in vari solventi aprotici, generalmente di media polarità, ad esempio eteri (quali etere etilico, tetraidrofurano); acetone; dimetossietano; idrocarburi alifatici (n-esano, eptano) o aliciclici (cicloesano); esametilfosforotriamide (HMPT).
Quando si utilizzano gli idrossidi, si opera in presenza di acqua. Ad esempio, secondo una forma di realizzazione tipica della presente invenzione, si aggiunge una soluzione acquosa di un idrossido, ad esempio NaOH 0,3 M, all'aglicone di fromula (II), sciolto nel solvente di reazione (ad esempio acetone), quindi si aggiunge il derivato di formula (IV), che può essere sciolto anch'esso nello stesso solvente di reazione.
In condizioni preferite, nel presente processo si utilizza come base inorganica un idruro alcalino o alcalino terroso (ad esempio KH, NaH), conducendo la reazione in ambiente anidro.
Quando si opera in condizioni anidre, la reazione può essere convenientemente effettuata in presenza di crown-eteri, che svolgono funzione catalitica. Ad esempio, quando si usano sali di potassio si utilizza il 18-C-6, generalmente utilizzati in quantità variabile dal 2 al 20 % in moli rispetto al reattivo di formula (II).
Le condizioni di deacetilazione e di successiva lavorazione della miscela di reazione sono critiche, in quanto vanno accuratamente evitati i trattamenti acidi in ambiente acquoso che porterebbero facilmente alla decomposizione dei derivati di formula (I) per idrolisi del legame glicosidico.
La deacilazione è preferibilmente effettuata utilizzando come alcossido il inetilato di sodio o di potassio o l'etilato di sodio o di potassio, e come alcool metanolo o etanolo; tipicamente si utilizza metilato sodico in metanolo. La neutralizzazione dopo deacilazione è preferibilmente effettuata con con una resina a scambio ionico a carattere fortemente acido, ad esempio una resina a matrice polistirenica, con gruppi funzionali solfonici, nella forma H+, quale la resina Dowex W50x8.
L'uso delle resine permette di controllare l'acidità della soluzione organica contenente il prodotto di reazione, consentendo la facile eliminazione per filtrazione dell'acidità in eccesso. La presenza di acidità in eccesso è indesiderata nelle successive fasi di isolamento del prodotto, che è acidolabile.
Il reattivo di formula (IV) e la base sono usati in quantità almeno stechiometrica rispetto all’aglicone, preferibilmente compresa fra 1,1 e 2,0 moli per mole.
I derivati di formula (I), sia acilati che non, possono essere purificati con varie tecniche, ad esempio mediante cromatografia e cristallizzazione.
Preferibilmente, la purificazione cromatografica è effettuata con la tecnica della flash-cromatografia su gel di silice, utilizzando come eluente miscele di solventi idrocarburici e di un solvente più polare, ad esempio etile acetato o solventi clorurati, quali CH2CI2 o CHCl3.
Può essere anche utlizzata la tecnica della cromatografia preparativa a fase invertita, utilizzando come eluenti solventi ad elevata polarità. Possono essere a tale scopo utilizzate fasi stazionarie di gel di silice funzionalizzate con catene idrocarburiche C8-C18 e come eluenti acqua, alcooli, acetonitrile e loro miscele.
La cristallizzazione è preferibilmente effettuata da solventi alcoolici, ad esempio da metanolo.
Le frazioni cromatografiche contenenti il prodotto desiderato sono saggiate mediante TLC o HPLC.
Le composizioni farmaceutiche contenenti i derivati dell'invenzione possono essere realizzate secondo tecniche convenzionali, quelli quelle descritte per esempio in "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", Hack Publishing Co., USA, 16 Ed.(1980).
I derivati dell'invenzione possono essere somministrati per via parenterale, in forma di preparazioni iniettabili, sciolti o sospesi in diluenti farmacologicamente accettabili, con un veicolo come l'acqua o un olio, con o senza l'aggiunta di altri componenti.
Gli olii che possono essere impiegati sono di origine vegetale, animale o minerale o sintetica quali olio di arachidi, olio di soia e olio minerale.
Generalmente come veicolo per le soluzioni iniettabili si possono utilizzare acqua, soluzioni acquose di sali minerali, soluzioni acquose di destrosio o di altri zuccheri, etanolo, glicoli quale il glicole propilenico o polietilenico.
I veicoli acquosi sono vantaggiosamente utilizzati data la solubilità in acqua dei presenti derivati β-glucopiranosidici di combretastatine.
Vengono di seguito riportati alcuni esempi di preparazione a scopo illustrativo ma non limitativo della presente invenzione. Gli spettri 1H e 13C NMR sono stati misurati mediante spettrometri Bruker , rispettivamente a 200MHz e 300MHz , usando TMS come standard interno.
Esempio 1
Preparazione del 3 ' -O-β-glucopiranoside di formula (I) in cui CH3. A= -CH2CH2- , R2 = -COCH3 e R3=H (variante A" ) .
Prima di effettuare la reazione, la combretastatina B1 ed il solfossido di formula ( III ) in cui Ar=Ph e R2= -COCH3 sono sciolti in toluene e le soluzioni evaporate ripetutamente a secchezza per eliminare ogni traccia di acqua.
Tutte le operazioni sono condotte sotto azoto.
Ad una soluzione di solfossido di formula (III) in cui Ar=Ph e R2= -COCH3 (164 mg) in cloruro di metilene anidro, raffreddata a -78°C in presenza di setacci molecolari 4À, viene aggiunta mediante ago a doppia punta una soluzione di anidride triflica (52 μΐ) in cloruro di metilene anidro, anch'essa raffeddata a -78°C. Dopo aver mantenuto sotto agitazione a - 78°C per 15 minuti, sempre con ago a doppia punta si aggiunge una soluzione in cloruro di metilene anidro contenente 80 mg di combretastatina Bl, quindi si aggiungono 70 mg di 2 ,6-di-terbutil-4-metilpiridina. Il quantitativo totale di cloruro di metilene utilizzato è di 6 mi.
Si porta a -60°0, si lascia sotto agitazione per 2 ore, quindi a temperatura ambiente per 12 ore. Si scarica la reazione in una soluzione satura di NaHCO3, e successivamente si lava la fase organica con acqua. Dopo essiccamento ed evaporazione del solvente, il residuo viene flash-cromatografato su gel di silice (eluente acetati di etile/esano 4/6). Si raccolgono 320 frazioni. Le frazioni 150-180 contengono il tetracetil glucoside (36 mg), che è ulteriormente purificato per cristallizzazione da metanolo, p.f. = 135-137°C.
FORMULA (V)
Le frazioni 230-260 contengono il 2 'O-β-tetracetil glucopiranoside della combretastatina B1 che, dopo acetilazione, è stato confrontato per TLC, HPLC, 1H-NMR e 13C-NMR con il pentacetato del prodotto naturale estratto.
Esempio 2
Preparazione del 3’-Ο-β-glucopiranoside di formula (1) in cui R1= CH3, A= -CH2CH2-, R2 = -COCH3 e R3=H (variante A'').
La combretastatina B1 è stata glicosilata con ci-D-bromotetracetil glucopiranosio, in solventi diversi, quali acetone, THF, DME, in presenza di basi quali NaOH o KOH.in presenza di acqua, oppure con basi quali NaH, KH, in ambiente anidro.
La reazione può essere effettuata anche in presenza di eteri corona (l8-crown-6 per KH).
Dopo lavorazione delle miscele di reazione secondo tecniche convenzionali, si ottiene il composto desiderato con rese variabili fra il 20 e il 35?*·
Esempio 3
Preparazione del 3*-Ο-β-glucopiranoside di formula (I) in cui R^= CH3, A= —CH2CH2—, R2 — H e R3=H.
Il 3'-Ο-β-glucopiranoside di formula (I) in cui R1= CH3, A= -CH2CH2- e R2 = -COCH3 e R3=H è stato desacetilato per trattamento con metossido di sodio in metanolo, come descritto di seguito.
A 110 mg di derivato di formula (I) in cui R1= CH3, A= -CH2CH2- e R2= -COCH3 in metanolo anidro (8 mi), in atmosfera di azoto, vengono aggiunti 3.5 mi di una soluzione 0,2 M di metossido di sodio in metanolo. Dopo 2 ore si neutralizza la soluzione con resina Dowex 50 W X 8 (nella forma H+). Si filtra, si lava la resina con metanolo e si evapora il solvente riprendendo con acetato di etile e filtrando a secchezza sotto vuoto. Si ottiene il prodotto desiderato in quantità di 90 mg.
Un campione analiticamente puro è stato ottenuto mediante precipitazione da AcOEt (lavato).
p.dec. (punto di decomposizione)= < 100°C.
Esempio 4
Preparazione del 3’-Ο-β-glucopiranoside di formula (I) in cui R1= CH3, A= -CH2CH2-. R-, = R,= -COCH3.
Il derivato 3'-O-β-glucopiranosidico di formula (I) in cui R1= CH3, A= -CH2CH2-, R2 = H e R3=H è stato acetilato secondo metodologie convenzionali per la determinazione dei gruppi OH, in particolare con anidride acetica e piridina (ad esempio con anidride acetica come solvente, in presenza di una quantità almento stechiometrica di piridina, a temperatura ambiente), ed è stato ottenuto il pentacetato di formula (VI):
La sintesi del derivato pentaacettao è utile anche per confermare ulteriormente la struttura del derivato totalmente desacetilato preparato nell'esempio precedente.
Il derivato pentacetato è stato caratterizzato da un punto di vista chimico-fisico. In particolare, l'acetilazione e le variazioni conseguenti ottenute negli studi con NMR hanno permesso di stabilire la posizione di attacco del glucosio. p.f.= 153-155°C
D
PROVE DI ATTIVITÀ' FARMACOLOGICA
Nelle prove di seguito descritte sono stati saggiati il 3,-0-βglucopiranoside di formula (I) in cui R1= CH3, A= -CH2CH2-, R2 = H e R3=H, indicato di seguito con la sigla BG3, e l'aglicone corrispondente, ovvero la combretastatina B1 [composto di formula (II) in cui A è -CH2CH2- e è CH3], indicato di seguito come Bl.
Prove di inibizione della crescita di cellule leucemiche di topo L1210
Il saggio è stato eseguito nelle stesse condizioni descritte da Pelizzoni F. et al . , in Naturai Products lettere. Voi . 1 (4) , pag.
273-280, 1993) .
In Tabella 1 sono riportati i valori di IC50 [concentrazioni (μΜ) alle quali si osserva inibizione della crescita cellulare del 50%] , determinati 24 ore dopo l ' esposizione delle colture cellulari a B1 e BG3 e 72 ore dopo il lavaggio per l ' eliminazione totale dei composti B1 e BG3*
* valori determinati dopo 24 ore di trattatmento con B1 e BG3 ** valori determinati 72 ore dopo il lavaggio di B1 e BG3 Conclusioni
Il composto BG3 mostra una attività citostatica significativa, in qualche caso dello stesso ordine di grandezza rispetto a quella del corrispondente aglicone.
Prove di inibizione della formazione di colonie di cellule di carcinomi umani (colony assay).
Linee cellulari di carcinomi ovarici umani SW626, IGROV, SKOV e di adenocarcinomi intestinali umani L0V0 e L0V0 DX in crescita esponenziale sono state seminate a densità clonale (27-107 cellule/cm ) in piastre petri del diametro di 6 cm. Quarantotto ore dopo la semina, le cellule sono state esposte a dosi scalari di B1 e BG3- Dopo 24 ore di incubazione a 37°C il trattamento è stato sospeso, le piastre sono state lavate con soluzione tampone e reincubate con terreno di coltura fresco, senza trattamento per 10 giorni. Dopo fissazione e colorazione il numero delle colonie formatesi è stato contato mediante analizzatore di immagine Ibae 20 Zeiss. L'attività dei composti B1 e BG3 è stata valutata in base all'inibizione della formazione di colonie nelle piastre contenenti le cellule trattate rispetto ai controlli non trattati (vedi tabella 2).
Conclusioni
Il composto BG3 mostra una interessante attività antitumorale, con spiccata selettività verso l'adenoma intestinale mdr+, nei cui confronti esplica una attività molto maggiore di quella del corrispondente aglicone.

Claims (20)

  1. Rivendicazioni 1. Derivato 3 ' -Ο-β-glucopiranosidico di combre tastatine avente formula (I) : in cui = H oppure CH3, R2 ed R3, uguali o diversi fra loro, possono essere H oppure -CO-B, dove B è un alchile saturo C1-C6, lineare o ramificato, e A è un radicale bivalente a due atomi di carbonio scelto tra -CH2-CH2- e -CH=CH-.
  2. 2. Derivato 3'-Ο-β-glucopiranosidico di combretastatine come rivendicato nella rivendicazione 1, scelto nel gruppo costituito da: derivato di formula (I) in cui A è -CH2-CH2-, R1 è CH3 e R2=R3=H; derivato di formula (I) in cui A è -CH2-CH2- R1 è CH3, R2 è -COCH3, R3 è H, e derivato di formula (I) in cui A è -CH2-CH2-, R1 è CH
  3. 3, R2=R3= COCH3. 3- Derivato 3’-Ο-β-glucopiranosidico di combretastatine come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui A è -CH2-CH2-, R1 è CH3 e R2=R3=H.
  4. 4. Procedimento per la preparazione di un derivato 3'-0-{S-glucopiranosidico di combretastatine come rivendicato nella rivendicazione 1, comprendente i seguenti passaggi: A1') si fa reagire l'aglicone di formula (II) in cui A e hanno il significato sopra visto, con il solfossido del β-tioglucopiranoside di formula (III) in cui R2 è -CO-B, dove B è un alchile saturo lineare o ramificato C1-C6, e Ar è un residuo idrocarburico aromatico il cui snello ha da 6 a 10 atomi di carbonio, in presenza di una anidride di acido alcansolfonico e di una base organica .non nucelofila, in un solvente organico aprotico anidro, in atmosfera di gas inerte, mettendo a contatto in una prima fase i reattivi di formula (II) e (III), la base e l'anidride ad una temperatura compresa fra -78° e -60°C, ed innalzando in una seconda fase la temperatura della miscela di reazione a valore ambiente, ottenendo il derivato di formula (I) in cui R1 ed A hanno il significato sopra visto, R2 è -C0-B, dove B è un alchile C1-C6 saturo, lineare o ramificato, ed R3 è H; B) si deacila il derivato ottenuto nel passaggio precedente mediante trattamento con un alcossido alcalino in ambiente alcoolico anidro, a temperatura ambiente, neutralizzando a fine reazione la eventuale base in eccesso mediante aggiunta di un acido.
  5. 5. Procedimento per la preparazione di un derivato 3'-0-β" glucopiranosidico di combretastatine come rivendicato nella rivendicazione 1, comprendente i seguenti passaggi: A’’) si fa reagire l'aglicone di formula (II) in cui A e R1 hanno il significato sopra visto, con l'α-D-alogeno glucopiranosil derivato di formula (IV) in cui R2 è -CO-B, dove B è un alchile C1-C6 saturo, lineare o ramificato e X è scelto fra CI o Br, in presenza di una base inorganica forte, in un solvente organico aprotico, a temperatura ambiente; B) si deacila il derivato ottenuto nel passaggio precedente mediante trattamento con un alcossido alcalino in ambiente alcoolico anidro, a temperatura ambiente, neutralizzando a fine reazione la eventuale base in eccesso mediante aggiunta di un acido in ambiente anidro.
  6. 6. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 4 o 5, in cui nel passaggio B l'alcossido è scelto nel gruppo costituito da metilato di sodio, metilato di potassio, etilato di sodio ed etilato di potassio; l'alcool è metanolo o etanolo; la neutralizzazione è effettuata con con una resina a scambio ionico a carattere fortemente acido.
  7. 7- Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 6, in cui l'alcossido è metilato sodico, l'alcool è metanolo, e la resina è una resina a matrice polistirenica, con gruppi funzionali solfonici, nella forma H+.
  8. 8. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 4, in cui la variante A è effettuata utilizzando il solfossido di formula (III) in cui Ar = fenile (Ph); l'anidride è l'anidride trifluorometansolfonica (anidride triflica), la base è 2,6-ditert-butil-4-metilpiridina; il solvente aprotico è cloruro di metilene.
  9. 9* Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 8, in cui nel solfossido di formula (III) R2 è COCH3.
  10. 10. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 4, in cui la variante A è effettuata aggiungendo l'anidride di acido alcansolfonico al solfossido (III), aggiungendo quindi alla miscela così ottenuta l'aglicone di formula (II), e in ultimo la base organica, ad una temperatura compresa fra -78° e - 60°C, e riscaldando poi la miscela di reazione a temperatura ambiente.
  11. 11. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 5. in cui nella fase A' si utilizza il derivato di formula (IV) in cui X è Br, la base inorganica è scelta nel gruppo costituito da idruri di metalli alcalini, idruri di metalli alcalino-terrosi e da idrossidi di metalli alcalini, ed i solventi sono scelti nel gruppo costituito da solventi eterei, acetone, dimetossietano, idrocarburi alifatici o aliciclici, e esametilfosforotriamide.
  12. 12. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 5, in cui si utilizza il derivato di formula (IV) in cui X è Br e R2 è -COCH3.
  13. 13. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 5. in cui si aggiunge una soluzione acquosa di un idrossido all'aglicone di formula (II) sciolto nel solvente di reazione, ad esempio acetone, quindi si aggiunge il derivato di formula (IV), sciolto anch'esso nello stesso solvente di reazione.
  14. 14. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 12 in cui l'idrossido è NaOH 0,3 M ed il solvente è acetone.
  15. 15- Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 5. in cui la base inorganica è un idruro alcalino o alcalino terroso e la reazione è condotta in ambiente anidro.
  16. 16. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 15. in cui la reazione secondo la variante A' è effettuata in presenza di crown-eteri.
  17. 17. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 4 o 5. in cui i derivati di formula (I) in cui, oltre ai gruppi R2. anche i gruppi sono residui acilici -C0B, dove B ha il significato sopra visto, sono preparati dai corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 e sono H, oppure dai corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 è -COB e R3 è H, ottenuti dai passaggi Α' o A'', per trattamento con un alogenuro (cloruro o bromuro), o con una anidride dell'acido carbossilico corrispondente (B-C00H, dove B è definito come sopra), in presenza di una base, a temperature comprese fra -20° e 40°C.
  18. 18. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 4 o 5. in cui i derivati di formula (X) in cui R2 = R3= -COCH3 sono preparati dai corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 e Rg sono H, oppure dai corrispondenti derivati di formula (I) in cui R2 è -COCHg, per trattamento con anidride acetica, in piridina, utilizzata come solvente, a temperatura ambiente.
  19. 19. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 4 o 5· in cui i derivati di formula (I) sia acilati che non acilati sono purificati mediante una tecnica scelta nel gruppo costituito da flash-cromatografia su gel di silice, utilizzando come eluente miscele di solventi idrocarburici e di un solvente scelto fra etile acetato e solventi clorurati polari; cromatografia preparativa a fase invertita, in cui si utilizzano fasi stazionarie di gel di silice funzionalizzate con catene idrocarburiche C8-C18 e come eluenti acqua, alcooli, acetonitrile e loro miscele; e cristallizzazione da solventi alcoolici.
  20. 20. Composizione terapeutica ad attività anti- tumorale comprendente come principio attivo una dose efficace di almeno uno dei composti di formula (I): in cui R1 = H oppure CH3, R2 ed R3, uguali o diversi fra loro, possono essere H oppure -CO-B, dove B è un alchile saturo C1-C6, lineare o ramificato, e A è un radicale bivalente a due atomi di carbonio scelto tra -CH2-CH2- e -CH=CH-, in combinazione con adatti eccipienti e diluenti farmaceuticamente accettabili.
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