ITMI20121380A1 - Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico per applicazioni cosmetiche - Google Patents

Description

"POLIESTERI POLIGLICEROLO-ACIDO AZELAICO PER APPLICAZIONI COSMETICHE"

Campo dell'Invenzione

La presente invenzione riguarda poliesteri poliglicerolo-acido azelaico e loro applicazioni in campo cosmetico.

Stato della Tecnica

L'acido azelaico à ̈ l’acido dicarbossilico avente nome IUPAC acido nonandioico e la formula di struttura (I) sotto riportata:

Questo acido può essere prodotto a partire dall’acido oleico (acido cis-9-ottadecenoico), un acido grasso monoinsaturo, mediante ozonolisi seguita da scissione ossidativa; nella reazione si formano una molecola di acido azelaico ed una di acido nonanoico.

L’acido azelaico si à ̈ dimostrato particolarmente efficace nel trattamento topico dell’acne comedonica e dell’acne infiammatoria (papulo-pustulosa, nodulare e nodulo cistica). Il suo utilizzo si deve all’osservazione che le specie del genere Pityrosporum ovale (Malassezia furfur) sono in grado di ossidare gli acidi grassi insaturi presenti nel sebo ad acidi dicarbossilici che inibiscono competitivamente l’enzima tirosinasi. In virtù del suo effetto inibente nei confronti della tirosinasi, il composto à ̈ stato anche usato per trattare il melasma, la lentigo maligna, l’iperpìgmentazione, così come per altre patologie caratterizzate dalla proliferazione anomala dei melanociti.

L'acido azelaico si à ̈ rivelato inoltre efficace nel trattamento deli’ìpermelanosi causata da agenti fisici e fotochimici, mentre non manifesta azione schiarente su pelle normale e non à ̈ foto sensibilizzante.

Questo acido ha anche mostrato un'attività antiproliferativa e citotossica selettiva verso melanociti umani maligni (come discusso nell’articolo “Azelaic acid. A review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in acne and hyperpigmentary skin disorders†, Fitton A., Goa KL. Drugs 1991 May; 41 (5):780-98.)· Il meccanismo di tale specificità à ̈ ancora poco chiaro sebbene sembra essere in relazione con la capacità dell’acido azeiaico di inibire l’attività dell’ossidoriduttasi mitocondriale e della sintesi del DNA.

Un problema collegato all’uso di acido azeiaico in formulazioni per uso topico à ̈ che questo acido, così come gli altri acidi dicarbossilici a catena più corta, ha un effetto irritante nei confronti della cute; questo effetto collaterale, generalmente temporaneo, può manifestarsi sotto forma di prurito o pizzicore. I dati di letteratura indicano che il potenziale irritante di queste sostanze decresce all'aumentare della catena alchilica, ma con catene più lunghe non vengono mantenuti gli effetti primari positivi sopra illustrati dell’acido azeiaico.

È quindi presente nel settore l’esigenza di avere a disposizioni composizioni in grado di veicolare l'acido azeiaico riducendone o eliminando in maniera sostanziale gli effetti collaterali.

Sommario dell'invenzione

Uno degli scopi della presente invenzione à ̈ quello di fornire polimeri o miscele di composti contenenti acido azeiaico in cui questo composto mantenga le sue attività, riducendo considerevolmente il verificarsi di effetti collaterali indesiderati tipici dell’acido azeiaico.

Altri scopi dell’invenzione sono quelli di fornire un processo per la produzione di dette miscele, così come di fornire composizioni cosmetiche che le comprendono. Questi scopi sono assolti, in accordo ad un suo primo aspetto dell’invenzione, fornendo poliesteri polìglicerolo-acido azeiaico, lineari o ramificati, ottenuti mediante condensazione di acido azeiaico con poligliceroli con un grado di polimerizzazione compreso tra 1 ,5-10.

In accordo ad un altro aspetto la presente invenzione fornisce un metodo per la produzione di miscele di esteri e poliesteri ottenuti per condensazione tra acido azeiaico e un poliolo scelto tra glicerolo e suoi oligomeri contenenti fino a 10 unità di glicerolo.

Descrizione delle figure

La Fig. 1 mostra il risultato di una prova SEC (Size Exclusion Chromatography) su un poliestere poligliceroIo-3-acido azeiaico secondo l’invenzione;

La Fig. 2 mostra un grafico a blocchi che illustra l’attività antinfiammatoria del poliestere poliglicerolo-3-acido azelaico dell'invenzione rispetto ad acido azelaico; La Fig. 3 mostra un grafico a blocchi che illustra l’azione irritante del poliestere poliglicerolo-3-acido azelaico dell'invenzione rispetto ad acido azelaico,

La Fig. 4 A mostra l’immagine a microscopio di un frammento di capello non trattato;

La Fig. 4 B mostra l'immagine a microscopio di un frammento di capello sottoposto a trattamento termico e trattato preliminarmente con una formulazione placebo; La Fig. 5 A mostra l’immagine a microscopio di un frammento di capello sottoposto a trattamento termico e trattato preliminarmente con una formulazione per capelli a risciacquo contenente i Poliesteri di poliglicerolo-acido azelaico.

La Fig. 5 B mostra l'immagine a microscopio di un frammento di capello sottoposto a trattamento termico e trattato preliminarmente con una formulazione per capelli senza risciacquo contenente Poliesteri di poliglicerolo-acido azelaico.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Il primo componente di esteri e poliesteri dell’invenzione à ̈ glicerolo o suoi oligomeri. Il glicerolo à ̈ una molecola trifunzionale e pertanto può condensare con altre molecole di glicerolo per formare dimeri, trimeri, oligomeri e polimeri. Il più semplice esempio à ̈ il diglicerolo o diglicerina che si ottiene dalla condensazione di due molecole di glicerolo. La reazione di disidratazione può interessare tutti e tre I gruppi ossidrilici della molecola e pertanto si possono avere condensazioni tipo alfa-alfa (α-α, cioà ̈ tra due ossidrili legati ad atomi di carbonio primari di due molecole di glicerolo), beta-beta (β-β, cioà ̈ tra due ossidrili legati ad atomi di carbonio secondari di due molecole di glicerolo) e alfa-beta (α-β, cioà ̈ tra un ossidrile legato ad un atomo carbonio primario di una molecola di glicerolo e un ossidrile legato ad un atomo carbonio secondario di un’altra molecola di glicerolo), come nelle strutture riportate sotto:

α-α-diglicerolo β-β-diglicerolo α-β -digli cero lo Con l’aumentare del grado di polimerizzazione aumenta anche il numero dei possibili isomeri, ad esempio si passa da tre differenti isomeri lineari per il diglicerolo a otto differenti isomeri lineari per il triglicerolo.

Reazioni intramolecolari possono anche portare alla formazione di prodotti ciclici. Tipicamente i processi attualmente disponibili per ottenere poligliceroli di elevata purezza si possono dividere in due tipologie:

metodi finalizzati all'allontanamento di prodotti ciclici e secondari, ad esempio descritti nel brevetto americano US 3,968,169 il cui contenuto viene qui interamente incorporato come riferimento,

metodi per ottenere prodotti lineari con elevata purezza ad esempio descritti nel brevetto americano US 6,620,904 il cui contenuto viene qui interamente incorporato come riferimento.

Per gli scopi dell'invenzione si sono rivelati particolarmente idonei il glicerolo e i suoi oligomeri contenenti fino a 10 unità del monomero (poliglicerolo-10); infatti, all'aumentare del grado di polimerizzazione dei poligliceroli corrisponde una diminuzione della purezza dei medesimi, unitamente alla presenza di un sempre più alto numero di frazioni a differente peso molecolare, che rendono sempre meno omogenee le proprietà chimico-fisiche dei poliesteri finali. Inoltre, c’à ̈ da considerare che all’aumentare del grado di polimerizzazione, e quindi del peso molecolare, si ha un aumento della viscosità e una diminuzione dell’igroscopia della molecola. Infine, i poligliceroli fino a 10 unità di monomeri sono commercialmente disponibili, per esempio dalle ditte Solvay , Spiga Nord di Carasco (Genova), Lonza (Basilea) evitando la necessità della sintesi di questo componente.

Tipicamente, i poligliceroli possono essere sintetizzati ricorrendo a metodi che prevedono la condensazione del glicerolo con catalisi alcalina (sua disidratazione) con eliminazione di acqua. Il risultato di questa sintesi à ̈ normalmente una miscela di oligomeri che può comprendere glicerolo non reagito, prodotti ciclici e oligomeri molto alti. Condizioni di temperatura, tipicamente al di sopra dei 200°C, di durata della sintesi e di vuoto, privilegiano la formazione delle strutture volute. Per disidratazione della glicerina si ottengono diversi polimeri dove le molecole di glicerina sono legate tra loro mediante un ponte di ossigeno. Dal glicerolo che contiene tre gruppi ossidrilici, il numero degli -OH aumenta di uno ogni per ogni molecola di glicerina che si condensa; pertanto, il diglicerolo ha quattro -OH liberi, il triglicerolo conque -OH, il tetraglicerolo sei e così via.

Nella produzione dei poliesteri dell'invenzione, il glicerolo o i suoi oligomeri possono essere usati puri, oppure in miscela tra loro.

In alcune forme di realizzazione dell’invenzione si usano glicerolo o un suo oligomero in forma pura.

In alcune forme di realizzazione dell’invenzione si usa poliglicerolo-3, tipicamente il trimero in cui le tre unità di glicerolo sono legate tra loro in configurazione α-α:

OH OH OH

Il secondo componente di esteri e poliesteri dell’invenzione à ̈ l’acido azelaico. La sintesi dei poliesteri del’invenzione viene effettuata per reazione del primo componente (glicerolo, suoi oligomeri o loro miscele) e detto acido.

Tipicamente, la reazione di esterificazione può essere catalizzata da acidi o basi. In alcune forme di realizzazione dell’invenzione si impiega un catalizzatore acido, per esempio acido paratoluensolfonico, oppure nessun catalizzatore aggiunto, sfruttando in questo caso l’acidità dell’acido azelaico stesso.

La sintesi di laboratorio può essere effettuata utilizzando attrezzature diverse. Per esempio, à ̈ possibile impiegare un reattore sferico in vetro (pallone) posizionato all’interno di un forno a microonde, munito di agitatore ad ancora, termometro a contatti, pescante per l’azoto, un distillatore Claisen completato in testa da un distillatore di Graham e nell'ultimo collo un imbuto gocciolatore. Alternativamente à ̈ possibile usare un reattore costituito da un pallone in vetro pyrex di capacità 250 mi a due colli, posizionato all’interno di un forno elettrico da laboratorio e collegato ad un candelabro in vetro a tre colli, che consente il passaggio dell’asta metallica per l'agitazione meccanica del prodotto (asta centrale) e la circolazione di un flusso di azoto. Le temperature di reazione sono variabili, e possono andare da circa 145 °C a 180 °C nel caso di sintesi in forno a microonde, e da circa 130 °C a 220 °C nel caso di sintesi in forno elettrico.

Per la sintesi tipicamente si impiegano quantità circa equimolari di glicerolo o suoi oligomeri e acido azelaico o viene introdotto in alimentazione un leggero eccesso di glicerolo e dei suoi oligomeri ad esempio del 5-10%.

Tipicamente, nell’ambiente di reazione sono presenti anche molecole lineari, derivanti dalla reazione tra un gruppo alcolico secondario e un gruppo acido, come anche molecole ramificate.

Regolando opportunamente i rapporti molari tra i reagenti e i tempi di reazione si può arrivare ad avere nei prodotto di reazione una prevalenza dei poliesteri desiderati.

La reazione tra un diacido e un polialcol può portare a diversi prodotti, a partire dall'estere “semplice†, derivante dalla reazione di una molecola di diacido e una del polìglicerolo, fino a oligomeri e polimeri derivanti da condensazioni successive dì molecole contenenti gruppi acidi e molecole con gruppi idrossilici. Poiché la poliglicerina à ̈ un reagente multifunzionale si può anche arrivare alla formazione di molecole reticolate (in cui cioà ̈ diverse catene reagiscono tra loro formando “ponti†, arrivando a prodotti insolubili) o ramificate. Nel caso in cui non si verifichino reticolazioni o ramificazioni ed i poliesteri siano quindi di tipo lineare, indicando con G un'unità di glicerolo o polìglicerolo, e con AZ un’unità di acido azelaico, gli esteri o poliesteri dell’invenzione possono essere rappresentati schematicamente come (-G-AZ-)n; il prodotto ottenuto dalla reazione di condensazione à ̈ una miscela relativamente complessa di esteri e poliesteri (-G-AZ-)nin cui sono variabili sia la struttura dell’unità G che l’ndice n.

In un suo secondo aspetto, l'invenzione riguarda esteri e poliesteri ottenuti dal processo di sintesi sopra descritto.

Tipicamente, il prodotto dell'invenzione comprende esteri e/o poliesteri derivati dalla condensazione del glicerolo o dei suoi oligomeri fino a poliglicerolo-10, aventi strutture in cui sono alternati un residuo di acido azelaico ed uno di glicerolo o polìglicerolo.

In accordo ad alcune forme di realizzazione l’invenzione riguarda esteri e/o poliesteri poligliceroio-acido azelaico ottenuti per condensazione tra acido azelaico e il trimero di glicerolo in cui le tre unità di glicerolo sono coliegate tra loro con legami a-a, rappresentata schematicamente sotto:

in cui l'indice n à ̈ variabile tra 1 e 7

Tipicamente, la caratterizzazione degli esteri o poliesteri poligiicerolo-acido azelaico ottenuti può essere fatta per via cromatografica, in particolare con la tecnica SEC (Size Exclusion Chromatography). Con questa tecnica si ottengono dei cromatogrammi che riportano picchi, corrispondenti all’uscita di una sostanza o frazione dallo strumento, in funzione del tempo; dopo aver calibrato lo strumento con composti di riferimento, convenientemente aventi volume idrodinamico simile a quelli delle molecole o polimeri da rilevare; per esempio, un polistirene di peso molecolare noto, la tecnica fornisce come risultati tra gli altri i valori:

- Mn, peso molecolare medio numerale (media aritmetica dei pesi);

- Mw, peso molecolare medio ponderale (media pesata);

- D (polidispersità), rapporto Mw/Mn.

Tanto più il valore di D si avvicina a 1 , tanto maggiore à ̈ la purezza della molecola. In accordo ad un suo ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda composizioni cosmetiche, in particolare preparazioni ad uso topico, che comprendono gli esteri e/o poliesteri poligiicerolo-acido azelaico sopra descritti.

Le preparazioni per l'uso topico dell’invenzione, possono essere da risciacquo e non, hanno proprietà idonee per le applicazioni in ambito cosmetico e dermatologico.

In accordo ad alcune forme di realizzazione, gli esteri e/o poliesteri poligiiceroloacido azelaico sono presenti nella composizione cosmetica dell’invenzione in un quantitativo compreso da 0,01 a 20% in peso, preferibilmente da 0,05 a 5% in peso.

Tipicamente, la composizione cosmetica dell’invenzione può presentarsi in una qualsiasi forma idonea all'applicazione locale o topica.

In alcune forme di realizzazione la composizione dell’invenzione comprende le miscele di esteri e/o poliesteri di poligiicerolo-acido azelaico del tipo precedentemente descritti ed un veicolo, cosmeticamente o farmaceuticamente accettabile.

Tipicamente, la composizione dell'invenzione può presentarsi in forma liquida ad esempio come lozione, soluzione, sospensione, shampoo, latte oppure in forma solida o semi-solida o fluida ad esempio come balsamo o siero.

In certe forme di realizzazione la composizione dell’invenzione à ̈ in forma liquida, ad esempio in forma di lozione a base acquosa contenente uno o più veicoli e/o eccipienti idonei per le applicazioni cosmetiche.

Nella forma liquida la composizione può generalmente contenere da circa 1 al 99.9% in peso di acqua. In alcune forme di realizzazione l'acqua à ̈ presente in un quantitativo compreso tra 5-95% in peso. In altre forme di realizzazione l’acqua à ̈ presente in un quantitativo del 10-90% in peso.

In alcune forme di realizzazione il veicolo della composizione dell’invenzione à ̈ un preparato base per le formulazioni cosmetiche, tipicamente per la formulazioni di preparati fluidi idonei all’applicazione cutanea o ideologica.

In accordo ad alcune forme di realizzazione, la composizione cosmetica contenente esteri e/o poliesteri di poliglicerolo-acido azelaico può essere una formulazione ad uso tricologico da applicare sui capelli, ad esempio del tipo senza risciacquo (leave-on).

Idonee formulazioni leave-on da applicare su capelli e/o cuoio capelluto comprendono, ma non sono limitati, a lozioni acquose quali soluzioni o dispersioni colloidali acquose, lozioni idroalcoiiche o soluzioni o dispersioni colloidali idroalcoliche, emulsioni fluide, emulsioni olio in acqua, gel idrofili, soluzioni acquose o idroalcoliche gelificate che si formano mediante l’aggiunta di polimeri, ad es. polimeri acrilici quali i Carbopol o i Polietilenglicoli ad alto peso molecolare ecc., a! solvente, oppure sieri.

Secondo altre forme di realizzazione, la composizione cosmetica contenente esteri e/o poliesteri di poliglicerolo-acido azelaico può essere una formulazione ad uso tricologico da applicare sui capelli ad esempio del tipo con risciacquo {rinseoff).

Idonee formulazioni rinse-off da applicare su capelli e/o cuoio capelluto comprendono ma non sono limitati a shampoo, sistemi detergenti contenenti tensioattivi, balsami ad esempio contenenti sostanze cationiche (Polyquaternium, Cetiltrimetilammonio cloruro, Docosil trimetilammonio metili solfato ecc.), alcoli o acidi grassi altofondenti da applicare sui capelli bagnati (o asciutti) prima o dopo lo shampoo e quindi da risciacquare, maschere, ad esempio contenenti sostanze cationiche.

Vantaggiosamente, l’applicazione della composizione cosmetica dell’invenzione sulla cute o sulle strutture cheratiniche determina la formazione di un film complesso, con caratteristiche filmogene protettive.

A titolo di esempio, le composizioni dell’invenzione in forma liquida possono essere preparate dissolvendo la miscela di esteri e poliesteri o poliesteri poliglicerolo-acido azelaico del tipo precedentemente descritto in un fluido, tipicamente acqua. Opzionalmente la miscela risultante può essere tamponata per raggiungere un livello di pH compatibile con quello della pelle, convenientemente selezionato tra pH 4 e 8,

In alcune forme di realizzazione le composizioni tricologiche dell’Invenzione possono comprendere eccipienti comunemente utilizzati nella formulazione di preparazioni cosmetiche ad uso locale, quali conservanti, agenti battericidi, stabilizzanti, emulsionanti, tensioattivi, tamponi, umettanti, coloranti ed altri eccipienti comunemente utilizzati nelle tecniche di preparazione cosmetiche / farmaceutiche.

La composizione dell’invenzione può essere applicata, in un quantitativo efficace, direttamente sulla parte da trattare, tipicamente la pelle del viso o del corpo, il cuoio capelluto o i capelli.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione viene fornito un metodo di trattamento cosmetico che comprende l'applicazione locale, a livello di una struttura cheratinica del corpo umano di un quantitativo efficace di una composizione cosmetica del tipo precedentemente descritta.

Le miscele e/o composizioni cosmetiche dell’invenzione offrono vantaggi rispetto all’uso cosmetico o dermatologico dell’acido azelaico in quanto tale o di composizioni cosmetiche che lo contengono come principio attivo.

Il poliglicerolo à ̈ una sostanza di impiego sicuro e ha la possibilità di formare strutture polimeriche anche molto diverse tra loro, lineari, ramificate e iperramificate, con caratteristiche di solubilità e citotossicità migliori rispetto ai polimeri del glicole polietilenico (usato in composizioni note). Inoltre, selezionando un determinato peso molecolare della catena poliglicerica, à ̈ possibile modulare le proprietà della miscela e delle formulazioni che la contengono, siano queste proprietà di tipo chimico fisico, ad esempio la solubilità, o la cinetica di assorbimento del principio attivo, fino ad arrivare alla realizzazione di forme di rilascio modificato dell’acido azelaico regolate da un meccanismo chimico, in virtù del fatto che il legame estere può, in talune condizioni, essere suscettibile di scissione idrolitica o enzimatica in situ.

Applicati sulla pelle, i poliesteri dell'invenzione, in virtù della presenza di numerosi gruppi idrossilici in grado di formare ponti idrogeno con altrettante molecole d’acqua, si comportano come un serbatoio polifunzionale di acido azelaico, in grado di formare film sottili sulla pelle, normalizzarla ed idratarla.

I poliesteri dell'invenzione risultano infine particolarmente vantaggiosi, alla luce della maggior tollerabilità rispetto all'acido azelaico, ai fine di produrre un’azione sebo normalizzante nei confronti della cute. Infatti come à ̈ noto, a livello delle ghiandole sebacee la concentrazione degli ormoni androgeni à ̈ il più importante fattore regolatore della secrezione del sebo; in particolare l'enzima 5 alfa reduttasi converte il 4-androstenedione in diidrotestosterone, un metabolita in grado di aumentare significativamente la secrezione sebacea.

Un ulteriore vantaggio ottenuto con l’impiego cosmetico dei Poliesteri poligliceroloacido azelaico dell'invenzione à ̈ riferibile all’azione antimicrobica dell’acido azelaico, che produce nel complesso una diminuzione dell’attività lipasica di origine batterica, associata ad una minor produzione di acidi grassi liberi che determina un’azione sebo normalizzante nei confronti della cute.

Conseguentemente a queste attività la presente invenzione prevede, in accordo ad un ulteriore aspetto, i’uso di

-una miscela di esteri e poliesteri ottenuti con il processo precedentemente descritto o

-poliesteri poliglicerolo-acido azelaico precedentemente descritti,

per il trattamento di stati di irritazione o di infiammazione della pelle.

In accordo ad alcune forme di realizzazione l’invenzione riguarda l’uso di

-una miscela di esteri e poliesteri ottenuti con il processo precedentemente descritto o

-poliesteri poliglicerolo-acido azelaico precedentemente descritti, come sebo-regolatore delia pelle.

In accordo ad un ulteriore aspetto della presente invenzione viene previsto l’uso di poliesteri poliglicerolo-acido azelaico del tipo precedentemente descritto per proteggere la cute, annessi cutanei o i capelli dai calore o trattamenti termici.

La Richiedente ha infatti sorprendentemente trovato che gli esteri e/o poliesteri di poliglicerolo-acido azelaico dell'invenzione formano una pellicola polimerica quando sono esposti ad una fonte di calore o ad un trattamento termico.

Questa inaspettata proprietà dei poliesteri poliglicerolo-acido azelaico dell’invenzione ne consente l'applicazione in campo cosmetico nella protezione della cute, dei suoi annessi o delle fibre cheratiniche, capelli in particolare, dai trattamenti termici o dall'esposizione ad una fonte di calore come la luce solare. In accordo ad alcune forme di realizzazione i poliesteri di poliglicerolo-acido azelaico sono aggiunti a formulazioni cosmetiche per il trattamento dei capelli con lavaggio o risciacquo con acqua, come ad esempio balsamo o shampoo, per formare una pellicola di protezione delle strutture cheratiniche del capello durante l’asciugatura a caldo ad esempio con phon.

In alcune forme di realizzazione i poliesteri di poliglicerolo-acido azelaico sono aggiunti a formulazioni cosmetiche per il trattamento dei capelli che non richiedono il lavaggio dopo il trattamento per proteggere il capello dall’azione dei raggi del sole.

La presente invenzione verrà ora descritta facendo riferimento ai seguenti esempi che vengono forniti a meri fini illustrativi e non devono essere intesi in senso limitativo della presente invenzione.

Nel lavoro sperimentale riferito negli esempi, sono stati usati i seguenti materiali di partenza:

acido azelaico, CAS 123-99-9: A.C.E.F, Fiorenzuola d’Arda (Piacenza), Italia;

diglicerina, CAS 59113-36-9: Solvay Solexis;

poliglicerolo-3, poliglicerolo-4 e poliglicerolo-6, CAS 25618-55-7: rispettivamente Pure Vegetable PG-3 Pure Vegetable PG-4 e Pure Vegetable PG-6, Spiga Nord, Carasco (Genova), Italia;

poliglicerolo-10, CAS 25618-55-7: Natrulon H10, Lonza;

Il poligliceriolo Pure Vegetable PG-3, preferito per gli scopi dell’Invenzione, à ̈ stato caratterizzato con prova SEC prima del suo impiego, dando i seguenti risultati:

Mn = 4818; Mw = 4931 ; Mp = 4693; D = 1 ,023. L’indice di polidispersità pari a 1 ,02 indica un prodotto molto puro, essenzialmente costituito solo da unità po ligi ice rolo-3.

ESEMPIO 1

Questo esempio si riferisce alla produzione di poliesteri poliglicerolo-acido azelaico.

Preparazione di un lotto (PGAO-02-01) di poliesteri poliglicerolo-acido azelaico:

Sono stati introdotti in un reattore:

560 g di poliglicerolo - 3

440 g di acido azelaico

0,25 grammi di acido ipofosforoso

4 g di acido paratoluensolfonico

La temperatura massima della reazione à ̈ stata di 175-180°C. L’andamento della reazione à ̈ stato seguito attraverso la misurazione dell'indice di acidità (su campioni raccolti ogni mezz’ora mediante campionatore). Il tempo di reazione à ̈ stato di circa 2 ore. Operando nelle condizioni di processo sopra descritto sono state prodotte differenti poliesteri poliglicerolo acido azelaico, indicati nel seguito come "Tesi’’, secondo la seguente tabella:

Tabella 1

Tesi Oligomero di Lotto (Rapporto molare Temperatura Tempo reazione glicerolo impiegato ac. azelaico- reazione (°C) (min) poliglicerolo)

Diglicerina PGAO-01-01 (1 :1) 175 120

Pure Vegetable PG- PGAO-02-01 (1 :1) 175-180 120

3 PGAO-02-02 (1 :1 ,1) 175-180 120

PGAO-02-03 (1 :1) 180-185 40

PGAO-02-04-(1 :1) 140-150 90

PGAO-02-05 (1:1) 150 6040

PGAO-02-06/120(2:1) 150 360

PGAO-02-07/150(1:2)

Pure Vegetable PG- PGAO-03-01(1:1) 175 120 4

Pure Vegetable PG- PGAO-04-01(1:1) 175 120 6

Natrulon H10 PGAO-05-01(1:1) 175 120 Di questi poliesteri, i Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico PGAO-02-01, sono stati caratterizzati con prova SEC, il cui cromatogramma à ̈ riportato graficamente in Fig. 1. La prova ha dato i seguenti risultati: Mn = 7722 Dalton; Mw = 10470 dalton;; D = 1,356. I pesi molecolari (P.M.) sono espressi in polistirene equivalenti. Utilizzando lo stesso sistema SEC e la medesima calibrazione per l’analisi dei monomeri (acido azelaico e poliglicerolo-3) si ottengono i seguenti valori:

Acido azelaico:

Mn = 3064

Mw = 3090

D = 1,008

Poliglicerolo-3:

Mn - 4818

Mw = 4931

D = 1,023

Il peso medio à ̈ molto vicino alla somma del peso di una molecola di acido azelaico e una di poliglicerolo, ma la distribuzione dei pesi indica la presenza di diverse specie, che derivano dalla condensazione di più di una molecola di acido e di poliglicerolo, che porta evidentemente alla formazione di oligomeri.

Dal confronto tra il cromatogramma SEC di questa miscela e quello dei composti di partenza si nota inoltra che nel prodotto si ha ancora del poliglicerolo non reagito (sovrapposizione tra il picco del poliglicerolo uno dei picchi della curva del prodotto).

Osservando il tracciato SEC si deduce che vi à ̈ un’importante presenza di frazioni polimeriche con pesi molecolari elevati.

La prova SEC à ̈ stata ripetuta su poliesteri ottenuti con poliglicerolo-3 in diverse condizioni di temperatura e rapporti molecolari tra i reagenti usate al fine di ridurre la presenza di monoesteri e di aumentare le frazioni a più alto peso molecolare. Queste prove hanno mostrato che il peso molecolare medio del prodotto aumenta aH'aumentare del tempo di reazione.

ESEMPIO 2

Questo esempio à ̈ relativo alla verifica dell’influenza delle miscele dell'invenzione sulle proprietà funzionali di formulazioni che le contengono.

In particolare si à ̈ verificata l’influenza delle miscele dell'invenzione su formazione e persistenza della schiuma in formulazioni detergenti.

Per le prove sono state preparate formulazioni che costituiscono un modello semplificato di uno shampoo, formato unicamente da acqua e il tensioattivo in esame, inserito alla percentuale pari alla sostanza attiva lavante (12% nel protocollo del presente esempio), secondo quanto riportato in “Estimated daily exposure levels for different cosmetic produci types according to Colipa data†, SCCNFP/0321/02; Hall et al. 2007, 2011). Il tensioattivo scelto à ̈ di tipo anionico, visto che come noto questi tensioattivi sono i più suscettibili alle acque dure e molto dure.

Le prove sono state effettuate su una formulazione che contiene una miscela dell’invenzione prodotta nell’esempio 1 e, per confronto, su un “bianco".

La formulazione secondo l’invenzione à ̈ stata preparata pesando 4,650 g di Sulfetal LA (materia attiva anionica 27%, per un totale di 1.255 g di Ammonio lauril solfato), 0,120 g di Tesi 2 - PGAO-02-01, e acqua demineralizzata quanto basta a 10,460 g, omogeneizzando il tutto con agitatore magnetico per 5 minuti.

La formulazione di confronto à ̈ stata preparata pesando 4,650 g di Sulfetal LA e acqua demineralizzata quanto basta a 10,460 g, omogeneizzando il tutto con agitatore magnetico per 5 minuti

Ad ognuno dei due campioni così preparati sono stati poi aggiunti 250 g di acqua a composizione controllata, classificabile come dura. I dati analitici di questa acqua sono: bicarbonati 574 mg/l; nitrato 6,9 mg/l; sodio 74,4 mg/l; calcio 171 mg/l; magnesio 27,8 mg/l; residuo fisso a 180 °C = 752 mg/l; conducibilità elettrica a 20 °C = 1123 pS; pH 5,8; si sono ottenuti in questo modo il campione 1, dell’invenzione, e il campione 2, “bianco†.

I due campioni sono stati sottoposti a prove di formazione e persistenza della schiuma, eseguite mediante l’utilizzo dello strumento SITA Foam Tester (SITA Messtechnick GmbH, Dresda). Lo strumento à ̈ descritto accuratamente nel brevetto EP 1092970 e consente il campionamento automatico, il riscaldamento e la termostatazione del campione grazie ad una doppia camicia nella camera destinata all’alloggiamento del campione in esame; un sensore permette una precisa regolazione della temperatura del campione. A tal scopo lo strumento à ̈ stato affiancato ad un termostato MLW 4 (VEB MLW Pmfgeràte - Werk, Medingen, Germany).

La formazione della schiuma viene realizzata da un rotore che permette di regolare la quantità d’aria all’interno del campione. La misurazione del volume di schiuma, e del suo decadimento nel tempo, vengono effettuati mediante sensori aghiformi in grado di misurare il profilo in molti punti della superficie del campione. Per le prove, i campioni vengono poi caricati nel serbatoio dello strumento che effettua il campionamento automatico di 250 mi di prodotto e inizia il test, secondo un ciclo di agitazione a 1250 rpm per 120 secondi. La temperatura del campione viene mantenuta a 44°C /- 1°C (rappresentativo di una doccia calda). La misurazione della schiuma viene fatta ogni 60 secondi per un tempo di 15 minuti. I risultati della prova vengono riportati in Tabella 2

Tabella 2

Tempo (min) Volume schiuma (mi)

Campione 1 (invenzione) Campione 2 (bianco)

1 950 950

2 947 946

3 940 941

4 935 936

5 931 930

6 929 925

7 928 924

8 925 917

9 925 913

10 921 911

11 920 908

12 915 903

13 911 901

14 908 898

15 904 893

16 899 888

Come si può osservare dai dati in Tabella 2, la presenza della miscela dell'invenzione non modifica in modo sostanziale le proprietà di persistenza della schiuma della composizione base acqua-tensioattivo.

Lo stesso test à ̈ stato effettuato fatti con altri tensioattivi an ionici e anfoteri, quali disodium laureth solfosuccinate, disosium laureth sulfate, disodium amphodiacetate, su formulazioni contenenti miscele dell'invenzione in un intervallo compreso tra 0,1 e 3% in peso, senza rilevare differenze significative per quanto riguarda ia formazione e stabilità della schiuma.

ESEMPIO 3

Formulazioni ad uso cosmetico contenenti Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico, ottenuti per condensazione tra il trimero lineare di glicerolo e acido azelaico secondo l’esempio 1.

Formulazione 1 - LOZIONE RISTRUTTURANTE

Componente (nome chimico/INCI) Concentrazione p/p (%) Alcool denaturato tipo C 13,00 - 18,00

PEG - 40 Hydrogenated castor oil 0,10 - 0,50

VP/VA Copolymer 0,01 - 0,05

Parfum 0,05 - 0,20

Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico 0,05 -1,80

Aqua q.b. 100

Formulazione 2 - SHAMPOO SEBONORMALIZZANTE

Componente (nome chimico/INCI) Concentrazione p/p (%) Disodium Laureth Sulfosuccinate 1 ,00-7,00 Di-PPG-2-Mireth-10 Adipate 0,50-3,00

Disodium Cocoamphodiacetate 0,50-3,00 Ammonium Laury! Sulfate 0,50-3,00 Polyquaternium-10 0,10-0,50 Tetrasodium EDTA 0,05-0,20

Parfum 0,10-1 ,50 Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Com Starch 0,05-1 ,00

BHA 0,005-0,015

Cloruro di potassio 0,50-1 ,50 Dimethìcone PEG-7 Isostearate 0,5-1 ,50

PEG-120 Methyl Glucose Dioleate 0,10-0,90

Laureth-3 0,01-0,80

PEG-90 Glyceryl Isostearate 00,10-0,80

1

PEG-8 Caprylyc/Capric Glycerydes 0,50- O1 ,00

OO

Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico 0,05-1 ,80

Sodium Hydroxymethylglycinate 0,20-0,45

Acido citrico q.b. a pH 5,5 - 6,0 Aqua q.b. 100ì

Formulazione 3 - SIERO TRICOLOGICO

Componente (nome chimico/INCI) Concentrazione p/p (%)

Alcool denaturato tipo C 15 - 20 Hydrogenated castor oil 0,50 - 0,9

Parfum 0,01 - 0,05 Hydroxypropy! guar

Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico 0,05 -1 ,80

Aqua q.b. 100 Formulazione 4 - BALSAMO CONDIZIONANTE

Componente (nome chimico/INCI) Concentrazione p/p (%) Behentrimonium Methosulfate 0,5 -3,0

Panthenol 0,5 -3,0

Cetearyl Alcohol 0,5 -4,0

Palmitic acid 0,5 -4,0

Mirystic acid 0,5 -4,0

Hydrolyzed Wheat Protein 0,05-1,0 Cetrimonium Chloride 1,0 -3,0

Penthylene glycol 5,0

Phenoxyethanol 0,5- 1,0

Parfum 0,1 -0,3

Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico 0,05-1,80

Aqua q.b. 100

Formulazione 5 - LATTE DA CORPO

Componente (nome chimico/INCI) Concentrazione p/p (%) Glycerin 1,00-6,00 Methylpropanediol 1,00-6,00

Cetyl hydroxyethylceìlulose 0,10-0,40

Xanthan gum 0,10-0,40

Tapioca starch 1,00-2,00

Disodium EDTA 0,025-0,20

Sorbitan stearate 2,00-5,00

Sucrose cocoate 0,10-1,00

Ethylexyl pa Imitate 1,00-5,00 Hydrogenated polydecene 100-5,00 Caprilic/capric triglycerides 1,00-5,00 Butyrospermum parkii 1,00-5,00 Meadowfoam (Limnanthes alba) seed oil 1,00-3,00 Dimethicone 1,00-3,00

Sodium hydroximethylglycinate 0-10-0,20

Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico 0,05-1 ,80 Phenoxyethanol 0,70-0,90

Lactic acid q.b. a pH 5,5 - 6,0 Parfum 0,30

Delta tocopherol 0,02-0,25

Sorbityl furfural 0,10-0,90

Aqua q.b. 100

Formulazione 6 - STRUCCANTE LEAVE ON

Componente (nome chimico/INCI) Concentrazione p/p (%) Glycerin 2,00-5,00 Ethylhexylglycerin 0-25-0,50

Octatrienoic acid 0,05-0,50

Trehalose 0,50-1 ,00

Idrossido di potassio q.b. pH 5, 5-6,0

PPG-26 Buteth-26 2,00-15,00

PEG-40 Hydrogenated Casto r Oil 2,00-15,00 Methylpropanediol 1 ,00-6,00

Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico 0,05-1 ,80

Aqua q.b. 100

ESEMPIO 4

Sono stati investigati gli effetti a nti infi animato ri degii oligomeri depoligliceril-3-azelaiato (POLY-AZ) ottenuto con il metodo dell’Esempio 1 in un modello di infiammazione in vitro, su cheratìnociti umani NCTC2544, ed utilizzando il lipopolisaccaride

(LPS) da E. coli come mediatore dello stato infiammatorio o irritativi. L'effetto del derivato nei modelli utilizzati à ̈ stato comparato con quello dell'acido azelaico (AZ-ACID), agente antinfiammatorio ad azione nota.

E’ stato inoltre determinato il potenziale irritante in vitro del derivato (POLY-AZ) nei confronti di un controllo positivo (cellule trattate con 5pg/ml di lipopolisaccaride). I dati ottenuti sono stati paragonati con quelli ottenuti, nello stesso modello sperimentale, utilizzando l'acido azelaico (AZ-ACID).

MATERIALI

Modello biologico

La linea di cheratinociti umnai NCTC2544 (Perry V.P. et Al., 1957) à ̈ stata ottentuta dall’Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro , Genova, Italia.

Coltura e propagazione della linea cellulare

Si utilizza la linea im morta lizzata di cheratinociti umani NCTC 2544 (Perry V.P. et al., 1957) mantenuta in coltura in fiasche sterili (25 cm<3>), incubate a 37°C in atmosfera umida al 5% di C02in terreno di coltura MEM (Minimum Essential Medium) addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), glutammina 2mM, 1% di aminoacidi non essenziali, in presenza di 1% di penicillina e streptomicina.

Lo split 1 :3 si effettua ogni 2 giorni al raggiungimento del monostrato mediante lavaggio con PBS 1X (tampone fosfato senza Ca<z+ e>Mg<2+>) e distacco delle cellule con una soluzione di tripsina- EDTA a 37°C per 2 minuti.

Reagenti e strumentazioni utilizzate

DITTA EMEM (EBSS) senza L-glutammina Lonza (BE12-125F) Soluzione di amminoacidi (100X) Lonza (BE13-114E) FBS ES Lonza (DE14-850F) PEN STREP MIX Lonza (DE17-602F) (Penicillina 10.000 Ul/ml, Streptomicina 10.000 Ul/ml)

L- glutammina 200mM Lonza (BE17-605E) DMSO SIGMA (D1435) PBS 1X senza Ca2+o Mg2+ Lonza (BE17-516F) Miscela di tripsina-versene (EDTA) (1X) Lonza (BE17-161 E) Trypan Blue Sigma (T8154-20ML) MEM Eagle EBSS (2X), W/O L-GIn, rosso fenolo Lonza (BE12-668-E) MTT Sigma (M2128 1G) Cloroformio Sigma (366919) Agarosio Sigma (A9539) Soluzione di etidio bromuro Sigma (E1510) Gel Loading Buffer. Sigma (G2526) Tri-Reagent Sigma (T9424)

2- Propanolo Sigma (59304) Tris Acetate-EDTA buffer Sigma (T9650) Acqua Sigma (95284) High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (4368814) TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG Applied Biosystems (4324018) Lipopolisaccaride da E. Coli Sigma (L4391 )

-.STROM^WION^f,DITTA

Microscopio a contrasto di fase invertito Leica

Cappa a flusso laminare Steril Manifacturing Division

Incubatore HeraCell C02 ( Mod:150 ADV) Thermo Scientific Bagno digitale termostatato Stuart

Freezer orizzontale -80°C Elcold

Camera di Burker Carlo Erba Bilancia (Mod. AM100) Mettler

Lettore spettrofotometrico di micropiastre (Mod: ELX808) Gen5 BioTek

Software

Spettrofotometro UV-visibile (MOD:6715, BS-6715B0) JenWay

Vortex analogico (Mod. Sa8, BS-SAB) Stuart

Sistema per Reai time PCR (Mod: Mx3000P) Stratagene

PcDell Software MX3000P version 1 .2 e 2.00 Stratagene

Trans-UV (ACDM-ECXF15M) Vilber Lourmat Camera elettroforetica orizzontale (MOD:250-5159) Ward

Alimentatore per camera elettroforetica (MOD:36-51 12) Ward

Fotocamera digitale dispositivo di protezione per UV (S630) Samsung Centrifuga da banco (Gaiaxy 7d) VWR

Mixer (TR1 3) Girmy Composti attivi testati

*Tutte le concentrazioni sono riferite al composto attivo nella matrice di utilizzo Controllo

Controllo negativo: Cheratinociti umani NCTC2544 mantenuti in coltura in EMEM (EBSS) al 2,5% FBS, supplementato con L-glutammina 2mlVI , 1% di soluzione di amminoacidi e 1% di miscela di penicillina (10.000 U/ml)/streptomicina (10.000 Ug/ml) a 37°C, 5% C02.

Controllo positivo: Cheratinociti umani NCTC2544 trattati con LPS (5pg/ml) in EMEM (EBSS) al 2,5% FBS, supplementato con L-glutammina 2mM , 1% di soluzione di amminoacidi e 1% di miscela di penicillina (10.000 U/ml)/streptomicina (10.000 Ug/ml) a 37°C, 5% C02.

METODI

L'espressione genica del TNF-α su NCTC 2544 à ̈ stata valutata mediante RT-PCR.

L’analisi dell'espressione genica comporta quattro fasi:

1. Trattamenti di cellule con composti attivi per 16-24-48h;

2. Estrazione di RNA;

3. retrotrascrizione del cDNA;

4. RT-PCR quantitativa.

Trattamento delle cellule NCTC2544

Nelle condizioni sperimentali, in relazione con i risultati ottenuti in un saggio MTT precedente (dati non riportati), il poligliceril-3-azelaiate e l’acido azelaico sono stati testati ad una concentrazione di 20Î1⁄4Îœ (concentrazione finale nel mezzo). Sia il controllo positivo e negativo sono stati testati.

Test anti-infiammatorìo su NCTC2544

Giorno 1 : semina delle cellule

Quando le cellule (cheratinociti umani NCTC 2544) hanno raggiunto circa Γ 80% di confluenza, sono state staccate con tripsina / EDTA e seminate a una densità di 1 x 10<6>cellule/ml in piatre da 12 pozzetti e poi incubate a 37<0>C, 5% C02 (24h). Giorno 2:esposizione alle sostanze per 24h

Il poligliceril-3-azelaiate e l’acido azelaico sono stati disciolti in DMSO (100%) ad una concentrazione di 25 mM (soluzione madre), e poi diluito in terreno EMEM, supplementato con 2,5% FCS, 2 mM L-glutammina, 1% soluzione NEAA e 1 % penicillina (10.000 U / mi) / streptomicina (10.000 pg / mi).

I controlli, contenenti solo terreno di coltura (controllo negativo) e il mezzo di coltura più LPS (5pg/ml) (controllo positivo) sono stati inclusi in ciascuna piastra. Le cellule sono state esposte a 20Î1⁄4Îœ dei composti. A ciascun pozzetto (eccetto nel controllo negativo) à ̈ stato aggiunto LPS ad una concentrazione di 5pg/ml. Ogni composto à ̈ stato testato in replica.

Saggio del potenziale irritante in NCTC2544

Giorno 1: semina

Quando le cellule (cheratinociti umani NCTC 2544) hanno raggiunto circa l’80% di confluenza, sono state staccate con tripsina / EDTA e seminate a una densità di 1 x 10<6>cellule / mi in piastre da 12-pozzetti e poi incubate a 37<0>C, 5% C02 (24h).

Giorno 2: esposizione 24h alle sostanze

II poligliceril-3-azelaiate e l’acido azelaico sono stati disciolti in DMSO (100%) ad una concentrazione di 25 mM (soluzione madre), e poi diluiti in terreno EMEM, supplementato con 2,5% FCS, 2 mM L-giutammina, 1% soluzione NEAA e 1 % penicillina (10.000 U / mi) / streptomicina (10.000 pg / mi).

I controlli, contenenti terreno di coltura (controllo negativo) e terreno di coltura più LPS (5pg/ml) (controllo positivo) sono stati inclusi in ogni piastra.

Le cellule sono state esposte a 20Î1⁄4Îœ dei composti attivi.

Le cellule sono state poi incubate a 37 ° C, 5% C02 per 24h.

RNA extraction

L’RNA totale à ̈ stato estratto dalle cellule usando il reagente Tri (Sigma Aldrich), che à ̈ una singola soluzione omogenea per l'isolamento dell’RNA seguendo le indicazioni del fornitore.

La purezza di RNA totale estratto à ̈ stata valutata leggendo l'assorbanza a 260nm, la λ in cui l'acido nucleico ha la massima assorbanza. È stato anche letta l'assorbanza a 280 nm, per valutare la contaminazione da proteine o fenolo. L'RNA à ̈ considerato di buona qualità, se il rapporto A260/A280 = R à ̈> 1,4.

Dopo aver determinato la concentrazione totale di RNA e la purezza ciascun campione di RNA à ̈ stato diluito in acqua DEPC ad una concentrazione finale di 2 Î1⁄4 g / mi. Questa à ̈ la concentrazione richiesta dal kit di retrotrascrizione .È stato anche eseguito una corsa elettroforetica su gel per verificare l'integrità del RNA totale estratto.

Reverse transcrìption PCR

L'RNA totale, estratto e quantificato, Ã ̈ stato amplificato utilizzando la "High Capacity cDNA Kit trascrizione inversa (Applied Biosystems).

Primer casuali sono stati utilizzati al fine di garantire una efficace sintesi del primo filamento del mRNA.

Per l'amplificazione abbiamo usato la RT-PCR System Mx3000P (Stratagene) e ciascun RNA totale à ̈ stato amplificato in duplicato.

^Condizioni<â– >7 Siep i: 3: Stà ̈p 4: amplificazione lililli Ili â– â– iillill ! mliiiimm Step

iilfti!i! iSillPP infilali Temperatura 25° C 37°C 85° C 25° C Tempo 10 min 120 min 60 sec hold Dopo amplificazione campioni sono stati diluiti con 30 pi di acqua DEPC e conservati a -20<0>C fino all'uso.

Reai Time PCR

La RT-PCR à ̈ stato impostata, usando sonde TaqMan lineari (Applied Biosystems). Queste sonde sono il sistema di rilevazione più diffuso e pubblicato per le applicazioni qPCR.

Le sonde inventariate e primer sono stati scelti in base agli studi bibliografici specifici in precedenza.

Abbiamo utilizzato il metodo di quantificazione relativa in cui viene confrontata la concentrazione relativa del gene di interesse (bersaglio) in campioni sconosciuti ad un calibratore o campione di controllo (cellule non trattate). Qui, ii calibratore à ̈ una linea di base per l'espressione di un gene bersaglio

/ seguenti geni sono utilizzati:

GENE NAME TAQMAN ÀSSAY 1 D ::RÃŒ6graiiiim£r::|y, :cfi j:Lunghezza amplificazione _ AirijpiìIcQn GAPDH Hs99999905_m1 95 °C 15s 122 (housekeeping) 60°C 60s

Per 40 cicli

TNF-α (target) Hs00174128_m1 95°C 15s 105

60°C 60s

per 40 cicli

Procedura Sperimenta fe

La RT-PCR Ã ̈ stata es Oeguita usando i cDNA delle cellule trattate a differenti tempi0

di trattamento e deOLl ole cellule controllo.

Al cDNA sono stati aggiunti 10 pi di Mix 2X Gene Expression master TaqMan e 1 Î1⁄4Ι di 20X Gene Expression TaqMan. Ogni campione biologico à ̈ stato trattato in duplice copia e amplificato come indicato in tabella.

Step 1; 3⁄4Step.;£ Actrvati 3⁄4 Step 3: PCR

:UDG ihcubation : 03⁄4?Arp p I iTaqX:. Gpìd :

DNA Pólymeràse

Hold Hold Cycle (50 cycles)

Denature Anneal/Extend Temperatura 95°C 95° C 60° C Tempo 2 min 10 min 15 sec Hold Data collection

I dati forniti dallo strumento Stratagene Mx3000P sono stati registrati dal software interno MXpro v.4.01. Quando l'amplificazione à ̈ stata completata, il software applica automaticamente il metodo del 2<' Δ Δ>Ct. I valori di Ct del target e il normalizzatore idealmente dovrebbe essere entro circa dieci cicli di uno dall'altro.

La quantizzazione comparativa derivante à ̈ un diagramma comparativo relativo.

Un valore pari a uno indica nessun cambiamento nell'espressione genica di del gene target tra il campione in studio e il calibratore, mentre se maggiore, indica up-regulazione, se inferiore ad uno indica la down-regulazione. Un valore à ̈ significativamente accettato come significativo se à ̈ una volta superiore o inferiore (up-regolato o down-regolato) rispetto al calibratore.

Risultati

II TNF -a à ̈ tipicamente over-espresso nell'epidermide di soggetti affetti da psoriasi (Kristensen et al, 1993;.. Ettehadi et al, 1994) e ha un ruolo fondamentale nella patogenesi della patologia stessa. Il ruolo chiave del TNF-α à ̈ inoltre supportato sia dall'evidenza che nella psoriasi altri geni che vengono regolati dal TNF-a risultano over-espressi e che antagonisti del TNF-α sono utilizzati come agenti terapeutici altamente efficaci nella maggior parte dei pazienti {Richardson e Gelfand, 2008). Recentemente, à ̈ stato suggerito che TNF-α inibisce l'espressione delle proteine barriera (per esempio, FLG e LOR), che antagonisti del TNF-a possono contribuire al miglioramento clinico dei pazienti affetti da psoriasi aumentando l'espressione delle proteine barriera (Kim et al., 2011).

McRitchie et al. (1997) hanno recentemente dimostrato che 10 pg / mi di LPS da E. coli stimola in modo massiccio la produzione TNF-α da parte delle cellule epiteliali alveolari entro le 4 h.

Nello studio intrapreso, abbiamo trovato che il trattamento con LPS da E. coli (5pg/ml) ha avuto un effetto simile sull'induzione del TNF-α e quindi del processo infiammatorio su cellule NCTC 2544 a partire dalle 16h di trattamento.

Dapprima à ̈ stato allestito un esperimento per verificare gli effetti dell'LPS sulla linea NCTC2544. I trattamenti con LPS (5pg/ml) in terreno EMEM con un basso contenuto di FBS (2,5%) per 16, 24 e 48 ore e valutato la stimolazione di TNF-a. Dalle 16h di incubazione l’LPS induce una produzione significativa di TNF-a (espressione genica) rispetto al controllo negativo.

Dopo 24 ore di trattamento con LPS (5pg/ml) l'espressione genica di TNF-α à ̈ significativamente (P <0,05) aumentata di circa tre volte e questo effetto si mantiene anche dopo 48h di incubazione, sebbene di minore entità.

Sulla base dei risultati ottenuti, sono stati effettuare i saggi successivi dopo 24 ore di incubazione corrispondente ad una induzione maggiore di TNF-α da parte di LPS.

SAGGIO DELL’INFIAMMAZIONE

In seguito all'esperimento preliminare sopradescritto di convalida del modello, à ̈ stata valutata l'espressione genica di TNF-α mediante RT-PCR su NCTC 2544, dopo i trattamenti con 20Î1⁄4Îœ di poliglìceril-3-azelaiate e 20Î1⁄4Îœ di acido azelaico aggiunte assieme a LPS a 5pg/ml nel mezzo di coltura per valutare l’effetto antiinfiammatorio dei due composti.

Dopo 24 ore di trattamento (Figura 2) l'acido azelaico non produce un effetto inibitorio sull’espressione genica TNF-α, mentre il poligliceriì-3-azelaiate ha un effetto inibitorio significativo (P <0,05).

SAGGIO DELL’IRRITAZIONE

L’espressione genica del TNF-α in cellule NCTC 2544 à ̈ stata valutata anche dopo i trattamenti con 20Î1⁄4Îœ di poligliceril-3-azelaiate 20Î1⁄4Îœ di acido azelaico rispetto alle cellule trattate con LPS (5pg/ml) in mezzo di coltura, al fine di confrontare gli effetti di questi composti contro un agente irritante ben noto (LPS). Durante il test infiammazione, dopo 24 ore di incubazione (figura 2), il trattamento con acido poligliceril-3-azelaiate, ha prodotto una significativa (P <0,05) downregulation in TNF-α rispetto al controllo positivo. In particolare, in questo test di valutazione del potenziale irritante delle due sostanze, entrambe non risultano irritanti, ma il poligliceril-3-azelaiate à ̈ più efficace dell’acido azelaico (riduzione di circa la metà) nella sua down-regolazione.

Gli esperimenti condotti evidenziano che quando usati a 20Î1⁄4Îœ, il poligliceril-3-azelaiate à ̈ stato ben tollerati da! sistema utilizzato.

Per quanto riguarda l’effetto antinfiammatorio, (abbiamo osservato un netto aumento dell’espressione genica di TNF-α dopo trattamento con LPS 5pg/ml rispetto alle cellule non trattate) il poligIiceril-3-azelaiate ha mostrato un effetto anti-infiammatorio (riduzione del TNF-α) e questo effetto à ̈ superiore rispetto all’acido azelaico.

Anche quando testati per il loro potenziale irritante in vitro su cheratinociti umani NCTC2544, dopo 24 ore di incubazione, il poligliceril-3-azelaiato à ̈ risultato più efficace nella down-regolazione dell’espressione genica del TNF-α rispetto alla stessa concentrazione di acido azelaico.

Descrizione delle Figure 2 e 3 relative alla parte sperimentale:

La Figura 2 illustra l’espressione genica del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-a) in cheratinociti umani NCTC 2544 determinato mediante RT-PCR. Le cellule NCTC 2544 sono state trattate per 16, 24 e 48 ore, a 37 ° C in C02 al 5%, con: LPS (5pg/ml), LPS (5pg/ml) poligliceril-3-azelaiato 20 Î1⁄4Îœ e con LPS (5pg/ml) acido azelaico 20 Î1⁄4Îœ. I valori sono la media di 2 esperimenti in duplicato.

La Figura 3 illustra l'espressione genica del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-a) in cheratinociti umani NCTC 2544 determinato mediante RT-PCR. Le cellule NCTC 2544 sono state trattate con: mezzo di coltura base, contenente 2,5% di siero fetale bovino (controllo negativo) e con: mezzo di coltura base, contenente 2,5% di siero fetale bovino a cui à ̈ stato aggiunto LPS (5pg/m!) (controllo positivo); con mezzo dì coltura base, contenente 2,5% di siero fetale bovino e poligliceril-3-azelaiato 20 Î1⁄4Îœ; con mezzo di coltura base, contenente 2,5% di siero fetale bovino e acido azelaico 20 Î1⁄4Îœ. I valori sono la media di 2 esperimenti in duplicato.

ESEMPIO 5

Premessa

Nel corso delle prove effettuate per individuare le condizioni di sintesi più idonee airottenimento dei poliesteri poliglicerolo-acido azelaico, si à ̈ osservato che l’applicazione di sempre crescenti carichi termici favorisce la reticolazione del polimero/poliestere.

In taluni casi il prodotto a base di Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico, così come si presentava al termine del processo, appariva come un solido elastico di aspetto opaco e geliforme.

Conseguentemente sono state testate le applicazioni topiche dei poliesteri poliglicerolo-acido azelaico nei casi in cui la cute o gli annessi cutanei sono esposti ad una fonte di calore, ad esempio durante l’esposizione alla radiazione solare nei periodi più caldi dell’anno o a sistemi di riscaldamento diretto o indiretto (piastre, asciugacapelli, caschi da parrucchiere ecc).

E’ noto che tali trattamenti possono essere anche molto stressanti per i capelli, soprattutto nei casi che in cui vi si ricorre con elevata frequenza.

E’ stato quindi allestito un test ad hoc per verificare tale osservazione.

INTRODUZIONE

Lo stiraggio temporaneo dei capelli mediante applicazione di calore con una piastra riscaldante rappresenta una tecnica sempre più utilizzata nel campo dell'hair styling.

Sono quindi stati esaminati gli effetti del trattamento termico prolungato, mediante utilizzo di una piastra per capelli commerciale (ga.ma Italia, professional line, mod. Art. 100), sulla struttura cuticolare della fibra del capello.

Il processo di stiraggio dei capelli mediante trattamento termico con una piastra per capelli commerciale stressa termicamente il capello in particolare se il trattamento termico à ̈ eseguito in maniera continuativa e ravvicinata.

SCOPO DEL LAVORO SPERIMENTALE

La procedura sperimentale di seguito riportata ha avuto come scopo la messa a punto di un metodo che permette di verificare l'efficacia protettiva di due differenti formulazioni (shampoo e prodotto leave-on) contenenti il poliglicerii-3-aze!aiato in seguito all’applicazione, su ciocche di capelli da donatore mai trattate precedentemente, nei confronti di uno stress termico prolungato mediante utilizzo di una piastra lisciante per capelli commerciale (GA.MA Italia, Professional Line, Mod. ART. 100). Una formulazione (shampoo) priva dell’ingrediente attivo à ̈ stata utilizzata come controllo negativo degli esperimenti. Ciocche dello stesso donatore e non sottoposte ad alcuno stress termico sono invece state utilizzate come controllo positivo.

MATERIALI

Formulazioni testate

Si à ̈ proceduto con l'allestimento delle sotto riportate formulazioni:

Formulazione-shampoo ATTIVO

INCI % p/p

AQUA Q.B. 100 g

AQUA, AMMONIUM LAURYL SULFATE 6,500

(SOLUZIONE ACQUOSA AL 27 % DI

TENSIOATTIVO)

AQUA, DISODIUM LAURETH-3 14,500

SULFOSUCCINATE (SOLUZIONE

ACQUOSA AL 38 % DI TENSIOATTIVO)

POTASSIUM CHLORIDE 1,000

AQUA, DISODIUM 7,000

COCOANPHODI ACETATO

(SOLUZIONE ACQUOSA AL 28 % DI

TENSIATTIVO)

POLYGLYCERYL 3 AZELAIATE 1,000

OLIGOMERS CITRIC ACID Q.B. pH 5,5

Formulazione-leave-on ATTIVO

INCI % p/p

AQUA Q.B. 100 g

POLYGLYCERYL 3 AZELAIATE 2,000

OLIGOMERS SODIUM HYDROXIDE Q.B pH 4,5

Controllo positivo

Ciocche di capelli dello stesso donatore non sottoposte ad alcun trattamento termico (prelievo dei capelli da ciascuna ciocca testata prima dell'inizio dei trattamenti termici).

Controllo negativo

Al fine di determinate il potenziale effetto protettivo dell’ingrediente attivo testato, à ̈ stata, parallelamente, allestita una formulazione-shampoo priva di poligliceri-3-azelaiato, secondo la seguente formulazione:

Formulazione-shampoo PLACEBO â– 

INC! % p/p

AQUA Q.B. 100 g

AQUA, AMMONIUM LAURYL SULFATE 6,500

(SOLUZIONE ACQUOSA AL 27 % DI

TENSIOATTIVO)

AQUA, DISODIUM LAURETH-3 14,500 SULFOSUCCINATE (SOLUZIONE ACQUOSA

AL 38 % DI TENSIOATTIVO)

POTASSIUM CHLORIDE 1,000 AQUA, DISODIUM COCOANPHODIACETATO 7,000 (SOLUZIONE ACQUOSA AL 28 % DI

TENSIOATTIVO)

CITRIC ACID Q.B. a Ph 5,5 Modello di studio

3 ciocche di capelli provenienti dallo stesso donatore, mai trattate precedentemente, di colore castano e della lunghezza di 25 cm, organizzate in ciocche aventi lo stesso peso (circa 10 g).

PROCEDURA SPERIMENTALE

1. Allestimento, in ciocche da 10g c.a., di 3 campioni di ciocche da donatore, non trattate;

2. Prelievo di 2 capelli (controllo positivo) per le successive analisi al microscopio;

3. Fissaggio della ciocca su un supporto adeguato che la mantenesse ferma durante le fasi successive;

4. La ciocca à ̈ stata sottoposta a spazzolamento consecutivo (alternando 10 passaggi sul fronte e 10 sul retro), per 4 minuti;

5. Avvio del primo ciclo di stress termico:

Applicazione della piastra per capelli commerciale (GA.MA Italia, Professional Line, Mod. ART. 100) in maniera continuativa per 15 secondi, lungo tutta la lunghezza della ciocca;

Lo stress termico di 15 secondi à ̈ stato ripetuto per ulteriori 5 volte;

6. Risciacquo della ciocca sotto acqua corrente (44°C, circa, a flusso costante) per la durata di un minuto;

7. Applicazione uniforme di 1mL della formulazione-shampoo PLACEBO o ATTIVO su tutta la ciocca per 1 minuto (dispersa poi delicatamente massaggiano la ciocca con i polpastrelli delle dita);

8. Condizionamento con la formulazione per un ulteriore minuto e successivo risciacquo sotto acqua corrente (44°C, circa, a flusso costante) per la durata di un minuto;

9. La ciocca à ̈ stata strizzata delicatamente e tamponata con un foglio di carta assorbente e successivamente riappesa al supporto.

APPLICAZIONE LEAVE-ON: solo in questo caso, al termine dello shampoo con la formulazione PLACEBO, sulla ciocca à ̈ stato applicato uniformemente 1mL di formulazione Leave-on;

10. Senza spazzolare o pettinare la ciocca, si à ̈ proceduti all'asciugatura della stessa mediante utilizzo di un phon (Turbo Action Professional, Mod. ST, 30005) la cui aria à ̈ stata applicata al massimo della temperatura, a flusso medio, ad una distanza di circa 4 cm dalla ciocca e per la durata di 4 min;

11. Al termine del primo ciclo termico i capelli o i frammenti raccolti sul foglio alla base del supporto sono stati delicatamente raccolti, contati e conservati per le successive analisi di immagine al microscopio;

12. La ciocca à ̈ stata sottoposta allo stesso ciclo termico per ulteriori due volte secondo le specifiche sopra elencate;

13. Al termine del terzo ciclo termico la ciocca à ̈ stata pettinata (fronte retro) con un pettine a denti stretti per circa 1 minuto;

14. Frammenti di capello della lunghezza di circa 2-3cm di ciascun ciclo termico sono stati successivamente analizzati al microscopio per la valutazione dei danni dello stress termico.

ELABORAZIONE DEI DATI

Per ciascuna delle tre formulazioni testate à ̈ stata effettuata un’osservazione al microscopio dei frammenti di capelli raccolti alla base del supporto e derivanti rispettivamente dal primo e dal terzo trattamento termico. Le immagini sono state acquisite al microscopio a contrasto di fase (Leica DM 2000) ad un ingrandimento 100X in olio di immersione. Per ciascun frammento sono state acquisite immagini digitali in 5 differenti punti del frammento. Ciascuna osservazione à ̈ stata condotta almeno in duplicato.

In Figura 4A viene riportata l'immagine a microscopio di un frammento di capello non trattato (non-stressato), non stressato proveniente da ciocca di donatore di lunghezza di 25 cm, colore castano/3. Il capello mostrato non à ̈ stato trattato.

Nella Figura 4B viene riportata l’immagine a microscopio di un frammento di capello trattato (stressato) proveniente da ciocca di donatore, mai trattata, di circa 25cm di lunghezza, colore castano/3. La ciocca di capelli à ̈ stata sottoposta a tre cicli di stress termici consecutivi, come indicato nella procedura sperimentale. Al termine di ciascun ciclo termico i capelli sono stati raccolti e osservati al microscopio, ingrandimento 100x con olio di immersione. Il capello mostrato à ̈ stato trattato con la formulazione placebo.

Nella Figura 5A viene riportata l'immagine a microscopio di un frammento di capello trattato (stressato) proveniente da ciocca di donatore, mai trattata, di circa 25cm di lunghezza, colore castano/3. La ciocca di capelli à ̈ stata sottoposta a tre cicli di stress termici consecutivi, come indicato nella procedura sperimentale. Al termine di ciascun ciclo termico i capelli sono stati raccolti e osservati al microscopio, ingrandimento 100x con olio di immersione. Il capello à ̈ stato trattato con formulazione rinse-off (shampoo) a base di Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico.

Nella Figura 5B viene riportata l'immagine a microscopio di un frammento di capello trattato (stressato) proveniente da ciocca di donatore, mai trattata, di circa 25cm di lunghezza, peso 10 g e colore castano/3. La ciocca di capelli à ̈ stata sottoposta a tre cicli di stress termici consecutivi, come indicato nella procedura sperimentale. Al termine di ciascun ciclo termico i capelli sono stati raccolti e osservati al microscopio, ingrandimento 100x con olio di immersione. Il capello à ̈ stato trattato con formulazione leave-on, a base di Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico.

RISULTATI

Sottoporre le ciocche di capelli a cicli termici prolungati, mediante l'utilizzo di una piastra stirante per capelli commerciale (GA.MA Italia, Professional Line, Mod. ART. 100), ha provocato una significativa degradazione e disorganizzazione delle cuticole dei capelli sottoposti a stress termico. Questo stress viene evidenziato in Figura 4 B che raffigura un frammento di capello sottoposto a lavaggio con una formulazione-placebo.

La Figura 5 A evidenzia come il trattamento di ciocche di capelli dallo stesso donatore con una formulazione shampoo contenente il poligliceril-3-azelaiato (1% p/v) e la successiva esposizione delle ciocche a 3 cicli termici consecutivi, à ̈ in grado di diminuire lo stress termico sui capelli. Sul capello stressato termicamente, che à ̈ stato sottoposto a lavaggio con la formulazione contenente l’attivo prima dell’applicazione di ciascun ciclo termico, si deposita un film protettivo. All’osservazione microscopica, i capelli così trattati manifestano un minor numero di cuticole, presumibilmente coperte e protette dal film protettivo creatosi.

La Figura 5 B evidenzia come il trattamento di ciocche di capelli trattate con la formulazione leave-on contenente il poligliceril-3-azelaiato (2% p/v), applicata sulle ciocche bagnate dopo lavaggio con la formulazione shampoo placebo e seguita dalla produzione degli stress termici. In particolare, l'analisi deN’ìmmagine evidenza come la formulazione leave-on sia in grado di creare uno strato protettivo sul capello in grado di proteggere le cuticole dello stesso dallo stress termico applicato. Tale strato protettivo à ̈ evidente e omogeneo al termine degli stress.

In generale i risultati ottenuti hanno evidenziato l’effetto protettivo esercitato dalle due formulazioni in forma di shampoo e lozione leave-on contenenti poligliceril-3-azelaiato, su capelli successivamente sottoposti a cicli termici ripetuti che in condizioni normali (applicazione di una formulazione shampoo placebo e stress termico ripetuto), creano un danno significativo del capello che si manifesta come deterioramento e la disorganizzazione delle cuticole dello stesso.

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico ottenuti mediante condensazione di acido azelaico con poligliceroli con un grado di polimerizzazione compreso tra 1 ,5-10.
2. 2. Poliesteri poliglicerolo-acido azelaico secondo la rivendicazione 1, aventi Mn compresi da 500 a 30000 Daiton, preferibilmente compresi da 1500 a 20000 Dalton, espressi in polistireni equivalenti in size exclusion cromatography.
3. 3. Metodo per la produzione di poliesteri poliglicerolo-acido azelaico comprendente la condensazione di acido azelaico con un poliolo scelto tra glicerolo e suoi oligomeri contenenti fino a 10 unità di glicerolo.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detto poliolo à ̈ poliglicerolo-3.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui in detto poliglicerolo-3 comprende il trimero HO y o y o y OH OH OH OH
6. 6. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 3-5, in cui la condensazione à ̈ effettuata in presenza di un acido o una base, preferibilmente sotto atmosfera inerte, e ad una temperatura preferibilmente compresa da 130 °C a 220 °C.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 6, in cui detto acido à ̈ acido paratoluensolfonico.
8. 8. Composizione cosmetica comprendente poliesteri poliglicerolo-acido azelaico secondo la rivendicazione 1 o 2 ed un veicolo cosmeticamente accettabile.
9. 9. Composizione cosmetica secondo la rivendicazione 8 in cui il poliestere poliglicerolo-acido azelaico à ̈ ottenuto facendo reagire acido azelaico e poliglicerolo-3. in cui l'indice n à ̈ variabile tra 1 e 7.
10. 10. Uso di un Poliestere poliglicerolo-acido azelaico secondo la rivendicazione 1 o 2 o di una composizione cosmetica secondo la rivendicazione 8 o 9 per il trattamento cosmetico della pelle, in particolare affetta da acne.
11. 11. Poliestere poliglicerolo-acido azelaico secondo la rivendicazione 1 o 2 per l'uso nel trattamento degli stati di infiammazione della pelle, in particolare con acne.
12. 12. Uso di poliesteri poliglicerolo-acido azelaico secondo la rivendicazione 1 o 2 o di una composizione cosmetica secondo la rivendicazione 8 o 9 per proteggere la cute,annessi cutanei o i capelli dal calore o da trattamenti termici.