ITMI20081830A1 - Composizione sinergica per il recupero e la riduzione del danno ischemico lieve - Google Patents

Description

TITOLO: Composizione sinergica per il recupero e la riduzione del danno ischemico lieve.

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda l'apporto sinergico di due sostanze per superare condizioni che determinano ipossia lieve al muscolo cardiaco, ad esempio cuore post-infartuato, disfunzione coronarica, patologia polmonare cronica da ostruzione, ischemia miocardica lieve.

TECNICA ANTERIORE

L'aumento considerevole di malattie cardiovascolari, che sono spesso associate ad ischemia miocardica o ad insufficiente apporto di sangue al muscolo cardiaco, provoca una mortalità superiore a quella del cancro.

Nel 2005 la World Health Organization ha dichiarato che le patologie cardiovascolari e cerebrali sono la causa di 17.5 milioni di morti, rappresentando circa il 30% di tutti i decessi. Di questi, 7.6 milioni sono imputabili ad attacchi di cuore, 5.7 milioni ad infarto, con un’incidenza pari all’80% nei Paesi poveri. Si stima che nel 2015 si arriverà a 20 milioni di morti. Nel 2008, l’American Health Association e il National Heart Lung Blood Institute hanno stimato un investimento pari a 448.5 bilioni di dollari per i costi diretti ed indiretti, senza considerare gli incalcolabili costi sociali ed umani.

Anche il recupero di pazienti post-infartuati à ̈ spesso lungo .... e non sempre il recupero à ̈ completo. Pertanto, la presente invenzione relativa alla somministrazione combinata di creatina e ribosio potrebbe rappresentare un supporto per i trattamenti farmacologici veri e propri rivolto al recupero funzionale dopo eventi di ischemia ed ipossia quali infarto, angina pectoris, disfunzione coronarica nonché alle complicanze associate quali anemia e patologia polmonare cronica da ostruzione, utili per la riabilitazione dei paziente postinfartuato.

Infatti anche se in letteratura sono noti gli usi di queste sostanze per le patologie cardiovascolari ed in particolare à ̈ noto che il D-ribosio, che costituisce la porzione saccaridica dell’ATP, aumenta la tolleranza all’ischemia ed allevia i sintomi di molte patologie cardiache e muscolari pur senza avere effetti specifici sulla forza e sul rendimento muscolare in condizioni fisiologiche così come à ̈ altrettanto noto l’effetto della somministrazione di creatina (Cr) nell'alleviare i sintomi di molte patologie cardiache e muscolari, aumentando la dimensione ed il rendimento delle fibre muscolari (1) e dove questa attività à ̈ almeno in parte legata al fatto che la creatina à ̈ un amminoacido che riveste un ruolo essenziale nella regolazione del metabolismo energetico muscolare in quanto, in presenza di ATP, si converte in fosfocreatina, e costituisce un deposito cellulare di energia.

Pertanto finora, l’assunzione dei due composti in combinazione tra di loro e in associazione con altre molecole, non à ̈ mai stata considerata particolarmente vantaggiosa e comunque solo in situazioni di riduzione dell’apporto energetico, in particolare durante fasi di intensa attività fisica. Ad esempio, in WO 02/09727 à ̈ descritta una composizione che comprende ribosio ed altri supplementi dietetici, quali ad esempio vitamine, acido folico etc., che può anche comprendere creatina, così come piruvato, taurina o glutamina. Tali composizioni hanno un generico effetto migliorativo su diverse vie metaboliche, grazie ad un aumentato apporto energetico.

Anche in US 6,172,114 à ̈ descritto un supplemento nutrizionale comprendente creatina e ribosio, dove però la creatina à ̈ fornita per aumentare la massa corporea ed il ribosio per contrastare i suoi principali effetti collaterali, quali nausea e diarrea.

L’effetto sinergico indispensabile per la ripresa del ciclo cellulare di cellule miocardiche sottoposte a lieve ischemia, descritta nella presente domanda di brevetto, non à ̈ mai stato riscontrato. Infatti, come sopra ricordato, il contributo di queste sostanze à ̈ stato finora dimostrato solo a livello della bioenergetica cellulare.

SOMMARIO

La presente invenzione riguarda una composizione consistente nella combinazione sinergica di creatina o i suoi derivati e ribosio o i suoi derivati, quali principi attivi, per la riduzione ed il recupero del danno ischemico al miocardio di lieve entità, dove tale danno à ̈ preferibilmente selezionato nel gruppo consistente di: situazione cardiaca post-infarto, disfunzione coronarica, patologia polmonare cronica da ostruzione, ischemia miocardica lieve.

Secondo una realizzazione preferita D-ribosio e creatina sono in rapporto in peso comprese tra 10:1 e 1:1.

Rappresenta ulteriore realizzazione dell’invenzione un kit per la preparazione di una miscela comprendente creatina e ribosio per la riduzione del danno ischemico di lieve entità, comprendente un contenitore con D-ribosio o i suoi derivati ed un contenitore comprendente creatina o i suoi derivati con opportune istruzioni per la miscelazione, da effettuarsi poco prima della somministrazione, e per il corretto rapporto in peso tra le due sostanze compreso tra 10 : 1 e 1:1 (D-ribosio: creatina).

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1. Effetto deH’aumento di concentrazione di Cr, Rib e della loro combinazione, sulla vitalità delle cellule H9c2 trattate con doxorubicina. La vitalità cellulare à ̈ determinata mediante saggio MTT ed à ̈ espressa (media±SEM, n=6) rispetto a quella misurata nelle cellule al tempo zero. ANOVA P<0.0001. *, P<0.01 vs cellule trattate con doxorubicina; #, P<0.001 vs cellule trattate con doxorubicina e con Cr 2.5 mM o Rib 5mM (post test di Bonferroni).

Figura 2. Effetto della somministrazione di Cr, Rib e della loro combinazione sulla vitalità delle cellule H9c2 sottoposte ad ischemia lieve. La vitalità cellulare à ̈ determinata mediante saggio del Trypan blu ed à ̈ espressa (media+SEM, n=6) rispetto a quella misurata nelle cellule non ischemiche non trattate. ANOVA P<0.0001.<*>, P<0.001 vs cellule ischemiche non trattate; #, P<0.05 vs cellule ischemiche trattate sia con Creatina 2.5 mM sia con Ribosio 5 mM (post test di Bonferroni).

Figura 3. Effetto della somministrazione di Cr, Rib e della loro combinazione sulla progressione del ciclo cellulare in cellule H9c2 sottoposte ad ischemia. Il pannello superiore riporta un tipico diagramma rappresentativo del ciclo cellulare, con A-F indicativi dei diversi trattamenti, come dettagliato in tabella. Il pannello inferiore mostra, per ciascun trattamento, la percentuale di cellule in fase S (media±SEM, n=4) rispetto alle cellule non ischemiche non trattate. ANOVA P<0.0001. *, P<0.01 vs cellule ischemiche non trattate; #, P<0.05 vs cellule ischemiche trattate sia con Cr 2.5 mM sia con Rib 5 mM (post test di Bonferroni).

Figura 4. Effetto della somministrazione combinata di creatina e ribosio sull’espressione proteica di Akt fosforilata (p-) e totale (t-), in cellule H9c2 sottoposte ad ischemia. Le immagini di Western blot sono rappresentative del contenuto proteico di Akt fosforilata e totale. Il rapporto p-Akt/t-Akt (media±SEM, n=4) à ̈ stato determinato mediante analisi densitometrica delle bande proteiche, come mostrato nel grafico sottostante. ANOVA P<0.002. *, P<0.05 vs cellule ischemiche non trattate (post test di Bonferroni).

Figura 5. Effetto della somministrazione combinata di creatina e ribosio sull’espressione proteica delle cicline D ed E, in cellule H9c2 sottoposte ad ischemia.

Le immagini di Western-blot sono rappresentative del contenuto proteico di ciclina D ed E, con l’actina come controllo del carico. Il grafico sottostante riporta la corrispondente analisi densitometrica delle bande proteiche (media±SEM, n=4). I dati sono espressi come variazione rispetto al valore nelle cellule non ischemiche non trattate. ANOVA P<0.001;<*>, P<0.05 vs cellule ischemiche non trattate; #, P<0.01 vs cellule non ischemiche non trattate (post test di Bonferroni) per la ciclina D. ANOVA P<0.0001; #, P<0.001 vs cellule non ischemiche non trattate (post test di Bonferroni) per la ciclina E.

Figura 6. Effetto della somministrazione combinata di creatina e ribosio sull’espressione proteica degli inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti, p21 e p27, in cellule H9c2 sottoposte ad ischemia. Pannello A: Western blots rappresentativi del contenuto proteico di p21 e p27 totali, con l’actina come controllo del carico. Il grafico sottostante riporta la corrispondente analisi densitometrica delle bande proteiche (media+SEM, n=4). I dati sono espressi come variazione rispetto al valore nelle cellule non ischemiche non trattate. ANOVA P=0.02; *, P<0.05 vs cellule ischemiche non trattate (post test di Bonferroni) per p21. ANOVA P=0.002; #, P<0.01 vs cellule non ischemiche non trattate (post test di Bonferroni) per p27. Pannello B: immagini immunofluorescenti rappresentative della forma fosforilata di p21 e p27 in cellule H9c2 sottoposte ad ischemia, in presenza o assenza di Cr e Rib. Ingrandimento 40x, la barra corrisponde a 20 Î1⁄4m .

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda la preparazione di composizioni comprendenti creatina e ribosio per la somministrazione combinata di queste due sostanze, al fine del ripristino delle condizioni di vitalità e di ri-attivazione del ciclo cellulare, dopo un danno cellulare dovuto ad un lieve evento ischemico.

Infatti à ̈ stato riscontrato, ed à ̈ alla base della presente domanda di brevetto, che queste due sostanze ed i loro derivati, hanno un effetto sinergico che permette il rientro nel ciclo cellulare delle cellule che hanno subito un danno ischemico lieve, diminuendo la necrosi del tessuto cardiaco e l’entità del danno permanente che ne consegue.

Tuttavia, poiché ia conservazione combinata delie due sostanze pone problemi di stabilità, dovuti al fatto che in particolari condizioni di umidità, pH e temperatura, il D-ribosio reagisce con la creatina dando luogo a fenomeni di imbrunimento del prodotto che sono indice di scadimento qualitativo, la presente invenzione risolve il problema tecnico legato alla conservazione in forma combinata o di dosi per l'assunzione combinata delle due sostanze.

Tali reazioni sono causate dalla reazione di "Maillard†del D-ribosio, zucchero riducente, che reagisce con i gruppi amminici della creatina dando luogo a fenomeni di imbrunimento accompagnati da note aromatiche che richiamano il caramello.

Pertanto secondo un primo aspetto l’invenzione riguarda una composizione comprendente creatina o i suoi derivati e ribosio o i suoi derivati per la riduzione ed il recupero del danno ischemico ai miocardio, di lieve entità. Tali condizioni sono quelle simulate in vitro da condizioni di ipossia cardiaca lieve (assimilabile ad una pressione parziale di 1%02in carenza di glucosio).

A livello cellulare, grazie al modello utilizzato, à ̈ stato osservato che la presenza sia di creatina che di ribosio sono necessarie per ripristinare la funzionalità dei cardiomiociti dopo un evento ischemico, provocato da una ipossia non grave. In particolare, nel modello di cardiomiociti H9c2, dopo ischemia indotta da condizioni di ipossia pari all'1% 02, e combinate alla deprivazione di glucosio, sono state analizzate la vitalità e proliferazione cellulari dopo l’induzione di tale evento, che contrariamente a condizioni di ipossia più gravi, non provocano una estesa necrosi del tessuto ma un danno, quello di ipossia lieve che adeguatamente trattato à ̈ potenzialmente reversibile ed à ̈ assimilabile a quello frequentemente riscontrato nel cuore post-infartuato, nella disfunzione coronarica, nella patologia polmonare cronica da ostruzione e nel recupero da ischemia miocardica e dove la riduzione del danno ischemico à ̈ associata positivamente ad una aumentata progressione del ciclo cellulare nei cardiomiociti.

Le composizione secondo l’invenzione hanno preferibilmente un rapporto ottimale in peso tra D-ribosio e creatina compreso tra 10 : 1 e 1 : 1.

A livello cellulare à ̈ stato osservato che la diminuzione del livello di espressione o di attivazione di alcune proteine che regolano il ciclo cellulare osservato in condizioni lievi di ipossia (11, 13) à ̈ meno drastica se sono presenti nel terreno di coltura sia creatina che D-ribosio. L’effetto delle due sostanze sul ciclo cellulare à ̈ maggiore della somma dei due effetti misurati singolarmente ed ha quindi le caratteristiche di una interazione sinergica.

In particolare, nel modello cellulare sono stati misurati i seguenti parametri: livello di fosforilazione di serina-treonina chinasi Akt (protein chinasi B), nota indurre progressione del ciclo cellulare (12) attraverso stimolazione delle cicline ed inibizione degli inibitori delle cicline ed il livello di espressione di proteine che regolano il ciclo cellulare (ciclina D e p21) quali indicatori della vitalità, della proliferazione e della rigenerazione cellulare.

L’effetto del trattamento combinato, osservato e descritto in dettaglio nella parte sperimentale, a livello molecolare à ̈ riscontrato come un aumento della fosforilazione di Akt, particolarmente evidente nelle cellule sottoposte ad ischemia (figura 4) e anche, lievemente, in cellule normali.

L’attivazione di alcuni trasduttori della fosforilazione di Akt à ̈ stata misurata, come meglio descritto nella parte sperimentale, osservando che, rispetto ad un controllo, sottoposto ad ischemia lieve, il livello di cicline (in particolare di ciclina D) aumenta ed il livello di inibitori delle cicline (in particolare di t-p21) diminuisce. In sostanza, l'effetto del trattamento combinato con creatina e ribosio sui cardiomiociti ischemici, interferisce positivamente con le vie di segnalazione cellulare per la progressione del ciclo cellulare e risulta più efficace rispetto ai trattamento con le singole sostanze.

L’effetto combinato delle due sostanze à ̈ rilevabile anche sulla vitalità cellulare. Infatti dopo stimolo ischemico, che diminuisce la vitalità cellulare del 50±4%, la presenza di entrambe le sostanze, ma non di ciascuna singolarmente, aumenta tale parametro di circa il 30+3%.

Quindi, la contemporanea somministrazione di creatina e ribosio, incrementa la vitalità delle H9c2 sottoposte ad ischemia, rendendola addirittura simile a quella di cellule non sottoposte allo stimolo ischemico. Lo stesso trattamento à ̈ invece inefficace sulle cellule non-ischemiche.

L’effetto relativo alla vitalità, come verificato nei cardiomiociti, à ̈ un effetto di regolazione sul ciclo cellulare: in presenza sia di creatina che di D-Ribosio diminuisce infatti l'arresto (provocato da ischemia) del ciclo cellulare e questo avviene attraverso l’attivazione di Akt e dei suoi mediatori, in particolare un inibitore delle cicline noto come t- p21 (9) e la ciclina D (12).

Infatti mentre à ̈ noto che l’ipossia induce arresto del ciclo cellulare a livello della transizione G1/S in molteplici linee cellulari (5) e che la protein-chinasi Akt (PI3K-Akt, 8) svolge un ruolo essenziale nella modulazione del ciclo cellulare attraverso la via di segnalazione, protettiva, il presente studio ha dimostrato che solo la contemporanea presenza di Creatina e di Ribosio, sinergicamente, revertono l’effetto di inibizione delle cicline indotto da ischemia, attraverso PI3K-Akt e che tale effetto à ̈ particolarmente pronunciato sulla ciclina D.

Pur non essendo legati ad alcuna specifica spiegazione tecnica, la complementarietà dell’effetto di creatina e ribosio potrebbe rendere ragione dell’effetto particolarmente vantaggioso della somministrazione combinata delle due sostanze, alla base della presente invenzione: infatti l’accumulo di creatina nel muscolo scheletrico e nei cardiomiociti già osservato uomo dopo assunzione per via orale di creatina, necessita di un co-trasportatore Na-Cr (sodio-creatina). Poiché l’attività di tale cotrasportatore à ̈ insulino-dipendente, potrebbe essere aumentata dall’associazione con la somministrazione combinata di zuccheri, quali il ribosio.

Tuttavia, la preparazione di dosi pronte per l’assunzione, della miscela della due sostanze, pone problemi di conservazione della creatina, che tende a decomporsi in presenza di un agente debolmente riducente come il D-ribosio.

Il proponente ha individuato, per risolvere questo problema tecnico, alcuni aspetto realizzativi preferiti, in varie forme di kit, dove le due sostanze sono combinate, preferibilmente, solo al momento dell’uso ed in rapporti finali D-ribosio e creatina, compresi tra 10:1 e 1 :1 e più preferibilmente compresi tra 8:1 e 2:1 , ancor più preferibilmente aH’incirca di 5:1 .

In particolare, secondo un aspetto realizzativo, la creatina viene preparata in forma di polvere o di granulato, preferibilmente in presenza di un agente lubrificante atto a facilitare lo scorrimento ed il suo dosaggio preconfezionamento, nonché ancor più preferibilmente di un agente antiagglomerante quale il biossido di silicio mentre il D-ribosio può essere preparato in forma predosata, sia in polvere che sciolto in soluzione acquosa in presenza di agenti conservanti, quali, ad esempio i derivati dell’acido benzoico e/o il potassio sorbato in quantità massima dello 0.2%. La polvere viene miscelata alla soluzione al momento dell’assunzione.

Nella forma realizzativa in cui sia la creatina ed il D-ribosio sono in polvere, essi possono essere conservati già miscelati in polvere o in granulato, e la miscela può essere in bustina predosata contenente entrambe le molecole in un rapporto di peso compreso tra 10:1 e 1 :1 , più preferibilmente compresi tra 8:1 e 2:1 , ancor più preferibilmente in un rapporto aH’incirca di 5:1. Tale preparazione à ̈ preferibilmente attuata mediante pre-miscelazione della creatina con un agente lubrificante, quale il magnesio stearato, in rapporto in peso di circa 1 :100, o in rapporto noto al tecnico del ramo e il D-ribosio pre-miscelato con un agente anti-aggregante, quale ad esempio il biossido di silicio o altri antiagglomeranti con priorità analoghe come ad esempio il calcio fosfato o la silice colloidale, in rapporto di circa 1 :200 e comunque non superiore al 5%, o preferibilmente al 1%.

In tali condizioni la miscela finale, nei rapporti sopra menzionati, à ̈ stabile per almeno 24 mesi a temperatura non superiore a 25°C. Secondo questa forma realizzativa la bustina monodose contiene preferibilmente circa 6.05 g di miscela, corrispondente a 5 g di ribosio e 1 g di creatina. Dosaggi multipli o frazioni di questo rapporto ottimale sono realizzabili, anche se dipendenti dalla minima quantità di polvere dosabile meccanicamente.

Tali rapporti preferiti e la dose ottimale tengono conto della solubilità di ciascuna delle due molecole, in un volume preferibilmente di circa 100 mi.

Secondo un’altra forma realizzativa le due polveri possono essere predosate secondo i rapporti in peso sopra definiti e mantenute in bustine separate ma gemellate, da miscelare e sciogliere in acqua o in soluzione acquosa al momento del utilizzo.

Ancora un altro aspetto realizzativo à ̈ rappresentato da preparazione in forma liquida in cui il D-ribosio à ̈ sciolto in concentrazioni variabili tra 10 e 80% (peso/peso), in presenza di agenti conservanti, quali derivati dell’acido benzoico e/o il potassio sorbato e la creatina à ̈ invece dosata, quale polvere, in un tapposerbatoio secondo gli stessi rapporti in peso rispetto alla creatina, sopra ricordati.

Da quanto sopra detto, risultano pertanto compresi nell’invenzione kit per la preparazione di una miscela comprendente creatina e ribosio per la riduzione del danno ischemico di lieve entità, comprendente un contenitore con D-ribosio o i suoi derivati ed un contenitore comprendente creatina o i suoi derivati con opportune istruzioni per la miscelazione, da effettuarsi poco prima della somministrazione, e per il corretto rapporto in peso tra le due sostanze compreso tra 10 :1 e 1 : 1 (D-ribosio : creatina).

Secondo una realizzazione dell'invenzione il kit comprende il D-ribosio o i suoi derivati in forma di polvere, e secondo questa realizzazione, il D-ribosio in polvere à ̈ preferibilmente miscelato con un agente anti-agglomerante, quale il biossido di silicio o suoi analoghi in quantità non superiore al 5%, preferibilmente al 1%.

Secondo una realizzazione diversa, il kit contiene creatina o i suoi derivati in forma di polvere e il D-ribosio à ̈ in soluzione, preferibilmente in presenza di conservanti (ad es. derivato acido benzoico e potassio sorbato).

Il kit può essere anche opportunamente realizzato come una miscela in polvere di D-ribosio o i suoi derivati e creatina o i suoi derivati, ed in cui il rapporto in peso tra le due sostanze à ̈ compreso tra 10 : 1 e 1 : 1 , tale miscela contenuta in un opportuno contenitore, scatola o busta, per la riduzione del danno ischemico di lieve entità, in cui sono comprese opportune istruzioni per la solubilizzazione della miscela, da effetuarsi poco prima della somministrazione. Preferibilmente tale miscela comprende anche un agente lubrificante ed un agente antiagglomerante, come sopra identificati dove l’agente lubrificante à ̈ preferibilmente magnesio stearato e l’agente anti-agglomerante à ̈ preferibilmente biossido di silicio.

Secondo sue ulteriori realizzazioni l’invenzione comprende: un procedimento per la preparazione di una miscela di D-ribosio e creatina in forma stabile che comprende la miscelazione di creatina o i suoi derivati con un agente lubrificante e di D-ribosio o i suoi derivati, con un agente anti-agglomerante.

Inoltre, l’invenzione à ̈ relativa all’uso combinato in una composizione di D-ribosio e creatina, presenti in un rapporto in peso compreso tra 10:1 e 1 :1 (peso/peso), per prevenire o ridurre il danno ischemico a livello miocardico causato da una condizione di ipossia lieve, dove la riduzione del danno ischemico à ̈ associata ad una aumentata progressione del ciclo cellulare nei cardiomiociti, indotta dal trattamento sinergico con le composizioni secondo l’invenzione.

PARTE SPERIMENTALE

Materiali e metodi. Materiali.

La creatina monoidrato ed il D-ribosio (Giellepi Chemicals, Milano, Italy) furono sciolti in terreno di coltura, filtrati con filtro 0.22 Î1⁄4m (Nalgene) e conservati a 4°C. I cardiomiociti della linea H9c2 furono ordinati alla American Type Culture Collection (Rockville, MD). Le cellule furono mantenute a 37°C in un incubatore al 5% C02in Dulbecco’s modified Eagle's medium supplementato con 10% di siero fetale bovino inattivato, 100 unità/ml di penicillina e 100 Î1⁄4g/ml di streptomicina. Le cellule vengono sub-coltivate 1 :3 ogni tre giorni in fiasche da 25 cm<2>.

Dopo aver raggiunto l’80% di confluenza, le cellule furono tratate con i diversi trattamenti, per ciascuno dei quali si utilizzarono n = 4-6 poois cellulari.

Saggio di vitalità cellulare: MTT.

Le cellule furono seminate alla concentrazione di 1.8x1 0<3>/pozzetto in piastre da 96 pozzeti ed incubate a 37°C per 24 ore. Quindi, incubate per ulteriori 24 ore con acqua o doxorubicina (concentrazione finale di 0.5 Î1⁄4Îœ) in presenza di diverse concentrazioni di Cr e/o Rib, come indicato nelle figure. La vitalità cellulare fu determinata mediante il saggio del 2-(4,5-dimethyltriazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromuro (MTT, Sigma, St Louis, Mo). In breve, dopo aver aggiunto 20 Î1⁄4Ι di una soluzione 5 mg/ml in PBS di MTT ad ogni pozzetto, le cellule furono incubate a 37°C per 4 h. Dopo eliminazione del surnatante, furono aggiunti 100 Î1⁄4Ι di DMSO per sciogliere i sali di formazano prodotti e leggere la densità ottica (OD) a λ=540 nm. Ogni trattamento fu eseguito in cinque replicati. Per ogni trattamento, l’indice di vitalità à ̈ calcolato come ODX/OD0, con ODxe OD0le OD medie al tempo x ed al tempo zero.

Test di esclusione del Trypan blu.

Le cellule vitali furono contate mediante il test di esclusione del Trypan blu. Un'aliquota di cellule tripsinizzate fu miscelata con il colorante ed osservata al microscopio per la conta delle cellule vitali. I dati furono espressi come percentuale di cellule vitali nei diversi trattamenti rispetto alle cellule controllo (poste uguali a 100), mantenute per lo stesso periodo di tempo in condizioni standard.

Modello di ischemia simulata.

Le cellule furono seminate in fiasche da 25 cm<2>alla concentrazione di 3.5x1 0<5>cellule/fiasca. Il modello di ischemia simulata (11 , 13) prevedeva quindi poi di saturare per 30’ con un' atmosfera all’ 1% 02(condizioni di ipossia lieve) le fiasche contenenti le cellule, in terreno privo di glucosio (Gibco, Invitrogen, #11966), in presenza di Creatina e/o di D-ribosio o della combinazione delle due sostanze, come specificato in ciascuna figura, mantenendo poi le fiasche sigillate (cellule in ischemia) per le successive 24 ore.

Citofluorimetria.

Il profilo del ciclo cellulare fu analizzato per citofluorimetria, dopo colorazione del DNA con propidio ioduro (PI, Sigma, St. Louis, Mo). Le cellule, lavate con PBS, furono fissate con etanolo al 70% a -20°C, centrifugate (15 min a 1800 rpm) e risospese in 1 mi PBS contenente 50 pg/ml di PI per 1 ha temperatura ambiente. Le cellule furono quindi analizzate in citofluorimetria mediante il FACSorter (Becton Dickinson). La percentuale di cellule nelle varie fasi del ciclo à ̈ calcolata utilizzando il programma CelIQuest (Becton Dickinson).

Immunoblotting.

Le cellule furono lavate due volte con PBS freddo ed incubate per 30 minuti in tampone di lisi (50 mM TRIS-HCI pH 7.4, 250 mM NaCI, 1% Triton X-100, 50 mM β glycerol-fosfato, 1 mM Na3V04l1 mM NaF, 1 mM fenii metil sulfnil fluoruro, Sigma, St. Louis, Mo) contenente il 2% di Protease inhibitor cocktail (Complete, EDTA-free, Roche Diagnostics, Germany). Le cellule sottoposte ad ischemia simulata, furono mantenute in un’apposita camera di compensazione che garantisce una bassa tensione di 02durante la procedura di estrazione (2).

I lisati cellulari ottenuti furono congelati a -20°C per 20 minuti, scongelati a temperatura ambiente e centrifugati a 14000 rpm per 15 min a 4°C. La concentrazione proteica fu determinata mediante Coomassie Plus Protein Assay reagent Kit (Pierce). Quaranta Î1⁄4g di proteine totali furono caricati in ogni pozzetto. Dopo la separazione eiettroforetica, le proteine furono trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK), trattata poi per 1 ora con 5% di latte per bloccare i siti di legame aspecifici, incubata tutta la notte a 4°C con l’anticorpo primario ed infine per 1 ora a temperatura ambiente con I'anticorpo secondario. Furono utilizzati i seguenti anticorpi: anti-fosfo-Akt policlonale (Ser473, Celi Signaling, 1 :1000), anti-Akt policlonale (Celi Signaling, 1 :1000), anti-ciclina D1 policlonale (Santa Cruz, 1 :750), anti-ciclina E monoclonale (Santa Cruz, 1 :750), anti-actina policlonale (Celi Signaling, 1 :1000), anti-fosfo-p21 policlonale (Thr145, Santa Cruz, 1 :500), antip21 policlonale (Santa Cruz, 1 :1000), anti-fosfo-p27 policlonale (Thr187, Santa Cruz, 1 :400), anti-p27 policlonale (Santa Cruz, 1 :750). Gli anticorpi secondari erano IgG coniugate con perossidasi anti-topo (Jackson Immuno Research, West Grave, PA, 1 :10000), coniglio (Jackson Immuno Research, West Grave, PA, 1 :10000) o capra (Southern, Biotech, 1:10000). Il controllo della quantità caricata fu effettuata mediante colorazione di actina.

Dopo aver incubato per 1 minuto la membrana con LiteAblot Chemiluminescent kit (Lite Ablot, EuroClone, EMP010004) il segnale chemiluminescente impressiona lastre fotografiche (Kodak X-Omat Blue XB-1 Film, Eastman Kodak Company, Rochester, NY). L’immagine fu quindi acquisita e quantificata mediante l’apparecchio Gel Doc che utilizza il programma di analisi densitometrica Quantity One (Bio-Rad), per una valutazione quantitativa dell'intensità delle bande.

Immunofluorescenza.

Le cellule furono centrifugate (800 rpm per 5 min a temperatura ambiente), lavate due volte in PBS, ri-centrifugate (1000 rpm per 5 min a 4°C) e fissate per 30 minuti a 4°C in formalina al 5%. Dopo ulteriore centrifugazione (1000 rpm per 5 min a 4°C) le cellule furono poste su vetrini silanizzati, post-fissate per 5 minuti a -20°C con etanolo-acido acetico 2:1, lavate due volte con PBS e bollite in tampone citrato 10 mM, pH 6.0, per 10 minuti. Quindi furono trattate con siero al 10% per 1 ora, incubate tutta la notte a 4°C con anticorpo primario e 45 minuti con anticorpo secondario coniugato con fluorescina (Santa Cruz, 1 :200) o rodamina (Invitrogen, 1:200). Il controllo negativo di ogni campione si ottenne sostituendo l’anticorpo primario con siero normale all’1.5%. Le immagini vennero acquisite come in precedenza descritto (4).

Analisi statistica.

Tutti i dati furono espressi come media±SEM. L’analisi statistica mediante ANOVA ad una via seguita, quando significativa (P<0.05), dal post test di Bonferroni, permise di verificare la significatività delle differenze tra i gruppi di trattamento. Esempio 1. Definizioni delle concentrazioni ottimali di Cr e Rib.

La concentrazione d’uso ottimale fu determinata mediante curva dose-risposta con il saggio MTT (colorante vitale) in presenza di Creatina e Ribosio. Le cellule H9c2 furono trattate con doxorubicina, un noto cardiotossico che provoca danno mitocondriale e produzione di specie reattive dell’ossigeno, in modo da testare l’efficacia di creatina e ribosio nel preservare l’omeostasi energetica cellulare. L'intervallo di concentrazioni nel sistema in vitro fu scelto per creatina intorno ad una concentrazione di 5 mM come valore intermedio delle curve dose-risposta e per D-Ribosio, ad una concentrazione di 10 mM, corrispondenti ad un rapporto in peso di 1 : 2.

Anche nel modello di sofferenza mitocondriale utilizzato (trattamento con doxorubicina associata a danno mitocondriale e produzione di specie reattive dell’ossigeno, la somministrazione combinata di creatina e ribosio risultò più efficace delle singole sostanze nel migliorare la vitalità delle cellule H9c2 trattate. La concentrazione minima efficace di creatina e ribosio necessaria per migliorare la vitalità delle cellule H9c2 trattate per 24 h con doxorubicina 0.5 Î1⁄4Îœ (Doxo) fu determinata dalla curva dose-risposta mostrata in Figura 1. La Doxo riduceva la vitalità del 35% rispetto alle cellule non trattate (P<0.001). La somministrazione di Creatina o Ribosio aumenta la vitalità cellulare in modo dose-dipendente: in particolare Creatina alla concentrazione di 2.5 mM e D-Ribosio alla concentrazione di 5 mM sono sufficienti per indurre protezione.

Inoltre in accordo con quanto si evince dalla figura 1 nel modello di stress mitocondriale utilizzato, à ̈ che la somministrazione combinata di creatina e ribosio aumenta l’indice di vitalità cellulare rispetto all’utilizzo delle due sostanze usate singolarmente.

Esempio 2. Definizione del modello di ischemia simulata: effetto della somministrazione combinata di Cr e Rib sulla vitalità cellulare.

Il modello di ischemia simulata prevede di incubare le cellule per 24 ore a 37°C con un terreno di coltura privo di glucosio, in un ambiente a bassa tensione di ossigeno (11). La vitalità delle cellule ischemiche, analizzata mediante saggio del Trypan blu, diminuisce del 50±4% rispetto alle cellule non ischemiche (Figura 2). L’aggiunta al terreno di Cr 2.5 mM o Rib 5 mM non migliora la vitalità (P=NS) rispetto alle cellule ischemiche non sottoposte a trattamento. Tuttavia, in presenza di entrambe le sostanze, la vitalità aumenta del 30±3% rispetto alle cellule non trattate. Qualora le cellule controllo siano supplementate con Cr 2.5 mM e Rib 5 mM in associazione, la vitalità resta invariata (P=NS vs. le cellule controllo). Quindi, la contemporanea presenza di creatina e ribosio, ma non delle due sostanze singolarmente, nel terreno di cellule H9c2 sottoposte ad ischemia, incrementa il loro indice di vitalità. Lo stesso trattamento à ̈ inefficace sulle cellule non-ischemiche.

Esempio 3. Valutazione degli effetti sull’arresto del ciclo cellulare indotto dall’Ischemia.

Sottoposte ad ischemia, le cellule H9c2 mostrarono un evidente arresto del ciclo cellulare in corrispondenza dell’entrata in fase S (Figura 3). La percentuale di cellule che transita dalla fase Gìalla fase S risultò essere ridotta del 55+4%. La somministrazione di creatina 2.5 mM o ribosio 5 mM singolarmente non modifica tale percentuale (P=NS) rispetto alle cellule ischemiche non trattate. Al contrario, la somministrazione combinata delle due sostanze aumentò del 25±4% la percentuale di cellule che passano dalla fase G1alla S rispetto alle cellule ischemiche non trattate. Le altre fasi del ciclo non risultarono sensibili al trattamento combinato con le due sostanze. Quindi, la contemporanea somministrazione di Cr e Rib, ma non delle due sostanze singolarmente, attenua l’arresto del ciclo cellulare in corrispondenza del passaggio dalla fase GÃŒalla S. Il trattamento risulta inefficace sulle cellule non ischemiche. Nelle cellule ischemiche non si osservano rilevanti variazioni nei passaggi G0/Gi e G2/M, qualunque sia il trattamento utilizzato.

Esempio 4. Effetti di creatina e D-Ribosio sul livello di Akt fosforiiata.

Nel modello di ischemia simulata, fu analizzato il contenuto della forma fosforilata di Akt, noto modulatore del ciclo cellulare. La Figura 4 mostra il contenuto proteico di Akt, nella forma fosforilata (p-) e totale (t-), in cellule H9c2 sottoposte a diversi trattamenti. Fu riscontrato che l'ischemia non modificava in modo significativo questo rapporto ma che la somministrazione di creatina e ribosio induce p-Akt (la forma fosforiiata), lasciando inalterato il livello della proteina totale. Questo comporta un aumento del rapporto p-Akt/t-Akt, come indicato dall’analisi densitometrica delle bande proteiche (Figura 4). Questo effetto non si riscontra nelle cellule non ischemiche.

Quindi, il recupero dell’arresto del ciclo cellulare conseguente al trattamento combinato con creatina e ribosio, potrebbe in parte spiegarsi con un aumentata fosforilazione di Akt.

Esempio 5. Effetto della somministrazione combinata di creatina e D-ribosio sull’espressione di cicline e dei relativi inibitori.

In cellule H9c2 sottoposte ad ischemia, furono misurati i livelli delle cicline D1 ed. E e degli inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti, p21 e p27, effettori di Akt fosforilata nel modulare la progressione del ciclo cellulare dalla fase Gìalla fase S. L’analisi dell’espressione proteica mostrò che l’ischemia riduce il contenuto di ciclina D1(P<0.01 vs le cellule non ischemiche, Figura 5) mentre il trattamento con creatina e ribosio, ne promuoveva la sintesi (P<0.05 vs cellule ischemiche non trattate). Inoltre, la somministrazione combinata di creatina e D-ribosio risultava invece inefficace nel ripristinare il contenuto proteico di ciclina E, ridotto significativamente dall’ischemia (P=0.001 vs le cellule non ischemiche). Da ultimo, abbiamo verificato se p21 e p27, inibitori del ciclo cellulare, fossero mediatori dell’effetto della somministrazione combinata di Cr e Rib.

Fu riscontrato che l’ischemia non alterava l’espressione di p21 mentre aumentava il livello di p27. Il trattamento combinato con Cr e Rib riduceva debolmente il contenuto di p21 risultando invece inefficace sull’espressione di p27 (Figura 6A). Dal momento che l’espressione proteica delie forme fosforilate di p21 e p27 à ̈ molto bassa e la determinazione risulta pertanto difficoltosa mediante immunoblotting, fu condotta un’analisi semiquantitativa mediante immunofluorescenza (Figura 6B). Nelle cellule ischemiche, la somministrazione di creatina e ribosio aumentava la forma fosforilata di p21, quasi esclusivamente a livello citoplasmatico. Il livello della forma fosforilata di p27, ridotto dall'ischemia non veniva invece perturbato dal trattamento.

Dall’analisi dei vari esperimenti in cardiomiociti della linea H9c2, à ̈ possibile concludere che l’ischemia induce una riduzione della vitalità cellulare associata all’arresto della progressione del ciclo cellulare in corrispondenza della fase Gi/S. La somministrazione di Cr e Rib in associazione, ma non singolarmente, induce sia la vitalità che la progressione del ciclo cellulare del 30%. I meccanismi sottesi ai benefici effetti della combinazione di Cr e Rib coinvolgono l’over-espressione di proteine che stimolano e la down-regolazione di proteine che inibiscono la progressione del ciclo cellulare.

Esempio 6. Preparazione di composizioni estemporanee in polvere.

I composti secondo l’invenzione furono confezionati sotto forma granulare solubile in bustine bipartite contenenti le due sostanze attive separate tra di loro.

Furono pesate separatamente le componenti necessarie per la preparazione di un lotto industriale di 35.000 bustine nelle seguenti quantità:

- D-Ribosio 175 kg

- Creatina monoidrata 35 kg;

Poiché il D-ribosio ha elevate caratteristiche di igroscopicità le norme di buona fabbricazione consigliano la sua miscelazione con biossido di silicio nelle seguenti proporzioni:

- D-ribosio 99.9- 98%

- Biossido di silicio (per esempio Aerosil 200) 0.1- 2%.

In un miscelatore biconico da 300 I fu introdotta la quantità preventivamente pesata di D-ribosio e Aerosil 200 per un tempo di 15 minuti finché venne raggiunta una buona distribuzione della silice nel D-ribosio. La miscela così ottenuta presenta buone caratteristiche di scorrevolezza e ridotte proprietà igroscopiche. La miscela fu scaricata in un apposito contenitore che successivamente venne sigillato ermeticamente e posizionato in una apposita stazione di caricamento della macchina imbustinatrice.

La creatina monoidrata in forma di finissimo granulare, dopo pesatura della quantità necessaria per la produzione del lotto industriale, fu scaricata in apposito contenitore, successivamente sigillato ermeticamente e idoneo per il caricamento della macchina imbustinatrice.

La macchina confezionatrice, tipo SIG RPD, venne posta in un locale ad umidità controllata per evitare l’assorbimento di umidità durante l’operazione di confezionamento. L’umidità del locale di ripartizione in bustine fu mantenuto con una UR non superiore ai 20%.

Mediante appositi dosatori i due componenti vennero dosati separatamente in una busta avente una saldatura supplementare centrale: in questo modo i componenti la formulazione non vengono in contatto tra di loro.

I dosatori possono essere regolati per dosare nei rispettivi scompartì quantità comprese tra 0.5g fino a 5g, ottenendo pertanto buste contenenti tutte le quantità dei componenti comprese in questo intervallo.

Possibili combinazioni sono ad esempio:

a) D-ribosio 5 g, Creatina 1 g; b): D-ribosio 10 g creatina 2 g; c) D-ribosio 2.5 g creatina 0.5 g.

Successivamente le bustine piene, termosaldate, vennero riordinate e convogliate alla macchina astucciatrice per il confezionamento secondario in astucci.

La ripartizione separata dei componenti D-ribosio e Creatina migliora la stabilità del prodotto nel tempo e previene possibili reazioni di imbrunimento, sviluppo di aromi sgradevoli e perdita di attività dei singoli componenti.

Esempio 7. Preparazioni in cui il D-ribosio à ̈ in forma liquida.

L’esempio di realizzazione riguarda composizioni in flaconcino bevibile con tappo serbatoio dosatore, realizzate come segue:

- in un dissolutore per liquidi furono preparate a freddo una soluzione di acqua depurata e demineralizzata e D-ribosio in quantità variabili tra 10% (peso/peso) e 80% (peso/peso) tenendo conto della solubilità del D-ribosio. Furono preparate soluzioni con concentrazioni variabili e le soluzioni acquose furono stabilizzate mediante l’aggiunta di conservanti quali i derivati dell’acido benzoico ed il potassio sorbato in quantità massima dello 0.2% peso/peso.

La soluzione così ottenuta fu inflaconata mediante apposita macchina inflaconatrice FARMOMAC in flaconcini di PET dal volume variabile tra 5ml e 30 mi.

Con apposita macchina opercolatrice furono riempiti i tappi serbatoio con creatina monoidrata in quantità variabile tra 0.1 g ed 1 g. I tappi serbatoio vengono inseriti a pressione sul collo dei flaconcini in modo da realizzare la chiusura ermetica del flaconcino.

Mediante avvitamento dei tappo si può ottenere la rottura della membrana permettendo alla creatina di unirsi alla soluzione contenente il ribosio. Dopo energica agitazione, il preparato à ̈ pronto per l’assunzione.

A titolo di esempio furono preparati i seguenti dosaggi in peso delle preparazioni: - flaconcino da 10 mi: D-Ribosio 7 g, creatina 0.5 g;

- flaconcino da 7 mi: D-ribosio 2.5 g, creatina 0.5 g;

- flaconcino da 15 mi: D-ribosio 10 g, creatina 1 g.

Sono possibili altre combinazioni tra i due componenti in un intervallo compreso tra 10:1 e 1:1 , fermo restando che il D-ribosio sia sempre posto in soluzione e la creatina in forma solida, sia per problemi di solubilità che di stabilità della creatina, meno solubile del D-ribosio e meno stabile in soluzione acquosa.

Esempio 8. Preparazione di una composizione in forma granulare ripartita in bustine gemellate.

Si procede alla preparazione separata dei due componenti D-ribosio e Creatina come già descritto nell’esempio 5 e mantenendo gli accorgimenti tecnologici, formulativi e operativi come sopra descritto.

I componenti D-ribosio e Creatina, negli appositi contenitori sigillati furono posizionati in modo da poter alimentare i due dosatori di una macchina imbustinatrice Marchesini mod. RC.

La ripartizione avvenne separatamente nelle due buste accoppiate con possibilità di variare l’intervallo di dosaggio per entrambi i componenti da 1 g a 10 g. In questo modo fu possibile dosare quantità più elevate rispetto a quelle indicate nell’esempio 5.

Possibili combinazioni tra D-ribosio e creatina, nell’intervallo sopra riportato sono le seguenti:

a) D-ribosio 10 g (Busta A), creatina 2 g (Busta B)

b) D-ribosio 10 g (Busta A), creatina 0.5 g (Busta B)

c) D-ribosio 5 g (Busta A), creatina 1 g (Busta B)

Esempio 9. Preparazione di una composizione in forma granulare ripartita in bustine gemellate.

Per la preparazione di un integratore alimentare in forma di miscela granulare ripartita in bustine termosaldate ed idoneo per una preparazione estemporanea in acqua.

E’ risaputo che uno zucchero riducente, quale il D-ribosio, in particolari condizioni di umidità, pH e temperatura reagisce con i gruppi amminici -(NH2) dando luogo a fenomeni di imbrunimento con colorazioni che virano verso il marrone e note aromatiche che richiamano il caramello. Questa reazione à ̈ conosciuta come reazione di “Maillard" e viene accuratamente tenuta sotto controllo nella preparazione delle derrate alimentari in quanto indice di scadimento qualitativo. L'associazione di D-ribosio e creatina in miscela tra di loro, richiede particolari accorgimenti atti ad evitare il verificarsi di quanto sopra descritto.

La creatina reperibile in commercio à ̈ nella forma monoidrata ed ha valori medi di perdita all’essiccamento intorno a 12%.

Il D-ribosio, pur avendo una umidità molto bassa, mediamente attorno all’1%, à ̈ molto igroscopico e tende ad adsorbire umidità sia dall’ambiente che dagli altri componenti qualora posto in una miscela.

La preparazione di una miscela stabile di creatina e D-ribosio à ̈ possibile mediante l’applicazione dei seguenti accorgimenti:

in un miscelatore biconico in acciaio inox da 1000 litri si caricano 450 Kg di D-ribosio ed una quantità di 4.5 Kg di biossido di silicio, AEROSIL® 200 o altro prodotto corrispondente, e si miscelano intimamente per circa 30’.

In un secondo miscelatore analogo al primo ma di capacità di 200 litri ca. si caricano 90 Kg di creatina monoidrata e 1.8kg di magnesio stearato preferibilmente di origine vegetale e si procede alla miscelazione per circa 30’. Le due miscele cosi ottenute vengono successivamente miscelate tra di loro in un miscelatore biconico o a “V" della capacità di 1200 litri per un tempo di 15’. La miscela finale viene scaricata in un contenitore con chiusura ermetica ed idoneo per il caricamento di una macchina imbustinatrice per la ripartizione in bustine monodose.

La ripartizione viene effettuata dosando 6.05 g ca.di miscela per bustina in modo che il contenuto corrisponda a 5 g di D-ribosio e 1 g di creatina monoidrata. In questo modo si ottiene una miscela stabile per almeno 24 mesi dalla preparazione se conservata a temperatura non superiore a 25°C.

Variando le quantità di creatina monoidrata e D-ribosio e proporzionalmente come sopra descritto la quantità degli eccipienti biossido di silicio e magnesio stearato si possono ottenere miscele a vario titolo .

Bibliografia

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Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1) Composizione consistente nella combinazione sinergica di creatina o i suoi derivati e ribosio o i suoi derivati, quali principi attivi, per la riduzione ed il recupero del danno ischemico al miocardio di lieve entità.
2. 2) Composizioni secondo la rivendicazione 1 dove tale danno del miocardio à ̈ causato da ipossia cardiaca lieve (assimilabile a 1%02).
3. 3) Composizioni secondo le rivendicazioni 1-2 dove tale danno à ̈ selezionato nel gruppo consistente di: situazione cardiaca post-infarto, disfunzione coronarica, ischemia miocardica lieve o à ̈ causata da patologia polmonare cronica da ostruzione.
4. 4) Composizione secondo le rivendicazioni 1-3 dove D-ribosio e creatina sono in rapporto in peso compreso tra 10:1 e 1:1 .
5. 5) Kit per la preparazione di una miscela comprendente creatina e ribosio per la riduzione del danno ischemico di lieve entità, comprendente un contenitore con D-ribosio o i suoi derivati ed un contenitore comprendente creatina o i suoi derivati con opportune istruzioni per la miscelazione, da effettuarsi poco prima della somministrazione, e per il corretto rapporto in peso tra le due sostanze compreso tra 10 : 1 e 1 :1 (D-ribosio: creatina).
6. 6) Kit secondo la rivendicazione 5 dove il D-ribosio à ̈ in forma di polvere.
7. 7) Kit secondo la rivendicazione 6 dove il D-ribosio in polvere à ̈ miscelato con un agente anti-agglomerante in quantità non superiore al 5%, preferibilmente al 2%.
8. 8) Kit secondo la rivendicazione 5 dove la creatina à ̈ in forma di polvere e il D-ribosio à ̈ in soluzione.
9. 9) Kit secondo la rivendicazione 8 dove il D-ribosio à ̈ in presenza di conservanti (ad es. derivato acido benzoico e potassio sorbato).
10. 10) Kit per la preparazione di una composizione per la riduzione del danno ischemico di lieve entità, comprendente un contenitore comprendente una miscela di D-ribosio o i suoi derivati e creatina o i suoi derivati, con opportune istruzioni per la solubilizzazione della miscela, tale da effettuarsi poco prima della somministrazione, ed in cui il rapporto in peso tra le due sostanze à ̈ compreso tra 10 : 1 e 1 : 1.
11. 11 ) Kit secondo la rivendicazione 10 dove tale miscela comprende anche un agente lubrificante ed un agente anti-agglomerante.
12. 12) Kit secondo la rivendicazione 11 dove l’agente lubrificante à ̈ magnesio stearato.
13. 13) Kit secondo la rivendicazione 11 dove l’agente anti-agglomerante à ̈ biossido di silicio.
14. 14) Un procedimento per la preparazione di una miscela di D-ribosio e creatina in forma stabile che comprende la miscelazione di creatina o i suoi derivati con un agente lubrificante e di D-ribosio o i suoi derivati, con un agente antiagglomerante.
15. 15) Uso di una composizione di D-ribosio e creatina in rapporto compreso tra 10:1 e 1 :1 (peso/peso) per prevenire o ridurre il danno ischemico a livello miocardico causato da una condizione di ipossia lieve.
16. 16) Uso secondo la rivendicazione 15 dove la riduzione del danno ischemico à ̈ associata ad una aumentata progressione del ciclo cellulare nei cardiomiociti .