IT202000021235A1 - Immunosaggio per l’identificazione di anticorpi contro il virus polioma delle cellule di merkel (mcpyv) mediante l’uso di peptidi sintetici - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: ?Immunosaggio per l?identificazione di anticorpi contro il virus polioma delle cellule di Merkel (MCPyV) mediante l?uso di peptidi sintetici?
DESCRIZIONE
La presente invenzione rientra nel settore dell?immunodiagnostica.
Pi? in particolare, la presente invenzione riguarda un saggio immunologico, preferibilmente del tipo ELISA indiretto, per l?identificazione della presenza di anticorpi contro il virus polioma delle cellule di Merkel (MCPyV) in un campione di fluido biologico di un soggetto preferibilmente umano.
Il virus polioma delle cellule di Merkel ? uno dei 14 virus polioma umani ad oggi conosciuti (1,2). Il suo genoma ? stato identificato, nel 2008, integrato nel DNA cellulare di un carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), un raro tumore umano della pelle (3). MCPyV, come gli altri virus polioma umani, ad esempio BKPyV e JCPyV, ? ubiquitario, cio? ampiamente diffuso nella popolazione umana (1,2). I virus polioma, in genere, non causano malattie in soggetti sani e, sebbene diversi virus siano associati a malattie negli ospiti immunocompromessi, MCPyV ? l?unico direttamente associato al cancro (3). Infatti, MCPyV ? stato classificato dalla WHO/IARC come probabilmente cancerogeno per l'uomo (gruppo 2A) (1,2)
Il carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), sebbene sia un tumore raro della pelle ? molto aggressivo. MCC presenta un alto tasso di mortalit?, circa 46% in 5 anni (3). Ha un'incidenza di 1/~3 milioni di casi all?anno in Europa. Tale tumore ? comune tra soggetti bianchi ed anziani (>60 anni) con un eccesso di esposizione ai raggi UV. Il virus oncogeno a DNA, MCPyV, ? il suo agente eziologico. Infatti, il DNA di MCPyV ? presente in circa l'80% di tutti i MCC (3). Anticorpi anti-MCPyV sono presenti in quasi il 100% di pazienti con MCC, nel 60-80% di adulti sani e nel 35% di bambini di 1-5 anni di et? (4). Questi dati indicano che MCPyV ? ubiquitario. Il DNA di MCPyV ? stato rilevato nello strato leucocitario-piastrinico e in sieri di adulti sani con prevalenze del 22% e 2,6% indicando che MCPyV pu? replicarsi nei soggetti sani, riattivandosi dalla sua fase latente (5,6). Infatti, dopo l'infezione primaria che avviene in et? pediatrica, MCPyV rimane latente in ospiti immunocompetenti, fino a quando un indebolimento del sistema immunitario porta alla riattivazione virale, integrazione del DNA virale nel genoma umano, con conseguente espressione permanente delle due oncoproteine virali, gli antigeni Large T (LT) e small T (ST). Similmente, ? noto che una riattivazione e conseguente infezione dei virus polioma umani (3), inclusi JCPyV e BKPyV, pu? essere indotta da un deficit immunitario.
Negli ospiti immunocompromessi, il rischio d?insorgenza dell?MCC aumenta (7); infatti circa il 10% dei pazienti affetti da MCC mostra deficit immunitari. I pazienti immunosoppressi sono anche pi? inclini a sviluppare tumori virus-associati, tra cui il sarcoma di Kaposi e il linfoma di Burkitt, associati rispettivamente agli herpesvirus HHV8/ KSHV e EBV.
Ai fini di ricerca scientifica, alcuni gruppi, compreso quello dei presenti inventori, hanno impiegato tecniche di biologia molecolare, come le metodiche della reazione a catena della polimerasi (PCR) sia qualitativa che quantitativa, per svelare la presenza di sequenze di DNA di MCPyV in campioni umani (7, 8). Tuttavia, attualmente non sono disponibili in commercio metodi specifici, rapidi, e poco costosi che utilizzino tecniche immunologiche per verificare la presenza di anticorpi contro MCPyV nell?uomo. Infatti, le attuali tecniche immunologiche riportate nella letteratura scientifica sono basate sull?utilizzo delle ?virus-like particles? (VLPs), aggregati di VP1 ricombinante di MCPyV che si auto-assemblano in vitro (9). Le VLPs come antigene virale vengono impiegate per la ricerca di anticorpi anti-MCPyV. La produzione delle VLPs prevede diversi e laboriosi passaggi, tra cui la sintesi in vitro a partire da cellule di Spodoptera frugiperda, o altro batterio ricombinante, l?isolamento, la quantificazione ed infine l?impiego con test ELISA per verificare la presenza di anticorpi contro MCPyV (9, 10). Alternativamente, studi pi? recenti riportano lo sviluppo di metodi ELISA basati sul rilevamento multiplo di anticorpi denominato ?Multiplex Serology? basato sull?impiego di microsfere fluorescenti, in combinazione con la glutatione S-transferasi (GST). Tali sistemi, seppur innovativi poich? permettono il rilevamento contemporaneo di differenti virus, presentano varie limitazioni metodologiche in quanto sono basati comunque sull?impiego delle VLPs o proteine ricombinanti solubili (10, 11). Infatti, ? importante far notare che l?utilizzo di proteine ricombinanti VLPs potrebbe far aumentare le probabilit? di cross-reazione tra diversi virus che, seppur differenti, presentano un certo grado di omologia, e quindi inficiare il risultato ottenuto (9, 10, 11).
Visto l?attuale stato delle conoscenze, ? evidente l?importanza di disporre di metodi di analisi standardizzati, specifici, sensibili, rapidi, e di basso costo che consentano di identificare in maniera inequivocabile la presenza di anticorpi contro MCPyV, sia nei sieri di pazienti affetti da patologie diverse, incluse le neoplasie come MCC, che in individui sani, per esempio donatori di sangue, di cellule staminali e di organi.
? inoltre di primario interesse la sorveglianza immunologica per MCPyV nei pazienti trattati con anticorpi monoclonali, come ad esempio i pazienti affetti da sclerosi multipla e da patologie autoimmuni, quali artrite reumatoide e spondilite anchilosante (7). Infatti, dati pregressi dei presenti inventori indicano un aumento di incidenza del MCC di circa mille volte in pazienti affetti da patologie autoimmuni in terapia con farmaci biologici, anticorpi monoclonali. Per tale scopo, monitorare nel tempo i livelli anticorpali contro MCPyV nei sieri di tali pazienti, con un metodo standardizzato, sensibile, rapido, e di basso costo ? di primaria importanza per garantirne un outcome favorevole (7).
Queste ed altre esigenze sono soddisfatte dalla presente invenzione, che mette a disposizione il procedimento immunologico e il relativo kit definiti nelle annesse rivendicazioni indipendenti, idonei per la rivelazione di anticorpi anti-MCPyV in un campione di un fluido biologico di un soggetto o paziente da analizzare.
Ulteriori caratteristiche dell?invenzione sono identificate nelle rivendicazioni dipendenti, che formano parte integrante della descrizione.
La presente invenzione consente di sopperire alla mancanza di metodiche analitiche immunologiche specifiche mediante l'impiego di una serie di nuovi peptidi sintetici, usati come antigeni virali in un saggio immunologico, che consentono di svelare la presenza di anticorpi contro MCPyV. In particolare, gli inventori hanno identificato brevi sequenze peptidiche uniche in MCPyV, che rappresentano epitopi specifici e bersagli immunologici selettivi per gli anticorpi presenti nei sieri e altri fluidi di soggetti infettati da MCPyV.
Un primo oggetto della presente invenzione ? quindi un peptide isolato, corrispondente a uno specifico epitopo o antigene di una proteina virale capsidica 1, 2 o 3 (VP1, VP2 e VP3) del virus polioma delle cellule di Merkel (MCPyV), consistente nella sequenza amminoacidica scelta nel gruppo che consiste di SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2. Tale peptide isolato ? caratteristico di MCPyV, nel senso che non d? reazione crociata con altri virus polioma.
Un secondo oggetto della presente invenzione ? un procedimento in vitro per la rivelazione di anticorpi anti-MCPyV in un campione di un fluido biologico di un soggetto, comprendente le fasi di: a) porre a contatto detto campione con un agente di cattura comprendente uno o pi? peptidi isolati di MCPyV come definiti in precedenza (i.e. SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2); e
b) rilevare la formazione di un immunocomplesso fra un anticorpo anti-MCPyV e il suddetto agente di cattura, in cui la formazione dell?immunocomplesso ? indicativa della presenza di anticorpi anti-MCPyV nel campione di fluido biologico.
In una forma di realizzazione preferita, gli anticorpi anti-MCPyV eventualmente presenti nel campione di fluido biologico sono anticorpi IgG e/o IgM umani. In tal caso, la formazione dell?immunocomplesso ? rivelata mediante l?impiego di un anticorpo secondario anti-uomo.
In un?altra forma di realizzazione preferita, il fluido biologico da analizzare ? scelto dal gruppo che consiste di siero, plasma, sangue, saliva, urina, o liquido cefalorachidiano. Fra di essi ? maggiormente preferito il siero.
In ancora un?altra forma di realizzazione preferita, la rilevazione dell?immunocomplesso ? effettuata mediante immunoprecipitazione, immunosaggio (preferibilmente ELISA o RIA o saggio immunologico in fluorescenza), western blot, analisi FACS o una tecnica immunocitochimica/immunoistochimica. Fra di essi ? maggiormente preferito un saggio ELI-SA indiretto.
Un terzo oggetto della presente invenzione ? un kit diagnostico per la determinazione della presenza di anticorpi anti-MCPyV in un campione di un fluido biologico di un soggetto, il kit comprendendo (i) un agente di cattura comprendente uno o pi? peptidi isolati come definiti in precedenza, e (ii) un reagente per la rivelazione dell?immunocomplesso eventualmente formatosi fra gli anticorpi anti-MCPyV e l?agente di cattura. Come reagente di rivelazione della presenza dell?immunocomplesso ? preferito l?impiego di un anticorpo secondario antiuomo.
Il kit diagnostico dell?invenzione pu? altres? comprendere un supporto solido di saggio, come ad esempio una piastra ELISA.
La sezione sperimentale che segue ? fornita a scopo puramente illustrativo e non limitativo della portata dell?invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni.
Sezione sperimentale
Materiali e metodi
Campioni biologici
I sieri di individui normali, maschi e femmine di et? diversa, ci sono stati forniti da diverse Cliniche Universitarie, Ospedali e Centri di Ricerca, previa sottoscrizione del consenso informato in accordo con la dichiarazione di Helsinki. Il Comitato Etico di Ferrara ha approvato lo studio, ID: 151078 (7).
Peptidi
Le proteine strutturali o capsidiche dei virus polioma, verso le quali vengono prodotti gli anticorpi, sono codificate dalla regione tardiva del genoma virale. I peptidi dell?invenzione sono stati sintetizzati utilizzando tecniche e apparecchiature standard (12). I due peptidi sintetici dell?invenzione, utilizzati come antigeni specifici del MCPyV in un saggio immunologico per rilevare nei sieri gli anticorpi contro MCPyV (preferibilmente un test ELISA indiretto), hanno le seguenti sequenze amminoacidiche:
Peptide MCPyV-VP1 S (PEP-S) (24 amminoacidi):
NH2- NSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSS ?COOH (SEQ ID NO:1) e
Peptide MCPyV-VP2/VP3 F (PEP-F) (25 amminoacidi): NH2- SLSPTSRLQIQSNLVNLILNSRWVF ?COOH (SEQ ID NO:2) Le sequenze amminoacidiche dei peptidi PEP-S e PEP-F sono localizzate all?interno delle sequenze codificanti per i geni tardivi del virus MCPyV: le proteine VP 1, VP 2 e VP 3 (Figura 1). Nonostante le regioni geniche di MCPyV VP1 e VP2/VP3 presentino un certo grado di omologia con altri virus polioma, tra cui JCPyV, BKPyV ed SV40, le analisi bioinformatiche effettuate dai presenti inventori hanno evidenziato che le regioni genomiche corrispondenti a PEP-S e PEP-F presentano vantaggiosamente una omologia estremamente ridotta quando comparate con gli altri virus polioma.
Identificazione di anticorpi contro MCPyV nei sieri umani mediante saggio immunologico ELISA indiretto La procedura di saggio comprende diverse fasi, come precedentemente riportato (13-15).
1. Coating. I peptidi liofilizzati sono stati disciolti in Coating Buffer (Candor Bioscience GmbH -CABRU s.a.s. Milano) 1x fino a raggiungere la concentrazione di 100 ?g/ml, aliquotati e sono stati conservati a -20?C fino al momento dell?utilizzo. Sono state utilizzate piastre da 96 pozzetti in cui ? stato fatto aderire il peptide sintetico in un passaggio definito ?coating?. I peptidi sono stati diluiti 1:2 in Coating Buffer 1X, ottenendo una concentrazione finale di 50 ?g/ml. In ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 ?l di peptide cos? preparato mediante l?utilizzo di una pipetta multicanale, si ? lasciata incubare la piastra al buio a 4?C per 16-18 ore in modo che il peptide aderisca correttamente al fondo del pozzetto della piastra. Dopo il periodo d?incubazione a 4?C sono state effettuati tre lavaggi con 250 ?l per pozzetto di Washing Buffer (Candor Bioscience GmbH - CABRU s.a.s. Milano) diluito 0,5x in acqua bidistillata, partendo da una concentrazione di stock 10x. Per effettuare i lavaggi, volti alla rimozione del peptide in eccesso, ? stato utilizzato un washer (Thermo Elctron Corporation, Wellwash 4 MK 2. Pobbiano, Italia).
2. Blocking. Questa fase prevede l?aggiunta della Blocking Solution (Candor Bioscience GmbH - CABRU s.a.s. Milano), in grado di completare la saturazione di ciascun pozzetto, nel caso vi siano aree non coperte dal peptide. Con questa soluzione si evita l?interazione tra l?anticorpo primario eventualmente presente nei campioni di siero e la superficie della piastra. Sono stati aggiunti 200 ?l di Blocking Solution in ogni pozzetto con una pipetta multicanale e la piastra ? stata posta in incubazione per 90 minuti a 37?C, al buio. In seguito, sono stati effettuati tre lavaggi con 250 ?l di Washing Buffer per ogni pozzetto, sempre utilizzando il washer.
3. Anticorpi primari. Una volta effettuati i lavaggi, i campioni di siero da saggiare sono stati posti nei pozzetti corrispondenti. In questo modo ? possibile verificare la presenza di eventuali anticorpi contro MCPyV presenti nel siero. I sieri sono stati diluiti 1:20 in Low Cross Buffer (Candor Bioscience GmbH - CABRU s.a.s. Milano, Italia); in ogni pozzetto sono stati aliquotati 100 ?l di siero cos? diluito. Ogni campione ? stato analizzato in doppio. La piastra ? quindi stata fatta incubare a 37?C per 90 minuti al buio. In ogni esperimento ? inoltre presente un controllo positivo rappresentato da siero di: (i) pazienti affetti da carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), risultati in precedenza positivi agli anticorpi IgG contro MCPyV (7); (ii) sieri appartenenti ad individui sani risultati in precedenza positivi agli anticorpi IgG contro MCPyV (9). Inoltre sono stati inseriti tre controlli risultati negativi in esperimenti precedenti, che vengono utilizzati per l?identificazione del valore-soglia (cut-off).
4. Anticorpo secondario. Sono stati effettuano tre lavaggi con 250 ?l di washing buffer per ogni pozzetto in modo da rimuovere il siero residuo. ? stato utilizzato un anticorpo secondario di capra anti-umano coniugato con perossidasi (CalbioChem, Milano), diluito 1:10.000 in Low Cross Buffer. In ogni pozzetto sono stati aggiunti quindi 100 ?l di anticorpo secondario, utilizzando una pipetta multicanale. Si ? lasciato incubare per 90 minuti a temperatura ambiente al buio.
5. Rilevazione e lettura allo spettrofotometro. Sono stati effettuati tre lavaggi con 250 ?l di Washing Buffer per ogni pozzetto, in modo da rimuovere l?anticorpo secondario residuo. Per effettuare una lettura allo spettrofotometro in grado di quantificare il livello di anticorpi eventualmente presenti nel siero, sono stati aggiunti a ciascun pozzetto 100 ?l di 2,2?-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS; Sigma, Milano) utilizzando una pipetta multicanale. La piastra ? stata incubata a temperatura ambiente per 45 minuti al buio. La lettura ? stata effettuata mediante uno spettrofotometro (Thermo Elctron Corporation, Wellwash 4 MK 2. Pobbiano, Italia) ad una lunghezza d?onda di 405 nm. I risultati ottenuti sono stati analizzati, in modo da valutare l?intervallo di densit? ottica (OD) ottenuto, controllando che i valori dei duplicati nella stessa piastra abbiano valori paragonabili tra loro.
6. Determinazione del cut-off. Il valore di cutoff ? stato determinato come descritto in precedenza (13-15). Nello specifico, il cut-off ? stato determinato per ogni esperimento, utilizzando le OD dei controlli negativi inseriti in piastra. Il valore-soglia ? stato calcolato attraverso la media di tre controlli negativi a cui ? stata sommata la tripla deviazione standard (+3D). Tale procedimento ? coerente con esperimenti effettuati in precedenza e con la letteratura internazionale (13-15). Il valore del cut-off viene calcolato in ogni esperimento e varia a seconda del peptide utilizzato.
Al termine delle analisi, un campione viene considerato positivo per MCPyV se risulta positivo sia per il peptide MCPyV-VP1 S che per il peptide MCPyV-VP2/VP3 F, quindi avente valori di OD superiori ai valori soglia dei singoli esperimenti.
Risultati
Saggio di specificit? di due peptidi sintetici, PEP-S e PEP-F, impiegati come antigeni per svelare la presenza di anticorpi anti-MCPyV nel siero umano In un saggio ELISA indiretto sono stati esaminati complessivamente n=1080 campioni di siero per valutare la presenza di anticorpi contro MCPyV. Nello specifico, i campioni erano rappresentati da sieri di individui sani (n=1.080), stratificati per et?: <1-4 anni (n=128), da 5 a 10 anni (n=54), da 11 a 17 anni (n=124), da 18 a 30 anni (n=130), da 31 a 40 anni (n=120), da 41 a 50 anni (n=141), da 51 a 65 anni (n=157), da 66 a 70 anni (n=40), da 71 a 75 anni (n=46), da 76 a 80 anni (n=57), da 81 a 85 anni (n=47), >86 anni (n=36).
Prevalenza di anticorpi anti-MCPyV determinata con il saggio ELISA indiretto
Con il saggio ELISA indiretto impiegante i peptidi PEP-S e PEP-F sono stati considerati MCPyV-positivi solo i sieri risultati contemporaneamente positivi per entrambi i peptidi MCPyV-VP1 S e MCPyV-VP2/VP3 F utilizzati nel test. La prevalenza di anticorpi anti-MCPyV ? risultata nel complesso del 55.3% (597/1080). I dati di prevalenza di anticorpi anti-MCPyV nei sottogruppi di individui sani stratificati per et? sono riportati in Tabella 1. Nello specifico, la prevalenza di sieropositivit? pi? bassa, 11.7% (15/128), ? stata riscontrata nel gruppo degli individui <1-4 anni. Infatti, la differenza di prevalenza di anticorpi anti-MCPyV nel gruppo degli individui <1-4 anni ? risultata statisticamente inferiore rispetto ai gruppi 5-10 anni (48.1%, 26/54), 11-17 anni (55.6%, 69/124), 18-30 anni (63.1%, 82/130), 31-40 anni (56.7%, 68/120), 41-50 anni (64.5%, 91/141), 51-65 anni (66.2%, 104/157), 66-70 anni (62.5%, 25/40), 71-75 anni (71.7%, 33/46), 76-80 anni (64.9%, 37/57), 81-85 anni (63.8%, 30/47), >86 anni (52.8%, 19/36) (p<0.0001) (Tabella 1). Inoltre, ? stata riscontrata una prevalenza statisticamente inferiore di anticorpi anti-MCPyV, 48.1%, 26/54, nel gruppo degli individui di fascia di et? 5-10 anni in comparazione con i gruppi 41-50 anni (64.5%, 91/141), 51-65 anni (66.2%, 104/157), 71-75 anni (71.7%, 33/46) (p<0.05) (Tabella 1).
Tabella 1. Sieroprevalenza di anticorpi anti-MCPyV negli individui sani stratificati per et?
Claims (12)
1. Peptide isolato del virus polioma delle cellule di Merkel (MCPyV), consistente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.
2. Procedimento per la rivelazione di anticorpi anti-MCPyV in un campione di un fluido biologico di un soggetto, comprendente le fasi di:
a) porre a contatto detto campione con un agente di cattura comprendente un peptide isolato consistente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO.1 o un peptide isolato consistente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO:2 o entrambi i suddetti peptidi isolati; e
b) rilevare la formazione di un immunocomplesso fra gli anticorpi anti-MCPyV e l?agente di cattura, in cui la formazione dell?immunocomplesso ? indicativa della presenza di anticorpi anti-MCPyV nel campione di fluido biologico.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui i suddetti anticorpi anti-MCPyV sono anticorpi IgG e/o IgM umani.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui la formazione dell?immunocomplesso ? rivelata mediante l?impiego di un anticorpo secondario antiuomo.
5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2 a 4, in cui il fluido biologico ? scelto dal gruppo che consiste di siero, plasma, sangue, saliva, urina, o liquido cefalorachidiano.
6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2 a 5, in cui il soggetto ? un individuo affetto da una patologia neoplastica, un individuo immunocompromesso, un individuo affetto da sclerosi multipla o patologia autoimmune trattato con anticorpo monoclonale, oppure ? un individuo sano.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui la patologia neoplastica ? il carcinoma delle cellule di Merkel (MCC).
8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2 a 7, in cui l?immunocomplesso ? rilevato mediante immunoprecipitazione; immunosaggio, preferibilmente ELISA o RIA o saggio immunologico in fluorescenza; western blot; analisi FACS; oppure una tecnica immunocitochimica/immunoistochimica. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, che ? un saggio immunologico del tipo ELISA indiretto. 10. Kit diagnostico per la determinazione della presenza di anticorpi anti-MCPyV in un campione di un fluido biologico di un soggetto sospettato di essere infettato da MCPyV, comprendente:
- un agente di cattura comprendente un peptide isolato consistente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO.1 o un peptide isolato consistente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO:2 o entrambi i suddetti peptidi isolati, e
- un reagente per rilevare la formazione di un immunocomplesso fra gli anticorpi anti-MCPyV e il suddetto agente di cattura.
11. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 10, comprendente un anticorpo secondario anti-uomo come reagente di rivelazione dell?immunocomplesso.
12. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 10 o 11, comprendente una piastra ELISA come supporto solido di saggio.
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2021
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (17)
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