ITMI20121550A1 - Composizione dermatologica utile della dermatite allergica da contatto - Google Patents

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ITMI20121550A1
ITMI20121550A1 IT001550A ITMI20121550A ITMI20121550A1 IT MI20121550 A1 ITMI20121550 A1 IT MI20121550A1 IT 001550 A IT001550 A IT 001550A IT MI20121550 A ITMI20121550 A IT MI20121550A IT MI20121550 A1 ITMI20121550 A1 IT MI20121550A1
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tocotrienols
cell
tocopherols
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IT001550A
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Stefano Manfredini
Silvia Vertuani
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Ambrosialab S R L
Giuliani Spa
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Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale dal titolo
COMPOSIZIONE DERMATOLOGICA UTILE NELLA DERMATITE ALLERGICA DA CONTATTO
DESCRIZIONE
La presente domanda riguarda una composizione dermatologica, preferibilmente in forma di dispositivo medico, o anche cosmetica, per uso topico a base di vitamina E. La vitamina E è un fattore nutriente liposolubile essenziale sintetizzato dagli organismi fotosintetici. L'uomo deve pertanto assumerla con la dieta.
L'azione principale della vitamina E è antiossidante, in quanto protegge gli acidi grassi dai danni ossidativi dovuti a perossidazione lipidica provocati dai radicali liberi (ROS), molecole altamente reattive che attaccano le catene poiinsature innescando una reazione a catena che provoca l'ossidazione dei lipidi. Ciò si traduce in un danno a carico soprattutto delle membrane cellulari che diventano maggiormente permeabili e perdono la loro efficienza. Di conseguenza, lo stress ossidativo provoca l’invecchiamento precoce di cellule e tessuti compromettendone la funzionalità.
La pelle è la parte del corpo più esposta agli agenti ossidativi esterni che possono promuovere la formazione di radicali liberi, in particolare i raggi UV. L’invecchiamento precoce della pelle con la comparsa di rughe, macchie scure e altri indesiderati inestetismi è uno dei primi segnali che indicano la presenza di una situazione di stress ossidativo, ma i danni alla cute provocati dai ROS possono estendersi anche fino a perdita della funzione barriera dello strato corneo, promozione di processi infiammatori, eritema, cancro.
La vitamina E è in grado di contrastare la reattività dei radicali liberi, bloccando la cascata di eventi che determinano lo stress ossidativo. La natura lipofila della vitamina E la rende particolarmente affine alle membrane cellulari dove è in grado di contrastare l’eccesso di ROS, attenuando gli effetti della perossidazione lipidica e dell’ossidazione delle proteine di membrana di cellule e mitocondri. La vitamina E inoltre agisce all'interno del nostro organismo prevenendo l'ossidazione delle LDL, la quale porta alla formazione di placche aterosclerotiche all'interno dei vasi sanguigni che perdono così la loro funzionalità, aumentando il rischio di gravi patologie quali ictus, infarto e altri problemi cardiovascolari.
Il termine vitamina E indica una famiglia di composti con struttura simile. Dal punto di vista strutturale, questa classe di composti è caratterizzata dalla presenza di una testa cromanilica polare e da una catena laterale alifatica a 16 atomi di carbonio di natura lipofila. In natura esistono otto differenti molecole a cui si può associare l’attività della vitamina E: quattro forme di tocoferoli e quattro di tocotrienoli. Le quattro forme di ciascun gruppo vengono distinte con i prefissi α-, β-, γ- e δ- e differiscono tra loro per il numero e la posizione dei sostituenti metilici sull’anello cromanilico. I tocoferoli hanno una catena fitilica, mentre i tocotrienoli presentano tre doppi legami sulla catena laterale.
A livello industriale è possibile sintetizzare i tocoferoli e tocotrienoli, ma la loro preparazione non è stereochimicamente controllabile per cui si ottiene una miscela racemica di tutti gli otto stereoisomeri per ciascun tocoferolo e dei due stereoisomeri per i tocotrienoli .
Poiché le piante e altri organismi fotosintetici sono gli unici organismi in grado di sintetizzare tocoferoli e tocotrienoli tramite enzimi stereospecifici, le molecole che si formano sono solo nella forma RRR per i tocoferoli e 2R per i tocotrienoli, ovvero molecole otticamente pure.
La vitamina E naturale risulta essere due volte più potente rispetto a quella sintetica (Burton GW et al.; Am. J. din. Nutr.\ 1998; 67:669-84) e diversi studi hanno dimostrato che i sistemi biologici sono in grado di utilizzare la vitamina E naturale in modo molto più efficace rispetto alla sintetica.
Per le sue proprietà come antiossidante e radicai scavenger, la vitamina E viene utilizzata da molti anni per il trattamento topico della cute e delle mucose con lo scopo di prevenire o attenuare i danni da stress ossidativo. È stato infatti dimostrato che la vitamina E quando applicata sulla cute è in grado di accumularsi nei diversi strati della pelle, in particolare nello strato corneo, aumentandone significativamente la capacità antiossidante (Ziosi P et al.; Skin Res. Technol.] 2006; 12(4):303-8).
I tocotrienoli hanno dimostrato una maggiore efficacia nel proteggere le cellule dal danno ossidativo. La presenza delle insaturazioni sulla catena laterale isoprenoide conferisce infatti una maggiore affinità per le membrane cellulari rispetto ai tocoferoli, per cui i tocotrienoli vengono incorporati più rapidamente nelle membrane lipidiche con un conseguente incremento dell’accumulo intracellulare.
È noto che l’applicazione topica di miscele tocoferoli/tocotrienoli rappresenta un efficace metodo per incrementare il contenuto di molecole antiossidanti nel tessuto potenziando così l’azione protettiva contro i danni provocati dai radicali liberi. In particolare, l’applicazione topica di tocoferoli e tocotrienoli che penetrano rapidamente nella pelle è in grado di offrire una importante protezione contro il danno ossidativo provocato dalle radiazioni UV (Weber C et al.; Free Radic. Biol. Med.] 1997; 22(5):761-9).
L’uso di vitamina E naturale in concentrazioni efficaci in formulazioni ad uso topico è limitato dalla scarsa stabilità della molecole, che spesso vengono sostituite da derivati esterificati di sintesi o semisintesi.
Oltre alla vitamina E, tra le molecole attive nel conferire protezione contro lo stress ossidativo, specialmente quando applicate sulla pelle, è noto anche l’acido alfalipoico, con proprietà protettive della pelle dall'invecchiamento precoce indotto dall’esposizione a radiazioni UV (Beitner H; Br. J. Dermatol .; 2003; 149(4):841-9). L’esposizione acuta e/o cronica della cute alle radiazioni solari, in particolare quelle UV, provoca degli effetti biologici, come l’induzione della pigmentazione o la sintesi di vitamina D, ma anche una serie di effetti dannosi, quali fenomeni di fototossicità, fotoallergia, fotodermatosi, foto-immunosoppressione e foto-invecchiamento. La formazione di molecole reattive, con conseguente perossidazione dei lipidi superficiali cutanei (lipoperossidazione delle membrane cellulari), la ossidazione delle proteine con alterazione del sistema antiossidante cutaneo, l’attivazione di fattori di traduzione e di espressione genica, la produzione di citochine e danni diretti al DNA, con conseguenti fenomeni di mutageni e morte cellulare, sono meccanismi alla base di processi sia infiammatori sia neoplastici e possono comportare l’aggravamento di preesistenti malattie dermatologiche. Il pattern e l’intensità degli effetti degli UV sono strettamente correlati con il grado di penetrazione all’interno del tessuto cutaneo.
Infatti, con l’aumentare della lunghezza d’onda aumenta sia la percentuale di penetrazione dei raggi, sia la profondità raggiunta da questi: UVB fino allo strato basale dell’epidermide, UVA fino al derma papillare, VIS fino all'ipoderma, IR bloccato dal sottocute che funge da isolante termico. Quando le radiazioni UV vengono assorbite nella cute, trasferiscono energia alle strutture che incontrano, dando luogo ad una serie di reazioni fotochimiche che influenzano il metabolismo delle cellule, alterandone le strutture e le funzioni, e favoriscono il rilascio di mediatori. Gli effetti biologici degli UV possono essere determinati sia direttamente dall’assorbimento di fotoni da parte di macromolecole, come gli acidi nucleici, sia indirettamente con un meccanismo che richiede la presenza di ossigeno e la produzione di specie reattive da parte di sostanze cromofore endogene. All'interno del tessuto cutaneo, esistono meccanismi intrinseci per la protezione del danno UV-indotto: macromolecole come le cheratine e la melanina agiscono da filtro assorbendo le radiazioni UV; un complesso sistema di antiossidanti chimici ed enzimatici contrastano la formazione di specie reattive; sistemi enzimatici adibiti a riparare i danni al DNA. Se tali meccanismi protettivi non riescono a mantenere l’omeostasi cellulare, si verificano le alterazioni strutturali e funzionali che caratterizzano i danni fotoindotti.
Gli effetti secondari successivi ad esposizione agli UVB sono rappresentati dalla produzione di numerosi mediatori solubili che portano all’iniziazione di uno stato immunosoppressivo. I cheratinociti sono capaci di produrre numerose citochine, fattori di crescita, fattori di stimolazione e chemochine, quali: TNF-α, IL-1a, IL-1 β, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, NGF, VEGF, PDGF, TGF-a, TGF- β, GM-CSF, G-CSF. Queste sostanze sono in grado di partecipare alle risposte immunologiche, aH’infiammazione cutanea, alla crescita e proliferazione cellulare ed all’angiogenesi.
La presente invenzione riguarda una composizione dermatologica o cosmetica ad azione antiossidante per uso topico, caratterizzata dal fatto di comprendere quale principio attivo una miscela di tocoferoli e tocotrienoli con almeno un ulteriore componente con attività antiossidante scelto tra teanina, estratto di tè (Camellia sinensis) titolato in teanina, acido lipoico, biofenoli e bioflavonoidi glicosilati scelti tra florizina e antocianine, biofenoli dell’olio di oliva, biofenoli del vino, estratto del frutto di baobab titolato in polifenoli.
La quantità di tocoferoli utilizzata può variare da 1% a 30%, preferibilmente da 5% a 15% del peso totale della composizione.
I tocotrienoli sono impiegati in concentrazione che può variare tra 0,01% e 1% e preferibilmente tra 0,1% e 0,8% del peso totale della composizione. Il detto ulteriore componente con attività antiossidante, come tale o in miscela con altri, è presente in quantità compresa tra 0,01% e 2% del peso totale della composizione.
Formulazioni adatte sono quelle per uso esterno, come creme, lozioni, gel o soluzioni che possono essere spruzzate sulla pelle.
In una forma di attuazione, la composizione comprende almeno una fase oleosa ed almeno una fase acquosa, il detto principio attivo costituito da miscela di tocoferoli e tocotrienoli con almeno un ulteriore componente con attività antiossidante essendo preferibilmente nella fase acquosa.
La composizione farmaceutica e/o cosmetica e/o dispositivo medico secondo l'invenzione è in forma scelta tra: soluzioni, sospensioni, emulsioni, emulsioni PIT, paste, unguenti, gel, creme, lozioni, polveri, saponi, prodotti per l’igiene contenenti tensioattivi, oli, aerosol e spray. Ulteriori esempi di forme di applicazione sono stick, shampoo e prodotti per la doccia.
Gli oli adatti a costituire un veicolo per la composizione dell’invenzione possono essere, da soli o in miscela, oli vegetali come squalene, Oryza Sativa Bran Gii, Oryza Sativa Rice Bran Oil, Borago Officinalis Seed Gii, Simmondsia Chinensis Gii, Helianthus Annuus Seed Oil, argania spinosa, adansonia digitata; e/o oli di derivazione naturale e sintetici come decyl oleate, caprylic capric triglyceride, octyl palmitate, Octyldecanol, Dicapryl Ether, Dicaprylyl carbonate, Triethylhexanoin, Cocoglucoside, Cocoglycerides, C12-15 alkyl benzoate, Hydrogenated polydecene, Isopropyl myristate, Neopentyl Glycol Diheptanoate, Isononyl Isononanoate, Cetyl palmitate.
II veicolo siliconico può essere scelto preferibilimente dal gruppo che include pentamer cyclomethicone, tetramer cyclomethicone, hexamer cyclomethicone, dimethicone, phenyl trimethicone, diphenyl trimethicone, hexamethyldisiloxane, disiloxane o una miscela di questi.
La composizione dell’invenzione può anche includere un altro componente oleoso, in percentuale compresa tra 5% e 20%, scelto tra gli oli vegetali e gli esteri degli acidi grassi, come ad esempio octyl palmitate, isopropyl myristate, ethyl oleate, eteri, alcoli grassi, insaponificabili, come quelli derivati dall’olio di oliva, di avocado, di soia, o una miscela di questi.
La composizione ad uso topico secondo la presente invenzione è indicata per il trattamento curativo oppure cosmetico della pelle in un’ampia gamma di situazioni di stress ossidativo provocato dall’azione dei radicali liberi, in particolare in tutti gli stati infiammatori cutanei provocati da danni di tipo ossidativo, per ridurre o prevenire l’infiammazione e come lenitivo del prurito. Inoltre, è particolarmente efficace nella prevenzione e nel trattamento delle radiodermatiti e delle dermatiti fotoindotte.
Inoltre, in maniera sorprendente, la composizione ad uso topico secondo la presente invenzione ha sperimentalmente mostrato la capacità di ridurre l’effetto sensibilizzante indotto da nichel su cellule dendritiche umane. Si configura pertanto una sua attività specifica nelle forme di dermatite allergica da contatto (DAC) e trattamento di pelli ipersensibili.
Al fine di illustrare ulteriormente la presente invenzione, viene di seguito riportato un esempio di composizione (nomenclatura INCI) non limitativo.
Esempio
ATTIVITÀ DELLA COMPOSIZIONE SECONDO L'INVENZIONE: PARTE SPERIMENTALE La composizione secondo il precedente esempio, denominata TOCO 3.0, è stata oggetto della seguente sperimentazione: valutazione preliminare della vitalità cellulare/citotossicità su monociti umani tramite metodica MTT. Valutazione dello stimolo pro-sensibilizzante su cellule dendritiche umane tramite FACS, Fluorescence Activated Celi Sorter. Valutazione dell'inibizione dell'attività sensibilizzante indotta da nichel tramite FACS. Espressione genica di TNF-α in colture cellulari di linee cherati nocitarie HaCaT dopo stimolazione con UVB.
Le figure dei disegni allegati mostrano in forma di grafico alcuni dei risultati ottenuti. In particolare, Figg. 1 e 2 mostrano i risultati del test di valutazione dell’inibizione dell’attività sensibilizzante indotta da nichel tramite FACS. Fig. 1 mostra l’espressione (come MFI) di due molecole costi molatori e (CD80 e CD86) al citofluorimetro di flusso dopo 48h di trattamento di cellule dendritiche umane (THP-1) con la composizione dell’invenzione a due diverse concentrazioni (8 e 40 pl/ml).
Fig. 2 analogamente mostra l’espressione di CD80 e CD86 riscontrata per la composizione dell’invenzione in presenza di nichel solfato dopo 48h di trattamento di cellule dendritiche umane (U937).
Fig. 3 mostra un grafico dell'espressione di TNF-α in colture cellulari di linee cheratinocitarie HaCaT dopo stimolazione con UVB e trattamento con la composizione dell'invenzione rispetto ai singoli componenti.
Stimolo pro-sensibilizzante e inibizione dell’attività sensibilizzante
Scopo di tale test è valutare l'assenza di effetti pro-sensibilizzanti da parte di una composizione o di una materia prima per uso cosmetico e la sua capacità di inibire l’attività pro-sensibilizzante indotta da nichel sulle cellule del sistema immunitario. Nella definizione di un quadro di tollerabilità cutanea, è importante considerare oltre al potenziale di irritazione anche il potenziale sensibilizzante dei prodotti e degli ingredienti per uso topico ai fini della sicurezza d'impiego. Nel test effettuato si è ritenuto opportuno utilizzare un modello cellulare per valutare la reattività immunologica di tipiche cellule immunitarie specializzate che presentano l’antigene (cellule dendritiche) esposte a contatto prolungato (48h) con il prodotto in analisi, a due diverse diluizioni, con e senza nichel.
Il test è stato condotto su cellule dendritiche immature derivate da monociti di sangue periferico di donatore sano. Le cellule dendritiche primarie umane sono un modello in vitro di cellule di Langerhans, che ne costituiscono la variante tissutale specifica della cute. Su queste cellule si è valutata la modulazione dell'espressione di due molecole costimolatorie, ossia CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2), utilizzando come controllo positivo una nota sostanza sensibilizzante da contatto, il nichel solfato.
Il nichel è capace di suscitare in vivo reazioni immunitarie di tipo allergizzante (sensibilizzazione da contatto) ed è stato largamente utilizzato in vitro per studiare la modulazione della risposta immune. Il riconoscimento dell'antigene da parte del TCR (T Celi Receptor) dei linfociti T (segnale 1) non è funzionale alla maturazione di una risposta immune efficiente se non avviene a livello della membrana di una cellula presentante l'antigene stesso e in grado di fornire un ulteriore segnale (segnale 2 o costimolo) qualitativamente fondamentale per la definizione del tipo di risposta (umorale, cellulare, etc.). Le molecole costimolatorie B7.1 e B7. 2 (insieme definite, in breve, B7) sono glicoproteine di membrana presenti sulla superficie di numerose cellule che presentano l'antigene (cellule dendritiche, cellule di Langerhans, monociti/macrofagi, linee cellulari diverse tra cui cheratinociti) e agiscono come costimoli. Infatti, entrambe le molecole sono ligandi di una glicoproteina denominata CD28, presente sulla membrana del linfocita T.
L'innesco del sistema ligando/recettore CD28/B7 previene l'apoptosi (morte cellulare programmata) delle cellule T e coopera nel sostenere la loro proliferazione e differenziazione. Nelle prime fasi della risposta immune fisiologica, B7.2 è espresso costitutivamente e modula le risposte TH1 e TH2.
Con il progredire della risposta immune anche B7.1 viene up-regolata e incrementa l'intensità del segnale costimolatorio, con espansione delle cellule T e produzione di varie citochine. B7.1 inoltre è preferenzialmente up-regolato durante la fase acuta delle risposte autoimmuni.
L'aumento dell'espressione di queste molecole costimolatorie su cellule dendritiche rappresenta quindi segno di attivazione di una risposta immunitaria in seguito ad esposizione ad un antigene potenzialmente allergizzante.
Un campione di detto TOCO 3.0, secondo l’invenzione, è stato diluito in dimetilsolfossido (DMSO) e poi disciolto nel medium di coltura delle cellule a diverse concentrazioni (8 e 40 μΙ/ml), con e senza nichel, ed è stato sottoposto a test preliminare di citotossicità su cellule dendritiche per valutare a quale concentrazione la sostanza poteva essere impiegata in vitro senza causare mortalità cellulare, evento che provoca alterazione dei risultati. Come controllo negativo è stato considerato il terreno di crescita delle cellule.
E’ stata utilizzata una linea umana primaria di cellule dendritiche derivate da monociti di sangue periferico di donatore sano. Le cellule sono coltivate in RPMI 1640 addizionato di FCS (10%) GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (1000 lU/ml).
Dopo l’esposizione le cellule sono state esaminate con colorazione di Trypan Blue e osservazione microscopica in camera conta-globuli per la vitalità, raccolte, lavate in un tampone isotonico (PBS) e marcate con un anticorpo fluoresceinato diretto contro B7.1 o B7.2. Dopo ulteriori lavaggi per asportare l'anticorpo in eccesso, le cellule sono state immesse in un citofluorimetro di flusso (FACS, Fluorescence Activated Celi Sorter, Becton Dickinson, Mountain View, CA) per la valutazione della MFI (Mean Fluorescence Intensity), proporzionale al numero di molecole marcate per cellula, e quindi rappresentativo del livello di espressione delle molecole costimolatorie indagate.
Si sono inoltre rilevati parametri qualitativi morfologici (alterazione del volume delle cellule, modificazioni delle granulazioni cellulari) legati a necrosi cellulare e apoptosi, eventi strettamente connessi al processo di elicitazione allergica.
Come controllo (fluorescenza di base) è stata valutata la MFI sia delle cellule non trattate (tranne che con i lavaggi in PBS) sia di cellule fatte reagire con un anticorpo monoclonale fluoresceinato (come anti-B7.1 e anti-B7.2) ma di specificità irrilevante (isotype-matched control).
In Tabella 1 sono riportati i risultati dell'analisi della linea primaria dendritica (THP-1 ) per espressione come MFI delle due molecole costimolatorie al citofluorimetro di flusso dopo 48h di reazione con il campione alle due concentrazioni testate (8 e 40 μΙ/ml), e con i controlli, corretti per il controllo negativo.
Tabella 1
* MFI = Mean Fluorescence Intensity - media geometrica dell'intensità di fluorescenza delle cellule decorate con l'anticorpo fluoresceinato, proporzionale al numero di molecole decorate per cellula.
I risultati sono anche riportati nel grafico di Fig. 1 , in cui CD80 è rappresentata dalla colonna chiara e CD86 è rappresentata dalla colonna scura.
In breve, il solfato di nichel (10 pg/ml) mostra un incremento elevato di entrambi i marcatori, con prevalenza di CD86.
Alle concentrazioni saggiate (8 e 40 μΙ/ml), la composizione dell'invenzione non ha invece evidenziato incremento dei marcatori indagati, oltre a non mostrare effetti citotossici sulle cellule utilizzate per il saggio (IC50 = 200pl/ml).
In tabella 2 sono riportati i risultati dell'analisi della linea primaria dendritica per espressione delle due molecole costimolatorie CD80 e CD86 al citofluorimetro di flusso dopo 48h di reazione con nichel solfato da solo (10 pg/ml), e con il nichel solfato (10 pg/ml) addizionato del campione di detto TOCO 3.0 secondo l’invenzione (alle concentrazioni di 8 e 40 pl/ml) e di un controllo interno (Dexametasone) alle concentrazioni ivi indicate e corretti per il controllo negativo.
Tabella 2
In figura 2 sono riportati in grafico i valori di espressione di CD80 e CD86 riscontrati per il campione di detto TOCO 3.0 secondo l’invenzione su cellule U937 in presenza di nichel solfato ed i relativi controlli, sottratti del controllo negativo, ossia del valore del campione trattato con un anticorpo fluoresceinato di specificità irrilevante. Ancora, CD80 è rappresentata dalle colonne chiare e CD86 è rappresentata dalle colonne scure.
Il campione saggiato insieme a nichel solfato riduce il grado di espressione di entrambi i marcatori. La concentrazione più alta (40 pl/ml) è risultata più efficace. Il risultato è quindi indicativo di una attività desensibilizzante/anti-infiammatoria.
In conclusione TOCO 3.0 secondo l’invenzione non risulta in grado di aumentare in vitro l'espressione dei marcatori indagati nei monociti umani, mostrando quindi di non possedere potenziale stimolatorio del sistema immunitario mediato dal monocita/macrofago.
Inoltre TOCO 3.0 secondo l'invenzione alle concentrazioni testate ha mostrato la capacità di ridurre l’effetto sensibilizzante indotto da nichel su cellule dendritiche umane.
Espressione genica di TNF-g in colture cellulari di linee cheratinocitarie HaCaT dopo stimolazione con UVB
Come sopra accennato, in presenza di radiazioni UV le citochine IL-1, IL-6, IL-8, IL-IO, TNF-α sono responsabili dell’avvio del processo infiammatorio fornendo segnali chemotattici ai neutrofili ed ai macrofagi nella cute. L’IL-10 possiede la capacità di shiftare il sistema di risposta immune dal tipo Th1 al tipo Th2, attraverso l’inibizione della produzione di citochine tipo Th1 , come l’IFN-γ. L’aumentata produzione di INF-
OI conduce ad un aumento dell’espressione delle I-CAM1 e ad un’elevata produzione di IL-8 e TGF- a. Quest’ultimo è in grado di stimolare la proliferazione di cheratinociti e di indurre la produzione di VEGF, da parte degli stessi jcheratinociti e delle cellule endoteliali; il VEGF sarà in grado di promuovere l’angiogenesi ed indirettamente promuoverà anche l'infiammazione attraverso l’aumentata espressione di selectine e VCAM sulle cellule endoteliali.
Obiettivo dello studio
E’ stato al riguardo condotto uno studio per testare l’azione foto protettiva di TOCO 3.0 secondo l’invenzione e dei suoi singoli componenti sui cheratinociti attraverso la valutazione di differenti citochine prò infiammatorie (IL-8 e TNF-a).
Metodi
Oltre ad un campione di TOCO 3.0, sono stati singolarmente testati campioni dei seguenti singoli componenti di TOCO 3.0: tocoferolo (T01), tocotrienolo (T1), teanina (TE3).
I campioni sono stati preparati in DMSO 0,5%, alle seguenti concentrazioni:
T1 , T01 , TOCO 3.0 = 0,05μΜ.
TE3 = 50μΜ.
Colture cellulari di linee cheratinocitarie HaCaT disposte in un piatto multiwell da 6 pozzetti, arrivate al 70-80% di confluenza, sono state irradiate in PBS con UVB 100mJ/cm<2>. Immediatamente dopo l’irradiazione, il PBS è stato allontanato e sostituito con DMEM contenente i campioni in esame, alle concentrazioni sopra indicate. Le cellule sono state lasciate in incubatore a 37°C, 5% CO<2>, alcuni pozzetti per 6 ore (per studiare IL-8), e altri pozzetti 24 ore (per studiare TNF-α); dopodiché si è proceduto all’estrazione di RNA e successiva conversione a cDNA per eseguire reazione di polimerizzazione a catena in reai time quantitativa (qRT-PCR) per IL-8 e TNF-α. Per stabilire la dose irradiativa e la concentrazione delle sostanze da testare sono state effettuate prove di vitalità cellulare a 6 e 24 ore, attraverso la metodica della conta cellulare con trypan blu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
La sorgente luminosa utilizzata è una lampada UVB (UVB, λ: 280-320nm) (TL12 lampada Philips, Eindhoven). Tra le diverse dosi testate (5, 25, 50, 100, 150 mJ/cm<2>) l’irradiazione ottimale è stata considerata 100mJ/cm<2>. Al fine di stabilire una corretta tempistica, l’espressione genica di ogni interleuchina in esame (IL-8 e TNF-α) è stata misurata con qRT-PCR a 6, 12 e 24 ore post UVB, al fine di identificare dopo quanto tempo dalla stimolazione con UVB ciascuna di esse fosse espressa al massimo dalle cellule (picco di espressione). Esperimenti aggiuntivi sono stati effettuati anche a 2, 4 e 48 ore in caso di possibile picco di espressione anticipato o ritardato. Come suggerito da questi esperimenti preliminari, si procedeva quindi alla stimolazione delle cellule, incubazione ed estrazione dopo 6 e 24 ore. Ogni campione cellulare stimolato è stato provvisto del controllo non irradiato. Ciascun set di esperimenti è stato ripetuto per 3 volte ed i valori considerati nei risultati rappresentano la media dei valori dei singoli esperimenti.
Analisi statistica
La valutazione statistica è stata effettuata mediante GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software Ine, La Jolla, CA). Il test t di Student è stato usato per calcolare le differenze statistiche; valori di p<0.05 sono stati considerati significativi. La significatività statistica è stata così segnalata: *P<0.05; **P<0.01 ; ***P<0.001.
Risultati
1) Vitalità cellulare dopo irradiazione con UVB.
L’irradiazione con UVB 5mJ/cm<2>e con 25mJ/cm<2>non alterava in maniera significativa la vitalità cellulare e verosimilmente non rappresentava uno stimolo abbastanza efficace da indurre le citochine prò infiammatorie di interesse, discostandosi in maniera netta da quanto si verifica in vivo. L’irradiazione ottimale è stata considerata quella con 100mJ/cm<2>: questa dose applicata in vitro consente una vitalità cellulare pari circa al 50% dopo 24 ore, in vivo corrispondendo ad un valore assimilabile a condizioni reali in quanto nella popolazione italiana i valori della minima dose eritemigena (MED) UVB oscillano fra 75 e 120 mJ/cm<2>.
2) Identificazione del picco di rilascio delle interleuchine pro-infiammatorie dopo stimolazione con UVB 100mJ/cm<2>.
L’espressione genica delle interleuchine in esame, IL-8 e TNF-α, è stata misurata con qRT-PCR dopo 6, 12 e 24 ore dalla stimolazione con UVB. Esperimenti aggiuntivi sono stati effettuati per IL-8 anche a 48 ore in caso di possibile picco di espressione ritardato. Da questi esperimenti è risultato che IL-8 raggiunge il picco di espressione cellulare dopo 6 ore dall’irradiazione, mentre TNF-α viene maggiormente espresso dalle cellule HaCaT dopo 24 ore dalla stimolazione.
3) Espressione genica di IL-8 e TNF-α dopo stimolazione con UVB 100 mJ/cm<2>ed incubazione con T01, T1, TE3, TOCO 3.0.
L’espressione genica di IL-8 è stata valutata dopo 6 ore dall’irradiazione e dall’aggiunta dei campioni T01 , T1 , TE3, TOCO 3.0, mentre l’espressione di TNF-α è stata valutata dopo 24 ore dall'irradiazione e dall’aggiunta dei campioni.
Il grafico di fig. 3 mostra l’espressione di TNF-α dopo 24 ore dall’irradiazione e dall’aggiunta dei campioni T01, T1, TE3, TOCO 3.0 in esame, alle concentrazioni T1, T01 , TOCO 3.0 = 0,05μΜ; e TE3 = 50μΜ, tutti in DMSO 0,5%.
L’espressione genica è stata paragonata e valutata statisticamente rispetto a cellule trattate solo con UVB (stimolo infiammatorio, si veda la seconda colonna a sinistra in fig. 3), con riferimento (si veda la prima colonna a sinistra in fig. 3) all’espressione delle stesse interleuchine in cellule di controllo non irradiate e non trattate con i campioni. L’aumento di TNF-α indotto da UVB appare decisamente inibito, rilevandosi una aumentata inibizione nel caso del campione TOCO 3.0 secondo l'invenzione rispetto ai tre singoli componenti T01 , T 1 , TE3, configurandosi in tale risultato un’azione sinergica della composizione rispetto ai singoli componenti.
Per quanto riguarda l’espressione genica dell’IL-8 in cellule HaCaT irradiate e trattate con i campioni in esame rispetto alle cellule trattate solo con UVB, si è anche osservata una significativa riduzione.
In conclusione la composizione dell’invenzione riduce l’espressione di TNF-α e di IL-8 limitando quindi il processo infiammatorio UVB indotto. In particolare l’andamento di TNF-α configura un’azione sinergica della composizione dell’invenzione rispetto ai singoli componenti.
Nel complesso, la protezione verso i danni da UV si esplica tramite la riduzione del danno al sistema immunitario causato dalle radiazioni. L’azione di riduzione della risposta immunitaria alla stimolazione da nickel ottenuta insieme all'effetto protettivo nei confronti delle radiazioni UV può dirsi simile a quella ottenuta con l’uso dei corticosteoroidi, composti molto più aggressivi dei componenti della composizione qui descritta per via dei noti effetti collaterali.

Claims (5)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione dermatologica o cosmetica ad azione antiossidante per uso topico caratterizzata dal fatto di comprendere quale principio attivo una miscela di tocoferoli e tocotrienoli con almeno un ulteriore componente con attività antiossidante scelto tra teanina, estratto di tè (Camellia sinensis) titolato in teanina, acido lipoico, biofenoli e bioflavonoidi glicosilati scelti tra florizina e antocianine, biofenoli dell’olio di oliva, biofenoli del vino, estratto del frutto di baobab titolato in polifenoli.
  2. 2. Composizione secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto di comprendere tocoferoli in quantità compresa tra 1% e 30%, tocotrienoli in quantità compresa tra 0,01% e 1% e detto ulteriore componente con attività antiossidante in quantità compresa tra 0,01% e 2% del peso totale della composizione.
  3. 3. Composizione secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto di comprendere tocoferoli in quantità compresa tra 5% e 15% e tocotrienoli tra 0,1% e 0,8% del peso totale della composizione.
  4. 4. Composizione secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto di comprendere tocoferoli, tocotrienoli, teanina ed estratto di tè (Camellia sinensis).
  5. 5. Uso della composizione secondo la rivendicazione 1 per ridurre l’effetto sensibilizzante indotto da nichel.
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