ITMI20011445A1 - Analoghi della cortistantina capaci di legarsi selettivamente ai recettori dei secretagoghi dell'ormone della crescita - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

"ANALOGHI DELLA CORTISTATINA CAPACI DI LEGARSI SELETTIVAMENTE AI RECETTORI DEI SECRETAGOGHI DELL’ORMONE DELLA CRESCITA"

La presente invenzione riguarda analoghi della cortistatina capaci di legarsi selettivamente ai recettori dei secretagoghi dell'ormone della crescita.

La cortistatina (Nature, 1996, 381,242-245) è un tetradecapeptide simile alla somatostatina, ma con un profilo farmacologico e fisiologico ben distinto (Brain Research Reviews, 2000, 33, 228-241. Infatti, pur legandosi ai cinque sotto-tipi dei recettori della somatostatina (Naunyn-Schmiedeberg Arch. Pharmacol., 1998, 357,483-489), la cortistatina mostra distinti effetti sull’ attività elettrica corticale, sul sonno e sul comportamento locomotore (J.Neurosci.Res. 1999,56,61 1-619).

La cortistatina è inoltre in grado di legarsi ai recettori dei secretagoghi dell’ormone della crescita (GHS-R), a differenza della somatostatina (J.Endocrinol. Invest., 2001,24(1), RC1-RC3) e analogamente alla ghrelina, un peptide endogeno prodotto nello stomaco (Nature, 1999,402,656-660) che stimola la produzione di ormone della crescita (J.Endocrinol. Invest., 2000,23,493-495) mediata dall’interazione con GHS-R (J.Clin. Endocrinol. Metab. 2000, 10, 3803-3807).

E’ stata ipotizzata l’esistenza di specifici recettori della cortistatina, ai quali possono legarsi i peptidi sintetici GHS.

Si sono ora trovati peptidi ciclici in grado di legare selettivamente il recettore della cortistatina e di competere con il legame della ghrelina ai GHS-R.

I peptidi dell’invenzione hanno la seguente formula generale I:

I . - . I

in cui:

Xaa rappresenta un residuo di fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) o di piridilalanina (Pai);

Xbb rappresenta un residuo di treonina (Thr) o di ter-leucina (Tle).

L’invenzione riguarda inoltre i coniugati dei peptidi I con chelanti di metalli o isotopi radioattivi, per impiego radioterapico o radiodiagnostico. I chelanti possono essere legati ai peptidi I direttamente per mezzo di legami covalenti con uno dei gruppi funzionali liberi presenti sui residui degli amminoacidi del peptide, ad esempio con i gruppi amminici dei residui di lisina, oppure attraverso un linker bifunzionale.

Esempi di opportuni chelanti che possono essere legati, direttamente o tramite un linker, ai peptidi sono i leganti poliazamacrociclici bifunzionali acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triacetico (DO3A), acido [10-(2-idrossipropil)- 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7-triacetico (HPDO3 A), acido 4-carbossi- 5,8,11 -tris(carbossimetil)- 1 -fenil-2-ossa- 5,8,11 -triazatridecan- 13-oico (BOPTA), acido 2-metil- 1,4, 7,10-tetraazaciclododecan- 1,4, 7,10-tetraacetico (MCTA), acido (α, α', α", α"')-tetrametil- 1,4, 7,10-tetraazaciclododecan- 1,4, 7,10-tetracetico (DOTMA); il residuo di poliamminofosfati, in particolare acido N,N'-bis-(piridossal-5-fosfato)etilendiammina-N,N'-diacetico (DPDP) e acido etilenedinitrilotetrakis(metilfosfonico) (EDTP); residui di acidi poliamminofosfonici o acidi poliamminofosfinici, in particolare acido 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecano- 1 ,4,7, 10-tetrakis-[metilen(metilfosfonico)] e acido 1,4, 7,10-tetraazaciclododecano- 1,4, 7, 10-tetrakis[metilen(metilfosfinico)]; il residuo di chelanti macrociclici naturali quali texafirine, porfirine e ftalocianine; acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) e suoi derivati quali acido N,N-bis[2-[bis(carbossimetil)-ammino]etil]L-glutammico (DTPA-GLU), DTPA coniugato con Lys (DTPA-Lys), N-[2-[bis(carbossimetil)ammino]-3-(4-etossifenil)propil]-N-[2-[bis(carbossimetil)ammino]etilglicina (EOB-DTPA), N,N-bis[2-[(carbossimetil)[(metilcarbamoil)metil]ammino]etil]glicina (DTPA-BMA); N3S triamidotioli, N2S2 diammidoditioli, N4 tetrammine, acido 2-idrazinonicotinico, chelanti bis amino bistiolo (BAT). Le formule di struttura di tali noti chelanti e le tecniche di coniugazione e radiomarcatura sono descritte in Current Medicinal Chemistry, 2000, 7, 871-994, il cui contenuto è qui incorporato per riferimento.

Opportuni linker bifunzionali comprendono bis-succinimidilmetil.etere (BSME), acido 4-2,2-dimetilacetil)-benzoico (DMBA), bis-succinimido-esano (BSH), tris(succinimidiletil)ammina (TSEA) e simili derivati aventi gruppi succinimmidici, tio, carbossi o amminici.

I peptidi I coniugati a chelanti formano complessi stabili con gli ioni bi-trivalenti di isotopi radioattivi di metalli

che costituiscono un ulteriore oggetto dell’ invenzione.

I peptidi di formula I possono essere usati per la terapia di patologie in cui sia desiderabile un ‘interazione selettiva con il recettore della cortistatina. In particolare, i peptidi I si sono rivelati utili come soppressori dell’appetito possono essere pertanto utilizzati nel trattamento dell’obesità o di condizioni di sovrappeso oppure nel trattamento di acromegalia. I coniugati radiomarcati dei peptidi I possono essere utilizzati per la terapia e/o la diagnosi di tumori che esprimono il recettore della cortistatina e di tumori GH -dipendenti quali carcinomi del polmone, della mammella, tiroide, pancreas, ipofisi o di altri tessuti che esprimono GHS-R.

Per i previsti impieghi terapeutici o diagnostici, i peptidi o i peptidi coniugati e marcati dell’invenzione saranno formulati in formulazioni adatte per la somministrazione orale, parenterale o transmucosale (sublinguale, intranasale o rettale).

Per somministrazione parenterale, esempi di formulazioni adatte comprendono soluzioni o sospensioni acquose sterili, aventi valori di pH compresi fra 6.0 e 8.5 circa e concentrazioni di peptide variabili tra 0.001 e 1 .0 molare.

Tali formulazioni possono essere liofilizzate e fomite come tali in modo da essere ricostituite al momento dell'uso.

Per somministrazione orale, esempi di formulazione adatte comprendono compresse o capsule eventualmente gastro-protette, sciroppi, granulari effervescenti, soluzioni o sospensioni. I dosaggi possono variare entro ampi limiti, a seconda delle caratteristiche farmacocinetiche e tossicologiche del peptide prescelto e del tipo di patologia in esame. In linea di massima, possono essere previsti dosaggi compresi da circa 0,1 μg a 10 μg di peptide totale per kg di peso corporeo al giorno per via parenterale e da circa 30 μg a circa 1000 pg di polipeptide per kg di peso corporeo per via orale in una o più somministrazioni. Nel caso dei peptidi radiomarcati, il dosaggio sarà invece determinato dalla dose di radioattività richiesta per la specifica applicazione diagnostica o terapeutica, secondo parametri noti e dipendenti dall’ attività specifica del coniugato, dal tempo di dimezzamento del radioisotopo e dalle caratteristiche del legante.

I peptidi dell'invenzione potranno essere inoltre vantaggiosamente formulati in composizioni a rilascio controllato, ad esempio come descritto in EP-A-0858323.

I peptidi oggetto dell’invenzione possono essere ottenuti con metodi convenzionali, ad esempio per sintesi peptidica su fase solida.

La sintesi in fase solida viene cominciata dall'estremità C-terminale del peptide. Un adatto materiale di partenza può essere preparato, per esempio attaccando il richiesto alfa-amminoacido protetto a una resina clorometilata, una resina idrossimetilata, una resina benzidrilamminica (BHA), o una resina para-metilbenzidrilamminica (p-Me-BHA). Una di queste resine clorometilate è venduta con il marchio BIOBEADS SX 1 dalla BioRad Laboratories, Richmond, California. La preparazione della resina idrossimetilica è descritta da Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 15997, (1966). La resina BHA è stata descritta da Pietta e Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) ed è disponibile in commercio dalla Peninsula Laboratories Ine., Belmont, California.

Dopo l'attacco iniziale, il gruppo protettivo dell'alfa-amminoacido può essere rimosso mediante una scelta di reagenti acidi, compreso l'acido trifluoroacetico (TFA) o l'acido cloridrico (HC1) in soluzione di solventi organici a temperatura ambiente. Dopo la rimozione del gruppo protettivo dell'alfa-amminoacido, i rimanenti amminoacidi protetti possono essere accoppiati passo a passo nell'ordine desiderato. Ciascun amminoacido protetto può in generale essere fatto reagire in un eccesso di circa tre volte usando un opportuno gruppo attivatore del carbossile, quale dicicloesilcarbodiimmide (DCC) o diisopropilcarbodiimide (DIC) in soluzione, per esempio, in cloruro di metilene (CH2C12) o dimetilformammide (DMF) e loro miscele. Dopo che la desiderata sequenza amminoacidica è stata completata, il desiderato peptide può essere scisso dalla resina supporto per trattamento con un reagente quale fluoruro di idrogeno (HF) che non solo scinde il peptide dalla resina, ma scinde anche i più comuni gruppi protettivi della catene laterali. Quando si usa una resina clorometilata o una resina idrossimetilata, il trattamento con HF dà luogo alla formazione del peptide acido in forma libera. Quando si usa una resina BHA o p-Me-BHA, il trattamento con HF dà luogo direttamente alla formazione del peptide ammide in forma libera.

La procedura in fase solida discussa sopra è nota nella tecnica, ed è stata descritta da Atherton e Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1989).

Alcuni metodi in soluzione, che possono essere impiegati per sintetizzare le porzioni peptidiche della presente invenzione sono precisati in Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2<nd >edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1976 e da Jones, The Chemical Synthesis of Peptides, (Clarendon Press, Oxford, 1994).

I seguenti esempi illustrano l’invenzione in maggior dettaglio.

ESEMPIO 1

II peptide di formula:

I . I

sintetizzato su fase solida, presenta le seguenti caratteristiche, in forma di acetato:

Spettro di massa: M+ 1025.3

Solubilità: 0.2 mg/ml in acqua distillata.

Titolo HPLC: 99%

Analisi amminoacidica: conforme.

ESEMPIO 2

II peptide di formula:

I . I

sintetizzato su fase solida, presenta le seguenti caratteristiche, in forma di acetato:

Spettro di massa: M+ 1009.2

Solubilità: 0.4 mg/ml in acqua distillata.

Titolo HPLC: 95 %

Analisi amminoacidica: conforme.

ESEMPIO 3 - Studi di legame

Gli studi di legame del peptide dell’Esempio 1 (Tyr<3>-cortistatina-8) e Esempio 2 (cortistatina 8) a GHS-R in tessuti da ipofisi umana sono stati effettuati in paragone a cortistatina 14, somatostatina 14 e ghrelina 28 secondo quanto descritto in J. Endocrinol. 1998,157,99-106 e in J.

Endocrinol. Invest., 2001, 24, RC2, usando <125>I-Tyr <4>-ghrelina come ligando. I risultati sono riportati nelle allegate Figure la-c.

Le IC50 calcolate per il peptide dell’ invenzione variavano da 24 a 33 nM, quelle della ghrelina-28 da 7.5 a 9.5, quelle della cortistatina 14 da 11.6 a 14 mentre quelle della somatostatina erano sempre superiori a 1000 nM.

ESEMPIO 4 - Effetto sul consumo di cibo.

II peptide dell’Esempio 2 è stato somministrato per via sottocutanea alla dose di 300 mcg/Kg in ratti Sprague-Dawley del peso di circa 200-250 g in cui veniva stimolato l’appetito mediante iniezione sottocutanea di 80 mcg/Kg del peptide GHS Hexarelin.

Gli animali venivano inoltre trattati, secondo un protocollo “crossover” con sola Hexarelin o con soluzione fisiologica e il consumo di cibo veniva registrato ogni ora per le sei ore successive al trattamento, secondo quanto descritto in European J. Endocrinol., 2001,144,155-162.

Il consumo totale di cibo risultava pari a 0.86 0.28 g per il trattamento con fisiologica, 0.85 0.19 g per il trattamento con Hexarelin associata al peptide dell’Esempio 2 e 3.33 0.47 g per il trattamento con sola Hexarelin.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Peptidi di formula I

   I . I I in cui Xaa rappresenta un residuo di fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) o di piridilalanina (Pai); Xbb rappresenta un residuo di treonina (Thr) o di ter-leucina (Tle).
2. 2. Peptidi secondo la rivendicazione 1 in cui Xaa è Tyr.
3. 3. Peptidi secondo la rivendicazione 1 in cui Xaa è Phe.
4. 4. Peptidi secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui Xbb è Thr.
5. 5. Peptide secondo la rivendicazione 1, scelto fra

   I . I

   I . - . I
6. 6. Coniugati dei peptidi delle rivendicazioni 1-5 con chelanti di metalli o isotopi radioattivi e i corrispondenti complessi chelati di detti metalli o isotopi.
7. 7. Coniugati secondo la rivendicazione 6 in cui i peptidi I sono legati al chelante direttamente per mezzo di legami covalenti con uno dei gruppi funzionali liberi presenti sui residui degli amminoacidi del peptide oppure attraverso un linker bifunzionale.
8. 8. Complessi chelati secondo la rivendicazione 6 o 7 dei metalli scelti fra:
9. 9. Composizioni farmaceutiche o diagnostiche contenenti un peptide delle rivendicazioni 1-5 o un complesso chelato delle rivendicazioni 6-8 in miscela con un veicolo adatto.
10. 10. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 9 a rilascio controllato.
11. 11. Uso dei peptidi delle rivendicazioni 1-5 o dei complessi chelati delle rivendicazioni 6-8 per la preparazione di medicamenti per il trattamento di tumori, di acromegalia e per la riduzione dell’ appetito.