JP5159074B2 - 細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、コラゲナーゼ活性阻害剤、メラニン産生抑制剤、抗酸化剤、抗炎症剤、脂肪蓄積抑制剤、皮膚外用剤及び食品 - Google Patents
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Description
ドゥアバンガの花、葉、茎又は樹皮の乾燥粉砕物100gに2.0kgの50容量%エタノール水溶液を加えて、室温にて攪拌しながら2時間抽出した後、濾過により不溶物を取り除いた。濾別した抽出上清を減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、ドゥアバンガの抽出物を得た。
ドゥアバンガの花、葉、茎又は樹皮の乾燥粉砕物100gに2.0kgの精製水を加え、オートクレーブを用いて120℃にて20分間加熱抽出した後、濾過により不溶物を取り除いた。濾別した抽出上清に凍結乾燥処理を施し、ドゥアバンガの抽出物を得た。
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートに1ウェル当り2.0×104個となるように播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間培養後、培地を、1質量%FBS添加DMEM培地にて各試料濃度に調製したサンプル培養液に交換し、更に24時間培養した。
この評価実験には、製造例2に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートに1ウェル当たり2.0×104個となるように播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に0.5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間培養後、培地を、0.5質量%FBS添加DMEM培地にて各試料濃度に調製したサンプル培養液に交換し、更に24時間培養した。
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートに1ウェル当たり2.0×104個となるように播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間培養後、培地を、0.5質量%FBS添加DMEM培地にて各試料濃度に調製したサンプル培養液に交換し、更に24時間培養した。
この評価実験には、製造例2に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの花の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。ヒト真皮線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートに1ウェル当たり2.0×104個となるように播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間培養後、培地を、5質量%FBS添加DMEM培地にて各試料濃度に調製したサンプル培養液に交換し、更に5日間培養した。
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの樹皮の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。トリス塩酸緩衝液に試料を添加し、各濃度のサンプル溶液を調製した。サンプル溶液に、I型コラゲナーゼ標品と、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識したI型コラーゲン0.25mg/mLを添加し、37℃にて2時間インキュベートした。これに酵素反応停止液を添加し、37℃にて30分間インキュベートした。エタノール沈殿法により、分解されたコラーゲンを含む上清を得た。蛍光分光光度計を用いて上清の蛍光強度(励起波長495nm、蛍光波長520nm)を測定した。
{(コントロール蛍光強度−サンプル蛍光強度)/コントロール蛍光強度}×100(%)
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。B16マウスメラノーマ(B16F0)細胞を90mmディッシュに1ディッシュ当たり18000個となるように播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間培養後、培地を、5質量%FBS添加DMEM培地にて各試料濃度に調製したサンプル培養液に交換し、更に5日間培養した。
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。50容量%エタノールにて各試料濃度に調製したサンプル溶液を、96ウェルマイクロプレートに100μLずつ添加した。更にそこへ、0.2mMの1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル(DPPH)エタノール溶液を100μLずつ添加した。
{1−(B)/(A)}×100(%)
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。0.25mMのWST−1と1mMのHypoxanthineを含むHANK’S(十)溶液75μLに、HANK’S(十)溶液にて各試料濃度に調製したサンプル溶液25μLを添加した。更に、Xanthine Oxidase25μL(0.0075Units)を添加し、37℃にて15分間反応させた後、450nmの吸光度を測定した。
{1−(B)/(A)}×100(%)
[実施例9] 過酸化脂質耐性の評価実験
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの花の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。ヒト表皮細胞株HaCaTを96ウェルプレートに1ウェル当り2.0×104個となるように播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間培養後、培地を、10質量%FBS添加DMEM培地にて各試料濃度に調製したサンプル培養液に交換した。
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。市販のヒアルロン酸カリウム塩(ヒト臍の緒由来)を0.9mg/mLになるように、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ(ウシ精巣由来)を5,300unit/mLとなるように、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、酵素溶液とした。なお、酵素溶液は用時調製とした。
{(コントロール吸光度−サンプル吸光度)/コントロール吸光度}×100(%)
[実施例11] ホスホリパーゼA2活性阻害作用の評価実験
この評価実験には、製造例1に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの花の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。各濃度の試料と20ng/mLのホスホリパーゼA2(PLA2)と3.3mMのDTNB(5,5−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)を含む溶液を調製し、室温にて10分間静置した。そこへ、PLA2の基質であるDiheptanoyl Thio−PC(1,2−ビス(ヘプタノイルチオ)グリセロホスホコリン)を1.66mMとなるように添加し、室温にて45分間反応させた。
[実施例12] 脂肪蓄積抑制作用の評価実験
この評価実験には、製造例2に記載の製造方法によって得られたドゥアバンガの葉の抽出物を試料として用いた。評価は、以下の手順で行った。皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Cryo HPRAD−SQ(三光純薬株式会社)を96ウェルプレートに1ウェル当り5.0×103個となるように播種した。播種培地には、10質量%のFBS、2mMのL−グルタミン、100units/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンを含むPGM培地を用いた。2日間培養後、培地交換を行った。新たな培地には、10μGのインシュリン、1μMのデキサメタゾン、200μMのインドメタシン、及び500μMの3−イソブチル−1−メチルキサンチンを含むPGM−分化用培地に各濃度の試料を添加したものを用いた。コントロールには、試料無添加のPGM−分化用培地を用いた。
[処方例6]W/O乳化型クリーム
Claims (2)
- ドゥアバンガ(Duabanga grandiflora)の抽出物を含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤。
- ドゥアバンガ(Duabanga grandiflora)の抽出物を含有することを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
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