ITMI20091361A1 - Composizione per uso farmaceutico o cosmetico o dietetico atta a svolgere un effetto di pigmentazione dei capelli - Google Patents

Description

"COMPOSIZIONE PER USO FARMACEUTICO O COSMETICO O DIETETICO ATTA A SVOLGERE UN EFFETTO DI PIGMENTAZIONE DEI CAPELLIâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda la pigmentazione dei capelli neH’uomo.

Il follicolo pilifero umano à ̈ un organo complesso nel quale sono presenti interazioni di popolazioni cellulari epiteliali (ad esempio differenti linee di cheratinociti, endotelio), mesenchimali (ad esempio fibroblasti della papilla dermica, fibroblasti della guaina del tessuto connettivo), neuroectodermiche (nervi, melanociti) e di cellule migranti transitorie (cellule immunitarie, mastociti).

La crescita e la pigmentazione delle fibre pilifere sono influenzate da numerosi fattori intrinseci comprendenti i cambiamenti dipendenti dal ciclo del capello, la distribuzione corporea, le differenze di razza e genere, la sensibilità ormonale variabile, i difetti genetici e i cambiamenti associati all'età. Lo studio della crescita dei capelli à ̈ complicato anche dagli effetti delle variabili estrinseche che comprendono il clima e le stagioni, le sostanze inquinanti, le tossine e l'esposizione a sostanze chimiche. Le differenze rilevate tra la regolazione della pigmentazione nell'epidermide e nei follicoli piliferi riflettono la compartimentazione del sistema di pigmentazione cutaneo mammifero.

I melanociti dell'epidermide, del bulbo del follicolo pilifero e della guaina della radice esterna del follicolo pilifero sono estremamente diversi tra loro, nonostante il fatto che la pigmentazione cutanea nei mammiferi debba intendersi un sistema aperto. Le maggiori differenze sono quelle della natura delle loro rispettive unità funzionali melanocitiche-cheratinocitiche. L'unità melaninica del bulbo pilifero si trova nel bulbo in anagen prossimale, che à ̈ una regione immunologicamente distinta delle pelle, ed à ̈ formata complessivamente da un melanocita ogni 5 cheratinociti nel bulbo pilifero e da un melanocita per ogni cheratinocita nello strato basale della matrice del bulbo pilifero. Al contrario, ciascun melanocita epidermico à ̈ associato a 36 cheratinociti vitali nell'unità melamminica epidermica immunocompetente.

Tuttavia la differenza più evidente tra queste due popolazioni melanocitiche della pelle, e con implicazioni significative per la regolazione della pigmentazione dei capelli, à ̈ l'osservazione che l'attività del melanocita del bulbo pilifero à ̈ soggetta a un controllo ciclico e che la melanogenesi à ̈ strettamente associata al ciclo di crescita dei capelli. Al contrario, la melanogenesi epidermica appare continua. Si à ̈ ora sorprendentemente trovato, e ciò costituisce oggetto della presente invenzione, che il composto spermidina, ossia N-(3-aminopropil)butano-1 ,4-diammina, come tale o sotto forma di derivato farmaceuticamente accettabile quale un sale, à ̈ dotato di un’attività di melanogenesi nei confronti dei capelli e può essere pertanto efficacemente usato per promuovere la loro pigmentazione, in particolare la pigmentazione del fusto.

Da tale attività si configura l’uso del composto attivo nell'uomo quale naturale agente di pigmentazione privo di effetti collaterali negativi, ad esempio tipici dei coloranti per capelli.

Oggetto dell’invenzione à ̈ anche una composizione per uso farmaceutico o cosmetico o dietetico atta a svolgere tale effetto di pigmentazione e contenente pertanto quale principio attivo spermidina, come tale o sottoforma di derivato farmaceuticamente accettabile quale un sale, per somministrazione sia topica sia orale.

Un sale preferito secondo l’invenzione à ̈ spermidina tricloridrato, ossia N-(3-aminopropil)butano-1,4-diammina<â– >3HCI.

Una composizione dell’invenzione preferibilmente comprende spermidina tricloridrato in soluzione formulata per uso topico. Adatte forme per uso topico sono ad esempio una lozione, un balsamo, uno shampoo, una maschera.

Una diversa composizione dell’invenzione preferibilmente comprende spermidina tricloridrato in unità di somministrazione formulata per uso orale. Adatte forme per uso orale sono ad esempio una compressa oppure una capsula, rivestite o non, oppure un granulato da disperdere in acqua o altro liquido.

Spermidina, come tale o sottoforma di derivato farmaceuticamente accettabile quale un sale, à ̈ contenuta in una composizione dell’invenzione secondo una quantità preferibilmente compresa nei seguenti intervalli:

- da 10<"7>a 1 g/100ml, corrispondente a da 0.004 a 4-10<4>Î1⁄4Îœ

- da 10<"5>a 1 g/100 mi, corrispondente a da 0.4 a 4-10<4>Î1⁄4Îœ

- da 10<"4>a 2.4-10<'2>g/100 mi , corrispondente a da 4 a 9-10<2>Î1⁄4Îœ.

Ulteriori preferiti intervalli di concentrazione sono i seguenti:

- da 10<'6>a 10<'1>g/100 mi

- da 10<'5>a 10<'2>g/100 mi

- da 10<'4>a 10<'3>g/100 mi

- da 10<'7>a 10<'6>g/100 mi

- da 10<"6>a 10<'5>g/100 mi

- da 10<"5>a 10<"4>g/100 mi

- da 10<'4>a 10<'3>g/100 mi

- da 10<'3>a 10<†̃2>g/100 mi

- da 10<"2>a 10<"1>g/100 mi

- da 10<'1>a 1 g/100 mi

I seguenti esempi di formulazione illustrano l’invenzione senza in alcun modo limitarne l'ambito. Le quantità dei componenti sono espresse in grammi oppure milligrammi e, nel caso degli esempi da 1 a 4, per intervalli di concentrazione.

Esempio 1

Shampoo

Composizione per 100 mi di soluzione

Componente (nomenclatura INCI) OL

Magnesium laureth sulfate 2-OL10

O g Sodium lauroyl sarcosinate 2-10 g Disodium laureth sulfosuccinate 0.5-5 g PEG-200 hydrogenated glyceryl palmate 0.5-5 g Cocamide MIPA 0.5-5 g Glycol distearate g Glycerin 0.5-5 g Laureth-7 0.1 -3 g PEG-7 glyceryl cocoate 0.1 -3 g Lauryl methyl gluceth-10 hydroxypropyldimonium

0.1 -3 g chloride

Polyquaternium-10 0.1 -3 g Potassium undecilenoyl wheat protein 0.1 -3 g Panthenol 0.1 -3 g Tetrasodium EDTA 0.1 -3 g Spermidine trihydrochloride 10<-7>- 1 g Preservative q.s.

pH corrector (to a final pH of 5.0-5.5) q.s.

Parfum q.s.

Aqua q.s. to 100 mi Esempio 2

Maschera per capelli

Composizione per 100 mi di soluzione

Componente (INCI)

Glycerin 1 - 10 g Ammonium acrylolyl-dimethyltaurate / vp copolymer 1 - 10 g Cyclopentasiloxane 1 - 10 g Silicone quaternium-15 0.1 -3 g Tocopheryl acetate 0.1 -3 g Dimethicone 0.1 -3 g Sericin 0.1 -3 g Methylparaben 0.05-0.1 g C11 -15 pareth-5 0.05-0.1 g C11-15 pareth-9 0.05-0.1 g Trideceth-12 0.05-0.1 g Decyl glucoside 0.01 -0.5 g Panthenyl ethyl ether 0.01 -0.5 g Disodium EDTA 0.01 -0.5 g Ethyl hexyl methoxycinnamate 0.01 -0.5 g Lactic acid q.s.

Preservante q.s.

Spermidine trihydrochloride 10<'7>-1 g Parfum q.s. g Aqua q.s. a 100 mi Esempio 3

Balsamo per capelli

Composizione per 100 mi di soluzione

Componente (INCI)

Cetearyl alcohol 1 - 10 9 Glyceryl stearate 1 - 10 g Dimethicone 1 - 10 g C12-13 alkyl lactate 0.5-5 g Cetrimonium chloride 0.5-5 g PEG-100 stearate 0.5-5 g Cyclopentasiloxane 0.5-5 g Hydroxyethylcellulose 0.1 -3 g Dimethiconol 0.1 -3 g Panthenol 0.1 -3 g Bis-isobutyl Peg/Ppg-20/35/amodimethicone copolymer 0.05-2 g Phytantriol 0.05-2 g Cetyl ethylhexanoate 0.05-2 g Butylene glycol 0.05-2 g Disodium edta 0.05 - 2 g Polysorbate 80 0.05-2 g Sericin 0.05-2 g Spermidine trihydrochloride 10<†̃7>-1 g Conservante q.s. g Parfum q.s. g Aqua q.s. to 100 mi Esempio 4

Lozione per capelli

Composizione per 100 mi di soluzione

Componente (INCI)

Alcohol 10 - 20 9 PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 0.2-2 g Disodium EDTA 0.01-0.5 g Parfum q.s.

Spermidine trihydrochloride 10<'7>- 1 g Aqua q.s. to 100 mi

Esempio 5

Capsule di gelatina dura

Composizione per singola capsula

Componente

Lactose Monhydrate 85 mg Corn starch 25 mg Tale 5 mg Spermidine trihydrochloride 1.25 mg Magnesium stearate 1.5 mg Hard gelatine capsule shell N. 4 1 n.

Esempio 6

Capsule di gelatina molle

Composizione per singola capsula

Componente

Soy oil 263.07 mg Gelatine 129.7 mg Glycerin 36.5 mg Sorbitol 70% 24.2 mg Water 23.274 mg Yellow wax 22 mg Fatty acids mono-diglycerides 20 mg Soy lecithin 10 mg Titanio Dioxide 0.686 mg Spermidine trihydrochloride 0.25 mg

Esempio 7

Compressa

Composizione per singola compressa

Componente

Microcrystalline cellulose 168.97 mg Lactose 150 mg Methylcellulose 45 mg Mono- and diglycerides of fatty acids 9 mg Colloidal Silicon dioxide 8 mg Magnesium stearate 2 mg Spermidine trihydrochloride 1.0 mg Esempio 8

Compressa rivestita a rilascio ritardato

Composizione per singola compressa

Componente

Microcrystalline cellulose 105 mg Calcium Phosphate bibasic dihydrate 85 mg Hydroxypropylmethylcellulose K100 45 mg Sepifilm TM LP 770 white 15 mg Magnesium stearate 8 mg Hydroxypropylmethylcellulose 6 mg Colloidal Silicon dioxide 3.5 mg Spermidine trihydrochloride 0.55 mg

Esempio 9

Granulato effervescente in bustina per la preparazione di un soluzione estemporanea

Composizione per singola bustina

Componente

Mannitolo 960 mg Acido Tartarico 530 mg Sodio bicarbonato anidro 280 mg Aroma 130 mg Polivinilpirrolidone 45 mg Trometamolo 32 mg Aspartame 20 mg Spermidina tricloridrato 1.25 mg Silice Colloidale Anidra 2 mg Si riporta nel seguito la descrizione di uno studio sperimentale relativo all’attività nell’uso della spermidina secondo la presente invenzione.

STUDIO DI ATTIVITÀ’

Campioni di tessuto

La pelle del cuoio capelluto umano normale à ̈ stata prelevata da una donna sottoposta ad intervento chirurgico di lifting facciale di routine dopo aver ottenuto consenso informato. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità ai principi di Helsinki, con approvazione del comitato etico.

Coltura d'organo della pelle a spessore completo

I tessuti biopsiati con bisturi cilindrico da 3-4 mm sono stati coltivati a 37°C per 6 giorni in terreno Williams E (Biochrom, Cambridge, U.K.), integrato con 100 IU mi<"1>di penicillina, 10 pg mi<"1>di streptomicina (Gibco, Karlsruhe, Germania), 10 pg mi<'1>di insulina (Sigma, Taukfirchen, Germania), 10 ng mi<"1>idrocortisone (Sigma) e 2mmol L<"1>(L-glutammina (Invitrogen, Paisley, U.K.).

Sono stati quindi somministrati spermidina tricloridrato alla concentrazione 0,1 pM, oppure il veicolo quale sostanza di riferimento, una volta ad ogni cambio di terreno (ossia ogni 48 ore).

Microdissezione dei follicoli piliferi e coltura d'organo

I follicoli piliferi (HF) in fase anagen VI con pigmentazione normale (dallo studio si sono esclusi i follicoli piliferi grigi/bianchi) sono stati micro dissezionati dalla pelle del cuoio capelluto umano normale e sottoposti a coltura d'organo in base al modello di Philpott. La spermidina oppure il veicolo sono stati somministrati una volta ad ogni cambio di terreno (ossia ogni 48 ore).

Misura della LDH

L'attività della LDH nel surnatante serviva come indicatore di citotossicità ed à ̈ stata misurata ogni giorno seguendo le istruzioni del produttore (Cytotoxicity Detection Kit; Roche, Mannheim, Germania). L'assorbanza dei campioni à ̈ stata misurata a 490 nm usando un lettore per piastre ELISA.

Allungamento del fusto pilifero

Le misure della lunghezza del fusto pilifero dei follicoli piliferi sono state eseguite ogni secondo giorno sui singoli follicoli piliferi usando un microscopio binoculare invertito Zeiss con un reticolo di misura oculare.

Determinazione dello stadio dei cicli dei follicoli piliferi

La determinazione dello stadio dei cicli dei follicoli piliferi à ̈ stata eseguita in base ai criteri morfologici definiti in precedenza, ed à ̈ stata determinata la percentuale di follicoli piliferi in fase anagen e in fase catagen precoce, intermedia o tardiva.

Pigmentazione dei capelli

Per la visualizzazione istochimica della melanina su sezioni congelate si à ̈ eseguita la colorazione di Masson-Fontana. La melanina à ̈ stata colorata sotto forma di granuli marroni ed à ̈ stato valutato il grado di pigmentazione attraverso la tecnica di Masson-Fontana quantitativa (Ito N., Ito T., Kromminga A., Bettermann A., Takigawa M., Kees F., Straub R. H., and Paus R. (2005): Human hair follicles display a functional equivalent of thà ̈ hypothalamic-pituitary-adrenal axis and synthesize cortisol. FASEB J 19, 1332-4).

Questo metodo à ̈ un indicatore particolarmente sensibile ed affidabile delle variazioni di sintesi della melanina, così come dimostrato da saggi di attività enzimatica e espressione della tirosinasi standard (Kauser S., Slominski A., Wei E. T., and Tobin D. J. (2006): Modulation of thà ̈ human hair follicle pigmentary unit by corticotropin-releasing hormone and urocortin peptides. FASEB J 20, 882-95). L'intensità della colorazione à ̈ stata analizzata in una regione di riferimento definita dell'unità di pigmentazione dei follicoli piliferi usando il software ImageJ (National Institute of Health).

Misure della proliferazione e deU'apoptosi

Per valutare le cellule apoptotiche in co-localizzazione con un marker di proliferazione Ki-67, si à ̈ usato il metodo di doppia colorazione TUNEL (terminal dUTP nick-end labeling) con Ki-67. Le sezioni per criostato sono state fissate in paraformaldeide ed etanolo-acido acetico (2:1) e marcate con un digoxigeninadeossi-UTP (kit di identificazione deU'apoptosi in situ con fluoresceina ApopTag; Intergen, Purchase, NY) in presenza di deossinucleotidil transferasi terminale, a cui à ̈ seguita l'incubazione con un antisiero anti-Ki-67 murino (1:20 in PBS per una notte a 4°C; Dako, Glostrup, Danimarca). Le cellule TUNEL-positive sono state visualizzate mediante un anticorpo antidigoxigenina fluoresceina isotiocianato coniugato (kit ApopTag), mentre Ki-67 à ̈ stato rilevato mediante un anticorpo antitopo di capra marcato con rodammina (Jackson ImmunoResearch, West Grave, PA). I controlli negativi sono stati eseguiti omettendo la deossinucleotidil transferasi terminale e l'anticorpo Ki-67. La controcolorazione à ̈ stata eseguita con 4\6-diamidino-2-feniIindolo (DAPI) (Roche Molecular Biochemicals GmbH, Mannheim, Germania). Si à ̈ eseguita l'immunoistomorfometria quantitativa; le cellule Ki-67, TUNEL o DAPI-positive sono state contate in una regione di riferimento definita precedentemente della matrice dei follicoli piliferi e deN'epidermide, ed à ̈ stata determinata la percentuale di cellule Ki-67/TUNEL positive.

Immunoistochimica quantitativa di K15

Per esaminare l'espressione della cheratina K15 si à ̈ usato il metodo di amplificazione del segnale con tirammide descritto precedentemente (Kloepper et al., 2008). In breve, le criosezioni fissate con acetone sono state lavate tre volte per 5 minuti usando il tampone TNT (tris-HCL NaCI Tween) (0,1 mol/l di Tris-HCI, pH 7,5; contenente 0,15 mol/l di NaCI e 0,05% di Tween 20). Quindi la perossidasi di rafano à ̈ stata bloccata attraverso il lavaggio con il 3% di H2O2 in un tampone fosfato isotonico (PBS) per 15 minuti. La preincubazione à ̈ stata eseguita con l'incubazione di avidina e biotina per 15 minuti e con il 5% di siero normale di capra in TNT per 30 minuti con delle fasi di lavaggio intermedie. Le K15 antiumane murine (clone LHK15, Chemicon, Billerica, USA) sono state diluite in TNT e incubate per una notte a 4°C, seguite da un anticorpo secondario biotinilato antitopo di capra (1:200 in TNT) per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi, à ̈ stata somministrata streptavidina-perossidasi di rafano (kit TSA; Perkin-Elmer, Boston, MA, USA) (1:100 in TNT) per 30 minuti a temperatura ambiente. La reazione à ̈ stata amplificata con un reagente di amplificazione FITC-tirammide a temperatura ambiente per 5 minuti (1:50 in un diluente di amplificazione fornito con il kit). L'intensità di questa immunocolorazione à ̈ stata quantificata con il software ImageJ (National Institutes of Healt). L'intensità della colorazione delle regioni di riferimento definite nei follicoli piliferi à ̈ stata misurata e confrontata tra i gruppi di controllo trattati con solo veicolo e i gruppi trattati con spermidina.

Analisi statistica

L'analisi statistica à ̈ stata eseguita usando un t-test di Student bilaterale per campioni non appaiati.

Risultati

Le figure dei disegni allegati mostrano i risultati dello studio sperimentale descritto. La fig. 1 mostra un grafico relativo all’intensità di pigmentazione nei follicoli piliferi misurata e confrontata tra il gruppo di controllo trattato con solo veicolo e il gruppo trattato con spermidina 3HCI in concentrazione 0,1 Î1⁄4Îœ.

La fig. 2 mostra le corrispondenti immagini tratte dalla visualizzazione istochimica della melanina attraverso colorazione di Masson-Fontana.

Da entrambe le figure risulta evidente l’aumento di melanina nel caso di trattamento con spermidina, dunque una spiccata attività di melanogenesi verso i capelli trattati con tale composto rispetto al veicolo di riferimento.

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di spermidina, come tale o sotto forma di derivato farmaceuticamente accettabile, quale principio attivo in una composizione farmaceutica o cosmetica o dietetica atta a promuovere la pigmentazione dei capelli, in particolare la pigmentazione del fusto.
2. 2. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 1 atta a svolgere tale effetto di pigmentazione e contenente quale principio attivo spermidina, come tale o sottoforma di derivato farmaceuticamente accettabile quale un sale.
3. 3. Composizione secondo la rivendicazione 2 in cui la spermidina à ̈ sottoforma di spermidina tricloridrato, ossia N-(3-aminopropil)butano-1,4-diammina<â– >3HCI.
4. 4. Composizione secondo la rivendicazione 2 comprendente detto principio attivo formulato con ogni adatto eccipiente per somministrazione topica sul cuoio capelluto.
5. 5. Composizione secondo la rivendicazione 4 sottoforma di lozione oppure balsamo oppure shampoo oppure maschera.
6. 6. Composizione secondo la rivendicazione 2 comprendente detto principio attivo formulato con ogni adatto eccipiente per somministrazione orale.
7. 7. Composizione secondo la rivendicazione 6 sottoforma di una compressa, rivestita o non, oppure di una capsula dura o molle o di granulato.
8. 8. Composizione secondo la rivendicazione 2, 3 e 4 comprendente spermidina in quantità compresa nell'intervallo da 0.004 fino a 4-10<4>Î1⁄4Îœ, corrispondente a spermidina tricloridrato da 10<"7>a 1 g/100ml.
9. 9. Composizione secondo la rivendicazione 8 comprendente spermidina in quantità compresa nell’intervallo da 0.4 a 4·10<4>Î1⁄4Îœ, corrispondente a spermidina tricloridrato da 10<'5>a 1 g/100 mi.
10. 10. Composizione secondo la rivendicazione 9 comprendente spermidina in quantità compresa nell’intervallo da 3.9 a 9.4-10<2>Î1⁄4Îœ, corrispondente a spermidina tricloridrato da 10<'4>a 2.4-10<'2>g/100 mi.
11. 11. Composizione secondo la rivendicazione 6 comprendente spermidina in quantità compresa nell’intervallo da 0.14 a 0.71 mg per unità di somministrazione di una composizione formulata per uso orale.
12. 12. Composizione secondo la rivendicazione 3 e 6 comprendente spermidina tricloridrato in quantità compresa nell’intervallo da 0,25 a 1.25 mg per unità di somministrazione di una composizione formulata per uso orale.