IT202000011776A1 - Formulazione di una miscela vegetale fermentata a base di riso integrale germogliato - Google Patents

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Cinzia Lucia Randazzo
Alessandra Pino
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Simone Ronsisvalle
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Description

DESCRIZIONE dell?invenzione industriale dal titolo "Formulazione di una miscela vegetale fermentata a base di riso integrale germogliato. "
La presente invenzione ha per oggetto una nuova formulazione a base di riso integrale germogliato, fermentato attraverso l?impiego di ceppi di lattobacilli, ascritti alla specie L. paracasei, isolati da una miscela di composizioni di riso integrale germogliato, per uso in prodotti alimentari, dermocosmetici e/o formulazioni farmaceutiche.
Stato dell?arte
La germinazione del riso si configura come un processo di attivazione di processi vitali e metabolici necessari per la riproduzione del seme, che permette di ottenere una matrice cremosa naturalmente priva di lattosio e facilmente digeribile. La frazione lipidica ? modesta e a differenza di quella del latte vaccino, ? priva di colesterolo, poverissima di grassi saturi e ricca di acidi grassi polinsaturi. La bevanda vegetale di riso sta riscuotendo un discreto successo commerciale per molteplici motivi, tra cui: un sapore gradevole (dato dalla ricchezza in zuccheri semplici), una bassa allergenicit?, l'assenza di lattosio, di colesterolo, di glutine e di acidi grassi saturi, un minor impatto ambientale e l'origine vegetale (C?ceres, P. J., Mart?nez-Villaluenga, C., Amigo, L., & Frias, J. (2014). Maximising the phytochemical content and antioxidant activity of Ecuadorian brown rice sprouts through optimal germination conditions. Food Chemistry, 152, 407414). Esempi di bevande vegetali a base di riso sono descritte nella domanda di brevetto EP3210479A1.
Durante il processo di germinazione del riso, gli enzimi idrolitici determinano l?idrolisi dell?amido, dei polisaccaridi non amidacei e delle proteine con formazione di zuccheri semplici a basso indice glicemico, come il glucosio e il maltosio, peptidi e aminoacidi. La germinazione comporta anche la produzione di componenti bioattivi con propriet? antiossidanti, quali acido ascorbico, tocoferoli, tocotrienoli e composti fenolici, nonch? l?aumento della concentrazione di acido ?-aminobutirrico, fibre alimentari, acido ferulico, tocotrienoli, magnesio, potassio e zinco (Kayahara H, Tsukahara K (2000) Flavor, health and nutritional quality of pre-germinated brown rice. Presented at 2000 Int Chem Congr Pac Basin Soc in Hawaii, December 2000).
In tale contesto, la formulazione di un prodotto fermentato a base di riso integrale germogliato pu? permettere di ampliare la limitata gamma di prodotti fermentati di origine non lattiero-casearia presenti sul mercato, soddisfacendo le richieste dei consumatori di prodotti naturali, senza glutine e vegani. E? infatti noto che la fermentazione operata dai batteri lattici pu? migliorare le propriet? benefiche per la salute dell?acido ?-aminobutirrico, nonch? incrementare la concentrazione di nutrienti e composti bioattivi migliorando le caratteristiche funzionali dei cereali, ad esempio nella produzione di bevande vegetali (Waters, D. M., Mauch, A., Coffey, A., Arendt, E. K., & Zannini, E. (2015). Lactic Acid Bacteria as a Cell Factory for the Delivery of Functional Biomolecules and Ingredients in Cereal-Based Beverages: A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 55(4), 503-520).
Nonostante il riso integrale germogliato sia considerato, rispetto ai cereali non maltati, un ottimo substrato per la formulazione di prodotti fermentati, soprattutto bevande vegetali, ad oggi le evidenze scientifiche nonch? i prodotti alimentari fruibili sul mercato sono ottenuti impiegando altri tipi di cereali quali avena, mais, riso non integrale, orzo e sorgo, o una loro miscela, utilizzando per la fermentazione diversi ceppi di lattobacilli, come Lactobacillus plantarum, reuteri e acidophilus, Streptococchi e lieviti disponibili commercialmente (Freire, A. L., Ramos, C. L., & Schwan, R. F. (2017). Effect of symbiotic interaction between a fructooligosaccharide and probiotic on the kinetic fermentation and chemical profile of maize blended rice beverages. Food Research International, 100, 698-707.; Salmer?n, I., Thomas, K., & Pandiella, S. S. (2015). Effect of potentially probiotic lactic acid bacteria on the physicochemical composition and acceptance of fermented cereal beverages. Journal of Functional Foods, 15, 106-115).
In WO2020/031143A1 viene descritto un processo di fermentazione acetica di riso integrale germogliato, basato sull?utilizzo di batteri della specie Acetobacter oppure da batteri lattici quali Lactobacillus bulgaricus o Streptococcus thermophilus, per l?ottenimento di ingredienti acidi utilizzati come componenti di preparati alimentari vegani a base di cereali.
Recentemente Caceres e collaboratori (Caceres, P.J., Pe?as, E., Mart?nez-Villaluenga, C., Garc?a-Mora, P., Frias, J., Development of a multifunctional yogurt-like product from germinated brown rice, LWT - Food Science and Technology (2018) hanno valutato l'idoneit? del riso integrale germogliato per la produzione di un prodotto fermentato simile allo yogurt, ottenuto impiegando una coltura starter commerciale contenente Lattobacilli e riso integrale crudo, bagnato o germogliato disponibile in commercio. Gli autori hanno evidenziato un incremento della concentrazione dei composti GABA e inositolo nel prodotto fermentato rispetto alla composizione di partenza, evidenziando come la fermentazione aumenti la biodisponibilit? dei nutrienti benefici, presenti naturalmente nel riso integrale germogliato.
La fermentazione ad opera dei batteri lattici, infatti, migliora le caratteristiche funzionali di svariati cereali, fra cui il riso integrale, attraverso la produzione di sostanze bioattive e la metabolizzazione di sostanze dannose all?organismo umano (Waters, Mauch, Coffey, Arendt, & Zannini, (2015). Lactic Acid Bacteria as a Cell Factory for the Delivery of Functional Biomolecules and Ingredients in Cereal-Based Beverages: A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 55(4), 503-520).
Nonostante sia stato recentemente dimostrato che i cereali integrali germogliati rappresentino degli ottimi substrati per la crescita dei batteri lattici, migliori rispetto ai cereali non maltati (Nsogning Dongmo, Procopio, Sacher, & Becker, (2016). Flavor of lactic acid fermented malt based beverages: Current status and perspectives. Trends in Food Science & Technology, 54 37-51), ad oggi sono presenti sul mercato pochi prodotti commerciali fermentati a base di riso integrale germogliato.
Inoltre, non tutti i ceppi di batteri disponibili commercialmente e utilizzati nei processi di fermentazione di miscele a base di cereali integrali germogliati, anche all?interno delle diverse specie di batteri lattici, sono in grado di dare origine alla produzione di sostanze attive nutrienti necessarie per ottenere dei preparati alimentari con migliorate caratteristiche organolettiche. In particolare, le miscele fermentate con ceppi batterici commercialmente disponibili solitamente comportano il mantenimenti dell?acido fitico presente nel seme, sostanza non digeribile dagli esseri umani e in grado di chelare le sostanze nutritive e quindi di rendere non assorbibili alcuni importanti microelementi come zinco e ferro, e in misura minore anche macroelementi come calcio e magnesio.
E? quindi evidente la necessit? di identificare dei nuovi formulati a base di riso integrale germogliato e fermentato che permettano di ottenere dei preparati per un uso non solo alimentare, ma anche dermocosmetico e/o farmaceutico, e che sfruttino le propriet? benefiche del riso integrale germogliato fermentato da ceppi autoctoni di lattobacilli.
DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE
E? stato sorprendentemente osservato che mediante l?utilizzo di nuove miscele di due o pi? componenti a base di riso integrale germogliato micronizzato, sottoposti a particolari trattamenti termici e di idrolisi, ? possibile isolare nuovi ceppi di Lattobacilli appartenenti alla specie di L. paracasei, qui definiti CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3, caratterizzati da ottime performance tecnologiche e funzionali quando utilizzati in processi di fermentazione di miscele a base di riso integrale germogliato.
In particolare, i ceppi isolati e selezionati dalle miscele prodotte dagli inventori, hanno mostrato ottime caratteristiche tecnologiche, quali un?ottima attivit? proteolitica, lipolitica, acidificante e coagulante, la capacit? di produrre diacetile ed esopolisaccaridi e l?attitudine alla liofilizzazione, caratteristiche che ne permettono l?uso nella preparazione di preparati alimentari con caratteristiche organolettiche ottimali per l?uso in diversi regimi alimentari.
Inoltre, tali ceppi hanno mostrato ottime performance funzionali, in termini di resistenza al lisozima, resistenza a bassi valori di pH, resistenza alla bile e alla digestione gastrointestinale, un?attivit? antimicrobica, un?attivit? antiossidante e anti-infiammatoria, che ne permettono l?uso nella preparazione di formulazioni dermocosmetiche e di formulazioni farmaceutiche.
Pertanto, l?utilizzo di tali ceppi autoctoni in processi di fermentazione di miscele a base di riso integrale germogliato, permette di ottenere delle preparazioni particolarmente vantaggiose dal punto di vista nutrizionale e con specifiche propriet? organolettiche, biologiche e farmacologiche, che possono essere utilizzate per ottenere dei preparati per uso alimentare, dermocosmetico e farmaceutico.
In particolare, a differenza del prodotto proposto da Caceres e collaboratori (2018), i componenti di riso integrale germogliato utilizzati nella miscela della presente invenzione non sono stati liofilizzati e poi ricostituiti, ma semplicemente micronizzati e in parte trattati termicamente e/o idrolizzati. Il trattamento termico e l?idrolisi di solo alcuni dei componenti di riso presenti nella miscela, ha lo scopo di ridurre la carica microbica totale e indesiderata presente nella composizione di partenza, rendendo pi? sicuro il prodotto dal punto di vista microbiologico e, nel contempo, di scindere gli amidi del riso in zuccheri pi? semplici, per una migliore fermentazione lattica successiva. Un altro grande vantaggio rispetto al prodotto fermentato ottenuto da Caceras e collaboratori (2018) risiede nell?impiego di nuovi ceppi autoctoni, ceppi prodotti dalle specifiche caratteristiche della miscela utilizzata e da essa isolati, invece che ceppi disponibili commercialmente, nel processo di fermentazione. L?utilizzo di tali ceppi e delle miscele della presente invenzione consente di garantire l?ottenimento un prodotto interamente vegetale e con propriet? organolettiche uniche rispetto ai prodotti disponibili commercialmente.
In particolare, la fermentazione della miscela con i ceppi della presente invenzione ? in grado di diminuire significativamente o addirittura di annullare la concentrazione di acido fitico nel prodotto finale, considerato un anti-nutriente, e di rendere maggiormente biodisponibili e fruibili tutti i nutrienti e micronutrienti presenti nel chicco di riso germogliato, che hanno un?importante funzione nel mantenimento del microbiota e della flora batterica intestinale.
La presente invenzione consta pertanto della messa a punto di una nuova miscela vegetale a base di riso integrale germogliato e dalla preparazione di una formulazione a base di riso integrale germogliato ottenuto dalla fermentazione con i batteri lattici L. paracasei CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3, isolati dalla suddetta miscela.
Un oggetto della presente invenzione ? pertanto una miscela di riso costituita da due o pi? componenti, in cui almeno un componente ? costituito da riso integrale germogliato micronizzato, trattato termicamente e idrolizzato; e almeno un componente ? costituito da riso integrale germogliato micronizzato, non trattato termicamente e non idrolizzato.
Secondo un aspetto preferito detta miscela ? costituita da due componenti di riso integrale germogliato, il primo trattato termicamente e idrolizzato, il secondo non trattato termicamente e non idrolizzato.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detta miscela comprende tre, quattro o pi? componenti di riso integrale germogliato. Gli eventuali componenti aggiuntivi, diversamente o ugualmente tra loro, possono essere, a seconda dei casi, sia trattati termicamente e/o idrolizzati, oppure ne? trattati termicamente ne? idrolizzati; ad esempio, un terzo componente potrebbe essere solo trattato termicamente, mentre un quarto componente potrebbe essere solo idrolizzato.
Secondo la presente invenzione il trattamento termico e l?idrolisi delle suddette componenti sono processi che vengono eseguiti prima della miscelazione delle stesse.
Preferibilmente, detta idrolisi viene eseguita in presenza dell?enzima alfabeta-amilasi. Ancora pi? preferibilmente detto enzima viene utilizzato in un quantitativo compreso tra 0.1 % e 5% in peso, rispetto al peso del riso sottoposto a idrolisi.
Secondo un aspetto dell?invenzione, durante l?idrolisi viene idrolizzato dal 20 al 100% degli amidi totali presenti nella composizione di riso integrale germogliato micronizzato.
Secondo un aspetto dell?invenzione l?idrolisi viene eseguita ad una temperatura compresa tra 20? C e 90? C, preferibilmente ad una temperatura compresa tra 16? C e 50? C, per un periodo di tempo compreso fra 1 ora e 24 ore, preferibilmente compreso fra 2 e 12 ore.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il trattamento termico ? scelto tra pastorizzazione, sterilizzazione o termizzazione.
Secondo un aspetto preferito, ognuna delle suddette componenti di riso integrale germogliato micronizzato ? presente nella miscela della presente invenzione in un quantitativo compreso fra l?1 e l?99% in peso, rispetto al peso totale della miscela, preferibilmente in un quantitativo compreso fra il 5 e l?80% in peso, rispetto al peso totale della miscela, pi? preferibilmente in un quantitativo compreso fra il 20 e il 70% in peso, rispetto al peso totale della miscela.
Preferibilmente, le particelle di riso integrale germogliato micronizzato utilizzate nella miscela della presente invenzione hanno dimensione media compresa tra 10 e 100 m, preferibilmente compresa tra 25 e 50 m.
La micronizzazione dei chicchi di riso germogliato secondo la presente invenzione pu? avvenire con sistemi noti nell?arte, come la micronizzazione con pompa omogenizzante turbo emulsione, micronizzazione con mulino colloidale, micronizzazione con mulino a sfere o la micronizzazione mediante compressione a rulli immersi.
Secondo un aspetto preferito della presente invenzione il trattamento termico viene eseguito a una temperatura superiore a 40 ?C, ancora pi? preferibilmente superiore a 55 ?C.
Secondo un ulteriore aspetto preferito della presente invenzione la sterilizzazione viene eseguita ad una temperatura compresa tra 105? C e 135? C per un periodo compreso fra 5 secondi e 30 minuti, pi? preferibilmente ad una temperatura di 110? C e 130 ?C per un periodo compreso fra 20 secondi e 20 minuti, ancora pi? preferibilmente ad una temperatura di circa 121 ?C per circa 15 minuti.
Secondo un ulteriore aspetto preferito della presente invenzione la pastorizzazione viene eseguita ad una temperatura compresa tra 60? C e 95? C per un periodo compreso fra 10 e 60 minuti, preferibilmente fra 80? C e 95 ?C per un periodo compreso fra 10 e 20 minuti.
Secondo un ulteriore aspetto preferito della presente invenzione la termizzazione viene eseguita ad una temperatura compresa fra 50? C e 75? C per un periodo compreso fra 30 minuti e 5 ore, preferibilmente ad una temperatura compresa fra 50 e 55 ?C per un periodo compreso fra 10 minuti e 2 ore.
Secondo la presente invenzione il trattamento termico dei componenti della miscela viene eseguito in seguito alla germogliazione e l?idrolisi viene eseguita dopo la micronizzazione dei semi di riso.
Secondo un ulteriore aspetto preferito, la miscela della presente invenzione ha un contenuto di proteine compreso tra 0.5-3 g/100g di miscela totale, un contenuto di carboidrati compreso tra 10-30 g/100g di miscela totale e un contenuto di grassi compreso tra 0.5-2.5 g/100g di miscela totale.
Preferibilmente, la miscela della presente invenzione ha un contenuto di proteine compreso tra 1-2.5 g/100g di miscela totale, un contenuto di carboidrati compreso tra 12-25 g/100g di miscela totale e un contenuto di grassi compreso tra 0.5-1.5 g/100g di miscela totale.
In un aspetto preferito durante la fase di isolamento dei ceppi di lattobacilli la miscela della presente invenzione viene incubata ad una temperatura compresa fra 25? C e 50 ?C, preferibilmente ad una temperatura compresa fra 30? C e 42 ?C.
Preferibilmente la suddetta miscela viene incubata per un tempo compreso fra 1 e 56 ore, pi? preferibilmente tra 10 e 24 ore.
Le suddette condizioni di incubazione permettono di isolare i ceppi di lattobacilli della presente invenzione.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? il ceppo di lattobacilli L.
paracasei CMR.V1 (numero di deposito DSM 33253, depositato il 1 ottobre 2019 presso il centro DSMZ in Germania).
Un ulteriore oggetto ? il ceppo di lattobacilli CMR.V2 (numero di deposito DSM 33254, depositato il 1 ottobre 2019 presso il centro DSMZ in Germania).
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? il ceppo di lattobacilli CMR.V3 (numero di deposito DSM 33316, depositato il 15 novembre 2019 presso il centro DSMZ in Germania).
In un aspetto preferito i suddetti ceppi di lattobacilli sono isolati dalla miscela secondo la presente invenzione.
Un ulteriore aspetto ? una formulazione ottenuta dalla miscela della presente invenzione fermentata in presenza di una coltura starter comprendente almeno uno dei ceppi CMR.V1, CMR.V2 o CMR.V3 e/o di una miscela degli stessi.
Preferibilmente, detta formulazione viene ottenuta da una miscela fermentata in presenza di una coltura starter comprendente almeno due dei ceppi CMR.V1, CMR.V2 o CMR.V3, pi? preferibilmente detta miscela viene fermentata in presenza di una coltura starter comprendente tre dei ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3.
Preferibilmente, detta miscela viene fermentata in presenza di una coltura starter comprendente da 10<6 >UFC a 10<11 >UFC di almeno uno dei suddetti ceppi, pi? preferibilmente comprendente fra 10<7 >UFC e 10<10 >UFC di almeno uno dei suddetti ceppi.
Preferibilmente, detta miscela viene fermentata in presenza di una coltura starter comprendente da 10<6 >UFC a 10<11 >UFC di almeno due dei suddetti ceppi, pi? preferibilmente comprendente fra 10<7 >UFC e 10<10 >UFC di almeno due dei suddetti ceppi.
Ancora pi? preferibilmente detta miscela viene fermentata in presenza di una coltura starter comprendente da 10<6 >UFC a 10<11 >UFC di ognuno dei suddetti ceppi, pi? preferibilmente comprendente fra 10<7 >UFC e 10<10 >UFC di ognuno dei suddetti ceppi.
Secondo la presente invenzione la suddetta miscela viene fermentata ad una temperatura compresa fra 20? C e 47? C, preferibilmente ad una temperatura compresa fra 25? C e 42? C, pi? preferibilmente ad una temperatura compresa fra 37? C e 40? C.
Preferibilmente la suddetta fermentazione viene eseguita per un tempo compreso fra 1 e 56 ore, pi? preferibilmente per un tempo compreso fra 30 minuti e 24 ore, ancora pi? preferibilmente per un tempo compreso fra 10 minuti e 12 ore.
Preferibilmente la miscela della presente invenzione viene fermentata in presenza di ulteriori componenti scelti tra prebiotici, come inulina, fruttooligosaccaridi, galatto-oligosaccaridi o xilitolo, gomma di guar e/o loro miscele.
Secondo un aspetto preferito la formulazione ottenuta dalla suddetta fermentazione pu? essere in forma solida, semi-solida o liquida.
Preferibilmente quando la formulazione ? in forma solida ? in forma di polvere liofilizzata o ottenuta mediante metodica di spray dryer, letto fluido o altre forme di disidratazione.
In un ulteriore aspetto preferito, la formulazione della presente invenzione ? caratterizzata da un contenuto di acido fitico inferiore al 1% in peso, rispetto al peso totale della miscela, preferibilmente la suddetta formulazione ? priva di acido fitico.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? l?uso della suddetta formulazione nella produzione di preparati alimentari, di prodotti dermocosmetici e/o di formulazioni farmaceutiche.
Preferibilmente i preparati alimentari secondo la presente invenzione sono scelti tra bevande vegetali, yogurt, budini e sorbetti, preparati e basi per farine, prodotti lievitati, dolci, merendine, biscotti, pizze, focacce, semifreddi, crepes, gelati e torte.
Secondo un aspetto preferito, detti preparati alimentari comprendono un quantitativo in peso compreso tra lo 0.1 e il 99 % della formulazione secondo la presente invenzione, preferibilmente comprendono un quantitativo in peso compreso fra il 10 e il 90% della formulazione, pi? preferibilmente comprendono un quantitativo in peso compreso fra il 20 e l?80% della formulazione.
Secondo un ulteriore aspetto preferito detti preparati alimentari sono costituiti interamente dalla formulazione della presente invenzione.
In un ulteriore aspetto preferito detti preparati alimentari comprendono almeno un ulteriore ingrediente scelto tra lipidi derivati da cereali o pseudocereali, addensanti, coloranti, oli, eccipienti alimentari, coadiuvanti alimentari, probiotici, emulsionanti, zuccheri, dolcificanti, aromatizzanti, spezie, sale, verdure, caffe, cacao, alghe marine commestibili, frutta, frutta a guscio, bacche, legumi, sostanze grasse, semi di leguminose, semi oleosi, semi proteici, erbe commestibili, aromi naturali o artificiali, erbe officinali, semi ottenuti da erbe commestibili, semi ottenuti da erbe officinali, proteine ed aminoacidi isolati da legumi, fibre isolate da verdure, principi attivi funzionali e qualsiasi ingrediente per uso nell?industria alimentare o una loro combinazione.
Preferibilmente detti addensanti comprendono sostanze scelte tra carragenine, agar-agar, amidi, semi di carruba, guar, gomma di xantano, farina di riso bianca, farina di riso integrale, farina di carruba, baobab, inulina, pectina, glucomannano, radice di tara, radice di kuzu, radice di konjak, radice di arrowot, o una loro combinazione.
Preferibilmente detti legumi e/o detti semi di leguminose sono scelti tra fagioli, fave, piselli, lupini, ceci, arachidi, lenticchie, fagioli azuki (Vigna angularis), cicerchie, fabaceae, alberi come l'acacia (Acacia), la pagoda (Sophora), la falsa acacia (Robinia pseudoacacia), albero di carrubo (Ceratonia siliqua), o una loro combinazione.
Preferibilmente dette alghe marine commestibili appartengono al genere scelto tra Undaria, Palmaria, Ecklonia, Porphyra, Sargassum, o una loro combinazione.
Preferibilmente dette erbe commestibili e/o dette erbe officinali, sono scelte tra tarassaco (Taraxacum), aglio, aloe, alloro, camomilla, stevia, o una loro combinazione.
In un ulteriore aspetto preferito detti prodotti dermocosmetici sono scelti tra creme per il viso e per il corpo, sieri e maschere per il trattamento del corpo e dei capelli, detergenti per il viso, detergenti per il corpo, detergenti e lavande lenitive per l?igiene intima femminile e maschile, emollienti per le labbra, creme per la pelle protettive dai raggi solari, creme per il trattamento di lesioni e cicatrici della pelle, creme dermo-riparatrici o creme per il trattamento delle ragadi al seno.
Secondo un aspetto preferito detti prodotti dermocosmetici comprendono un quantitativo compreso tra lo 0.1 e il 99% in peso della formulazione secondo la presente invenzione, pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 10 e il 90% in peso della formulazione, ancora pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 20 e l?80% in peso della formulazione, rispetto al peso totale della formulazione e almeno un eccipiente fisiologicamente accettabile.
Secondo un aspetto preferito le suddette formulazioni farmaceutiche comprendono un quantitativo compreso tra lo 0.1 e il 99% in peso della formulazione secondo la presente invenzione, pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 10 e il 90% in peso della formulazione, ancora pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 20 e l?80% in peso della formulazione, rispetto al peso totale della formulazione e almeno un eccipiente fisiologicamente accettabile.
Secondo un ulteriore aspetto preferito i suddetti preparati alimentari, prodotti dermocosmetici e/o formulazioni farmaceutiche possono contenere almeno un ulteriore principio attivo.
Detto ulteriore principio attivo ha un?attivit? dietetica, alimentare, nutraceutica e sono scelti tra probiotici, sali minerali, tonici, multivitaminci e multiminerali, adiuvanti la funzione intestinale, vitamine, venotonici, trofici e adiuvanti le articolazioni, adiuvanti la funzione epatica, antiacidi, integratori per la salute degli occhi, prodotti anti-caduta dei capelli, adiuvanti le funzioni immunitarie, prodotti per le vie urinarie, adiuvanti la memoria e le funzioni cognitive, antiossidanti multifunzionali, prodotti stimolanti il sistema immunitario, omega 3, prodotti per la menopausa, adiuvanti le neuropatie periferiche, prodotti per il trattamento della calcolosi, come potassio citrato o altri integratori alimentari specifici.
Preferibilmente i principi attivi con azione dietetica, alimentare e/o nutraceutica sono scelti tra vitamine, come ad esempio vitamina A, D, E, K, vitamine del gruppo B, acido pantotenico, minerali, come ad esempio sali di magnesio, calcio, fosforo, ferro, zinco, rame, manganese, fluoro, selenio cromo, molibdeno, iodio, boro, potassio, cloro, sodio, silicio, e altre sostanze ad effetto nutritivo e/o fisiologico quali: aminoacidi essenziali, aminoacidi ramificati, acido idrossi-isocaprilico (HICA), acido ialuronico, acido linoleico coniugato (CLA), acido nervonico, alfa chetoisocaproato (KIC), arabinogalattano, arabinoxilano, arginina alfa chetoglutarato (AAKG), astaxantina, betalanina, betaina, beta glucani, butirrato, caffeina, carnosina, chitosano, citicolina, clorofilla, coenzima Q10, ubichinolo, colina, collagene, colostro, condroitinsolfato, creatina, dimetilglicina, enzimi come alfagalottosidasi, bromelina, enzimi da maltodestrine fermentate, lattasi, betagalattosidasi, papaina o superossidodismutasi, epigallocatechingallato, fitosteroli, flavonoidi come quercetina, quercitrina, rutina, spireoside, esperidina, esperitina o diosmina, fosfolipidi come fosfatidilcolina, fosfatidilserina o fosfoserina, GABA, gamma orizanolo, glicerofosfoseriletanolamina, glicociamina, glucomannano, glucosamina, glucuronolattone, glutatione, gomma di guar, idrossitirosolo/polifenoli da olivo, inositolo, isoflavoni, lattoferrina, lattulosio, licopene, luteina, melatonina, N-acetil-D-glucosamina, NADH, naringina, norvalina, nucleotidi, olio di pesce (DHA-EPA) omotaurina, ornitina alfa-chetoglutarato (OKG) o palmitoiletanolamide (PEA).
In un ulteriore aspetto preferito della presente invenzione detti ulteriori principi attivi sono presenti in una quantit? compresa tra 1 e 20% in peso, preferibilmente fra 5 e 15% in peso, rispetto al peso totale della formulazione.
Gli eccipienti fisiologicamente accettabili utilizzabili per le formulazioni secondo la presente invenzione possono essere scelti tra diluenti, lubrificanti, aggreganti, disgreganti, filmanti, coloranti, edulcoranti o aromatizzanti, o antiossidanti-antimicrobici.
Preferibilmente, gli eccipienti fisiologicamente accettabili utilizzabili nelle formulazioni della presente invenzione sono scelti tra citrato di sodio, calcio, magnesio, potassio, fosfato di sodio, calcio, magnesio, potassio, magnesio ossido leggero, magnesio idrossido, magnesio idrossicarbonato, carbonato di sodio, cloruro di sodio, carbonato di potassio, bicarbonato di sodio, bicarbonato di potassio, acido adipico, acido citrico, acido tartarico, acido alginico, acido stearico e i suoi sali, acido oleico, l-leucina, glicerol beenato, idrossipropilmetilcellulosa, oli vegetali idrogenati,come olio di palma, burro di palma, burro di cacao, pasta di cacao, cacao in polvere, xilitolo, maltitolo, sorbitolo, mannitolo, sucralosio, acesulfame K, sodio ciclammato, aspartame, saccarosio, eritritolo, estratto di citrus, fruttosio, destrosio, maltosio, malto spraizzato, aspartato di sodio, neoesperidina, maltodestrine, inositolo, inulina, lievito di birra, gel di silice, fibre vegetali, come la fibra di pisello, chitosano, aromatizzanti, come oli essenziali, polveri o simili), menta piperita, menta crispa o menta dolce, anetolo della badiana, vaniglia, salvia, fegato, glutammato di sodio, farina di pesce, pollo, pompelmo, pesca, lime o loro miscele.
Secondo un ulteriore aspetto preferito della presente invenzione dette formulazioni farmaceutiche possono essere somministrate per via orale, topica, rettale o vaginale.
Preferibilmente, quando la somministrazione delle formulazioni farmaceutiche dell?invenzione viene effettuata per via orale, la forma farmaceutica ? scelta tra compressa, capsula, granulo, polvere, perla oleosa, soluzione o sospensione, e ancora pi? preferibilmente detta forma orale ? scelta tra compressa, capsula, granulo, polvere o soluzione.
Preferibilmente, quando la somministrazione delle formulazioni farmaceutiche dell?invenzione viene effettuata per via topica, la forma farmaceutica ? scelta tra crema, unguento, gel, pomata, soluzione, lavaggio (soluzione o sospensione), gocce, tampone (soluzione tampone), sospensione, collirio, spray, salvietta o polvere, cerotti e preferibilmente ? scelta tra crema, gel, spray, supposte o unguento.
Preferibilmente, quando la somministrazione delle formulazioni farmaceutiche dell?invenzione viene effettuata per via rettale, la forma farmaceutica ? scelta tra crema, supposta o un clistere.
Preferibilmente, quando la somministrazione delle formulazioni farmaceutiche dell?invenzione viene effettuata per via vaginale, la forma farmaceutica ? scelta tra crema, ovulo, salvietta o cannula.
Preferibilmente dette formulazioni farmaceutiche sono per l?uso nella prevenzione e nel trattamento delle infezioni vaginali, delle infezioni e/o infiammazioni gastrointestinali, della secchezza e irritazione delle mucose indotta da infezione vaginale, nel riparo di ferite e ustioni, rigenerazione dei tessuti epiteliali interni ed esterni, nel ripristino del microbiota intestinale ed epiteliale, e nella riduzione dell?infiammazione.
DEFINIZIONI
Se non diversamente definito, tutti i termini dell?arte, notazioni e altri termini scientifici qui utilizzati sono destinati ad avere i significati comunemente compresi da coloro che sono esperti nella tecnica a cui questa descrizione appartiene. In alcuni casi, termini con significati comunemente compresi sono qui definiti per chiarezza e/o per pronto riferimento; l?inserimento di tali definizioni nella presente descrizione non deve quindi essere interpretata come rappresentativa di una differenza sostanziale rispetto a quanto ? generalmente compreso nell?arte.
Il termine "eccipiente fisiologicamente accettabile" si riferisce a una sostanza priva di qualsiasi effetto farmacologico proprio e che non produce reazioni avverse quando somministrato ad un mammifero, preferibilmente a un essere umano. Eccipienti fisiologicamente accettabili sono ben noti nell?arte e sono descritti, ad esempio nell?Handbook of Pharmaceutical Excipients, sixth-edition (2009), qui incorporato per riferimento.
I termini ?comprendente?, ?avente?, ?includente? e ?contenente? sono da intendersi come termini aperti (cio? il significato ?comprendente, ma non limitato a?) e sono da considerarsi come un supporto anche per termini come ?consistere essenzialmente di?, ?consistente essenzialmente di?, ?consistere di? o ?consistente di?.
Con il termine ?germogliazione? secondo la presente invenzione si intende l?attivazione di processi vitali e metabolici necessari per la riproduzione del seme.
Con il termine ?trattamento termico? secondo la presente invenzione si intende il riscaldamento a una temperatura superiore a 40 ?C, preferibilmente superiore a 55 ?C.
Con il termine ?sterilizzazione? secondo la presente invenzione si intende un processo di riscaldamento eseguito ad una temperatura compresa tra 105 e 135 ?C per un periodo compreso fra 5 secondi e 30 minuti, pi? preferibilmente ad una temperatura di 110-130 ?C per un periodo compreso fra 20 secondi e 20 minuti, ancora pi? preferibilmente ad una temperatura di circa 121 ?C per circa 15 minuti.
Con il termine ?pastorizzazione? secondo la presente invenzione si intende un processo di riscaldamento eseguito ad una temperatura compresa tra 60 e 95 ?C per un periodo compreso fra 10 e 60 minuti, preferibilmente fra 80 e 95 ?C per un periodo compreso fra 10 e 20 minuti.
Con il termine ?termizzazione? secondo la presente invenzione si intende un processo di riscaldamento effettuato ad una temperatura compresa fra 50 e 75 ?C per un periodo compreso fra 30 minuti e 5 ore, preferibilmente ad una temperatura compresa fra 50 e 55 ?C per un periodo compreso fra 10 minuti e 2 ore.
Con il termine ?idrolisi? secondo la presente invenzione si intende il trattamento dei chicchi di riso integrale micronizzati in presenza di alfabeta-amilasi e acqua per trasformare gli amidi in malti e zuccheri semplici. Con il termine ?micronizzazione? secondo la presente invenzione si intende un processo di micromacinazione dei chicchi di riso fino ad ottenere particelle di dimensioni inferiori ai 100 micron.
Con il termine ?prebiotici? secondo la presente invenzione si intende ogni sostanza che, presente nel cibo, non viene assorbita dall?organismo ma ? utilizzata dalla flora intestinale.
Con il termine ? fruttoligosaccaridi? (FOS), chiamati anche oligofruttosio o oligofruttani, secondo la presente invenzione si intendono degli oligosaccaridi (fruttani) catena corta presenti in diverse specie di vegetali, dove svolgono il ruolo di riserva energetica.
Con il termine ?galatto-oligosaccaridi?, noti anche come oligogalattosillattosio, oligogalattosio, oligolattosio o transgalactooligosaccaridi, secondo la presente invenzione si intendono oligosaccaridi formati da galattosio e glucosio.
Con il termine ?coltura starter? secondo la presente invenzione si intende una preparazione contenente ceppi selezionati di microorganismi utile per essere inoculata e per condurre il processo di fermentazione.
SEZIONE SPERIMENTALE
A titolo puramente esemplificativo e non limitativo, di seguito si riportano alcune forme di realizzazione della presente invenzione.
MATERIALI E METODI
Preparazione di composizioni a base di riso integrale germogliato
Per la preparazione delle composizioni utilizzate nell?invenzione vengono eseguiti i seguenti passaggi.
I semi di riso integrale sono sottoposti a germogliazione in acqua. La germogliazione avviene a temperature tra 10 ?C e 50?C in presenza di una quantit? di acqua compresa tra il 30% e l?80% in peso rispetto al peso totale della composizione.
Una volta germogliati i chicchi di riso possono essere trattati al calore con vapore o in acqua, secondo tecniche note, a temperature comprese tra 40-135? C.
Successivamente, i chicchi di riso germogliato (trattati al calore o non trattati) sono sottoposti ad un trattamento di micronizzazione con mulino colloidale, in modo da ottenere particelle di dimensione media compresa tra 10 e 100 ?m, preferibilmente tra 25 e 50 ?m. Anche questa fase del processo ? condotta in acqua per limitare il surriscaldamento dei nutrienti e dunque la loro termo-degradazione e/o ossidazione.
I chicchi di riso germogliati e micronizzati possono essere successivamente sottoposti ad un processo di idrolisi, che ? condotto preferibilmente in acqua in presenza dell?enzima alfa-beta-amilasi, per trasformare gli amidi in malti e zuccheri semplici.
Composizione 1
5 kg di semi di riso integrale sono sottoposti a germogliazione in un contenitore contenente circa 10 litri di acqua. La germogliazione avviene a una temperatura di 25 2 ?C per 48 ore.
Una volta germogliati i chicchi di riso disposti nel contenitore sono trattati con vapore ad una temperatura di circa 121 ?C per 15 minuti, per ridurre la carica microbica presente nella composizione.
Successivamente la composizione ottenuta di riso germogliato viene sottoposta a micronizzazione in mulino colloidale, in modo da ottenere particelle di dimensione media compresa tra 10 e 100 ?m. Anche questa fase del processo ? condotta in presenza di acqua per limitare il surriscaldamento dei nutrienti e dunque la loro termo-degradazione e/o ossidazione.
La composizione ottenuta (2kg) viene incubata in presenza di 2 g di enzima alfa-beta-amilasi/kg di composizione, per trasformare gli amidi in malti e zuccheri semplici per 1 ora a 37 ?C.
Composizione 2 (Matrice K)
5 kg di semi di riso integrale sono sottoposti a germogliazione in un contenitore contenente circa 10 litri di acqua. La germogliazione avviene a ad una temperatura di 25 2 ?C per 48 ore.
Una volta germogliati i chicchi di riso sono sottoposti a micronizzazione con mulino colloidale in acqua, in modo da ottenere particelle di dimensione media compresa tra 10 e 100 ?m.
Preparazione della miscela per isolamento dei ceppi
Le due composizioni di riso integrale germogliato ottenute come riportato sopra vengono combinate in una miscela, in un rapporto di 5% in peso di composizione 1 e 95% in peso di composizione 2, e incubate ad una temperatura compresa fra 37+4 ?C per 16-20 ore in un contenitore adeguato.
Al termine dell?incubazione della miscela sono stati isolati 60 ceppi batterici che sono stati screenati per le loro caratteristiche tecnologiche e funzionali. Tra i 60 ceppi analizzati sono stati scartati quelli che non avevano capacit? acidificante e coagulante, quelli che non avevano attivit? proteolitica o lipolitica, e quelli che non avevano capacit? di produrre diacetile o esopolisaccaridi. Alcune caratteristiche dei ceppi analizzati sono riportate nella tabella 17.
Viene riportato qui di seguito in dettaglio il processo di isolamento e caratterizzazione dei ceppi isolati.
Processo di isolamento dei ceppi di Lattobacilli probiotici CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3
DaIla miscela sopra ottenuta a base di riso integrale germogliato sono stati isolati 60 ceppi di batteri lattici, presso il Dipartimento di Agricoltura, Alimentazione e Ambiente dell?Universit? degli Studi di Catania. La ricerca ? stata condotta sotto la responsabilit? scientifica della prof.ssa Cinzia Randazzo. I ceppi sono stati studiati dal punto di vista fenotipico, genotipico, tecnologico e funzionale e sulla base delle migliori performance tecnologiche, funzionali e di sicurezza, sono stati selezionati e caratterizzati i nuovi ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3. In dettaglio, per l?isolamento dei ceppi ? stato impiegato il terreno di coltura De Man Rogosa and Sharpe agar (MRS). Gli isolati sono stati sottoposti a strisci di purificazione su terreno agarizzato nonch? propagazione su terreno liquido. Ciascun isolato ? stato sottoposto a caratterizzazione fenotipica mediante: osservazione al microscopio, colorazione di Gram, test della catalasi. Tutti gli isolati non-sporigeni, Gram-positivi, catalasi negativi sono stati propagati in brodo MRS (2% v/v), in condizioni di microaerofilia, e conservati a -80 ?C in mezzo liquido integrato con glicerolo come crioprotettore.
Caratterizzazione dei ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3
Mediante caratterizzazione genotipica, basata sullo studio del gene Tuf, ? stato possibile ascrivere i ceppi alla specie Lactobacillus paracasei. I ceppi sono stati, inoltre, sottoposti al sequenziamento del 16S rDNA confermando l?appartenenza dei ceppi alla specie sopramenzionata. I ceppi sono stati, quindi, studiati per le performance tecnologiche, di sicurezza e funzionali mediante test in vitro.
Studio delle performance tecnologiche e probiotiche dei ceppi CMR.V1 (DSM n.33253), CMR.V2 (DSM n.33254) e CMR.V3 (DSM n.33316). La caratterizzazione tecnologica ha riguardato lo studio delle seguenti performance: attivit? proteolitica, attivit? lipolitica, attivit? acidificante in BioSuRice? Cream, attivit? coagulante in BioSuRice? Cream, produzione di diacetile, produzione di esopolisaccaridi, attitudine alla liofilizzazione. I tre ceppi selezionati hanno mostrato attivit? proteolitica e lipolitica, ottima attivit? acidificante e coagulante in BioSuRice? Cream.
I ceppi sono risultati essere produttori di esopolisaccaridi e di diacetile, mostrando, in aggiunta, attitudine alla liofilizzazione. I ceppi sono stati anche studiati per le performance funzionali mediante valutazione della resistenza al lisozima, a bassi valori di pH, alla bile, alla digestione gastrointestinale simulata, attivit? antimicrobica nei confronti di microrganismi patogeni, attivit? antiinfiammatoria in cellule epatiche e in macrofagi, attivit? antiossidante. Inoltre, in accordo con quanto riportato nelle linee guide per probiotici e prebiotici, redatte dal Ministero della Salute, i ceppi sono anche stati sottoposti a valutazione dei requisiti di sicurezza.
In dettaglio, sono state studiate l?attivit? emolitica, la capacit? di produrre DNAse e gelatinasi, nonch? l?antibiotico resistenza nei confronti di svariati antibiotici di cui l?EFSA ha stabilito i valori di breackpoint.
Di seguito si elencano le propriet? dei ceppi autoctoni CMR.V1 (DSM 33253), CMR.V2 (DSM 33254) e CMR.V3 (DSM 33316) ascritti alla specie L. paracasei supportate dai risultati sperimentali di seguito riportati. Tali risultati per comodit? sono suddivisi in:
- Performance tecnologiche;
- Performance funzionali;
- Performance di sicurezza.
Performance tecnologiche
a. Attivit? proteolitica
L'attivit? proteolitica extracellulare ? stata determinata in piastra impegnando il substrato di crescita Plate Count Agar (PCA, Oxoid) addizionato del 10% (p/v) di skim milk (Oxoid). Colture cellulari in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/ml) sono state trasferite in piastra mediante spot e incubate a 37 ?C per 72 h. Dopo incubazione, HCl all'1% ? stato distribuito sulla superficie delle piastre. L'attivit? proteolitica ? stata indicata dalla presenza di una zona chiara attorno alle colonie. I risultati sono stati espressi come (presenza di attivit?) e ? (assenza di attivit?). Tabella 1. Valutazione attivit? proteolitica
Tutti i ceppi testati hanno esibito attivit? proteolitica comprovata dalla comparsa, dopo incubazione a 37 ?C per 72 h, di una zona chiara attorno allo spot delle colonie.
b. Attivit? lipolitica
L'attivit? lipolitica ? stata valutata in piastra impiegando il terreno di coltura Tributyrin Agar (Merck, Germania). Colture cellulari in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/ml) sono state trasferite in piastra mediante spot e incubate a 37 ?C per 72 h. L'attivit? lipolitica ? stata rilevata da una zona chiara che circonda la crescita. I risultati sono stati espressi come (presenza di attivit?) e ? (assenza di attivit?).
Tabella 2. Valutazione attivit? lipolitica
Tutti i ceppi testati hanno esibito attivit? lipolitica comprovata dalla comparsa, dopo incubazione a 37 ?C per 72 h, di una zona chiara attorno allo spot delle colonie.
c. Attivit? acidificante
Colture cellulari in fase esponenziale di crescita sono state trasferite (1% v/ v) in provette contenenti 10 ml di BioSuRice? Cream e incubate a 37 ?C. Il pH ? stato misurato dopo 0, 2, 4, 6, 12, 24 e 48 ore di incubazione usando un pHmetro. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. I risultati sono riportati come variazione di pH (?pH).
Tabella 3. Valutazione attivit? acidificante
Tutti i ceppi testati hanno esibito una buona attivit? acidificante in BioSuRice? Cream comprovata dalla significativa riduzione del pH nell?intervallo di tempo considerato.
d. Attivit? coagulante
Colture cellulari in fase esponenziale di crescita sono state trasferite (1% v/ v) in provette contenenti 10 ml di BioSurice? Cream e incubate a 37 ?C per 6 ore. L?attivit? coagulante ? stata valutata tenendo conto della compattezza del coagulo generato dopo incubazione alla temperatura ottimale di crescita.
I risultati sono stati riportarti come:
- (assenza di coagulo);
(coagulo poco compatto);
+ (coagulo compatto);
++ (coagulo molto compatto).
Tabella 4. Valutazione attivit? coagulante
Tutti i ceppi testati hanno esibito una buona attivit? coagulante dopo incubazione a 37 ?C per 6 ore, comprovata dalla formazione di un coagulo compatto.
e. Produzione di diacetile
Colture cellulari in fase esponenziale di crescita sono state trasferite (1% v/ v) in tubi sterili contenenti latte UHT addizionati di ?-naftolo (1 % w / v) e KOH (16 % w / v) e incubati a 37 ?C per 10 minuti. La produzione di diacetile ? dimostrata dalla formazione di un anello rosso nella parte superiore delle provette. In relazione all?intensit? della colorazione rossa presente nella parte superiore dei tubi, i ceppi sono stati classificati come caratterizzati da (tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato):
? (nessuna produzione);
(bassa produzione);
+ (media produzione);
++ (elevata produzione).
Tabella 5. Produzione di acetile
Tutti i ceppi testati hanno esibito capacit? di produrre diacetile.
f. Produzione di esopolisaccaridi (EPS)
E? stata testata in piastra mediante loop touch test. Colture cellulari in fase esponenziale di crescita sono state propagate in terreno di coltura De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar (Oxoid). Dopo incubazione a 37 ?C per 48 ore, la produzione di EPS ? stata valutata sulla base della presenza colonie mucoidi. I ceppi sono stati classificati come:
- (non produttori);
(bassa produzione);
+ (media produzione);
++ (elevata produzione).
Tabella 6. Valutazione della produzione di esopolisaccaridi
Tutti i ceppi testati hanno esibito capacit? di produrre EPS dopo incubazione a 37 ?C per 48 ore.
g. Attitudine alla liofilizzazione
L?attitudine alla liofilizzazione dei ceppi in studio ? stata comprovata dalla capacit? di mantenere inalterata la densit? di popolazione dopo il trattamento. Tutti e 3 i ceppi sono stato liofilizzati presso la Veneto Agricoltura.
Performance funzionali
I ceppi autoctoni CMR.V1 (DSM 33253), CMR.V2 (DSM 33254) e CMR.V3 (DSM 33316), ascritti alla specie L. paracasei, hanno dimostrato di possedere:
- Resistenza al lisozima,
- Resistenza a bassi valori di pH,
- Resistenza alla bile,
- Resistenza durante simulazione della digestione gastrointestinale Di seguito dettagli delle caratterizzazioni funzionali effettuate.
a. Resistenza al lisozima
La capacit? dei ceppi in studio di sopravvivere in presenza di lisozima ? stata valutata in brodo MRS dopo 0, 30, e 120 minuti di incubazione a 37 ?C. La tolleranza al lisozima ? stata determinata mediante conteggio in piastra delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati sono riportati come media e deviazione standard. Per ciascun ceppo ? stata valutata la % di sopravvivenza, calcolata tenendo conto della densit? di popolazione finale (cfuF) e iniziale (cfuI) (cfuF/cfuI *100) e il valore 80% ? stato considerato come limite minimo di sopravvivenza.
Tabella 7. Valutazione della resistenza al lisozima
Tutti i ceppi testati hanno mostrato capacit? di sopravvivere in presenza di lisozima, presentando % di sopravvivenza maggiore all?80% dopo incubazione a 37 ?C per 120 minuti. La percentuale di sopravvivenza dopo 120 min ? pari a 87.1%, 86.6% e 91.1% rispettivamente per i ceppi CMR.V1, CMR.V2, e CMR.V3.
b. Tolleranza a bassi valori di pH
La capacit? dei ceppi di tollerare bassi valori di pH ? stata testata in brodo MRS acidificato a pH 2.0 e pH 3.0 mediante di HCl 1 M. MRS a pH 6.2 ? stato usato come controllo. I ceppi in studio sono stati rivitalizzati in brodo MRS e la sospensione cellulare in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/mL) ? stata inoculata nel mezzo di coltura acidificato. Aliquote sono state prelevate immediatamente dopo l'inoculo (0 ore) e dopo 2 e 4 ore di incubazione a 37 ?C. La tolleranza ai bassi valori di pH ? stata determinata mediante conteggio in piastra delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati sono riportati come media e deviazione standard. Per ciascun ceppo ? stata valutata la % di sopravvivenza, calcolata tenendo conto della densit? di popolazione finale (cfuF) e iniziale (cfuI) (cfuF/cfuI *100), e il valore 80% ? stato considerato come limite minimo di sopravvivenza.
Tabella 8. Valutazione della resistenza a pH bassi
Tutti i ceppi testati hanno mostrato capacit? di sopravvivere a pH 3.0 e 2.0, presentando % di sopravvivenza maggiore all?80% dopo incubazione a 37 ?C per 4 ore.
La percentuale di sopravvivenza a pH 3.0 dopo 4 ore ? pari a 90.7%, 96.0% e 97.3% rispettivamente per i ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3. La percentuale di sopravvivenza a pH 3.0 dopo 4 ore ? pari a 87.6%, 90.0% e 95.3% rispettivamente per i ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3. c. Tolleranza ai sali di bile
La capacit? dei ceppi di sopravvivere in presenza di sali di bile (bovine bile salts, Oxgall; Sigma-Aldrich), a concentrazioni finali dello 0.5% e dell?1.0% ? stata valutata come segue. I ceppi in studio sono stati rivitalizzati in brodo MRS e la sospensione cellulare in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/mL) ? stata inoculata in brodo MRS contenente le percentuali di sali di bile sopra riportate. MRS senza sali di bile ? stato utilizzato come controllo. Aliquote sono state prelevate immediatamente dopo l'inoculo (0 ore) e dopo 2 e 4 ore di incubazione a 37 ?C e si ? proceduto al conteggio in piastre delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati sono riportati come media e deviazione standard. Per ciascun ceppo ? stata valutata la % di sopravvivenza, calcolata tenendo conto della densit? di popolazione finale (cfuF) e iniziale (cfuI) (cfuF/cfuI *100), e il valore 80% ? stato considerato come limite minimo di sopravvivenza.
Tabella 9. Valutazione resistenza alla bile
Tutti i ceppi testati hanno mostrato capacit? di sopravvivere in presenza di sali di bile alle concentrazioni dello 0.5% e 1%.
La percentuale di sopravvivenza allo 0.5% di sali bile dopo 4 ore di incubazione ? pari a 82.1%, 88.6% e 89.4% rispettivamente per i ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3.
La percentuale di sopravvivenza all?1% di sali di bile dopo 4 ore ? pari a 83.0%, 85.5% e 88.9% rispettivamente per i ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3.
d. Sopravvivenza durante simulazione della digestione GI
La capacit? dei ceppi in studio di sopravvivere durante il transito gastrointestinale (GI) ? stata determinata in vitro impiegando succo gastrico simulato (SGJ) e su fluido intestinale simulato (SIF). In dettaglio, SGJ (0.3% pepsina, 0.5% NaCl, aggiustato a pH 2 aggiungendo HCl 1 M) e SIF (0.1% pancreatina, 0.5% sale biliare, 0.5% NaCl, 0.4% fenolo, aggiustati a pH 8 aggiungendo 1 M NaOH) sono stati preparati immediatamente prima dell'uso e sterilizzati utilizzando un filtro in acetato di cellulosa da 0.22 ?m (filtri Minisart, Tutti i prodotti chimici sono stati ottenuti da
Colture cellulari in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/ml) sono state pellettizzate mediante centrifugazione e risospese in tampone fosfato (PBS). La sospensione cellulare ottenuta ? stata miscelata con SGJ e incubata per 2 ore a 37 ?C, in condizioni di microaerofilia sotto agitazione (200 rpm). Le cellule, pellettizzate per centrifugazione, sono state nuovamente sospese in SIF e incubate a 37 ?C per 3 ore. Le cellule trattate con SGJ e SGJ-SIF sono state sottoposte a conteggio in piastra delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati sono riportati come media e deviazione standard. Per ciascun ceppo ? stata valutata la % di sopravvivenza, calcolata tenendo conto della densit? di popolazione finale (cfuF) e iniziale (cfuI) (cfuF/cfuI *100), e il valore 80% ? stato considerato come limite minimo di sopravvivenza.
Tabella 10. Sopravvivenza durante simulazione della digestione GI
Tutti i ceppi testati hanno mostrato capacit? di sopravvivere durante simulazione della digestione GI presentando % di sopravvivenza maggiore all?80% dopo incubazione a 37 ?C. La percentuale di sopravvivenza dopo trattamento con SIF ? pari a 86.8%, 84.0% e 89.3% rispettivamente per i ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3.
e. Attivit? antimicrobica
I ceppi in studio sono stati testati per l'attivit? antagonistica usando Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Listeria monocytogenes DSM 12464, e Salmonella enterica serovar typhimurium ATCC 14028 come batteri bersaglio. Il test ? stato eseguito mediante agar spot test. Dopo incubazione a 37 ?C per 48 ore, l?attivit? antimicrobica ? stata valutata mediante misura dell?alone di inibizione ottenuto. I risultati sono stati espressi come:
? (nessuna attivit?);
(alone di inibizione di diametro <10 mm;
+ (alone di inibizione di diametro compreso tra 11 e 20 mm);
++ (alone di inibizione di diametro > 20 mm).
Tabella 11. Valutazione attivit? anti-microbica
Tutti i ceppi testati hanno mostrato attivit? antimicrobica nei confronti dei patogeni testati.
La massima attivit? antimicrobica contro Escherichia coli ? stata esibita dal ceppo CMR.V3.
f. Attivit? anti-infiammatoria in macrofagi
Le linee cellulari LX-2 e U937, utilizzate come modello in vitro di infiammazione, sono state sospese in Dulbecco?s modified Eagle?s medium (DMEM) 1 g/L D-glucosio integrato con 10% v / v di siero bovino (FBS) (Invitrogen,
1% di penicillina/streptomicina e 60 mg/mL di gentamicina (Gibco). Le cellule U937 sono state differenziate in macrofagi attraverso il trattamento con 200 nM di PMA (Phorbol 12-miristato 13-acetato) per 72 h. Al fine di simulare il processo infiammatorio, le cellule sono state pretrattate con lipopolisaccaride (LPS) ad una concentrazione di 100 ng/mL per 2 ore. L'effetto antinfiammatorio dei ceppi in studio ? stato valutato trattando le cellule differenziate con i medium condizionati dei ceppi batterici alla concentrazione di 10 ?g/mL per 6 ore. Alla fine del trattamento, le cellule sono state lavate con PBS, raccolte mediante tripsinizzazione e quindi lisate per l'estrazione dell?RNA. La quantificazione dei geni IL-8 (Interleuchina-8) e IL-10 ? stata effettuata mediante real-time qRT-PCR.
Tabella 12. Valutazione attivit? anti-microbica
Dall?analisi effettuata si evince che tutti i ceppi presentano attivit? antiinfiammatoria in macrofagi, determinando la riduzione dell?interleuchina pro-infiammatoria IL-8 e l?incremento l?interleuchina antiinfiammatoria IL-10. g. Attivit? antiossidante
I ceppi in studio sono stati testati per l'attivit? antiossidante impiegando 1 mL di surnatante (privo di cellule) addizionato di 1 mL di PBS (0.1 M, pH 7.0) e 1 mL di acido linoleico (50 mM) in etanolo (99.5%). L'ossidazione ? stata misurata mediante determinazione del tiocianato ferrico. Idrossitoluene butilato (BHT) e ?-tocoferolo (1 mg/mL) sono stati usati come controlli positivi. Il brodo MRS ? stato impiegato come controllo negativo. I risultati sono espressi come valori di assorbanza a 500 mn. L?analisi ? stata effettuata in triplicato.
Tabella 13. Valutazione attivit? anti-ossidante
I ceppi testati hanno mostrato attivit? antiossidante.
3. Performance di sicurezza
In accordo con quanto riportato nelle linee guide per probiotici e prebiotici, redatte dal Ministero della Salute, i ceppi autoctoni CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3, ascritti alla specie L. paracasei sono stati sottoposti a valutazione dei requisiti di sicurezza. In dettaglio, sono state studiate l?attivit? emolitica, la capacit? di produrre DNAse e gelatinasi, nonch? l?antibiotico resistenza nei confronti di svariati antibiotici di cui l?EFSA ha stabilito i valori di breakpoint.
I ceppi in studio soddisfano i requisiti di sicurezza d?uso ed in particolare: - Nessuna attivit? emolitica;
- Nessuna capacit? di produrre DNAse e gelatinasi;
- Esclusa la presenza di antibiotico-resistenza acquisita;
- Esclusa la presenza di antibiotico-resistenze potenzialmente trasmissibili.
Di seguito dettagli delle caratterizzazioni effettuate.
a. Attivit? emolitica
I ceppi in studio sono stati rivitalizzati in terreno brodo MRS e incubati a 37 ?C per 18-24 ore. Le colture cellulari in fase esponenziale di crescita sono state trasferite, mediante striscio di propagazione, in piastre Blood Agar contenenti il 5% di sangue defibrinato di montone (Biolife, Milano, Italia) e incubate a 37 ?C per 24?48 h. L'attivit? emolitica ? stata rilevata visivamente e distinta come ?-emolisi, ?-emolisi o ?-emolisi basata sulla presenza di une zone chiare, aloni verdi o nessuna zona intorno alle colonie, rispettivamente.
I risultati sono stati espressi come (presenza di attivit?) e ? (assenza di attivit?).
Tabella 14. Valutazione attivit? emolitica
Nessuno dei ceppi testati ha mostrato attivit? emolitica.
b. Capacit? di produrre DNase e gelatinase
La produzione di DNAse ? stata testata trasferendo 5 ?l di una coltura cellulare in fase esponenziale di crescita su piastre di DNAse agar (Oxoid). Dopo incubazione a 37 ?C per 48 ore, le piastre sono state coperte con HCl 1 N per 5 minuti. La presenza di zone chiare intorno alle colonie viene considerata come indicatore di positivit? alla produzione di DNase. La produzione di gelatinase ? stata valutata utilizzando piastre di agar gelatina (30 g/L di gelatina, 5 g/L di peptone, 3 g/L di estratto di lievito e 17 g/L di agar). Dopo incubazione a 37 ?C per 48 h, la superficie delle piastre ? stata ricoperta con ammonio solfato saturo (Meck). La presenza di zone chiare intorno alle colonie viene considerata come indicatore di positivit? dell?attivit? gelatinasica. Per entrambi i test i risultati sono stati espressi come: - (assenza di attivit?), (presenza di attivit?).
Tabella 15. Produzione gelatinasi e DNasi
Nessuno dei ceppi testati ha mostrato capacit? di produrre DNAse.
Deposito dei ceppi presso collezione internazionale DSMZ
I ceppi CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3 sono stati depositati presso il Leibniz Institute DSMZ ? German Collection of Microorganisms and Cell cultures GmbH) (vedi allegato). Sono stati attribuiti i seguenti codici:
DSM 33253: ceppo CMR.V1
DSM 33254: ceppo CMR.V2
DSM 33316: ceppo CMR.V3
Riassunto delle performance ottenute dai ceppi isolati
Di seguito si riportano i risultati delle performance tecnologiche e probiotiche dei ceppi CMR.V1 (DSM 33253), CMR.V2 (DSM 33254) e CMR.V3 (DSM 33316) ascritti alla specie Lactobacillus paracasei.
Tabella 16. Propriet? dei ceppi isolati
Nella Tabella 17 sotto indicata sono riassunte le caratteristiche di 40 dei ceppi analizzati.
Tabella 17. Riassunto delle caratteristiche dei ceppi isolati
LEGENDA EPS: esopolisaccaridi; nt: non testato.
Attivit? coagulante: - (assenza di coagulo); (coagulo poco compatto); + (coagulo compatto); ++ (coagulo molto compatto).
Attivit? proteolitica e lipolitica: (presenza di attivit?); ? (assenza di attivit?).
Produzione di diacetile: ? (nessuna produzione); (bassa produzione); + (media produzione); ++ (elevata produzione).
Produzione di EPS: - (non produttori); (bassa produzione); + (media produzione); ++ (elevata produzione).
Tutti i ceppi isolati hanno presentato capacit? coagulante in BioSurice? Cream. L?82.5% dei ceppi testati ha mostrato attivit? coagulante in BioSurice? Cream. In dettaglio, 31 ceppi su 40 hanno determinato la formazione di coagulo molto compatto; 1 ceppo ha prodotto coagulo compatto; 1 ceppo ha generato coagulo poco compatto; 8 ceppi su 40 testati non hanno esibito attivit? coagulante in BioSurice? Cream.
L?attivit? proteolitica ? stata esibita dall?82.5% dei ceppi testati (33/40).
Il 97.5% (39/40) dei ceppi testati ha mostrato attivit? lipolitica.
Solo 3 ceppi (30%) hanno mostrato produzione di diacetile, produzione di EPS e attitudine alla liofilizzazione, caratteristiche fondamentali per l?utilizzo in processi fermentativi.
Esempi di formulazioni ottenute da miscele fermentate
Formulazione 1.
La formulazione 1 ? ottenuta da un processo di fermentazione della miscela della presente invenzione in presenza di culture starter contenenti i ceppi isolati CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3.
Una miscela costituita dal 40% in peso della composizione 1 e dal 60% in peso della composizione 2 (come sopra ottenute) viene fermentata in presenza di una coltura starter comprendente 10<7 >UFC dei tre ceppi isolati di lattobacilli L. paracasei CMR.V1, CMR.V2 e CMR.V3, secondo le procedure e apparecchiature note nell?arte, ad una temperatura di fermentazione pari a 40 2 ?C e per un tempo di fermentazione di 12-15 ore.
Il prodotto ottenuto da tale fermentazione presenta un pH compreso fra 4.3 e 4.6, una consistenza cremosa e una densit? finale di lattobacilli compresa fra 10<7>-10<9 >CFU/g di miscela.
Formulazione 2
La formulazione 2 viene ottenuta mediante un processo di fermentazione della miscela della presente invenzione in presenza di una coltura starter comprendente i ceppi isolati CMR.V1 e CMR.V3.
Una miscela costituita dal 30% in peso della composizione 1 e dal 70% in peso della composizione 2 (come sopra ottenute) viene fermentata in presenza di una coltura starter comprendente 10<8 >UFC dei ceppi isolati di lattobacilli L. paracasei CMR.V1 e CMR.V3, secondo le procedure e apparecchiature note nell?arte, ad una temperatura di fermentazione pari a 42 2?C e per un tempo di fermentazione di 12-15 ore.
Il prodotto ottenuto da tale fermentazione presenta un pH compreso fra 4.3 e 4.6, una consistenza cremosa e una densit? finale di lattobacilli compresa fra 10<7>-10<9 >CFU/g di miscela.
Le formulazioni ottenute dalla fermentazione delle diverse miscele secondo la presente invenzione possono essere utilizzate per ottenere diversi tipi di preparati alimentari e di formulazioni dermocosmetiche e farmaceutiche, di cui vengono riportati qui di seguito alcuni esempi.
Esempi di preparati alimentari
Esempio 1
Yogurt bianco (vasetto da 125 g)
- Formulazione 1 124 g
- Dolcificante 1 g
- Aromatizzante 0.1g
Yogurt con frutta (vasetto da 125 g)
- Formulazione 1 100 g
- Frutta 23 g
- Conservanti 1 g
- Aromatizzanti 0.5 g
- Saccarosio 1 g
Esempio 2
Budino al cioccolato (vasetto 125 g)
- Formulazione 2 (in polvere liofilizzata) 24 g - Cioccolato 100 g - Conservanti 1 g Esempio 3
Base per pizza, focaccia o piadina
- Formulazione 2 900 g - Farina di farro 80 g - Pectina 2 g - Sale qb
Base per focaccia
- Formulazione 2 800 g - Farina di soia 150 g - Grassi vegetali 2 g - Sale qb Esempio 4
Preparato per torta
- Formulazione 1 800 g - BioSuRice? Cream 200 g Esempi di preparati dermocosmetici e farmaceutici Esempio 5
Crema idratante per viso
- Formulazione 1 80%
- Sodio benzoato 0.5% - Etil palmitato 1%
- PEG 5%
- Aloe vera 5%
- Glicerina 2%
- Acqua qb
Esempio 6
Maschera tonificante per il viso
- Combinazione di alghe 40%
- Formulazione 2 40%
- Olio di mandorla 5%
- Acqua qb
Esempio 7
Fiala con sospensione orale di lattobacilli per ripristino flora batterica intestinale
- Formulazione 1 contenente 10 miliardi di lattobacilli L. paracasei - Acqua
Parametri chimico-fisici e sostanze funzionali presenti nel componente 1, nel componente ?K? e nel prodotto fermentato.
In accordo ai protocolli ufficiali di analisi, sono state effettuate determinazioni analitiche, allo scopo di definire le caratteristiche chimicofisiche del componente 1, del componente K e di una miscela dei due componenti fermentata mediante l?impiego dei ceppi autoctoni precedentemente descritti.
Le analisi chimico-fisiche hanno previsto la determinazione quantitativa di pH, umidit?, proteine, carboidrati, grassi, ceneri, fibra alimentare, valore energetico, sostanza secca e zuccheri. In aggiunta, sono stati effettuati studi sui componenti 1 e ?K? nonch? sul prodotto fermentato ottenuto miscelando i due componenti e impiegando i ceppi starter autoctoni precedentemente descritti. Le determinazioni hanno riguardato anche la quantificazione di sostanze funzionali quali: acido lattico, acido butirrico, inositolo, GABA, orizanolo. ? stata, inoltre, determinata la concentrazione di acido fitico.
Tali composti sono stati analizzati mediante HPLC. In dettaglio, i campioni in studio sono stati sottoposti a cicli di estrazione con solventi organici (metanolo) ed acqua. Le quantit? di metanolo sono state portate a secco e quindi ri-solubilizzate in metanolo specifico per Massa.
Tabella 18. Caratteristiche chimico-fisiche e sostanze nutrizionali presenti nel componente 1, nel ?K? e nel prodotto fermentato.
Dai risultati si evince che il prodotto fermentato presenta un pi? elevato valore di GABA e orizanolo rispetto alle composizioni di partenza. L?acido fitico, notoriamente classificato come composto anti nutrizionale, risulta sotto il limite di rilevazione nel prodotto fermentato o assente.

Claims (18)

RIVENDICAZIONI
1. Miscela di riso a due o pi? componenti, in cui almeno un componente ? riso integrale germogliato micronizzato, trattato termicamente e idrolizzato.
2. Miscela secondo la rivendicazione 1, in cui almeno un componente ? riso integrale germogliato micronizzato non trattato termicamente e non idrolizzato.
3. Miscela secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzata dal fatto che detto trattamento termico ? scelto tra pastorizzazione, sterilizzazione o termizzazione.
4. Miscela secondo ognuna delle precedenti rivendicazioni, caratterizzata dal fatto che ognuna delle suddette componenti ? presente nella miscela in un quantitativo compreso fra l?1 e il 99% in peso, rispetto al peso totale della miscela, preferibilmente in un quantitativo compreso fra il 5 e l?80% in peso, rispetto al peso totale della miscela, pi? preferibilmente in un quantitativo compreso fra il 20 e il 70% in peso, rispetto al peso totale della miscela.
5. Miscela secondo la rivendicazione 4, caratterizzata dall?avere un contenuto di proteine compreso tra 0.5 e 3 g/100g di miscela totale, un contenuto di carboidrati compreso tra 10 e 30 g/100g di miscela totale e un contenuto di grassi compreso tra 0.5 e 2.5 g/100g di miscela totale.
6. Ceppo di lattobacilli L. paracasei CMR.V1 (numero di deposito DSM 33253).
7. Ceppo di lattobacilli L. paracasei CMR.V2 (numero di deposito DSM 33254).
8. Ceppo di lattobacilli L. paracasei CMR.V3 (numero di deposito DSM 33316).
9. Ceppo di lattobacilli L. paracasei secondo le rivendicazioni 6-8 isolato dalla miscela secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5.
10. Formulazione ottenibile dalla fermentazione della miscela secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in presenza di una coltura starter comprendente almeno uno dei ceppi CMR.V1, CMR.V2 o CMR.V3 e/o di una miscela degli stessi.
11. Formulazione secondo la rivendicazione 10, caratterizzata dal fatto che detta miscela viene fermentata in presenza di ulteriori ingredienti, preferibilmente scelti tra prebiotici, come inulina, frutto-oligosaccaridi, galatto-oligosaccaridi o xilitolo, gomma di guar e/o loro miscele.
12. Uso della formulazione secondo le rivendicazioni 10 o 11 nella produzione di preparati alimentari, di prodotti dermocosmetici o di formulazioni farmaceutiche.
13. Preparati alimentari contenenti dallo 0.1 al 99% in peso della formulazione secondo le rivendicazioni 10 o 11, pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 10 e il 90% in peso della formulazione, ancora pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 20 e l?80% in peso della formulazione, rispetto al peso totale della formulazione e, opzionalmente, un ulteriore ingrediente.
14. Prodotti dermocosmetici o formulazioni farmaceutiche contenenti dallo 0.1 al 99% in peso della formulazione secondo le rivendicazioni 10 o 11, pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 10 e il 90% in peso della formulazione, ancora pi? preferibilmente un quantitativo compreso fra il 20 e l?80% in peso della formulazione, rispetto al peso totale della formulazione e almeno un eccipiente fisiologicamente accettabile.
15. Preparati alimentari, prodotti dermocosmetici o formulazioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 12-14, caratterizzati dal fatto di comprendere un ulteriore principio attivo.
16. Preparati alimentari secondo le rivendicazioni 12 o 13 scelti tra bevande vegetali, yogurt, budini e sorbetti, preparati e basi per farine, prodotti lievitati, dolci, merendine, biscotti, pizze, focacce, semifreddi, crepes, gelati o torte.
17. Prodotti dermocosmetici secondo le rivendicazioni 12 o 14 scelti tra creme per il viso e per il corpo, sieri e maschere per il trattamento del corpo e dei capelli, detergenti per il viso, detergenti per il corpo, detergenti e lavande lenitive per l?igiene intima femminile e maschile, emollienti per le labbra, creme per la pelle protettive dai raggi solari, creme per il trattamento di lesioni e cicatrici della pelle, creme dermo-riparatrici o creme per il trattamento delle ragadi al seno.
18. Formulazioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 12 o 14 per uso nella prevenzione e nel trattamento delle infezioni vaginali, delle infezioni e/o infiammazioni gastrointestinali, della secchezza e irritazione delle mucose indotta da infezione vaginale, nel riparo di ferite e ustioni, rigenerazione dei tessuti epiteliali interni ed esterni, nel ripristino del microbiota intestinale ed epiteliale e nella riduzione dell?infiammazione.
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