SE1050373A1 - förfarande och kit för cancerdiagnos - Google Patents

Description

15 20 25 30 patienten och samhället. Biopsi som uppföljande undersökning efter PSA-test kan exempelvis leda till att patienten får blodförgiftning.

Bristerna hos PSA-testet resulterar vidare ofta i stympande kirurgi, d v s total prostataektomi. Denna typ av överbehandling är ett betydande obehag inte endast för patienterna utan även för samhället p g a extra kostnader.

Prostasomer, vilka är en grupp av exosomer, är utsöndringsprodukter från prostatakörteln. Membranarkitekturen hos dessa organeller är komplex och tvådimensionell gelelektrofores av membranmaterial har visat mer än 100 olika proteinenheter. Prostasomerna innehåller neuroendokrina molekyler och CD (cluster of differentiation)-molekyler och många olika enzymer ingår i prostasomens membranmosaik. Prostasomer har tillskrivits många olika biologiska aktiviteter, men deras fysiologiska funktion är fortfarande ofullständigt klarlagd.

I WO2007/015174 beskrivs exosomspecifika ligander och kompositioner som innefattar desamma. US 7 083 796 beskriver kompositioner och fusions- proteiner som innehåller minst Mycobacterium sp.-antigen och RNA som kodar för sådana kompositioner och fusionsproteiner. I US 6 620 922 beskrivs kompositioner och förfaranden för behandling och diagnos av cancer, såsom prostatacancer. US 6 107 090 beskriver användning av antikroppar eller bindande delar därav, prober, ligander, eller andra biologiska ämnen som antingen känner igen en extracellulär domän hos prostataspecifikt membranantigen eller binder till och internaliseras med prostataspecifikt membranantigen. I "Perspectives on the Biological Role of Human Prostasomes", Lena Carlsson, doktorsavhandling 2001, beskrivs att prostasomer har en potent antibakteriell effekt. I “Flow cytometric technique for determination of prostasomal quantity, size and expression of CD10, CD13, CD26 and CD59 i human seminal plasma", Lena Carlsson et al., International Journal of Andrology (2006) diskuteras det prostasomala uttrycket av CD-markörer. Såsom följer av det ovan nämnda föreligger det ett 10 15 20 25 30 behov av förbättrade, icke-invasiva diagnostiska verktyg för detektion av prostatacancer. De ovannämnda publikationerna, vars innehåll i största möjliga utsträckning som juridiskt tillåts inkluderas häri, beskriver inte några icke-invasiva diagnostiska verktyg för detektion av prostatacancer.

Beskrivning av uppfinningen Enligt en första aspekt av uppfinningen tillhandahålles ett förfarande för diagnostisering eller tillhandahållande av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer, innefattande in vitro-detektion och kvantifiering av prostasomalt uttryck av minst ett antigen och jämförelse av nämnda kvantifierade uttrycksvärde med ett referensvärde för det resp. antigenet erhållet från en frisk individ(-er). Frisk individ(-er) definieras häri som individer som inte har subjektiva och/eller kliniska tecken på cancer, tex inte har prostatacancer. I ett steg före detektionen och kvantifieringen av det prostasomala uttrycket tillhandahålles ett prov från den individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer. Förfarandet enligt uppfinningen är icke- invasivt, d v s inga biopsier krävs. Provet kan vara en kroppsvätska i naturlig eller bearbetad form, såsom prostatasekret, urin, seminalvätska, blod (se Tabell 4). Bearbetning av provet kan vara exempelvis centrifugering.

Enligt en utföringsform av uppfinningen anrikas provet med avseende på prostasomer mellan tillhandahållet av nämnda prov och det följande steget med detektion och kvantifiering av det prostasomala antigenuttrycket. Denna anrikning kan utföras genom immobilisering av prostasomerna på en fast yta, tex på nitrocellulosamembran, i radioimmunassayrör, på partiklar såsom nanopartiklar, eller på ELISA-plattor.

I en utföringsform av uppfinningen väljs det minst enda antigenet från gruppen bestående av CD13, CD59, CD10, CD26, CD142, CD143 och MHC I. 10 15 20 25 30 I en utföringsform av uppfinningen baseras förfarandet för diagnostisering eller tillhandahållande av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer på uppreglering av antigenen CD10, CD26, CD142 (även känd som Tissue Factor) och MHC I hos individer som är drabbade av prostatacancer, jämfört med referensvärdet. Följaktligen kan i enlighet med uppfinningen kvoten mellan referensvärdet (d v s kontroll) och CD26 uttryckt på prostasomer från prostatacancerpatienter vara 0,95 eller mindre. För CD 142 kan på motsvarande sätt kvoten mellan referensvärdet (d v s kontroll) och CD142 uttryckt på prostasomer från prostatacancerpatienter vara 0,75 eller mindre. Även för MHC I kan kvoten mellan referensvärdet (d v s kontroll) och MHC I uttryckt på prostasomer från prostatacancerpatienter vara 0,75 eller mindre, för att prostatacancer skall diagnostiseras eller prognosticeras.

I en alternativ utföringsform är förfarandet för diagnostlsering eller tillhandahållande av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer baserat på nedreglering av antigenen CD13 och CD59 hos individer som är drabbade av prostatacancer, jämfört med referensvärdet.

Kvoten mellan referensvärdet (d v s kontroll) och CD13 uttryckt på prostasomer från prostatacancerpatienter kan följaktligen i enlighet med uppfinningen vara 1,59 eller mer. På motsvarande sätt skall för CD59 kvoten mellan referensvärdet (d v s kontroll) och CD59 uttryckt på prostasomer från prostatacancerpatienter vara 1,30 eller mer.

Det referensvärde som används kan vara erhållet från friska individer som har bekräftats inte vara drabbade av prostatacancer genom användning av PSA, kliniska och anamnesiska data.

Uttrycket av ovan angivna antigen kan mätas genom mätning av antikroppar som reagerat med antigenen. Antikropparna kan vara märkta för detektion.

Detektionen kan utföras t ex med fluorescens exempelvis vid flödescytometri och utvärderas med ROC-kurvor. 10 15 20 25 30 Fackmannen inser att de genomsnittliga fluorescensintensiteterna på vilka de ovanstående kvoterna beräknas kan variera med den använda analytiska utrustningen. Det är dock troligt att kvoterna i stor utsträckning skulle förbli oförändrade. På motsvarande sätt inser fackmannen att andra förfaranden kan användas för mätning av uttrycket av antigenen. Såsom tidigare skulle de ovan angivna kvoterna i stor utsträckning förbli oförändrade. l en utföringsform av uppfinningen beräknas en kvot mellan minst två av antigenen och kvoten jämförs med ett referenskvotvärde. En kvot kan vara baserad på tex nedreglerade prostasomala antigen från prostatacancer- patienter delat med uppreglerade prostasomala antigen från samma prostatacancerpatient. Detta kvotvärde jämförs därefter med ett referens- kvotvärde från normala patienter utan prostatacancer. Användning av en sådan kvot kan ge förfarandet förbättrat prognostiseringsvärde.

I en utföringsform av uppfinningen bestäms således kvoten (CD13 + CD59)/ (CD1O + CD26), baserat på mängderna av de detekterade antigenen, och jämförs med ett referensvärde. CD13 och CD59 är båda nedreglerade på prostasomer från prostatacancerpatienter, medan CD10 och CD26 båda är uppreglerade på prostasomer från prostatacancerpatienter. Fackmannen inser att kvoterna kan beräknas och användas även genom användning av andra kombinationer av antigen än den kombination som specifikt beskrivs häri. l ytterligare en utföringsform av den föreliggande uppfinning används minst en typ av antikroppar som har förmåga att binda specifikt till minst ett av antigenen för detektion och kvantifiering av uttrycket därav. Antikropparna kan vara monoklonala eller polyklonala. Som ett alternativ till intakta antikroppar kan Fab, Fab2 eller enkelkedjiga Fv-antikroppar användas. De intakta antikropparna eller delarna därav skall alla ha den relevanta antigenbindande domänen, 10 15 20 25 30 I ytterligare en utföringsform av uppfinningen är den minst enda typen av antikroppar märkt med igenkänningsbara fluorescerande markör(-er). Flödes- cytometri kan användas för detektion och kvantifiering av nämnda antikroppar för erhållande av ett uttrycksmönster. l en alternativ utföringsform används ELISA för detektion och kvantifiering av nämnda antikroppar.

DELPHIA-analys genom användning av exempelvis europium och samarium kan även användas i enlighet med uppfinningen.

Enligt en andra aspekt av uppfinningen tillhandahålles ett kit för användning vid diagnos eller tillhandahållande av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer, innefattande minst en typ av antikroppar som specifikt binder till minst ett antigen som har valts från gruppen bestående av CD13, CD59, CD10, CD26, CD142, CD143 och MHC I. Nämnda antikroppar kan vara monoklonala eller polyklonala, eller alternativt kan Fab, Fab2 eller enkelkedjiga Fv-antikroppar utgöra del av kitet.

Uppfinningen beskrivs vidare i de följande exemplen i kombination med de vidhängande figurerna, vilka inte är avsedda att begränsa omfånget av uppfinningen på något sätt.

Kortfattad beskrivning av figurerna Fig. 1 visar ROC-kurvan för förhållandet mellan CD13 och CD10. AUC (area under kurvan) för särskiljande av prostatacancerpatienter från normala individer (utan prostatacancer) var 0,874 och förhållandet hade en sensitivitet som uppgick till 83,3% och en specificitet som uppgick till 91 ,1% vid en cut off-gräns som uppgick till 2,04.

Fig. 2 visar ROC-kurvan för förhållandet mellan CD59 och CD10, AUC för särskiljande av prostatacancerpatienter från normala individer (utan prostata- cancer) var 0,863 och förhållandet hade en sensitivitet som uppgick till 100% 10 15 20 25 och en specificitet som uppgick till 64,6% vid en cut off-gräns som uppgick till 5,32.

Exempel Provberedning Seminalprover från 79 patienter utan känd prostatacancer enligt PSA-värden och klinisk och anamnesisk information och 10 patienter med bekräftad prostatacancer tillhandahölls.

Seminalvätskor erhölls från human sperma efter inkubation därav vid rumstemperatur under omkring 30 minuter och centrifugering under 20 minuter vid 1 000 x g vid en temperatur av 20°C, för att separera spermier från seminalplasma. Seminalplasman var därvid klar för den flödescytometriska analys som beskrivs nedan.

Urin, prostatasekret resp. hepariniserade blodprover centrifugerades vid 2 500 x g under 10 minuter vid en temperatur av 20°C. Supernatanterna från prostatasekret, urin resp. hepariniserat blod var klara för analys med flödes- cytometri. Blodplasma som erhållits genom centrifugering testades vidare på fast fas med ELlSA och dot blot/lmmun-blot på nitrocellulosapapper med specifika antikroppar mot prostasomer (se ELlSA och immunblottingavsnitten nedan). 10 15 20 25 30 Beredning av prover för flödescytometri 30 pl av utspädd seminalplasma eller av den resp. supernatanten (vardera utspädd 1:25 i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)) tillsattes till polystyrenrör innehållande 10 pl FITC-inmärkta antikroppar. Varje antikropp tillsattes till ett separat rör och varje markör analyserades således därefter separat.

De följande monoklonala antikropparna, vilka har förmåga att binda till den extracellulära domänen hos det resp. proteinet, användes (alla antikroppar erhållna från Serotec (Kidlington, UK): FITC-CD10 (antikropp MCA1556F, 0,1 mg/ml), FITC-CD13 (antikropp MCA127OF, 0,1 mg/ml), F|TC-CD26 (antikropp MCA1317F, 0,1 mg/ml), FlTC-CD59 (antikropp MCA1054F, 0,1 mg/ml), FlTC-CD142 (antikropp MCA2548F, 0,1 mg/ml), FlTC-CD143 (antikropp MCA2057F, 0,1 mg/ml) Proverna inkuberades under 10 minuter vid 20°C och analyserades därefter medelst flödescytometri. Inga tvättningssteg utfördes.

Flödescytometri Proverna analyserades genom användning av en cytometer av typen Epics Profile XL-MCL (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Flödescytometern detekterar enskilda celler eller organeller och presenterar dessa på ett vanligt sätt i ett punktdiagram. 100 ul av varje prov analyserades för bestämning av prostasomkoncentration och storlek. För analyser av CD-markörer genomfördes databehandling av 5 000 prostasomer genom användning av mjukvaran XL (Coulter Electronics), för varje enskild patient. Baserat på ljusspridningsegenskaper representerades varje prostasom av en punkt i ett 10 15 20 25 30 rektangulärt koordinatsystem. Lokalisationen och storleken hos grinden (gate) sattes med beaktande av att prostasomerna var kraftigt renade.

Diskrimineringsramar placerades runt prostasomansamlingen och flödesansamlingen genom användning av framåtspridning och sidospridning.

Flödescytometern mäter fluorescenssignalen från inmärkta antikroppar bundna till prostasomerna. Flödescytometern ger procentandelen positivt färgade prostasomer, medianen och genomsnittet för fluorescensintensiteten (MFI), komplexitet (höger vinkelspridning), och median- och genomsnittsstorleken (vinkelspridning framåt) för prostasompopulationen inom fältet.

Analytiska markörer sattes ifluorescenskanalen för mätning av MFI (våglängd = 225 nm för FITC). Grindarna sattes före studien.

Flödescvtometri på seminalvätska Prover från prostatacancerpatienter uppvisade ett divergerande proteinmönster i jämförelse med kontroller. Sensitiviteten och specificiteten hos markörerna utvärderades med ROC-kurvor. Markörerna CD13, CD59 och förhållandena CD13/CD10 resp. CD59/CD26 var de markörer som gav högst sensitivitet och specificitet för prostatacancer. CD13/CD10 gav den högsta specificiteten (91,1%, Fig. 1) medan CD59/CD26 gav den högsta sensitiviteten (100%). Partiklar med sido- och framåtspridning typiska för prostasomer detekterades.

Flödescvtometri på serum och urin 10 ul seminalplasma från cancerpatienter och kontroller sattes till polystyrenrör innehållande 100 pl serum eller urin och proverna späddes ut 1:25 med PBS. 30 ul av det utspädda provet och 10 pl av FITC-inmärkta 10 15 20 25 30 antikroppar blandades och blandningen inkuberades under 10 minuter vid en temperatur av 20°C och analyserades därefter genom användning av flödescytometri. Inga tvättningssteg utfördes. 100 ul serum från två patienter med höga PSA analyserades även såsom ovan men utan tillsats av renade prostasomer. Partiklar med sido- och framåtspridning typiska för prostasomer detekterades.

Flödescytometriresultat (serum och urin) CD-uttrycket för prostasomer som återsuspenderats i serum eller urin var oförändrat med icke ändrade resultat ijämförelse med den ursprungliga seminalvätskan. Patienternas prover uppvisade organeller med en framåt- och sidospridning representativa för prostasomer. Partiklarna var CD13- positiva, viklet visar att partiklarna var prostasomer (se Tabell 4).

Beredning av renade prostasomer Renade prostasomer behövdes för att ställa flödescytometerns diskrimineringsgrindar. Seminalplasmaprover slogs samman (12-15 prover) och ultracentrifugerades vid 10 000 x g vid 4°C under 15 minuter för avlägsnande av eventuella cellrester. Supernatanten gjordes därefter till föremål för ytterligare ultracentrifugering under 2 timmar vid 100 000 x g vid 4°C för att överföra prostasomerna till pelletform. Prostasomerna resuspenderades i isoton Tris-HCl-buffert, pH 7,6, och renades vidare på en gelkolonn av typen Sephadex G 200 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Eluatet följdes vid 260/280 nm. Fraktionerna med förhöjda UV- absorbanser samlades in och analyserades med avseende på CD13, vilken är ett starkt markörenzym för prostasomer. Ultraviolett absorberande fraktioner med hög CD13-aktivitet slogs samman och ultracentrifugerades vid 100 000 x g vid 4°C under 2 timmar. Den pellet som representerade de 10 15 20 25 30 renade prostasomerna resuspenderades i isoton Tris-HCI-buffert med pH 7,6 och justerades till en lämplig proteinkoncentration. lmmunblotting 1 pl av renade seminala prostasomer pipetterades på ett nitrocellulosa- membran och membranet blockerades med 1% BSA i 0,02 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,2 (PBS) under1 timme. Efter tre tvättningar inkuberades membranet med 100 ul av biotinylerade polyklonala kyckling anti- prostasomala antikroppar (utspädda 1:1 000 i PBS med 1% BSA) under 1 timme vid 20°C. Efter tre nya tvättningar med PBS-T (PBS med 0,05% Tween 20), tillsattes 100 ul streptavidin-alkaliskt fosfataskonjugat (Zymed Laboratories, Inc., CA, USA), utspätt 1:2 000 i PBS med 1% BSA, och inkuberades under 1 timme vid 20°C. Efter tre tvättningar framkallades nitrocellulosamembranet. lmmunblottingresultat Antikroppen kände igen prostasomerna på nitrocellulosamembranet och en lila punkt visualiserades. Detta visar att prostasomer kan fångas på fast fas (i detta fall ett nitrocellulosamembran) och därefter detekteras med antikroppar.

ELISA Mikrotiterplattor (F96, Polysorp, Nunc) belades med 4 ug/ml av renade seminala prostasomeri 0,1 M NaHCOß, pH 9,5, under 2 timmar vid 20°C.

Plattorna tvättades tre gånger med 0,02 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,2 (PBS-T) och plattorna blockerades med 1% BSA i 0,02 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,2 under 2 timmar. Efter tre tvättningar inkuberades plattorna med 100 ul av polyklonal kyckling anti-prostasomal antikropp (utspädd 1:1 000 i PBS) under 2 timmar vid 20°C. Efter tre nya 10 15 20 tvättningar med PBS-T, tillsattes 100 ul av get anti-kyckling lgG pepparrots- peroxidas (HRP)-konjugerade antikroppar (Zymed Laboratories, lnc., CA, USA), utspädda 1:2 000 i PBS, och inkuberades under 2 timmar vid 20°C.

Plattorna tvättades tre gånger med 250 ul PBS-T och inkuberades med substrat (tetrametylbensidin, Zymed Laboratories, lnc.) under 15 minuter vid 20°C varvid de skyddades mot ljus. Reaktionen stoppades genom tillsats av 50 ul av 1,8 mol/I svavelsyra. Absorbansen mättes vid 450 nm i ett ELISA- läsarsystem (SPECTRA Max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

ELISA-resultat Anti-prostasomantikroppen (lmmunsystem AB, Uppsala, Sverige) gav en positiv reaktion med de prostasomer som bundits till ELISA-plattan, med ett absorbansvärde > 1,0. Detta visar att prostasomerna kan fångas in på en fast fas (i detta fall en mikrotiterplatta) och därefter detekteras med antikroppar, såsom i detta fall enzyminmärkta antikroppar.

Experimentella resultat Nedan visas jämförande resultat mellan kontroller och patienter drabbade av prostatacancer (Tabell 1, 2 och 3). Tabell 4 visar vidare mätningar på seminalvätska, serum resp. urin.

Tabell 1 CD10 CD13 CD26 CD59 MHC I MFI MFI MFI MFI MFI Kontroll 1 1,3 2,3 3,4 4 1,4 2 1,9 4 1,9 10,5 1,8 3 1,3 3,4 1,3 10,2 2,9 4 0,74 2,8 0,78 6,3 0,9 5 2,1 5,3 2,2 10,7 0,7 6 3,1 8 2,5 21,7 1,1 7 2,8 8,6 3,8 17,5 1,7 8 1,5 4,7 1,4 9,5 1,2 9 2,5 4,6 2,2 12,7 1,8 10 1,4 2,8 1,6 7,2 0,6 11 1,1 1,3 1,3 3,6 1,9 12 0,9 2,6 0,9 5,6 2,2 13 1,7 4 2,1 8,1 2,8 14 2,1 5,8 2,1 12,4 1,2 15 1,7 6,4 2,3 16 1 16 1,2 2,7 1,8 5,5 1,5 17 1,5 4 1,4 10,2 2,9 18 1,5 5,8 1,8 12 2,4 19 1,9 4,7 2,1 8,8 0,6 20 1,8 5,6 2,2 8,2 0,6 21 1,7 4 2,1 9,5 2,4 22 1,7 3,5 2,1 8,1 1,7 23 1,9 4,4 2 13 1,2 24 1,4 5,3 1,6 11 1,9 25 2,5 6,5 2,4 9,2 1,3 26 1,6 4,1 2,1 11,9 2,9 27 0,8 3,8 1,3 5,4 3,1 28 1,5 5,9 2,7 10,9 2,4 29 2,5 8,5 2,6 15,9 2,7 30 1,4 5,3 1,6 11 1,6 31 2,1 8 3,2 16,8 1,3 32 1,3 5,3 1,8 10,2 1,9 33 1,4 3,7 1,3 10,9 1,2 34 1,7 3,4 2,2 8 1,1 35 1,2 1,6 1,6 4 0,5 36 1,4 3,8 1,3 9,2 1,9 37 2,1 6,5 2,8 12,4 1,3 38 1,5 4,7 2 10,6 1,6 39 2,1 6,2 3,8 16 0,8 40 1,5 4,7 1,4 9,5 0,9 41 1,8 4 1,6 11,3 2,7 42 1,4 2,8 1,6 7,2 2,6 43 2,1 6,5 3,5 13,1 2,8 44 0,94 1,3 0,9 4 1,7 45 1,9 8,2 1,6 16,2 1 46 1,3 3,5 1,6 9,2 1,1 47 0,87 2 1,6 4,2 1,8 48 1,8 6,6 2,3 12,6 0,9 49 1,1 1,5 2,2 6,1 0,6 50 1,7 4 2,1 8,1 0,4 51 2,1 5,8 2,1 12,4 1,2 52 1,7 6,4 2,3 16 1,7 53 1,2 2,7 1,8 5,5 2,8 54 1,5 4 1,4 10,2 2,5 55 1,5 5,8 1,8 12 2 56 1,4 7,6 1,4 14,7 1,3 57 1,9 10,6 1,9 12,9 1,2 58 1,8 8,3 1,6 16,3 0,7 59 2,1 5,4 2,1 11,1 0,5 60 1,1 1,5 2,1 6,1 0,6 61 1,9 8,8 1,6 16,2 1,4 62 1 1,7 2,3 3,3 1,1 63 1,2 3,4 1,3 9,8 0,8 64 1,2 2,8 1,3 8,7 1,8 65 0,94 3,4 1,1 7,7 1,2 66 2,1 5,3 2,2 10,7 1,9 67 3,1 8 2,5 21,7 1,5 68 1,7 3,4 1,6 10,4 0,7 69 1,5 4,7 1,6 9,3 2,6 70 1,6 3,9 1,8 12 2,7 71 2,9 6,3 3 15,2 3,2 72 1,5 7,3 1,4 14,1 2,6 73 1,5 4,7 1,6 9,3 1,8 74 1,4 3,7 1,5 8,2 1,7 75 1,7 3,6 1,7 8,7 1,5 76 2,3 6 2 18,7 0,5 77 1,6 4 2 8,1 0,8 78 1,1 2,6 1,6 4,6 1,6 79 1,5 4,6 2,1 10,1 1,4 antal 79 79 79 79 79 genomsnitt 1,5 4,6 1,8 10,2 1,5 intervall 1,3-1,9 3,4-5,9 1,6-2,2 8,1-12,5 1,0-1,9 CD10 CD13 CD26 CD59 MHC I MFI MFI MFI MFI MF I Cancerpatienter cancerp1 1,3 2,9 2,4 7,8 1,9 cancerp2 1,5 1,4 2,1 3,5 2,8 cancerp3 1,2 4,1 1,6 6,1 2,5 cancerp4 1,7 1,9 0,96 7,5 2,1 cancerp5 1,6 2,2 0,89 8,7 1,8 cancerp6 2,1 2,9 1,9 10,8 2,7 cancerp7 2,3 4,7 3 11,3 1,3 cancerp8 1,5 2,8 1,9 6,5 1,5 cancerp9 1,6 3,3 3,1 7,8 1,6 cancerp10 2,1 3,5 1,9 8,7 2,6 antal 10 10 10 10 10 genomsnitt 1,6 2,9 1,9 7,8 2 intervall 1,5-2,0 2,4-3,5 1,7-2,3 6,8-8,7 1,6-2,6 Tabell 2 CD142 CD142 Kontroll 1,8 Cancerp 2,1 Kontroll 1,6 Cancerp 2,3 Kontroll 1,7 Cancerp 2,1 Kontroll 1,6 Cancerp 1,5 Kontroll 2,1 Cancerp 2,5 Kontroll 2,1 Cancerp 3,8 Kontroll 1 ,7 Cancerp 2,8 Kontroll 1,6 Cancerp 2,1 Genomsnitt 1,8 Genomsnitt 2,4 lntervall 1,6-2,1 lntervall 1,5-3,8 Tabell 3 CD10 CD13 CD26 CD59 MHC Kontroll 1,6 4,6 1,8 10,2 1,5 Cancerpatient 1,5 2,9 1,9 7,8 2 Förhållande 1,07 1,59 0,95 1,30 0,75 Kontroll/cancer Tabell 4 CD13 CD26 MHC I MFI MFI l\/lF| Seminal- 2,8 1,9 1,5 Cancerpatient 1 vätska Serum 2,7 1,9 1,5 Urin 2,9 1,8 1,4 Seminal- 2,9 2,4 1,9 Cancerpatient 2 vätska Serum 2,9 2,4 1,9 Urin 2,9 2,4 1,9 Seminal- 3,3 3,1 1,6 Cancerpatient 3 vätska Serum 3,3 3,1 1,5 Urin 3,3 3,1 1,6 10 15 CD13 CD26 MHC I MFI MFI MFI Kontroll 1 Seminal- 3,4 1,6 0,7 vätska Serum 3,4 1,5 0,7 Urin 3,3 1,5 0,7 Kontroll 2 Seminal- 3,4 1,3 0,8 vätska Serum 3,4 1,3 0,7 Urin 3,5 1,3 0,8 Kontroll 3 Seminal- 8,3 1,6 0,7 vätska Serum 8,5 1,6 0,7 Urin 8,3 1,5 0,6 ROC-analvser - proqnostiserinq av prostatacancerförekomst i enliqhet med uppfinningen ROC-kurvan (receiver operating characteristic) är en enkel men samtidigt komplett empirisk beskrivning av besluts-tröskeleffekten, vilken indikerar alla möjliga kombinationer av de relativa frekvenserna av olika typer av korrekta och inkorrekta beslut vid diagnostiskt beslutsfattande. En ROC-kurva är ett grafiskt diagram över sensitiviteten, eller sanna positiva svar, vs. (1 - specificitet), eller falska positiva svar, för ett binärt klassificeringssystem då dess diskrimineringströskel varieras. ROC kan även ekvivalent åskådliggöras genom att grafiskt visa fraktionen av sanna positiva svar (TPR = sannt positivt förhållande; true positive rate) versus fraktionen av falska positiva svar (FPR = falskt positivt förhållande; false positive rate). ROC-analysen tillhandahåller verktyg för att välja möjligen optimala modeller och för att förkasta suboptimala sådana oberoende av kostnadssammanhanget (och 10 15 20 25 30 före dess specificering) eller klassdistributionen. ROC-analysen är på ett direkt och naturligt sätt kopplad till kostnad/nytta-analysen vid diagnostiskt beslutsfattande.

Resultat Som visas i tabellerna 1-3 skiljer sig prostasomer från prostatacancerpatienter avseende uttrycket av de angivna ytantigenen. De presenterade markörantigenerna i dessa tabeller kan således användas för att differentiera mellan prostatacancer och kontrollindivider. I\/larkörerna kan användas individuellt eller kombinerade för förbättring av analysernas sensitivitet och specificitet (se "Beskrivning av uppfinningen" ovan). Fig. 1 presenterar förhållandet mellan CD13 och CD10 och Fig. 2 presenterar förhållandet mellan CD59 och CD10 i form av ROC-kurvor. Sensitiviteten och specificiteten ökar jämfört med användning av enbart en antigenmarkör.

Tabell 4 visar att liknande värden erhölls när prostasomer analyserades i olika kroppsvätskor (serum, urin och seminalvätska). Den flödescytometriska detektionen av prostasomer i serum från två prostatacancerpatienter visar att prostasomer även kan föreligga i serum.

Citerade dokument: WO2007/015174 US 7 083 796 US 6 620 922 US 6 107 090 "Perspectives on the Biological Role of Human Prostasomes" Lena Carlsson, doktorsavhandling 2001 och "Flow cytometric technique for determination of prostasomal quantity, size and expression of CD10, CD13, CD26 and CD59 in human seminal plasma", Lena Carlsson et al., International Journal of Andrology (2005)

Claims (10)

10 15 20 25 30 Patentkrav

1. Förfarande för diagnostisering eller tillhandahållande av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer, innefattande in vitro detektion och kvantifiering av prostasomalt uttryck av minst ett antigen och jämförelse av nämnda kvantifierade uttrycksvärde med ett referensvärde för det resp. antigenet som erhålles från en frisk individ(-er).

2. Förfarande enligt krav 1, vari det minst enda antigenet väljs från gruppen bestående av CD13, CD59, CD10, CD26, CD142, CD143 och MHC l.

3. Förfarande enligt krav 2, vari diagnostiseringen eller tillhandahållet av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer är baserad på uppreglering av antigenen CD10, CD26, CD142 och MHC I hos individer som har drabbats av prostatacancer, jämfört med referensvärdet.

4. Förfarande enligt krav 2, vari diagnostiserande eller tillhandahållandet av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer är baserad på nedreglering av antigenen CD13 och CD59 hos individer som har drabbats av prostatacancer, jämfört med referensvärdet.

5. Förfarande enligt något av kraven 1-4, vari en kvot beräknas mellan minst två av antigenen och kvoten jämförs med ett referenskvotvärde.

6. Förfarande enligt något av kraven 1-5, vari minst en typ av antikroppar som har förmåga att binda specifikt till minst ett av antigenen används för detektion och kvantifiering av uttrycket därav.

7. Förfarande enligt krav 6, vari den minst enda typen av antikroppar är inmärkt med igenkänningsbara fluorescenta markör(-er). 10

8. Förfarande enligt krav 7, vari antikropparna som är bundna till det minst enda antigenet detekteras och kvantifieras medelst flödescytometri.

9. Förfarande enligt krav 6, vari antikropparna som är bundna till det minst enda antigenet detekteras och kvantifieras medelst ELlSA.

10. Kit för användning vid diagnos eller tillhandahållande av en prognos för en individ som misstänks vara drabbad av prostatacancer, innefattande minst en typ av antikroppar som specifikt binder till minst ett antigen som har valts från gruppen bestående av C013, C059, C010, C026, C0142, C0143 och MHC I.