ES2964142T3 - Procedimiento de obtención de un tejido dermoepidérmico prevascularizado - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un proceso para la obtención de un sustituto de la piel, que comprende las siguientes etapas: a) mezclar fibroblastos, células endoteliales e hidrogel de origen exclusivamente biológico; b) incubar la mezcla obtenida en la etapa a) durante un tiempo suficiente y en condiciones adecuadas para obtener una dermis prevascularizada; c) añadir queratinocitos a la dermis prevascularizada del paso b) para obtener un sustituto de la piel; en el que dichos fibroblastos, células endoteliales y queratinocitos se obtuvieron a partir de células madre pluripotentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de obtención de un tejido dermoepidérmico prevascularizado
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a un procedimiento para obtener un tejido dermoepidérmico prevascularizado a partir de queratinocitos, fibroblastos y células endoteliales derivadas de células madre embrionarias o células madre inducidas a pluripotencia en una matriz de hidrogel de origen exclusivamente biológico.
Estado de la técnica
Los sustitutos cutáneos son tejidos artificiales creados en laboratorio, compuestos por una matriz celularizada o no celularizada. Estos sustitutos cutáneos pueden sustituir una parte de la piel que falta o que falla en pacientes con quemaduras, heridas crónicas, etc., lo que constituye una alternativa esencial cuando los tratamientos “estándar” han fracasado. El tratamiento estándar actual para el tratamiento de estas heridas es el injerto de piel autóloga, que, aunque es capaz de cubrir la brecha tisular y restaurar la función de barrera utilizando el tejido cutáneo del propio paciente, tiene la desventaja de que la zona de la herida sufre una contracción significativa y una remodelación tisular aleatoria.
La disponibilidad de piel autóloga también es una limitación en los casos en que las heridas de un paciente superan el 60 % de su superficie corporal total; en estos casos, las heridas no pueden cubrirse adecuadamente con autoinjertos debido a la falta de tejido extirpable. Por tanto, el tratamiento requiere el uso de estrategias alternativas, la mayoría de las veces aloinjertos cadavéricos. Éstos funcionan principalmente como un apósito temporal para proteger y estimular la cicatrización en el lecho de la herida antes de la colocación de un autoinjerto.
En caso de quemaduras graves, infecciones necrotizantes de tejidos blandos, tras un traumatismo o una resección tumoral, la cantidad de tejido extirpado es significativa. En la práctica clínica, tales extirpaciones suelen tratarse con injertos de piel autóloga de doble capa. Sin embargo, debido a la cicatrización restrictiva de estos injertos y a la capacidad limitada de la zona donante en pacientes con quemaduras graves, existe una fuerte demanda de enfoques terapéuticos alternativos. La ingeniería de tejidos cutáneos es un campo en rápida expansión en la cirugía plástica y reconstructiva. Se centra en la implantación de sustitutos cutáneos artificiales, que deberían favorecer la rápida cicatrización de las heridas y evitar la pérdida de fluidos y las infecciones. Además, los sustitutos cutáneos deben evitar las cicatrices y las contracturas importantes.
Existen varios sustitutos cutáneos en el mercado: Dermagraft® (sustituto dérmico celular a base de colágeno, elastina y fibroblastos alogénicos), MatriDerm® (sustituto dérmico acelular liofilizado a base de colágeno y elastina no reticulados), Apligraf® (sustituto dermoepidérmico a base de colágeno con fibroblastos y queratinocitos humanos primarios), etc. Sin embargo, todos estos apósitos presentan una serie de inconvenientes, entre ellos la ausencia de células que permitan una rápida revascularización de las zonas afectadas. De hecho, la transición clínica de los sustitutos cutáneos se ha visto limitada por la insuficiente difusión de oxígeno y nutrientes en el injerto. A distancias de difusión superiores a 150-200 pm, las construcciones tisulares sin redes vasculares perfundibles sufren una rápida muerte celular y necrosis. Por consiguiente, con el fin de obtener una implantación satisfactoria, la sustitución artificial requiere una rápida perfusión e integración con el sistema vascular receptor.
Numerosos equipos de investigación han demostrado que la adición de células endoteliales a tejidos generados in vitro (piel u otros tejidos/órganos) permite mejorar la absorción del injerto y limita la necrosis. La presencia de estas células endoteliales permite una rápida perfusión del tejido injertado por anastomosis con el tejido huésped.
La solicitud internacional WO2016/209166 describe un método para obtener una capa de dermis vascularizada mediante la combinación de los siguientes tipos celulares, todos ellos derivados de células madre pluripotentes: células endoteliales, células musculares lisas vasculares/pericitos y, opcionalmente, fibroblastos.
En particular, la solicitud internacional WO2016/209166 enseña que es necesario asociar células de músculo liso/pericitos con células endoteliales con el fin de obtener una vascularización funcional y duradera.
Sorprendentemente, los inventores han demostrado que es posible obtener una dermis prevascularizada y un tejido dermoepidérmico prevascularizado a partir de células endoteliales y fibroblastos obtenidos de células madre pluripotentes, en ausencia de células musculares lisas vasculares/pericitos.
Objeto de la invención
El alcance de la invención se define en las reivindicaciones. Las realizaciones relativas a métodos de tratamiento no están cubiertas por el objeto de las reivindicaciones.
La presente invención describe un procedimiento para preparar tejidos dermoepidérmicos prevascularizados a partir de células derivadas de células madre pluripotentes, preferiblemente a partir de células derivadas de células madre pluripotentes humanas (hPSC o “human pluripotent stem cells” en inglés) en una matriz de hidrogel de origen exclusivamente biológico.
Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento para obtener un sustituto cutáneo según la reivindicación 1.
Según una realización particularmente preferida, dichos fibroblastos, células endoteliales y queratinocitos se obtuvieron a partir de células madre pluripotentes humanas.
Según la invención, la incubación en la etapa b) tiene lugar durante un tiempo suficiente y en condiciones adecuadas para obtener una dermis prevascularizada.
Por dermis “prevascularizada” o “dermis equivalente prevascularizada” o “sustituto de dermis” se entiende un tejido que comprende fibroblastos y células endoteliales embebidos en una matriz.
Por “tejido dermoepidérmico prevascularizado” “tejido dermoepidérmico” o “sustituto cutáneo”, se entiende un tejido que comprende una dermis prevascularizada sobre la que descansa una monocapa de queratinocitos.
Por “tejido dermoepidérmico prevascularizado pluriestratificado”, se entiende un tejido que comprende una dermis prevascularizada sobre la que descansa una epidermis pluriestratificada que comprende varias capas de queratinocitos diferenciados.
Por “hidrogel de origen exclusivamente biológico” se entiende cualquier hidrogel que comprenda proteínas de origen animal o vegetal, como quitosano, colágeno, elastina, gelatina, fibrina y glicosaminoglicanos. En el contexto de la presente invención, el hidrogel preferido es la fibrina de plasma humano.
Según la presente invención, el hidrogel no contiene polietilenglicol (PEG) ni otros polímeros sintéticos comúnmente utilizados en las matrices de sustitutos tisulares.
En una realización, la etapa b) tiene lugar durante al menos 4 días, preferiblemente al menos 6 días, e incluso más preferiblemente al menos 7 días.
En una realización, la etapa b) tiene lugar durante un máximo de 14 días, preferiblemente un máximo de 12 días, incluso más preferiblemente un máximo de 10 días, 9 días, 8 días o 7 días.
En una realización preferida de la invención, la etapa b) tiene lugar durante aproximadamente 7 días.
Según una realización de la invención, el medio de cultivo en la etapa b) se compone de factores de crecimiento que favorecen la proliferación y maduración de fibroblastos y células endoteliales. Para los fibroblastos, por maduración se entiende: la producción de matriz extracelular y remodelación de la matriz; y para las células endoteliales, remodelación de la matriz y ensamblaje de una red vascular primitiva.
Según una realización de la invención, el medio de cultivo de la etapa b) comprende factor de crecimiento endotelial vascular (“Vascular Endothelial Growth Factor” o VEGF), preferiblemente VEGF estabilizado. Preferiblemente, el VEFG o VEGF estabilizado está presente en el medio de cultivo de la etapa b) a una concentración de 5 a 60 ng/mL, preferiblemente de 45 a 55 ng/mL, incluso más preferiblemente aproximadamente 50 ng/mL.
Según una realización de la invención, el medio de cultivo de la etapa c) comprende factores de crecimiento que favorecen la proliferación de queratinocitos y su posible estratificación posterior, así como la estabilización de la red vascular primitiva creada durante la etapa b).
Según una realización de la invención, el medio de cultivo de la etapa c) comprende VEGF, preferiblemente VEGF estabilizado. Preferiblemente, el VEFG o VEGF estabilizado está presente en el medio de cultivo de la etapa c) a una concentración de 5 a 60 ng/mL, preferiblemente de 45 a 55 ng/mL, incluso más preferiblemente aproximadamente 50 ng/mL.
Ventajosamente, los diferentes tipos celulares utilizados (fibroblastos, células endoteliales, queratinocitos) se obtienen por diferenciación de células madre pluripotentes, preferiblemente células madre pluripotentes inducidas humanas.
La invención no se basa en el uso de células que requieran la destrucción de un embrión.
El experto en la técnica dispone de varios métodos para obtener poblaciones celulares diferenciadas homogéneas a partir de células madre pluripotentes humanas.
En la literatura se han descrito numerosos procedimientos para diferenciar células madre pluripotentes humanas en fibroblastos, células endoteliales o queratinocitos.
Habitualmente, los procedimientos de diferenciación de células madre en fibroblastos se describen en Shamis Y, Silva EA, Hewitt KJ, Brudno Y, Levenberg S, Mooney DJ,et al.(2013) Fibroblasts Derived from Human Pluripoterit Stem Cells Activate Angiogenic Responses In Vitro and In Vivo. PLoS O<ne>8(12): e83755.
Habitualmente, los procedimientos para diferenciar células madre en células endoteliales se han descrito en las solicitudes de patente EP3327118, WO2018101466 y US20180023051.
Habitualmente, un procedimiento para diferenciar células IPS en queratinocitos se describe en la solicitud internacional WO2009/156398.
La presente invención también abarca los diversos usos no terapéuticos de dichos sustitutos cutáneos.
En un aspecto, la invención se refiere a un sustituto cutáneo tal como el descrito anteriormente como medicamento. En un aspecto, la invención se refiere a un sustituto cutáneo tal como el descrito anteriormente para su uso en un método de tratamiento, tal como el tratamiento de quemaduras y heridas cutáneas crónicas.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un sustituto cutáneo tal como el descrito anteriormente en un método de cribado de compuestos y moléculas destinados a estar en contacto con la piel y, en particular, con fines cosméticos o terapéuticos.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una población de sustitutos cutáneos obtenidos según el procedimiento descrito anteriormente. Ventajosamente, esta población de sustitutos cutáneos representa un conjunto homogéneo y reproducible de muestras obtenidas en condiciones clínicas y en grandes cantidades.
Descripción de las figuras
Otras características, detalles y ventajas de la invención se desprenderán de las figuras adjuntas.
Figura 1
La [figura 1] representa el procedimiento de obtención de dermis equivalente a partir de células endoteliales, fibroblastos y fibrina.
Figura 2
La [figura 2] representa un ejemplo de procedimiento de obtención de tejido dermoepidérmico según la invención. Figura 3
La [figura 3] representa un ejemplo de tejido dermoepidérmico según la invención suturado en el ratón.
Figura 4
La [figura 4] representa la formación de estructuras circulares compuestas por células endoteliales en un tejido dermoepidérmico obtenido según el procedimiento de la invención en el que el biomaterial es fibrina y se siembran fibroblastos y células endoteliales derivadas de iPSC humanas en una proporción 1:40 (medio EC:CNT).
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1: obtención de fibroblastos, células endoteliales y queratinocitos a partir de células madre pluripotentes inducidas
Se utilizó una línea de células madre humanas inducidas a pluripotencia para obtener fibroblastos (FIB), células endoteliales (EC) y queratinocitos (KER) mediante 3 procedimientos de diferenciación adaptados.
Ejemplo 2: obtención de una dermis prevascularizada
Los fibroblastos (FIB) y las células endoteliales (EC): los FIB y las EC fueron preamplificados antes de la preparación del tejido en frascos de cultivo y en medio F-CnT (CelInTec) para los FIB y en medio StemPro34 (Invitrogen) o ENDO-CnT (CelInTec) suplementado con VEGF a 50 ng/mL para las EC. Cuando los 2 tipos celulares estuvieron listos, se colocaron en placas y se contaron. Las células, en una proporción de 1 FIB por cada 40 CE, se mezclaron con fibrina. La fibrina se obtiene mezclando plasma y solución salina en las condiciones descritas en la tabla 1:
[Tabla 1]
La solución “células fibrina” se depositó en insertos de 1cm2, es decir, 600 uL/inserto con 10.000 FIB 400.000 EC. A continuación, se colocaron las placas a 37 °C para permitir la coagulación de la matriz durante al menos 1 h. Una vez fraguada la fibrina, se añadió medio: 1 mL en los insertos y 2 mL en los pocillos para garantizar la inmersión completa del tejido. El medio utilizado fue una mezcla de 1/3 de medio F-CnT y 2/3 de medio “EC” durante 1 día. Al día siguiente (J1) y hasta J7, el medio se cambió cada 2 días por el medio compuesto por 1/3 de medio F-CnT y 2/3 de medio EC, con los mismos volúmenes anteriores.
Ejemplo 3: obtención de un tejido dermoepidérmico prevascularizado
El cultivo se llevó a cabo durante aproximadamente 14 días en una incubadora a 37 °C con un 5 % de CO<2>para los tejidos dérmicos y 21 días para los tejidos dermoepidérmicos. El medio F-CnT de la mezcla se sustituyó por medio ECM el J1 para permitir que FIB secretaran matriz extracelular y VEGF estabilizado a 50 ng/mL.
El J7, una parte del tejido se dejó en las mismas condiciones hasta el J14 para realizar un análisis de la dermis sola y la otra parte se sembró con queratinocitos (KER) sobre las matrices en medio CnT07.HC con 1,6 mg/mL de Exacyl® durante 24-48 h a 100.000/cm2. El J9, los tejidos con KER se colocaron en la superficie de contacto de airelíquido para permitir la estratificación de la epidermis. El medio utilizado estuvo entonces compuesto por un 70 % de medio Airlift, un 30 % de medio ENDO-CnT con 1,6 mg/mL de Exacyl® y un 50 ng/mL de VEGF estabilizado.
Estos experimentos permitieron obtener un tejido dermoepidérmico prevascularizado que, una vez injertado en el ratón, no mostró necrosis.
Claims (12)
1. Procedimiento de obtención de un sustituto cutáneo que comprende las siguientes etapas:
a) mezcla de fibroblastos, células endoteliales e hidrogel de origen exclusivamente biológico;
b) incubación de la mezcla obtenida en la etapa a) durante un tiempo suficiente y en condiciones adecuadas para obtener un tejido de tipo “dermis prevascularizada”;
c) adición de queratinocitos a la dermis prevascularizada de la etapa b) para obtener un sustituto cutáneo d) opcionalmente, incubación en la superficie de contacto de aire-líquido durante un tiempo suficiente para obtener un tejido dermoepidérmico prevascularizado pluriestratificado
en el que dichos fibroblastos, células endoteliales y queratinocitos se han obtenido a partir de células madre pluripotentes,
y en el que no se añaden células musculares lisas vasculares ni pericitos a la mezcla de la etapa a).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,caracterizado por quela incubación en la etapa a) tiene lugar durante 7 días.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,caracterizado por queel factor de crecimiento epidérmico vascular (VEGF), preferiblemente VEGF estabilizado, está presente en el medio de cultivo de la etapa b), preferiblemente a una concentración de 30 a 60 ng/mL, preferiblemente de 45 a 55 ng/mL.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizado por queel VEGF, preferiblemente el VEGF estabilizado, está presente en el medio de cultivo de la etapa c), preferiblemente a una concentración de 30 a 60 ng/mL, preferiblemente de 45 a 55 ng/mL.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,caracterizado por quelos fibroblastos y las células endoteliales de la etapa a) se obtienen a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,caracterizado por quelos queratinocitos de la etapa c) se obtienen a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas.
7. Sustituto cutáneo que comprende una dermis prevascularizada y una monocapa de queratinocitos obtenida según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Sustituto cutáneo que comprende una dermis prevascularizada y una epidermis pluriestratificada, obtenidas según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Sustituto cutáneo según la reivindicación 7 u 8 para su uso como medicamento.
10. Sustituto cutáneo según la reivindicación 7 u 8 para su uso en un método de tratamiento.
11. Uso de un sustituto cutáneo según la reivindicación 7 u 8 en un método de cribado de compuestos y moléculas destinados a estar en contacto con la piel y, en particular, con fines cosméticos y/o terapéuticos.
12. Población de sustitutos cutáneos obtenidos por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
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