IT8009394A1 - Istamicine e produzione delle stesse, per impiego come antibatterici ed antibiotici - Google Patents
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Description
Descrizione dell'Invenzione Industriale dal titolo: "ISTAMICINE E PRODUZIONE DELLE STESSE PER IMPIEGO COME ANTIBATTERICI ED ANTIBIOTICI?
RIASSUNTO
Vengono previsti quattro nuovi antibiotici, denominati istamicina A, istamicina B, istamicina Ao e istamicina Bo, che sono utili quali agenti antibatterici aventi un'attivit? inibitoria alla crescita di batterio Esci sono prodotti tramite fermentazione di un nuovo microorganismo, la Streptomyces tenjimarionsis FERM -P 4932 (A.T.C.C. numero 31603),,
DESCRIZIONE
La presente invenzione ai rifer?sce a quattro nuovi ed utili antibiotici, designati quali ?stamicina A, istamicina B, ?stamic?na Ao e istamicina Bo rispettivamente . Questa invenzione ai riferisce anche al la produzione per fermentazione di questi nuovi antibiotici usando un nuovo microorganismo,; come pure agli usi d? questi nuovi antibiotici? La presente invenzione si riferisce inoltre al nuovo microorganismo stesso che viene impiegato nella produzione di istamicine per fermentazione .
Une grande variet? di microorganismi patogeni co m batteri e funghi sono responsabili di .nli/;?ia in esseri umani, animali e piante. Nonostante che sia sta to sviluppato un certo numero di antibiotici , alcuni dei quali possiedono un 'attivit? antimiorobica utilmente elevata contro uno o pi? microorganismi patogeni,, rimane ia necessit? di un agente terapeutico pi? efficace per combattere le tante malattie causate dai microorganismi patogeni in esseri umani, animali e piante.
Uno scopo della presente invenzioni ? quello di fornire nuovi antibiotici che sono utili quale agente antibatterico per il trattamento terapeutico di infezioni batteriche nell'essere umano ed in animali e/o per la steril?zzazione d? materiali e strumenti chirurg?ci. Un ulteriore scopo della presente invenzione ? quello di fornire un processo per la produzione per fermentazione di questi nuovi antibiotici. Altri scopi della presente invenzione risulteranno chiaramente dalle descrizioni seguenti?
Sono stati effettuati studi e ricerche estesi nel ne di terra prelevato in fondo al mare alla costa del la Penisola di Miuraa nella prefettura di Kanagawa, Giappone , ed al quale venne assegnato il contrassegno di laboratorio Ceppo No? SS-939 - viene coltivato in un mezzo di coltura sotto condizioni aerobiche, vengo no prodotte ed accumulate nella colture quattro sostanze differenti che presentano un?attivit? antibatterica contro una grande variet? di batteri ? Si ? riu sciti ad isolare queste sostanze antibatteriche dalla coltura ed a purificarle? Dagli studi chimici, fisici e microbiologici di queste sostanze isolate, ? stato confermato che ciascuna di queste sostanze isolate ? un antibiotico nuovo aminoglicosidico poco tos sico e distinguibile da ciascuno degli antibiotici noti. Perci? sono stati chiamati questi quattro nuovi antibiotici istamicina A, istamicina B, istamicina ed istamicina rispettivamente.
Secondo un primo aepetto della presente invenzione, viene fornita - quale nuova sostanza antibiotica -la istamicina che ? almeno un elemento selezionato da istamicina A, istamicina B, istamicina A0, istamicina B e da loro sali per addizione di acidi :
(r.) datta istamicina A essendo caratterizzata per il fatto: che presenta una formula empirica
contien de guppi N-Metile ed un gruppo O-metile nella sua molecola; che mostra soltan to l ' t } * --bir JIV?O finale nelle spettro di asbi men to ultravioletto dell'istamicina in acqua ; che ? so lubile in acqua, e metanolo ma difficilmente solubile o insolubile in etanolo ad altri solventi organici co muni; che d? una reazione positiva con reagente alla ninidrina e con reagente di Hydon-Smith. dando un valore Rf di 0,22 su di una cromatografia a strato sottile di cellulosa sviluppata con n-butanolo-piridina--acido acetico-acqua (6:4: 2:4 in volume); e che lo emi-carbonato dell' istamicina A si presenta nella for ma di una polvere incolore che non presenta un punto di fusione definito ma si scompone a 102-108?C e d? una specifica rotazione ottica = 155? (c 0,1, acqua );
(b) detta istamicina B essendo caratterizzata per il fatto: che presenta una formula empirica
che contiene due gruppi N-metile ed un gruppo 0-metile nella sua molecola; che mostra soltan to l'assorbimento finale nello spettro di assorbimento ultravioletto dell 'istamicima B in acqua; che ? solubile in acqua e metanolo ma difficilmente solubile e insolubili in metanolo ed <.l';ri s J -iti cr uni organici ; che d? una reazione
un valore Rf di 0,25 su di una cromatografia a strato sottile di cellulosa sviluppata con n-butanolo-piridi -na-aci acetico-acqua (6: 4:2: 4 in volume ; e che lo e.ai -carbonato dell ' istamicina B ? in forma di una pol vere il calore che non presenta un punto di fusione de finito ma si scompone a 112-114?C e d? una rotazione specifica ottica = 165 ? ( c 0, 4, acqua) ;
(e) detta istamicina Ao essendo caratterizzata per il fatto: che presenta la formula empirica
che contiene due gruppi N-metile ed un grup 0-metile nella sua molecola; che mostra soltan to l assorbimento finale dello spettro ultravioletto dell' istamicina in acqua; che ? solubile in acqua metanolo ma difficilmente solubile o insolubile in etanolo ed altri solventi organici comuni ; che d? una reazione positiva con reagente alla ninidrina e con reagente Rydon-Smith ; che d? un valore Rf di 0,36 su di una cromatografia a strato sottile di gel di silice sviluppata con la fase inferiore della miscela di cloroformio-metanalo-ammoniaca acquosa al 17% ( 2: 1 : 1 in volume) ; e che l'ami -carbonato di istmicina A si presenta nella forma di una polvere cristallina incoloro che non presenta alcun punto di fusione definito ma si scompone a 111 -1 14?C e d? una rotazione specifica ottica acqua) ;
(d) detta istamicin essendo caratterizzata per il fatto: che presenta una formula empirica
che contiene due gruppi M-Metil .; od un
gruppo O-Metil nella sua molecola; e mostra soltan to l ' assorbimento finale nello spettro di assorbimento ultravioletto dell'?stamicina Bo in acqua; che ? solubile in acqua e metanolo ma difficilmente solubile a insolubile in etanolo ad altri solvnti organici comuni; che d? una reazione positiva con reagente alla ninidrina e con reagente Rydcn- Smith; che d? un valore Rf di 0,1d su di una cromatografia a strato sottile di gel di silice, sviluppata con la fase inferiore della miscela di cloroformio-metanolo-ammonia ca acquosa al 17% (2:1:1 in volume); e che l'umi-car bonato dell' istamicina B s? presenta nella forme, di una polvere incolore cristallina che non presenta un punto di fusione definito e d? ma rotazione specifica ottica ?-= 160? (c 1? acqua).
Nel seguito, con il termine istamicina si inten de istamicina A, istamicina B, istamicima A o istamicina B o la loro miscela se non ? indicato altrimenti. Inoltra con il temine complesso istamicina si intende una di due tre o tutte e ?stamicina se non indicato altrimenti , La pre sente isamcina A, istamicina B, istamicina A ed istamicina B , sia da sole che in una miscela di almeno due di queste sostanze che possono essere presenti in una soluzione diluita, quale concentrato grezzo, quale solido grezzo,, quale solido purificato, quale forma di base libera o nella forma di un sale per aggiunta di acido con un acido inorganico od organico.
Le caratteristiche fisico-chimiche dell?istamicina, includenti le caratteristiche menzionate sopra, vengono ora descritte in maggior dettaglio.
L'istamicina A ? un composto basico e l'istamicina A isolata quale un carbonato di essa si presenta nella forma di una polvere incolore che non presen ta un punto di fusione definito, si scompone a 102-108?C e mostra una rotazione specifica ottica = 155? (c 0,4, acqua) e l'analisi elementare della quale coincide con i valori teorici della formula molecolare ? 3555 3 Questa formula molecolare ? stata conferma ta tramite spettrometria di massa ad elevata risoluzione (trovato: m/e 389,2588; calcolato per
m/e 389,2635). LO spettro di assorbimento infrarosso dell'emi-carbonato di istamicina A pellettizzata in bromuro di potassio ? mostrato nella tlg.1 dei disegni allegati. Lo spettro di assorbimento ultravioletio dell ' emi -carbonato dell ' istamicina A in acqua nostra soltanto l ' assorbimento finale. Nello spettro di assorbimento a risonanza magnetica del protone ( 1 H) nucleare ( standard esterno : dell ' emi-car bonato dell' istamicina A in deuterio-acqua, si notano segnali caratteristici a ^
L ' istamicina A ? solubile in acqua e metanolo ma limitatamente solubile o insolubile in etanolo ed altri solventi organici comuni ed ? positiva alla reazione con ninidrina ed alla reazione di Rydon-Smith. L'istamicina A d? una singola macchia a 0,22 in una cromatografia a strato sottile su cellulosa (Avicel, Fimakoshi Yalruh?ri Co. ) sviluppata con solventi miscelati di a-butanolo-piridina-acido acetico-acqua ( 6: 4: 2: 4 in volume) 9 ed ? distinguibile dall'istamicina B che d? una singola macchia ad Rf 0,25 nella stessa cromatografia a strato sottile su cellulosa come indicato di seguito. In una elettroforesi con carta a voltaggio elevato (3.300 volta, 15 minuti ) usando acido for mico-acido acetico-acqua ( 25 :75 :900 in volume) , la mobilit? di ambedue , cio? dell 'istamicina A e dell' istamicina B ? di 2, 15 , premesso che la mobilit? dell 'alanina ? 1 ,0. Di conseguenza I' istamicina A non ? distinguibile dall' istamicina B per mezzo dell ' elettro foresi con carta ad elevato voltaggio.
L'istamicina B ? molto simile all'istamicina A nelle sue caratteristiche, e l istamicina B ? anche
un composto basico. L'istamicina B isolata quale carbonato di essa si presenta nella forma di una polvere incolore che non presenta un punto di fusione definito, si scompone a 112-124?C e d? una rotazione specifica ottica = 165? (c O,4, acqua) e l'analisi elementare della quale coincide con i valori teorici della formula molecolare
Questa forum la molecolare ? stata confermata con una spettrometria di massa ad elevata risoluzione (trovato: m/e 389^2625; calcolato per . Lo spettro
di aesorbimento infrarosso dell'istamicina B pellettiz zata in bromuro di potassio ? mostrato nella Fig.2
dei disegni allegati. Lo spettro di assorbimento ultravioletto dell emi-carbonato dell'istamicina B in acqua mostra soltanto l'assorbimento finale. Nello spettro di assorbimento della risonanza magnetica del protone ( H) nucleare (standard esterno: 3MS, pD 5,4) dell'em?-carbonato dell'istamicina B in deuterio-ac qua, si notano segnali caratteristici a
Similmente all'istamicina A, l istamicina B ? solubile in acqua e metanolo ma limitatamente solubile o insolubile in etanolo ed altri sol venti organici comuni . ed ? positiva alla, reazione alle ninidrina ed alla reazione di Rydon-Smith. Come menzionato sopra, l'istam?cina B ? separabile dall'istamicina A tramite una cromatografia a strato sottile su cellulosa,
L'istamicina Ao ? anche essa un composto basico e 1 'istamicina Ao isolata quale emi -carbonato di esso si presenta nella forma di una polvere cristallina incolore che non presenta un punto di fusione definito;. s? scompone a 111-114?C e d? una rotazione ottica specifica - 76? (c 0,56, acqua) o l'analisi elementare delle quale coincide con i valori teorici della formula molecolare
?, Questa formula molecolare ? stata confermata tramite una spettrometria di massa ad elevata risoluzione ( trovato: m/e 332,2414, calcolato per * Lo spettro d? assorbimento infrarosso dell ' emi-carbonato dell ' i -
stamicina Ao pallettizzata in bromuro di potassio ? mostrate nelle ? *3 dei disegni allegati. Lo spettro di ultravioletto dell ' emi-carbonato deln, vga frti ca del protone H) nucleare ( ai*. ; &&ru tsterno dell ' emi -carbonato dell' istamicina in et, tori "?-acqua , si notano
^ a a ? L'istamicina Ao ? solubile in acqua e metanlo ma limitatamente solubile o insolubile; in etanolo ed altri solventi organici comuni , ct. ? positiva nella reazione con n?nidr?na e nella reazione di Rydon- Smith* L'istamic?na A d? una macchia singola a Rf 0,36 in una cromatografia a strato sottile su gel di silice, sviluppata con la fase inferiore della miscela di cloroformio-metanolo-ammoniaca acquosa al 17% (2:1:1 in volume). In una elettroforesi con carta ad elevato voltaggio (3.300 volta, 15 Minuti) usando acido formico-acido acetico-acqua (1:3:36 in volume) . la mobilit? relativa dell ' istamicina A o ? 2,35 , premesso che la mobilit? dell'alanina ? 1,0.
L'istamicina B ? anche essa un composto basico l ' istamicina B isolata quale ami -carbonato d? esse si presenta nella forma di una polvere cristallina incolore che non presenta un punto di fusione definito e d? una rotazione ottica specifica
(c 1, acqua ) e l 'analisi aleresti iure dall, quale c-fJn? ? cidi con i valori !r-orici della al: -,1 3c ?' re?
na Bo non ? distinguibile dall ' istamicina ?o perch? le loro mobilit? sono uguali e cio? 2,35.
Da studi strutturali, la seguente struttura chi_ mica viene adesso presentata dagli inventori per l'istamicina A.
La seguente struttura chimica viene data per 1' istami -cina B
La seguente struttura chimica viene presentata per 1 ' istamicina A .
oppure
Dall 'ulteriore studi o della struttura chimica del-1 'istamicina A ,? stato trovato che l'istamicina A nel la sua soluzione acquosa a pH pi? elevato del neutro prende la configurazione mostrata nella formula (III ) , mentre l'istamicina Ao nella sua soluzione acquosa con pH pi? basso del neutro (forma protonato) prende la configurazione mostrata dalla formula (IV) suddetta. La struttura seguente viene presentata per l'istamicina Bo .
L'istamicina A, l'istamicina B, l'istamicina Ao e l'istamicina Bo vengono ciascuna abitudinalmente ottenute quale base libera o un idrato od un carbonato di essa ed esse possono essere convertite in sali per aggiunta di acidi farmaceuticamente accettabili tramite reazione con un acido farmaceuticamente accettabile in un modo convenzionale. Il sale per aggiunta di acido farmaceuticamente accettabile dell'istamicina pu? essere uno di quelli ottenuti tramite reazione con un acido inorganico come l'acido cloridrico, l'acido bromidrico, l'acido solforico, l'acido fosforico, l'acido l acido solfonico e simili, oppure con un acido organico come l'acido acetico, l'acido malico, l'acido cidrico , l' aco ascerbico, l acido medano-ol - onico simili.
Con riferimento ai disegni allegati : la
Fig*1 mostra una curva dello spettro di assorb? mento infrarosso di un campione dell'ami-carbonato dell' ?stamicina A pellettizzata in bromuro di potassio, La
J?ig02 mostra una curva dello spettro di assorb?mento infrarosso di un campione dell?emi--carbonato dell 'istamicina B pellettizzata in bromuro di potassio . La
Fi?03 mostra una curva dello spettro di assorbimento infrarosso di un campione dell'emi-carbonato dell'istamicina Ao pellettizzata in bromuro di potassio . La
3?:ig?4 mostra una curva dello spettro di assorbimento infrarosso di un campione dell'e mi-carbonato dell 'istamicina Bo pellettizzata in bromuro di potassio ?
L 'istamicina A e l'istamicina B della precente invenzione presentano una elevata attivit? antibatterica contro un vasta gamma di batteri gram-negativi e gram-positivi, come risulter? cM rc^'i.ato dagli spettri antibatt?rici di queste sostanze mostrati nel la Tabella 1 seguente. L 'istamicine, A e l'istamicina B impediscono fortemente la crescita di batteri gram--negativi e gram-positivi . Le concentrazioni minime inibitorie (mcg/ml) dell 'istamicina A e dell' istamicina B contro vari batteri sono state determinate in conformit? ad un metodo di diluizione in serie standard su piastre nutritive di agar che vennero incubate ad una temperatura di 37 ?C per 17 ore.
di modo che le istamicine A e B e perci? le istamicine Ao e Bo sono da considerare nuove sostanze antibiotiche.
in conformit?. ad un secondo aspetto della presen te invenzione , viene fornito un processo per la produzione del complesso istamicina antibiotico;, che com prende la coltivazione di un ceppo di Streptomyces pr?ducente istamicina sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fonti di carbonio e di azoto fino a quando una quantit? sostanziale di istamicina ? prodotta ed accumulata nel mezzo di coltura. Il processo di questo secondo aspetto dell'invenzione pu? comprendere ulteriormente la fase d? ricuperare il complesso istamicina dal mezzo di coltura. Con il termine complesso istamicina nella presente trattazione si intende una miscsla d? due, tre o quat tro delle istamicina A. B. Ao e Bo ?
In conformit? ad una realizzazione del secondo aspetto dell' invenzione? viene fornito un processo per la produzione della istamicina A che comprende la coltivazione di un ceppo di Streptomyces producente 1 ? istamicina A sotto condizioni aerobiche in un ma ', :o di contenente f OH ;i di carboni o e di azoto fino a quando 1 istamicina A viene prodotta ed accumultata da detto nel mezzo di coltura. Secondo un 'altra realizzazione del secondo aspet to dell ' invenzione , viene fornito un processo per pr? durre l ' is tamic?na B che comprende la coltivazione di un ceppo di Streptomyces producente 1 ?istamicina B sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura con tenente fonti di carbonio e di azoto fino a quando
1 ?istamicina B viene prodotta ed accumulata da detto microorganismo nel mezzo di coltura ? Secondo un'ulteriore realizzazione del secondo aspetto dell'invenzio ne, viene fornito un processo per produrre l'istamici na AqS che comprende la coltivazione di un ceppo di Streptomyces producente 1" istamicina Ao sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fon ti di carbonio e di azoto fino a quando 1 * istamicina Ao viene prodotta ed accumulata da detto microorganismo nel mezzo di coltura. Secondo un?altra realizzazione ancora del secondo aspetto dell?invenzione. viene fornito un processo per produrre 1' istamicina Bo, che comprende la coltivazione di un ceppo di Streptomyces producente 1* istamicina Bo sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fonti di carbonio e di azoto, fino a quando 1* istamicina Bo viene prodotta ed accumulata da detti microorganismi nel mezzo di colture.. Il processo secondo il secondo aspetto dell 'invenzione pu? includere la fase di ricuperare l'istamicina sia come pura istamic?na A, pura istamicina B, pura istamicina Ao, pura istamicina Bo o come prodotto grezzo di una di queste in soluzione o co_ me solido grezzo o quale miscela di almeno due di que ste istamicina A, B, A e B .
Quale esempio del ceppo producente istamic?na ? menzionato un ceppo di actinomyceti che venne isolato dagli attuali inventori da un campione di terra raccolto dal fondo del mare presso la costa della Penisola di Miura nella prefettura di Kanagawa, Giappone, nell'agosto 1978 e che ? contrassegnato quale ceppo
No. SS-939.
Questo ceppo SS-939 presenta le caratteristiche microbiologiche seguenti :
(a) morfologia microscopica
Quando il ceppo SS-939 cresce bene nel mezzo di agar, il micelio produce diramazioni monopodiali.
Ife aeree diritte o leggermente curve si sviluppano dal micelio del substrato* La ife aeree mature portano alla punta una catena di 10 a 50 spore, La forma della spora ? cilindrica ( 1 micron di larghezza x 4?5 micro di lunghezza). Non vengono osservate spirali o diramazioni a merticilloo. Sotto il microscopio elettronico, la superficie della spora ? liscia e non ha una struttura spinosa o pelosa, Non si osserva n? flagell? (flagellum ) n? sporangi ( sporangium ) , per cui il ceppo 3S~939 ? un tipico ceppo di Streptomyces.
(b) Carat teristiche di coltura su differenti mezzi di coltura .
( 1 ) Su di un mezzo di agar a1 nitrato di saccaro sio (incubato a 27 CC) : crescita debole incolore con ife aeree di colore bianco che variano gradualmente nel grigio con tendenza al verde bluastro ( 17 ec, aqua blu . secondo lo standard colori dato nel "Manuale di armonia dei colori" ("Color Harmony Manual" ) pubblica to dalla Container Corporation of America; lo stesso standard colori si impiega nel seguito, a meno che non sia indicato altrimenti) . Nessun pigmento diffusibile apprezzabile viene prodotto nel mezzo di incubazione.
{ ;2) Su di un mezzo di agar alla glicerina-aspare g?na (incubato a 27?0) : sostanzialmente lo stesso come sul mezzo di agar di nitrato di saccarosio come in dicato in ( 1 ) qui sopra, ma le ife aeree sono difficili da essere prodotte.
{ 3) Su di un mezzo di agar all ' amido (incubato a 27?0) : sostanzialmente lo stesso come sul mezzo di agar di saccarosio~nitrato come indicat in ( 1 ) c ui sopra . ma ife aeree 2 sono prodotti . L'amido alla periferia dell? crescita a di- or? fa tri paronto.
mato; sostanzialmente negative.
( 4) Formazione di pigmento melanoide: positiva su mezzo agar di tirosina e su mezzo agar di peptone--estratto di lievito-ferro ,
(d) Utilizzazione di fonti di carbonio per la crescita ( stimata in un mezzo Pridham-Gottlieb) .
Soltanto glucosio e inositolo sono utilizzabili.
Arabinosio, D-xilosio, saccarosio, rhamnosio, raffinosio e D-mannitolo non sono utilizzabili . L'utilizzazione di D-fruttos?o ? dubbia.
Riassumendo le caratteristiche menzionate sopra del ceppo SS-939, si nota che questo ceppo appartiene al genere Streptomyces ed ? caratterizzato dall 'assenza di spirali sulle ife aeree e dalla sua cromogenicit?. Sulla base delle caratteristiche menzionate sopra* il ceppo SS-939 viene confrontato con specie note di Streptomyces con riferimento alle descrizioni neII' International Streptomyces Project (ISP) e Bergey's Determinative Bacteriology. 1374? Le caratteristiche del ceppo SS-939 assomigliano per lo pi? allo Streptomyces viridochromogenes, Per?* il ceppo 33-939 differisce dal S. viridochromogenes in quanto il ceppo SS-939 non produce spirali n? mostra l'utilizzazione di xilosio, arabinosio, rhamanosio fruttosio, raffinosi o manni -tolo. Un?altra differenza distinguibile fra di essi.
( 4 ) Su di un mezzo di agar alla tirosina (incubato a 37?C) : caratteristiche di coltura sostanzialmente le stesse come sui mezzi indicati sopra in ( 1 ) e (2) sono osservate, ma viene prodotto il pigmento melanoide.
(5) Su di un mezzo di agar nutriente (incubato a 27?C) : crescita incolore sulla quale sono formate ife aeree di colore bianco. Il mezzo di incubazione ? colorato con marrone scuro ,
(6) Su mezzo di agar di estratto di l?evito-estrat; to di malto (incubato a 27?C) : crescita incolore sulla quale sono formate ife aeree. Le ife aeree sono di colore bianco e mostrano gradualmente un gr?gio con tendenza al verde bluastro { 19 dcf acqua verde). Il mezzo diventa di colore marrone scuro.
(7) Su di un mezzo di agar di farina di avena (incubato a 27?C) : crescita incolore sulla quale si formano ife aeree con colore bianco a gr?gio bluastro ( 1? ec, aqua blu } .
(o) Caratteristiche fisiologiche
( 1 ) temperatura per la crescita: crescono a
20-41 ?C.
(2) Idrolisi d? amido : 1' amido viene idrolizzato in un mezzo ag ar di amido .
( 3) Coagulazione e peptonizzazione d? latte sere ? che la superfi cie della spora prodotta dal ceppo SS-939 non. ? spinosa,, Poi , lo Streptcmyces viridifacien non presenta croniogenicit? e produce ife aeree di un colore simile a quello del ceppo SS-939? Per? si distinguono fra loro per il fatto che il ceppo SS-939 non produce n? spirali alle ife aeree n? utilizza fruttosio e saccarosio quale fonte d? carbonio per la crescita,, Inoltre non si possono trovare specie note di Streptomyces che offrano le caratteristiche dell 'utilizzazione di fonti di carbonio caratteristiche per i?, ceppo SS-939. Di conseguenza^ il ceppo SS-939 viene distinto per essere una nuova specie ed ? nominato Streptomyces tenjimariensis,
Il ceppo Streptomyces tea.jimar?ensis SS -9 39 venne depositato nel Deposito Pubblico giapponese
" Fermentation Research Institute" , Agenzia di Scienze Industriali e Tecnologia, Taukuba-gun, Prefettura di Ibaragi j, Giappone, sotto il numero d? deposito PEHM-P 4932 il e fino dal 21 aprile 1979 e venne depositato anche nella American Type Culture Collection, Washington ?.* D . C . U , S . A ? > sotto il numero AfCC 31603* la mutazione di actinomycetes avviene frequentemente, sia in condizioni artificiali che spontanee.
In conformit?, la presente invenzione include l 'uso del ceppo SS-933 come pure le sue varianti e prodotti di mutazione, finch? questi producono istamic?na.
I' istamic?na pu? essere ottenuta tramite coltivazione aerobica di spore o miceli di un ceppo producente istamic?na di Streptomyces , per esempio Streptomyces tenjimariens?s ceppo SS -9 39 (identico al FERH-P 4932 o ATCC N?31603) t Nell' eseguire il processo del secondo aspetto della presente invenzione, perci?, una certa quantit? di spore o miceli d? un ceppo producente istamic?na viene inoculata ad un mezzo di coltura adetto, che a tale scopo comprende fonti nutritive assimilabili dal ceppo e viene poi incubata sotto condizioni aerobiche fino a quando viene ottenuto un bro do di coltura contenente istamicina, cio? almeno una delle istam?cina A* B. A e B . Generalmente- costi -tuenti nutritivi del mezzo di coltura comunemente impiegato per la coltivazione di actinomiceti comuni, possono essere usati per lo scopo della presente invenzione- Per esempio, farina di scia commercialmente disponibile, polvere di arachidi o noccioline americane, farina di semi di cotone, lievito essiccato, peptone, estratto di carne, caseina, liquido di maceraz?o ne di grano* nitrato di sodio, solfato di ammonio e simili possono essere utili quale fonti di azoto- Carboidrati commercialmente disponibili come glucosio, amido, glicerina, maltosio, destrina, saccarosio, lattosio e simili come pure olio di semi di soia e grassi sono utili come fonti d? carbonio. Addizionalmente sali inorganici come cloruro ai sodio, carbonato di calcio , solfato di magnesio, cloruro di manganese e fosfati come pure diversi amino-acidi possono essere utilizzati ? nel mezzo di coltura, se necessario, fatti ? materiali nutritivi che si conoscono per la coltivazione di actinomiceti possono essere usati nel pro cesso della presente invenzione, fintanto che siano assimilabili dal ceppo producente istamicina per la produzione di istamic?na
Per la produzione di istamicina su grande scala* s? preferisce la coltivazione liquida. Qualunque temperatura alla Quale il ceppo producente istamicina pu? crescere e produrre istamicina pu? essere utiliz sata per la coltivazione* ma una temperatura preferita si trova nell ?ambito fra 25 ? e 30?C. La coltivazione pu? abitualmente essere continuata per un periodo di tempo sufficiente per produrre ed accumulare una quantit? sufficente di istamicina nel mezzo di coltura. La coltivazione pu? abitualmente essere effettuata per 2 a 7 giorni .
L 'anali si dell 'istamicina A e dell' istamicina B pu? essere effettuata usando il Bacillus subtilis PCI 219 quale organismo di prova secondo un. metodo ceppo producente 1 ? istamic?na. Le istamic?na A e B come pure X ' istamic?na A o e l ' istamic?na Bo in soluzione in acqua sono praticamente non estraibili tramite un solventi organico quale butanolo? butil-acetato, cloroformio od altri solventi organici non miscelab?li in acqua? di modo che questi solventi organici possono essere utilizzati per l'asportazione di impurit? dal brodo di coltura tramite estrazione , se necessario. Per il ricupero del complesso dell "istamicina dal brodo di coltura o da una soluzione acquosa di istamic?na il brodo di coltura o la soluzione acquosa possono essere trattati con vari mezzi di assorbimento per separare 1 * istamic?na da essi tramite assorbimento. Quando viene utilizzato carbone attivato quale assorbente, 1 ?istamicina assorbita dal carbone pu? essere estratta tramite trattamento con acqua leggermente acidificata? metanolo acquoso leggermente acidificato? propanolo acquoso leggermente acidificato* acetone acquoso leggermente acidificato e simili .
Le istamicine , data la loro basicit?* possono es sere efficacemente assorbite da rosine a scambio cuti onico dalle quali l'istaoi?cina pu? essere poi eluita con un solvente adatto. L 'assorbimento su di una resina a scambio cationico ? un modo molto adatto per il ricupero dall *istamicina da un grande volume di brodo di coltura.. Lo scambiatore di cationi di sponibili per questo scopo pu? essere una resina di scambio cationico comportante unzioni carbossiliche come la Amberlite 110-50 & l ' Amberlita Ct?-?Q 'un. prodotto del. la Robin & Zaa3 Co, , USA) , Levia ti t CUP (un prodotto della Bayer Co, , Repf Ped , Ted* ) ., CM -Sephadex (un prodotto della Pharmacia Co. , Svezia) nella loro forma H, forma. Na o nella forma od una miscela di queste forme. L'istamicina che ? stata assorbita dallo scambiatore cationico pu? essere eluita efficacemente da esso trattando con acqua acidificata, ammoniaca acquosa diluita o una soluzione acquosa di un sale inorganico. Per 1 eluizione a questo scopo, acido cloridrico da 0,2N fino ad IN a ammoniaca acquosa da 0,2N fino ad 1N possono essere riatti . Poich? la ista micina A e la istamicina B come pure la istamicina A o e la istamicina non sono praticamente assorbibili da una resine a scambio anionico, la resina a scambio anionico pu? essere impiegata adeguatamente per neutralizzare una soluzione acquosa acida di istamicina o per asportare impurit? acide dalla soluzione di ista micina.
.Per ottenere 1 "istamicina , l ' istamicina B, l 'istamicina A o a 1?istamicina o separatamente dal complesso istamicina ricuperato in questo modo, il complesso dellistamicina viene assoggettato ad una cromatografia in colonna su gel di silice, sviluppata con la fase inferiore dei solventi miscelati composti di cloroformio-metanolo-ammoniaca acquosa al 177? (2:1:1 in volume) o di alcuni solventi miscelati analoghi* utilizzando le caratteristiche delle istamici. ne che l'istamicina A d? una macchia singola a Rf 0,17? 1 *istamicina B d? una macchia singola a Rf 0,11* l?istamic?na Ao d? una macchia singola a Rf 0,36 e l'ista micina Bo d? una macchia singola a Rf 0,14- in una cromatografia a strato sottile su gel di silice sviluppata con la fase inferiore dei solventi miscelati com posti di cloroform io-metanolo-ammoniaca acquosa al 17% di modo che esse sono separabili l?uria dall'altra. Per separare 1 "istamicina A dall ?istamicina B, una miscela delle istamicine A e B pu? essere sottoposta ad un isolamento cromatografico in una colonna di cellulosa sviluppata con solventi miscelati composti d? n-butanolo-piridina? acido acetico-acqua (6: 4:2:4 in volume) o con alcuni solventi analoghi miscelati* utilizzando le caratteristiche delle istamicine A e B c cio? che l'istamicina A d? una macchia singola a F.f 0.22 mentre 1'istamicina B d? una macchia singola a Rf 0.25 in una cromatografia a strato sottile di cellulosa sviluppata, con solventi miscelati composti di n-butanolo- piridina- acido acetico-acqua ( 6; l: 2 : j) . Questi procedimenti per l'isolamento cromatografico possono essere utilizzati per il recupero delle istamicine come pure per la purificazione delistamicina isolata? Le istamic?ne A, B? A o B pos sono essere isolate in uno stato purificato utilizzando i metodi di estrazione ed i metodi di isolamento cromatografico menzionati sopra sia da soli oppure in maniera ripetuta od in una combinazione adatta? Per il ricupero del complesso di istamicina e per l'isolamento e la purificazione di ogni istamicina, la seguente procedura vi ene preferita. Il brodo di coltura del ceppo producente istamicina viene regolato a pH 2 , 0 tramite addizione di acido cloridrl co e poi filtrato per dare il filtrato del brodo che viene susseguentemente passato in una colonna di resina a scambio cationico come Aimberlite IRC-50 ( ciclo NH^ ) per effettuare l'assorbimento dell 'istamicina dalla res?na. La resina viene lavata con acqua e poi eluita con ammoniaca acquosa 1 % ? Le frazioni attive dell ' eluato vengono raccolta insieme e concentrate sotto pressione ri dotta, par dure una soluzione concentrata che viene susseguentemente fatta passare attraverso una colonna di una resina a scambio cationa--catione come Amberlite CG- 50, per effettuare l ?assorbimento dell'istamicina tramite la resina. Questa resina viene lavata con acqua e poi con ammoniaca acquosa 0,2N e susseguentemente eluita con ammoniaca acquosa 0, 4N.
Piu frazioni attive contenenti una quan tit? sostanziale dell 'istamicina B, viene combinata insieme e concentrata in vuoto fino ad essiccazione per dare una polvere grezza di istamicina B. Questa polvere grezza viene ripetutamente assoggettata alla cromatografia in colonna su gel di silice , per dare una polvere incolore di istamicina B purificata? Pi? frazioni attive contenenti una quantit? sostanziale dell ?istamicina A, come pure alcune quantit? delle istamicine A e B vengono combinate insieme e concentrate in vuoto fino ad essiccazione per dare una polvere grezza comprendente le istamicine A, Ao o Bo. Questa polvere grezza viene poi assoggettata alla cromatografia in colonna su gel di silice sviluppata con la fase inferiore dei solventi miscelati com posti di cloroformio -metanolo-ammoniaca acquosa al-1 '8,5% { 2 ; 1 ; 1 in volume) .
Tali frazioni attive dell ' eluato, che contengono solamente istamicina A * vengono combinato insieme e concentrate in vuot e la souzione concentrata viene fatta passare attraverso una colonna di una resina per scambio cationico come Amberlite CG-50 ( ciclo NH4) , seguita dall ' eluizione della resina con ammoniaca acquosa Q,5N. Le frazioni attive cosi e luite contenenti solamente 1 'istamicina Ao vengono combinate insieme e concentrate in vuoto fino ad essiccazione per dare una polvere cristallina incolore di istamicina A o pura,
Le frazioni attive dell' eluato dalla cromatografia in colonna su gel di silice menzionata sopra ? che contengono l 'istamicina A, vengono combinate insieme e concentrate in vuoto . La soluzione concentrata cos? ottenuta viene nuovamente assoggettata ad una cromatografia in colonna su gel di silice e le frazioni attive contenenti solamente l' istamicina A vengono combinate insieme e concentrate fino ad essiccazione per dare una polvere incolore di istamicina purifica ta A0 Le frazi oni attive dell'eluato dalla cromatogra fia in colonna su gel di silice menzionata sopra, che contengono solamente l ?istamicina Bo vengono combinate insieme e concentrate in vuoto , e la soluzione concentrata risultante viene assoggettata ad una cromatografia in colonna su di una resina a scambio cationi co come Amberlite CG-50 ( ciclo NH4) sviluppata con ammoniaca acquosa a 0,5N. Tali frazioni attive dell' eluato contenenti solamente istamicina Bo vengono combinate insieme e concentrate in vuoto fino ad es siccazione, per dare una polvere cristallina incolore dell 'istamicina Bo purificata.
Dagli studi strutturali delle istamicine A, B, Ao e Bo si rileva che l'istamicina A ? un derivato de-glicile dell 'istamicina A e che l 'istamicina Bo ? un derivato de-glicile dell 'istamicina B ( si confrontino le formule (I) e (II) con le formule (III ) , (IV) , (V) di cui sopra) . Perci? l 'istamicina Ao e l'istami- . cina Bo della presente invenzione possono essere convertite in istamicina A ed istamicina ?, rispettivamente, condensando in modo noto una molecola di glicina o glicocol con il gruppo imino presente nel grup po metilamino alla posizione 4 dell 'istamicina Ao o dell 'istamicina Bo? Questa conversione ? valida perch? l'istamicina A e l 'istamicina B presentano una at tivit? antibatterica pi? elevata e sono agenti chemoterapeutic? molto pi? utili dell 'istamicina Ao e del-1 'istamicina Bo .
Inoltre ? stato trovato che l?istamicina Ao e l 'istamicina Bo possono essere prodotte tramite l*idro lizzaz?one dell 'istamicina A e l'istamicina B, rispetivamente, sotto condizioni alcaline. Secondo un terzo aspetto della presente invenzione, perci?, viene fornito un processo per produrre istamicina Ao dalla istamicina A o istamicina B dall 'istamicina B. che comprende l'idrolizzazione dell 'istamicina A o della istamicina B in soluzione acquosa sotto condizioni alcaline per produrre istamicina A o istamicina B o l'idrolisi alcalina dell 'istamicina A o dell?istamicina B, secondo il processo del terzo aspetto dell *in venzione, pu? essere effettuata tramite riscaldamento ad una temperatura di 50-1 10?C di una soluzione di istamicina A o di istamicina B in presenza di un sleale. come un metallo alcalino o un idrossido o carbonato di un metallo alcalino-terroso, per esempio idros sido di sodio, idrossido d? potassio e idrossido di bario e simili ? L'alcale, come un idrossido di metallo alcalino, pu? essere presente in una concentrazione d? 0,1 a 4M. L'idrolisi pu? essere completata in 1-3 ore. Ad esempio l'idrolisi dell 'istamicina A o dell 'istamicina B pu? prefer?bilmente essere ottenuta tramite riscaldamento di essa in acqua contenente 4M di idrossido di sodio a 100?C per 1 ora od in acqua contenente ?,5M di idrossido di bario a 100?C per 3 ore. Sotto queste condizioni d? reazione, i collegamenti glicos?dici dell 'istamicina A o dell ?istaimicina non si rompono. L'idrolisi alcalina pu? essere effettuata anche in un brodo d? coltura od in un filtrato di brodo contenente anche istamicina A od ista micina B
L ?istamicina A e l'istamicina B della presente invenzione presentano un' elevata attivit? antibatterica e ridotta tossicit? per gli animali * Perci? le istamicine A e B sono utili in modo simile agli antibiotici noti quale agente antibatterico? e possono essere formulate in forme farmaceutiche. note e somministrate nella stessa maniera come gli agenti antibiotici antibatterici noti ? Secondo un ulteriore aspet to della presente invenzione? perci?? viene fornita una composizione farmaceutica comprendente una sicura ed efficace quantit? antibatterica di almeno una fra istamicina A, istamicina B e sale di esse per aggiunta di acido, in combinazione con un veicolo farmaceuticamente accettabile ? Secondo un altro aspetto della presente invenzione, viene fornito un metodo per inibire la crescita batterica? che comprende la somministrazione di una efficace quantit? antibatterica di almeno una fra istamicina A, istamicina B e sali di esse per aggiunta di acidi ad un animale suscettibile alla crescita batterica? Sar? chiaro che le quan tit? effettive preferite dell 'istamicina usata varieranno secondo la particolare composizione formulata? il modo di applicazione, il particolare situs e l' organismo che viene trattato? Molti fattori che modificano l 'azione dei farmaco verranno presi in considerazione dagli esperti , per esempio l ' et?, il peso cor pareo, il sesso, la dieta, il tempo di somministrazio ne, la velocit? di escrezione, le combinazioni d? medicinali , la sensibilit? di reazione e la gravit? del la malattia. I ritmi d? applicazione ottimali per una data serie di condizioni possono essere accertati dagli esperti usando prove di determinazione di dosaggio convenzionali in vista dei criteri di massima indicati sopra.
Come indicato sopra, lo Streptomyces tenjimariensis SS-939 ( FEHL?-P 4932 ? ATCC numero 31 603) ? un nuovo microorganismo utile per produrre i nuovi antibiotici , istamicine, e presentante le caratteristiche microbiologiche descritte sopra. Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, viene fornito quale nuovo ed utile microorganismo Streptomyces tenjimariensis SS-939 isolato in uno stato sostanzialmente puro e depositato quale FEFM -P 4932 o ATCC numero 31603 e presentante le caratteristiche che esso produce ife aeree di colore bianco variante gradualmente verso il grigio con tendenza al verde bluastro, che le ife aeree non producono spirali ,, che la superficie delle spore ? liscia, e che il ceppo mostra cromogenicita, utilizza glucosio e anositolo ma non utilizza arabinosio, D-xi losio, saccarosio, ramnosio, raffinosio e D-mannitolo quale fonte di carbonio ed ? capace di produrre le istamicine A, B, Ao e Bo. Questo ceppo SS-939 venne isolato tramite incubazione di un campione di terra raccolto dal fondo del mare alla costa della penisola di Miura nella prefettura di Kanagawa, Giappone, su di un mezzo d? coltura MY comprendente 1% di maltosio 0,4% di estratto di lievito, 1 , 5% di agar (pH 7,2) con. 1 ?addizione di 10 mcg/ml di kanamicina A. L'isolamento venne effettuato dopo l ?incubazione del mezzo di agar menzionato sopra a 27?C per 3 giorni e raccogliendo miceli e spore di una colonia che erano stati prodotti su detto mezzo MY? Detti miceli e spore vennero inoculati a piastre di mezzi di coltura Pridham-Gotlieb (mezzi di prova per 1' estimazione dell 'assimilabilit? di vari carboidrati) ciascuna contenente 1% di glucosio, xilosio, arabinosio, ramnosio, raffinosio o inositolo. Pu? essere ottenuto un ceppo di sctinomyceti come S. tenjimariensis che ? cresciuto nel mezzo Pridham-Gotlieb contenente inositolo pre sentante assimilabilit? di inositolo.
Si ritiene che usando le descrizioni precedenti e senza ulteriore elaborazioni un esperto possa utilizzare il cene etto della presente invenzione per l 'intera estensione di esso. Le seguenti realizzazioni specifiche preferite cio? i seguenti esempi dovran no perci? essere consideraci puramente illustrativi 9 non limitativi in nessun modo del resto dell'invenzione,
Esempio 1
Una coltura in agar inclinata d? Streptomycea tenjimariensis 3S-939 (FERM~P 49321 identificata qua~ le ATCG numero 31603) venne Inoculata in un mezzo ?i coltura liquido (110 ml , posto in ciascun matracci? Erlenmeyer di una capacit? di 500 ml) comprendente 1,0% d? amido, 0,2% di glucosio, 1,0% di farina di soia, 0,3% di cloruro di sodio, 0,1% d? bipotassio idrogeno-fosfato e 0,1% di solfato di magnesio (7 i2C), da cui ha fatto seguito una coltivazione sotto rotazione ed agitazione a 27?C per 43 ore per dare una coltura di seme. La risultante coltura di seme (220 ml) venne inoculata in un fermentatore a vaso ?i 30 litri contenente 15 litri d? un mezzo ?i coltura liquido il produzione comprendente 2,0% di amido, 0,2% di glucosio, 2,0% di farina d? soia. 0,3,- di cloruro di solio, 0.1% di bipotassic idrogeno-fosfato e 0,1% di solfato di magnesio (7 H2O)< L? fermentazione venne effettuata a 27?C per 72 ore sotto aereazione (15 I di aria per minuto) ed agitazione (300 giri/min,)?
I volumi del brodo di coltura raccolti dai se' fermentatori a vaso vennero combinati insieme , regolati ad un pH di 2 ,0 tramite aggiunta di acido cloridrico e poi filtrati per dare 90 1 del filtrato di brodo (capacit? 2 , 5 mcg/ml) . II filtrato di brodo venne fatto passare attraverso una colonna di 12 1 di Amberlite IRC-50 (forma NH4) (un prodotto di Rohm & Haas Co. , USA) per l'assorbimento dell 'istamicina dalla resina. La resina venne lavata con 24 1 di acqua e poi eluita con ammoniaca acquosa 1N? Le frazioni attive dell? eluato vennero combinate insieme ( 3 1) e concentrate in vuoto fino ad essiccazione per dare 3,51 g di una polvere grezza ( capacit? 61 mcg/mg) .
Questa polvere grezza venne sciolta in 100 ml di acqua e la soluzione risultante venne passata attraverso una colonna ( 40 mm di diametro) di 300 ml di una resina a scambio anionico, Dowex 1-X4 (foma OH) (un prodotto della Dow Chemical Co* USA) , seguito da uno sviluppo della colonna con acqua. I primi passaggi (200 ml) dell ' effluente dalla colonna vennero scar tati ma i passaggi seguenti (880 ml) dell 'effluente vennero raccolti e fatti passare in una colonna (25 mm di diametro) di 150 mi di Amberlite CG-50 (forma NH4) per l'assorbimento dell'istamicina. Questa colonna di resina per lo scambio cationico venne lavata con acqua ( 300 ml) e susseguentemente eluita con 900 ml di ammoniaca acquosa 0,2N e poi con 900 ml di ammoniaca, acquosa 0,4N. L'eluato vanne raccolto in frazioni di 16 ml. Lo frazioni attive No. 66-80 vennero combinate insiema e concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare 210 mg di una polvere bianca (capacit? 460 mcg/mg) comprendente le istainicine A e B, Le frazioni No* 28-65 vennero elaborate in maniera similare per dare una polvere grezza, comprendente alcuni antibiotici non identificati diversi dalle istamicine A. B, A e B .
Esempio 2
Il filtrato di brodo (150 litri, raccolti da 10 fermentatori a vaso) che ? stato ottenuto tramite fer mentazione di Streptomyces tenjimariensis nello stesso modo come nell'esempio 1,venne fatto passare attraverso una colonna di 20 1 di Amberlite IRC-50 (forma NH4) per l'assorbimento dell'istamicina. Dopo il lavaggio con acqua (40 1) la colonna venne eluita con ammoniaca acquosa IN e le frazioni attive dell'eluato vennero combinate insieme e concentrate ad essic cazione sotto pressione ridotta per dare 4,1 g di una polvere grezza (capacit? 240 mcg/mg).
Questa polvere grezza venne sciolta in 20 ml di acqua, e la soluzione acquosa ottenuta venne posta in una colonna (30 mm di diametro) di 200 ml di Dowex 1 -X4 (forma OH) , a cui ha fatto seguito lo sviluppo della colonna con acqua* I primi passaggi ( 270 ml) de 1' effluente vennero scartati , ed i passaggi susseguen ti (270 ml) vennero raccolti e poi fatti passare attraverso una colonna (25 mm di diametro) di 150 ml di Amberlite CG-50 ( forma NH4) per l'assorbimento del 1 'istamicina. La colonna di resina venne lavata con 150 ml di acqua e poi eluita con 900 al di ammoniaca acquosa 0,2N e con 900 ml di ammon?aca acquosa 0, 4-N. L'eluato venne raccolto in frazioni di 18 ml. Le frazioni No . 55-90 vennero combinate insieme e concentra te fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare 980 mg di una polvere bianca ( capacit? 940 meg/m comprendente le istamicine A e B.
Esempio 3
La polvere bianca (980 mg, capacit? 940 mcg/mg) comprendente le istamicine A e B ottenuta nell' esempio 2 ascondo quanto descritto sopra venne ripresa in 15 ml d? una miscela di n-butanolo-piridina-acido acetico -acqua ( 6: 4:2 ; 2 in volume) , e la soluzione risultante venne posta in una colonna ( 25 mm di diametro) di 60 g di polvere di cellulosa (Avicel, un prodotto della Funalroshi Yakulin Oo. ' per 1 ' assorbimento dell ?istamicina. La colonna d? cellulosa venne sviluppata dapprima con 1200 ml dai solventi miscelati di n~butanolo~piridina-acido acetico-acqua (6:4:2:2 in volume) e susseguentemente con 600 ml dei solventi mi acelati di n-butanolo-piridina,-acido acetico-acqua (6:4:2: 4 in volume),, L'eluato venne raccolto in frazioni di 10 mi. Le frazioni Not.45-74 comprendevano la istamicina B solamente? le frazioni No. 114-154 compren devano l'istamicina A solamente e le frazioni No.75--113 comprendevano le istamicine A e B in miscela.
Le frazioni No. 45-74 menzionate sopra vennero combinate insieme e concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare una polvere che ven~ ne poi sciolta in 5 ml di acqua. La soluzione acquosa dell ?istamicina B cos? ottenuta venne fatta passare in una colonna di 25 mi di Amberlite GG-50 (forma NH4) per l'assorbimento dell'istamicina B. Dopo aver lavato con 25 mi di acqua, la colonna ?i resina venne eluita con ammoniaca acquosa 0S4H,. Le frazioni attive (in totale 40 mi) dell'eluato vennero concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare 1523 mg di una polvere di istamicina B pura (capacit? 317C mcg/mg).
Le frazioni No. 114-154 menzionate sopra vennero combinate insieme e concentrate /ino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare una polvere che venne poi sciolta in 5 ml di acqua La soluzione dell'istamicina A in acqua cos? ottenuta venne fatta passare attraverso una colonna di 25 ml di Amberlite CG-50 (forma NH4) per l'assorbimento dell'istamicina A. Dopo il lavaggio con 25 ml di acqua, la colonna venne eluita con ammoniaca acquosa 0,411. Le frazioni attive (in totale 45 ml) dell'eluato vennero concentrate fino ad essiccasione sotto pressione ridotta per dare 50 mg di una polvere di istamicina A pura (capacit? 1000 meg/mg).
Esempio 4
Una coltura in agar inclinata di Strcptomyces tanjimariensis SS-939 (EERM-P 4932, identificato con il numero ATCG 31603) venne inoculata in un mezzo di coltura liquido (110 ml, posto in ciascun matraccio di Erlenmeyer di capacit? di 500 ml) comprendente 1,0% di amido, 0,2% di glucosio,. 1,0% di farina di soia, 0,3% di cloruro di sodio, 0,1% di bipotassio idrogeno-f osfato e 0,1% di solfato di magnesio (7 ?2O). La coltivazione venne effettuata a 27?C per 48 ore agitando e facendo ruotare per dare una coltura di seme . Questa coltura di seme (220 al) venne inoculata in fermentatori a vaso di 30 1 ciascuno contenenti 15 I di un mezzo di coltura di produzione liquido comprendente 2,0% di amido , 0,2% di glucosio, 2,0% di farina di soia, 0,2% di palmitato di sodio, 0,3% di cloruro di sodio, 0, 1% d? bipotassio idrogeno-fosfato e 0 , 1% di solfato di magnesio (7 H2O) . La fermentazione venne condotta a 27 ?C per 72 ore sotto aerea zione ( 15 1 di aria per minuto) ed agitazione ( 300 giri/min. ) .
Il brodo di coltura cos? proodotto venne raccolto da dieci fermentatori a vaso * regolato a pH 2 ,0 tramite addizione di acido cloridrico e poi filtrato per dare 150 l del filtrato di brodo (capacit? 6 mcg/mg) ? Questo filtrato d? brodo venne fatto passare attraver so una colonna di 12 1 di Amberlite IRC-50 (forma NH 4 ) per 1 'assorbimento dell 'istamicina? Dopo il lavaggio con 24 1 di acqua, la colonna di resina venne elu?ta con ammoniaca acquosa 1N. Le frazioni attive (in totale 5 ,6 I) dell' eluato vennero combinate insieme e concentrate sotto pressione ridotta? La soluzione con centrata risultante venne posta in una colonna di 2G0 ml d? Amberlite CG-50 (forma NH^} per l' assorbimento dell ' istamicina? Dopo lavaggio con 200 ml di acqua, la colonna di resina venne lavata con 1200 ml di ammon?aca acquosa 0S2H e poi eluita con 1200 ml di ammoniaca acquosa 0,4N. L? eluato venne raccolto in frazioni d? 18 ml.
Le frazioni Ho? 80-106 vennero combinate insieme e concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare 240 mg di una polvere grezza di ista micina B ( capacit? 380 meg/mg) ? Questa polvere grezza venne assoggettata ripetutamente a cromatografia in colonna su gel di silice sviluppata con la fase inferiore di una miscela di cloroformio-metanolo-ammoniaca acquosa all 8,5% (2: 1 : 1 ) fino a quando si ottenne una polvere purificata bianca di istamicina B di una capacit? di 1350 meg/mg. Resa 25 mg.
Le frazioni Not 107-124 combinate insieme vennero concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare 380 mg di una polvere grezza ( capacit? 180 meg/rng) comprendente le istamicina A, Ao e Bo. Que sta polvere grezza venne assoggettata a cromatografia in colonna usando una colonna di 38 S di gel di silice ( 60, un prodotto della E. Merck Go? s Rep* Red* Ted. ) e sviluppata con la fase inferiore dei solventi misce lati di cloroformio -metanolo -ammoniaca acquosa alli'8,5% ( 2: 1 : 1 in volume) . L ' eluato della colonna di gel di silice venne raccolto in frazioni di 5 ml.
Le frazioni Ilo. 54-61 combinate insieme vennero concentrate sotto pressione ridotta e poi poste in una colonna di 3 ml di Amberlite CG-50 (forma HH4) per 1 ' assorbimento dell' istamicina Ao . La colonna di Amberlite venne eluita con ammoniaca acquosa 0,5K e le fra zioni attive dell ' effluente vennero concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare una polvere cristallina incolore di istamicina A pura (capacit? 5 racg/mg). Resa 25 mg,
Le frazioni Kor 65-76 combinate insieme vennero concentrate sotto pressione ridotta e poi assoggettate a cromatografia in colonna usando una colonna di 10 g di gel di silice e sviluppate con la fase inferiore dei solventi miscelati cloroformio-metanolo~am moniaca acquosa all'8,5% (2;1s1J per la purificazione dell'istamicina A. In questo modo una polvere incolore di istamicina A pura (capacit? 1000 meg/mg) venne ottenuta con.una resa di 23 mg-Le frazioni No, 77-90 combinate insieme vennero concentrate sotto pressione ridotta e poi fatte passare in una colonna di 3 ml di Amberlite GG-50 (forma NH4) per 1'assorbimento dell'istamicina B o Questa colonna venne eluita con ammoniaca acquosa 095H e le frazioni attive dell eluato vennero concen trate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare una polvere incolore cristallina di istamicina pura (capacit? 10 meg/mg). Resa 18 mg.
Esempio 5
Questo esempio e gli esempi seguenti illustra no la produzione dell'istamicina Ao o Bo dall'istamicine A o dall'istamicina B tramite idrolisi alca lina
Una soluzione di 20 mg d? istamicina A in 2 al di acqua venne miscelata con 300 mg di idrossido di bario (Bai OF^oSH^O) . La miscela venne riscaldata a 100?C per 3 ore in un tubo reso ermetico per effettuare l?idrolisi alcalina dell ? istamicina A. La miscela di reazione venne neutralizzata tramite addizione di anidride carbonica solidificata e poi filtrata. La soluzione del filtrato venne fatta passare attraverso una colonna di 3 ml di Amberlite CG-50 (forma ???) * e la colonna venne eluita con ammoniaca acquosa 095No Le frazioni attive dell' eluato vennero concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare 16 mg d? una polvere cristallina incolore di istamicina A o pura,
Listasicina B ( 20 mg) venne assoggettata ad idrolisi alcalina nella stessa maniera come indicato poco prima sopra. Una polvere cristallina incolore di istamicina pura venne ottenuta con una resa di 15 mg.
Esempio 6
Una coltura, di agar inclinata di Streptomyces tenjimariensis 33-939 (FiSIffil-P 4932) venne inoculata in un mezzo di coltura liquide { % 1) comprendente 1 ,0% d? amido, 0, 2% di glucosio* 1 , 0% di farina di soia 0.3% di cloruro di sodio, 0.1% di bipotassio idrogeno-fosfato e 0,1/ di solfato d? magnesio (7 HgO) (pH 7,0) posto in un serbatoio di fermentazione d? una capacit? di 100 1 di acciaio inossidabile. La fer ontazione venne effettuata t, 28?C per 24 ore sot to aereazione (50 1 di aria per minuto) ed agitazione (200 giri/min. ) per produrre una coltura di seme. Una porzione (20 1) della coltura di seme risultante venne inoculata in un serbatoio di fermentazione di acciaio inossidabile con una capacit? di 2 tonnellate contenente 1000 1 di un mezzo di coltura liquido comprendente 4,0/ di amido, 0,4/ di glucosio, 5,0/ di germi di grano, 0,6/ di carbonato di calcio e 0,3/ di cloruro di sodio (pH 7?0), a cui ha fatto seguito la fermentazione a 28?C per 108 ore sotto aereasione (800 1 di aria per minuto) ed agitazione (280 giri/min. ).
Il brodo di fermentazione (pH 7,3) cos? ottenuto venne regolato a pH 2,0 tramite addizione d? acido cloridrico e poi filtrato? Il filtrato venne neutralizzato tramite l'addizione di idrossido di sodio acquoso per dare 850 1 di un filtrato di brodo (pH 6,2, capacit? 05 meg/ml)? Questo filtrato li brodo venne fatto passare in una colonna d? 55 1 di amberlite IR0-50 (forma ) per l'assorbimento dell "istamicina. Dopo lavaggio con 300 l di acqua, la colonna venne eluita con ammoniaca acquosa 1 , 1 N. primi passaggi ( 33 1) dell' effluente vennero scartati ed i passaggi susseguenti ( 188 1) vennero raccolti e poi concentrati ad un volume di 2, 8 1 sotto press?o ne ridotta
La soluzione concentrata cos? ottenuta venne miscelata con 475 , 2 g di idrossido di bario (Ba(OH)g0 ??^?) a cui ha fatto seguito un riscalda mento a 110?C per 3 ore sotto riflusso per effettuare l 'idrolisi alcalina delle istamicina A e B.
La miscela di reazione venne neutralizzata (a pH 7 ,2) tramite addizione di I960 ml di acido solforico 2H e poi filtrata. Il filtrato venne fatto passare at traverso una colonna di 15 I di Amberlite CG?50 (forma NH4) per in assorbimento dell' istamicina ? Dopo lavaggio con 45 1 di acqua, la colonna venne eluita successivamente con volumi di soluzioni acquose di ammoniaca in varie concentrazioni come indicate sotto,, mentre l 'eluato venne raccolto in frazioni di 3 1.
Le frazioni No* 82-1 04 vennero combinate insieme e concentrata fino ad essiccazione sotto pressione ri dotta per dare 38,05 g di una polvere grezza comprendente 1? istamicina A . Le frazioni No? 105 -1 34 vennero raccolte insieme e concentrate fino ad essiccazione sotto pressione ridotta per dare 19 , 19 g di una polvere grezza comprendente istamicina
Esempio 7
La polvere grezza dell ' istamicina A (2 *0 g) ottenuta nell ' esempio 6 venne purificata assoggettandola ad una cromatografia in colonna usando una colonna di 180 g di gel di silice e sviluppata con la fase inferiore dei solventi miscela ;i di cloroformio~me tanolo - amamoniaca acquosa all' 8,5/ ( 2 ; 1 ; 1 i n volume ) t mentre 1 ? eluato vne raccolto in fr zioni di 25 ml.
Le frazioni attive No , 65-12*? combinate insieme ven
Claims (19)
- RIVENDICAZIONI1 , Il nuovo composto, istamicina, che ? scelto fra istamicina A della formula:istamicina B della formula:istamicina Ao della formulaoppure della formula:e istamicina B della formula:ed un sale di queste per aggiunta di acido.
- 2. Il composto della rivendicazione 1 , che ? ista micina A od un sale di essa per aggiunta di acido
- 3. Il composto della rivendicazione 18 che ? ista micina B od un sale di essa per aggiunta di acido.
- 4. Il composto della rivendicazione 1 che ? ista micina A od un sale di essa per aggiunta di acido.
- Q
- 5, II composto della rivendicazione 1 che ? ista micina Bo od un sale di essa per aggiunta di acido 6. Il processo per la produzione dell'antibiotico costituito dal complesso di istamicina, che compren de la coltivazione di un ceppo producente Istamicina di Streptomyces sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fonti di carbonio e di azoto fino a quando una quantit? sostanziale di istamicina ? prodotta ad accumulata nel mezzo di coltura.
- 7* Il processo della rivendicazione 6, che comprende inoltre una fase di ricupero del complesso di istamicina dal mezzo di coltura?
- 8. Il processo della rivendicazione 69 nel quale come ceppo producente istamicina viene usato Streptomyees tenjimariensis SS-935 identificato quale PERM-P 4932 o ATCC numero 31603,,
- 9 Il processo per produrre istamicina A che comprende la coltivazione di un ceppo producente istamicina A di Streptomyces sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fonti di carbonio ed azoto, fino a quando una quantit? sostanziale di istam?cina A ? prodotta ed accumulata nel mezzo di coltura.
- 10. Il processo per produrre istamicina 3 che com prende la coltivazione di un ceppo di Streptomyces producente istamicina B sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fonti d? carbonio e di azoto , fino a quando una quantit? sostanziale di ista micina B ? prodotta ed accumulata nel mezzo di coltura.
- 11 o II processo per produrre istamicina Ao che comprende la coltivazione di un ceppo di Streptomyces producente istamicina Ao sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fonti di carbonio e di azoto, fino a quando una quantit? sostanziale di istamicina Ao ? prodotta ed accumulata nel mezzo di coltura.
- 12. Il processo per produrre istamicina Bo che comprende la coltivazione di un ceppo d? Streptomyces producente istamicina Bo sotto condizioni aerobiche in un mezzo di coltura contenente fonti d? carbonio e d? azoto , fino a quando una quantit? sostanziale di istamicina Bo ? prodotta ed accumulata nel mezzo di coltura.
- 13. Il processo della rivendicazione 9, 10, 1 1 o 1 2* nel quale viene coltivato Streptomyces tenjimariensis SS-939.
- 14 Il processo della rivendicazione 9, 10, 11 o 12, nel quale ? inoltre inclusa uria fase di isolamento di istamicina A, istam?cina B, istamicina A o istamicina B .
- 15 * Il processo per produrre istam?cina Ao da istam?cina A, che comprende l 'idrolizzazione dell'-stamicina A sotto condizioni alcaline .
- 16* Il processo per produrre istam?cina Bo dall" istam?cina che comprende la idrolizzazione dell' istamicina B sotto condizioni alcaline.
- 17* Una composizione farmaceutica comprendente una sicura ed efficace quantit? antibatterica di almeno una fra istamicina A, istam?cina B e sali per aggiunta di acidi farmaceuticamente accettabili d? esse, in combinazione con un veicolo farmaceuticamente accettabile.
- 18. Un metodo per inibire la crescita batterica. che comprende la somministrazione di una quantit? anti battericamente efficace di almeno una fra istamicina A, istam?cina B e sali per aggiunta di acido farmaceuticamente accettabili di esse ad un animale suscettibile alla crescita batterica.
- 19 Il nuovo microorganismo, Streptomyc tenjimariensis SS-939 identificato quale FERM-~P 4932 o ATCC numero 31603.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5251779A JPS55145697A (en) | 1979-05-01 | 1979-05-01 | Istamycins a or/and b, and their preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT8009394A1 true IT8009394A1 (it) | 1981-09-28 |
Family
ID=12916924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT1980A09394A IT8009394A1 (it) | 1979-05-01 | 1980-03-28 | Istamicine e produzione delle stesse, per impiego come antibatterici ed antibiotici |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS55145697A (it) |
| IT (1) | IT8009394A1 (it) |
-
1979
- 1979-05-01 JP JP5251779A patent/JPS55145697A/ja active Granted
-
1980
- 1980-03-28 IT IT1980A09394A patent/IT8009394A1/it unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0142960B2 (it) | 1989-09-18 |
| JPS55145697A (en) | 1980-11-13 |
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