ITBO20070702A1 - Metodo di trattamento di tessuto connettivo e relative applicazioni di uso di tale tessuto. - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE - dal titolo:
METODO Di TRATTAMENTO DI TESSUTO CONNETTIVO E RELATIVE APPLICAZIONI DI USO Di TALE TESSUTO.
La presente invenzione è diretta ad un metodo di trattamento di tessuto connettivo, in particolare derma, e relative applicazioni di uso del tessuto connettivo ottenuto.
Più in particolare, la presente invenzione riguarda un metodo di trattamento di tessuti connettivi, in particolare derma, per preservare selettivamente matrici extracellulari a base proteica e per eliminare e necrotizzare cellule, quali fibroblasti, macrofagi, mastociti, e simili, responsabili di reazioni immunitarie e di rigetto in trapianti omologhi ed eterologici.
II trapianto di tessuti connettivi è un’operazione che spesso è in grado di salvare la vita di un soggetto.
Un tipico esempio è dato dal trapianto di cute, il quale viene utilizzato nelle ustioni estese di terzo e secondo grado dei corpo. I soggetti che subiscono ustioni nella maggior parte del corpo rischiano la vita in quanto la mancanza del rivestimento cutaneo provoca la perdita di liquidi e di proteine, abbassa drasticamente la temperatura corporea ed espone direttamente l'organismo ad agenti fisici e microbiologici. Quando le ustioni non sono molto estese è possibile effettuare auto trapianti di cute, prelevando la cute dalla parti non ustionate dello stesso soggetto e impiantandola sulle ustioni.
Nei trapianti di tipo autologo, il tessuto necessario al trapianto viene prelevato direttamente dal soggetto che riceverà il tessuto trapiantato, in questi tipi di trapianto non sono presenti complicanze dovute a reazioni immunitarie e di rigetto, in quanto il tessuto trapiantato viene riconosciuto dal’organismo e quindi non viene attaccato dalie difese immunitarie.
Tuttavia, in alcuni casi i trapianti autologhi non sono praticabili. Infatti, ad esempio, nei bambini e nelle ustioni molto estese non esiste abbastanza cute indenne per effettuare un auto trapianto.
In questi casi si ricorre a trapianti omologhi o eterologici, vale a dire a trapianti nei quali il donatore è della stessa specie del recidente ma non è il ricevente stesso o nei quali il donatore è di una specie diversa da quella del ricevente.
Questi trapianti, tuttavia, sono soggetti a gravi complicanze post operatorie dovute a reazioni immunologiche e di rigetto del tessuto trapiantato.
Il rigetto è quel complesso di reazioni biologiche in base al quale l'organismo tende a rifiutare il tessuto trapiantato riconoscendolo come estraneo.
Per ovviare a questo grave inconveniente, sono stati sviluppati metodi volti al raggiungimento della tolleranza immunitaria, ossia dell'accettazione biologica, da parte del'organismo ricevente del tessuto estraneo che gli è stati innestato.
Un primo tipo di metodo prevede la somministrazione di forti dosi di farmaci immunodepressivi, ad esempio la "ciclosporina', al soggetto che ha subito il trapianto.
Tale metodologia, se da una parte diminuisce la probabilità di rigetto, dall’altra espone il soggetto trapiantato, peraltro già indebolito dall’operazione subita, alla probabile contrazione di infezioni che non possono essere autonomamente contrastate dal’organismo del trapiantato dal momento che l’intero sistema immunitario viene depresso di farmaci somministrati.
Un'altra tipologia di metodica messa a punto per cercare di evitare il rigetto del tessuto trapiantato prevede di trattare il tessuto prelevato dal donatore prima di innestarlo nel soggetto ricevente.
Tale metodologia è diretta da una parte a stabilizzare le strutture proteiche e collagene della struttura extracellulare del tessuto prelevato e, dall’altra parte, a mascherare o ad eliminare gli agenti antigeni presenti nel tessuto prelevato.
Numerosi lavori scientifici hanno dimostrato la possibilità di trattare il tessuto nel modo sopra descritto per renderlo “acellulare” ed evitare quindi reazioni immunitarie o di rigetto.
Un esempio noto di tale lavoro è dato da un metodo per ottenere un impianto acellulare dermico ottenuto da pelle di cadavere umano. Tale metodo prevede di eliminare le cellule responsabili delle reazioni immunologiche dal tessuto mediante l’uso di sostanze detergenti, quali polyoxyethylene (20), sodio desossicolato e simili.
Alternativamente, in luogo di sostanze detergenti viene descritto l’uso di enzimi, o di particolari sali.
Successivamente tale metodo prevede di porre il tessuto trattato in un liquido crioprotettivo e di disidratare lo stesso, di una predeterminata percentuale funzione del peso del tessuto, durante il criocongelamento. Il criocongelamento consente di conservare intatta la matrice extracellulare del tessuto.
II tessuto criocongelato viene conservato in una soluzione idratante per prevenire contaminazioni microbiche del tessuto.
Il tessuto così ottenuto viene scongelato e reidratato prima del trapianto e, una volta trapiantato viene rapidamente rivascolarizzato dal sangue dello stesso trapiantato.
Nonostante, il tessuto ottenuto dal metodo brevemente descritto consenta di prevenire e contenere complicanze post operatorie dovute al rigetto, il metodo per ottenere tale tessuto è laborioso e difficile di difficile ripetibilità in quanto, ad esempio, richiede molta esperienza e sensibilità per disidratare correttamente e nella giusta quantità il tessuto parzialmente pretrattato.
In questo contesto, è scopo della presente invenzione mettere a disposizione un metodo di trattamento di tessuto connettivo che consenta di preservare selettivamente la matrice extracellulare del tessuto e che elimini o necrotizzi cellule responsabili di reazioni immunitarie e di rigetto in trapianti omologhi ed eterologici.
In particolare è scopo della presente invenzione mettere a disposizione un metodo di trattamento di tessuto connettivo facilmente implementabile e riproducibile.
in accordo con l’invenzione, tali scopi vengono raggiunti da un metodo di trattamento di tessuto connettivo, in particolare derma, comprendente le fasi esposte in una o più delle rivendicazioni annesse.
Le caratteristiche dell’invenzione, secondo i suddetti scopi, sono chiaramente riscontrabili dal contenuto delle rivendicazioni sotto riportate, ed i vantaggi delia stessa risulteranno maggiormente evidenti nella descrizione dettagliata di una forma realizzativa preferita dell’invenzione.
Il metodo di trattamento del tessuto connettivo secondo la presente invenzione verrà descritto con riferimento a derma umano espiantato dal cadavere di un donatore.
Dal tronco del donatore viene rimosso, con un dermatomo elettrico, un lembo di derma avente spessore compreso tra 0,3 e 0,8 mm.
Il lembo espiantato viene posto all'interno di un vasetto sterile contenente soluzione fisiologica, in particolare una soluzione di sodio cloruro 0,9%, per il trasporto alla stazione di trattamento.
All’interno di una cappa sterile a flusso laminare, che consente di garantire adeguate condizioni di sterilità e sicurezza, il lembo prelevato viene disteso accuratamente all’interno di un matraccio per culture cellulari, facendo aderire la parte superiore del derma espiantato alla superficie del matraccio.
II derma viene quindi ricoperto con una soluzione enzimatica in grado di fagocitare almeno in parte fibroblasti, macrofagi, mastociti, ed altre cellule responsabili di reazioni immunitarie e di rigetto nei trapianti. Il derma così immerso viene lasciato nella soluzione enzimatica per un tempo di almeno 12 ore.
Preferibilmente, il tempo di permanenza del derma nella soluzione enzimatica è di 24 ore.
Durante tutto il periodo di permanenza del derma nella soluzione enzimatica, il complesso derma-soluzione viene posto in un incubatrice avente atmosfera e temperatura controllata.
In particolare, l’atmosfera dell'incubatrice comprende CO2in una percentuale compresa tra il 3% ed il 7%, preferibilmente del 5%. La temperatura all’interno dell'incubatrice viene mantenuta tra 307 K e 314 K, preferibilmente a 310 K.
La soluzione enzimatica è, nella forma realizzativa preferita, composta da una soluzione di tripsina, preferibilmente di maiale, con diluizione compresa tra 1 ,8x e 2,2x in soluzione fisiologica, ad esempio sodio cloruro 0,9%, 0 acqua sterile.
La concentrazione preferita di tripsina è 2x.
Una volta trascorso il tempo di permanenza del derma nella soluzione enzimatica, il derma viene rimosso da tale soluzione ed immerso in una soluzione di lavaggio.
Tale soluzione di lavaggio è una soluzione sterile di sodio cloruro 0,9%. Il derma viene lasciato nella soluzione di lavaggio per 10 minuti, allo scopo di rimuovere eventuali residui di soluzione enzimatica.
Successivamente alla fase di lavaggio del derma, lo stesso viene immerso in una soluzione antibiotica su un terreno di cultura cellulare, allo scopo di inattivare residui di soluzione enzimatica che non sono stati rimossi dalla fase di lavaggio.
Va sottolineato che la quantità di soluzione antibiotica è almeno uguale alla quantità di soluzione enzimatica, in modo tale da garantire un’efficiente in attivazione di eventuali residui di soluzione enzimatica ancora presenti sul derma.
La soluzione antibiotica è composta da una miscela 100x di antibiotici e antimicotici scelti, singolarmente o in combinazione dal gruppo comprendente 10.000 lU/ml peniccilina, 10 mg/ml streptomicina, 25 μ/ml Anfotericina B.
Il terreno di cultura cellulare impiegato è RPMI 1640 contenente L-Glutamine con HEPES 25mM.
Il tempo di permanenza del derma nella soluzione antibìotica è di 10 minuti.
Il derma viene successivamente sigillato all'interno di sacche idonee al criocongelamento, ad esempio Hermofreeze bag.
Va sottolineato che durante il sigillamento del derma all’interno delle sacche, non viene aggiunto alcun additivo crioprotettivo al derma. In particolare, non viene aggiunto dimetilsolfossido.
Questo per non compromettere l’efficacia della successiva fase, la quale in combinazione con la fase di immersione in soluzione enzimatica sopra descritta, permette sorprendentemente di ottenere un derma acellulare.
Tale fase prevede di sottoporre il derma ad irraggiamento con radiazioni elettromagnetiche ionizzanti avente frequenza compresa fra 10<19>e 10<22>Hz (raggi gamma).
Tale fase di irraggiamento può prevedere anche la presenza minima di altre radiazioni come conseguenza del tipo di sorgente emettitrice della radiazione.
Nell’esempio realizzativo qui descritto la sorgente emettitrice di radiazioni è<137>Cs, la quale oltre all’emissione prevalente di raggi gamma, emette anche minime quantità di raggi beta.
L'energia per unità di massa ceduta al tessuto dalle radiazioni elettromagnetiche ionizzanti è compresa tra 90 e 110 Gy, preferibilmente di 100 Gy.
L'energia delle radiazioni elettromagnetiche ionizzanti è compresa tra 550 e 750 Kev, preferibilmente di 660 Kev.
Ad irraggiamento terminato, le sacche contenenti il derma vengono criocongelare, seguendo procedure già note e standardizzate, ad una temperatura di circa 80 K.
È stato sorprendentemente notato che l’azione combinata della soluzione enzimatica con radiazioni ionizzanti gamma garantisce la rimozione o la necrotizzazione di qualsiasi cellula responsabile di reazioni di rigetto a seguito di trapianto.
Test di laboratorio hanno evidenziato una vitalità cellulare pari a 1 ,8% del derma sottoposto al trattamento combinato di soluzione enzimatica e radiazioni gamma (si noti che per poter definire un derma cellularmente vitale il valore di vitalità deve essere superiore a 50%). Allo stesso tempo, l’azione combinata di soluzione enzimatica e radiazioni gamma garantisce una perfetta conservazione biologica della matrice extracellulare del derma, vale a dire la matrice extracellulare rimane integra nella propria struttura proteica, nella propria matrice di collagene ed in tutto ciò che non siano cellule responsabili delle reazioni di rigetto.
L’integrità della matrice extracellulare è sia biologica (nel senso sopra detto) che meccanica, nel senso che le proprietà meccaniche del derma, quali ad esempio elasticità, resistenza a trazione e simili, rimangono pressoché immutate rispetto ad un derma che non ha subito alcun trattamento.
È stato inoltre notato sperimentalmente che il derma trattato con l’azione combinata di soluzione enzimatica e radiazioni gamma garantisce una perfetta crescita di tecnociti, permettendo quindi una ottima ricrescita cellulare (con cellule proprie del ricevente) a trapianto effettuato.
Il derma così trattato è inoltre un ottimo supporto per cellule staminali. Il derma acellulare ottenuto dall’azione combinata di soluzione enzimatica e radiazioni gamma trova impiego in molteplici applicazioni. Esempi di tali applicazioni prevedono che il derma acellulare ottenuto dal procedimento sopra descritto, ed in particolare dall’azione combinata della soluzione enzimatica e delle radiazioni gamma, sia impiegato quale sostituto dermico a seguito di ustioni e/o in presenza di ampie perdite di sostanza della cute e delle parti molli (come ad esempio nelle lesioni da decubito) nelle ulcere croniche, nelle lesioni traumatiche, nelle perdite di sostanza di ampie superfici mucose, nella ricostruzione del tratto di esofago cervicale, per neovagine, quale rinforzo e rigenerazione delle lesioni tendinee, legamentose o di altri tessuti dell'apparato locomotore.
Il derma acellulare può inoltre essere inciso (con tecniche laser o meccanicamente) per realizzare un tessuto a rete a piccole maglie, utilizzato per ricostruzioni con gel di piastrine, fattori di crescita, matrice ossea demineralizzata e simili.
Il derma acellulare può inoltre essere impiegato anche in varie forme tra cui quella tubulare per la rigenerazione muscolare , nervosa centrale e periferico ed ossea, e in questi impieghi divenire una camera di rigenerazione tessutale e contenere anche cellule, stimolatori biologici e molecole segnale, innesti e simili.
Un’ulteriore applicazione prevede che il derma acellulare venga ricoperto con materiali biocompatibili, quali ad esempio silicone, polietileni, poliuretani, idrogeli, e caricato con varie sostanze e principi chimici, per realizzare un derma parzialmente artificiale costituito da una matrice biologica e da componenti artificiali.
Claims (21)
- RIVENDICAZIONI 1 . Metodo di trattamento di tessuti connettivi comprendente le fasi di predisporre un tessuto biologico, ricoprire il tessuto con una soluzione enzimatica in grado di fagocitare almeno in parte fibroblasti, macrofagi, mastociti, ed altre cellule responsabili di reazioni immunitarie e di rigetto in trapianti omologhi ed eterologici, caratterizzato dai fatto di comprendere la fase di irraggiare il tessuto così trattato con radiazioni elettromagnetiche ionizzanti avente frequenza compresa fra 10<19>e 10<22>Hz.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato da! fatto di comprendere la fase di criocongelare il tessuto dopo irraggiamento; il tessuto non essendo sottoposto a nessuna soluzione crioprotettrice prima della fase di irraggiamento.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che l'energia per unità di massa ceduta al tessuto da dette radiazioni elettromagnetiche ionizzanti è compresa tra 90 e 110 Gy.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l'energia per unità di massa ceduta al tessuto da dette radiazioni elettromagnetiche ionizzanti è di 100 Gy.
- 5. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dai fatto che l'energia di dette radiazioni elettromagnetiche ionizzanti è compresa tra 550 e 750 Kev.
- 6. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detta soluzione enzimatica è una soluzione di tripsina, preferibilmente di maiale, con diluizione compresa tra 1 ,8x e 2,2x in soluzione fisiologica o acqua sterile.
- 7. Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di tripsina ha diluizione 2x in soluzione fisiologica o acqua sterile.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che la fase di copertura in soluzione enzimatica del tessuto viene attuata per almeno 12 ore consecutive.
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che la fase di copertura in soluzione enzimatica del tessuto viene attuata per 24 ore consecutive.
- 1 0. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dai fatto che la fase di copertura in soluzione enzimatica del tessuto viene attuata in incubatore con atmosfera avente concentrazione di CO2compresa tra 3% e 7%, preferibilmente del 5%, ed ad una temperatura compresa tra 307 K e 314 K, preferibilmente di 310 K.
- 1 1. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto di comprendere, successivamente alla fase di copertura con soluzione enzimatica, una fase di lavaggio del tessuto con soluzione fisiologica.
- 1 2. Metodo secondo la rivendicazione 11 , caratterizzato dal fatto di comprendere, successivamente alla fase di lavaggio, una fase di immersione in soluzione antibiotica su un terreno di cultura cellulare per inattivare residui di soluzione enzimatica.
- 1 3. Metodo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detta soluzione antibiotica comprende una soluzione 100x di 10.000 lU/ml Penicillina, 10 mg/ml Streptomicina, 25 μ/ml Anfotericina B, detto terreno di cultura essendo RPMI 1640.
- 14. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto di comprendere la fase di sigillatura del tessuto all’interno di una sacca per la conservazione criogenica di materiale biologico prima della fase di irraggiamento.
- 15. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detto tessuto connettivo è derma umano.
- 16. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detto tessuto connettivo è derma di cadavere umano.
- 17. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detto tessuto connettivo è derma animale.
- 18. Uso di un tessuto connettivo ottenuto con un metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti da l a 17, caratterizzato dal fatto che detto tessuto viene impiegato quale sostituto dermico a seguito di ustioni e/o in presenza di ampie perdite di sostanze cutanee e/o dele parti molli.
- 19. Uso di un tessuto connettivo ottenuto con un metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti da l a 17, caratterizzato dal fatto che detto tessuto può essere utilizzato in farie forme tra cui quella tubolare per la rigenerazione muscolare, nervosa centrale e periferico ossea; detto tessuto divenendo in tali applicazioni una camera di rigenerazione tessutale.
- 20. Uso di un tessuto connettivo secondo la rivendicazione 18 o 19, caratterizzato dal fatto che detto tessuto connettivo viene ricoperto con materiali biocompatibili, quali ad esempio silicone, polietileni, poliuretani, idrogeli, e caricato con varie sostanze e principi chimici, per realizzare un derma parzialmente artificiale costituito da una matrice biologica e da componenti artificiali.
- 21. Uso di un tessuto connettivo secondo una delle precedenti rivendicazioni da 18 a 20, caratterizzato dal fatto che detto tessuto connettivo viene inciso per realizzare un tessuto a rete a piccole maglie, utilizzato per ricostruzioni con gel di piastrine, fattori di crescita, matrice ossea demineralizzata e simili.
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