JP7177039B2 - フィトケミカル吸収促進剤 - Google Patents
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Description
本発明において、「フィトケミカル」とは、植物中に存在する天然の化学物質およびその修飾体並びにそれらを含む組成物であって、通常の身体機能維持には必須とはされないが、健康維持・改善によい影響を与えるものとして摂取されている、または今後摂取されるものとなる化合物または組成物を意味する。従って、本発明において、フィトケミカルとは、植物由来の純粋なまたはある程度の純度を有する化合物に加え、そのような化合物を主たる成分として含む植物由来の組成物の形態のもの、例えば画分をも意味するものとする。
本発明において、フィトケミカルの吸収促進とは、フィトケミカルを、多糖体を含有する乳酸菌産生物なしで摂取した対照と比較して、体内への取り込み、特に血中への移行の速度および/または移行の量を有意に高めることを意味する。具体的には、投与後、対照と比較して高い血中濃度を生じさせる、または対照と比較して大きな血中濃度-時間曲線下面積(AUC)を生じさせることのいずれかまたは両方を意味する。それにより、より少ない量または短い時間でフィトケミカル摂取の効果が得られ、併せて原料コストを低減できる。また、本発明によるフィトケミカル吸収促進剤を飲食品、飲食品組成物に添加することで、飲食品等の付加価値を高め商品価値を上げることができる。
本発明において、多糖体を含有する「乳酸菌産生物」とは、乳酸菌発酵物に加え、乳酸菌培養物、乳酸菌代謝物等、乳酸菌の発酵により多糖体を含むことになる組成物を広く意味する。
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスとして、
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスOLL1247菌、または
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスOLL1224菌を用い、
ストレプトコッカス・サーモフィラスとして、
ストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌、または
ストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3290菌を用いる。
本発明において、「吸収促進剤」とは、「乳酸菌産生物」として乳酸菌発酵物、乳酸菌培養物、乳酸菌代謝物等の形態のまま用いられてもよいが、好ましくは製剤化して用いられる。従って、本発明において「吸収促進剤」とは、例えば、医薬品の他、そのまま摂取、好ましくは経口摂取される製剤の形態、いわゆるサプリメントの形態で提供されるものを包含し、また食品添加剤として、他の食品、飲食物に添加して、その食品、飲食物にフィトケミカル吸収促進作用を付加するために用いられるものも含まれる。
本発明において、フィトケミカル吸収促進剤の摂取量は、適宜決定されてよいが、本発明の一つの態様によれば、多糖体の摂取量が200μg以上/日となる程度の量とされ、200μg/日以上60000μg/日以下の範囲内であることが好ましく、300μg/日以上45000μg/日以下の範囲内であることがより好ましく、400μg/日以上30000μg/日以下の範囲内であることがさらに好ましく、500μg/日以上15000μg/日以下の範囲内であることが特に好ましい(なお、「質量/日以上」の表記は「質量以上/日」の表記と同義であり、「質量/日以下」の表記は「質量以下/日」の表記と同義である。)。摂取の期間も特に限定されないが、例えば少なくとも1回以上、経口摂取することが好ましい。
(人体への必要投与用量(換算値))=(動物への必要投与用量)×(女性体重下限値:40kg)÷(安全係数:100)
ヨーグルト中の多糖体含有量の測定
ヨーグルト中の多糖体の含有量は、フェノール硫酸法(Hodgeら,「Methods in carbohydrate chemistry」,第1巻,第338頁(1962年))に従って測定した。具体的には以下の通りである。
(1)ヨーグルトの調製
10質量%の脱脂粉乳を含む培地にラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)OLL1247菌、およびストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)OLS3078菌を接種した後、その培地を43℃で3時間発酵させて加熱した。このようにして得られたヨーグルトには、多糖体が110μg/g含まれていた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにケルセチン(和光純薬工業株式会社製)、ケルセチンとヨーグルトをそれぞれ投与した。ここで、ケルセチンは50mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、ケルセチンを投与したラット群(コントロール)を「ケルセチン群」と呼び、ケルセチンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「ケルセチン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
ケルセチン代謝物であるケルセチン抱合体と、イソラムネチン抱合体を以下のとおり測定した。血清50μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させたグルクロニダーゼ溶液を45μL(10000U/mL、シグマアルドリッチ社製)、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させた0.1Mアスコルビン酸溶液を5μL加え、37℃で2時間加温させた。メタノールを300μL加え、酵素反応を停止させ、遠心分離(12000rpm 、10分、4℃)した。上清を別のチューブに移し、遠心濃縮により溶媒を除去した。300μLの0.1%ギ酸含有の50%アセトニトリル溶液に溶解させ、HPLC用のサンプルを調製した。
HPLCは、Nexera XR(島津製作所製)、MS/MS検出器は4500QTRAP(サイエックス社製)を使用した。カラムは、ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×50mm)(Waters社製)を使用し、カラム温度は40℃に設定した。移動相はA液として0.1%含有ギ酸溶液、 B液として0.1%ギ酸含有アセトニトリル溶液を調製した。B液30%で1分間保持し、その後4.5分間でB液45%までグラジエントをかけ、目的の物質を溶出させた。その後、B液99%でカラムを2分間洗浄し、B液30%で3分間保持した。なお、流速は、0.3mL/分に設定した。MS/MS分析はESIネガティブモードで分析した。MS/MSの分析条件は、カーテンガス流量30psi、コリジョンガス流量9psi、イオンスプレー電圧-4500V、ターボガス温度600℃、イオンソースガス70psiに設定した。
結果は表1並びに図1および2に示される通りであった。図1はケルセチン抱合体の血清中濃度を、図2はイソラムネチン抱合体の血清中濃度をそれぞれ表すグラフである。いずれの時点においても、ケルセチン群に比べ、ケルセチン+ヨーグルト群において、ケルセチン抱合体、イソラムネチン抱合体の血清中濃度が有意に上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、ケルセチン群に比べ、ケルセチン+ヨーグルト群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がケルセチンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でケルセチン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いた脱脂粉乳およびヨーグルト
脱脂粉乳として実験例1(1)で用いた培地を、ヨーグルトとして実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにケルセチンと脱脂粉乳、ケルセチンとヨーグルトをそれぞれ投与した。ここで、ケルセチンは50mg/kg体重、脱脂粉乳とヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、ケルセチンと脱脂粉乳を投与したラット群(コントロール)を「ケルセチン+脱脂粉乳群」と呼び、ケルセチンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「ケルセチン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
ケルセチン代謝物であるケルセチン抱合体と、イソラムネチン抱合体を、実験例1に記載の方法および条件に従い行った。
結果は表2並びに図3および4に示される通りであった。図3はケルセチン抱合体の血清中濃度を、図4はイソラムネチン抱合体の血清中濃度をそれぞれ表すグラフである。ケルセチン+脱脂粉乳群に比べ、ケルセチン+ヨーグルト群において、投与後60分、120分のケルセチン代謝物、投与後60分、120分、240分のイソラムネチン抱合体の血清中濃度が有意に上昇した。その他の全ての時点において、ケルセチン代謝物又はイソラムネチン抱合体の血清中濃度が上昇した。また、ケルセチン抱合体の血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、ケルセチン+脱脂粉乳群に比べ、ケルセチン+ヨーグルト群において有意に増加した。本結果は、乳酸菌による発酵がケルセチンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でケルセチン+脱脂粉乳群に対して有意差があることを示している。
(1)ヨーグルト由来の多糖体濃縮物の調製
ヨーグルトの一部を分取し、その上清に3倍量のエタノールを添加して冷凍保管した。その後、その上清を遠心分離処理したところ、沈殿物が得られた。そして、この沈殿物を凍結乾燥して多糖体濃縮物を得た。なお、11.3gのヨーグルト中に70mgの多糖体濃縮物が含まれていた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにケルセチン、ケルセチンと多糖体濃縮物をそれぞれ投与した。ここで、ケルセチンは50mg/kg体重、多糖体濃縮物は70mg/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、ケルセチンを投与したラット群(コントロール)を「ケルセチン群」と呼び、ケルセチン多糖体濃縮物を投与したラット群(実施例)を「ケルセチン+多糖体濃縮物群」と呼ぶこととする。
ケルセチン代謝物であるケルセチン抱合体と、イソラムネチン抱合体についての測定及び分析を、実験例1に記載の方法および条件に従い行った。
結果は表3並びに図5および6に示される通りであった。図5はケルセチン抱合体の血清中濃度を、図6はイソラムネチン抱合体の血清中濃度をそれぞれ表すグラフである。ケルセチン群に比べ、ケルセチン+多糖体濃縮物群において、投与後480分のケルセチン抱合体の血清中濃度が、投与後240分、480分のイソラムネチン抱合体の血清中濃度が有意に上昇した。その他の全ての時点において、ケルセチン代謝物又はイソラムネチン抱合体の血清中濃度が上昇した。また、イソラムネチン抱合体の血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、ケルセチン群に比べ、ケルセチン+多糖体濃縮物群において有意に増加した。本結果は、多糖体を含有する乳酸菌産生物の摂取がケルセチンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でケルセチン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにゲニステイン(東京化成工業株式会社製)、ゲニステインとヨーグルトをそれぞれを投与した。なお、ゲニステインは50mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、説明の便宜上、ゲニステインを投与したラット群(コントロール)を「ゲニステイン群」と呼び、ゲニステインとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「ゲニステイン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
ゲニステイン代謝物であるゲニステイン抱合体を、以下のとおり測定した。すなわち、血清50μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させたグルクロニダーゼ溶液を45μL(10000U/mL、シグマアルドリッチ社製)、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させた0.1Mアスコルビン酸溶液を5μL加え、37℃で2時間加温させた。メタノールを300μL加え、酵素反応を停止させ、遠心分離(12000rpm 、10分、 4℃)した。上清を別のチューブに移し、遠心濃縮により溶媒を除去した。300μLの0.1%ギ酸含有の50%アセトニトリル溶液に溶解させ、HPLC用のサンプルを調製した。
HPLCは、Nexera XR(島津製作所製)、MS/MS検出器は4500QTRAP(サイエックス社製)を使用した。カラムは、ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×50mm) (Waters社製)を使用し、カラム温度は40℃に設定した。移動相はA液として0.1%含有ギ酸溶液、 B液として0.1%ギ酸含有アセトニトリル溶液を調製した。B液30%で1分間保持し、その後4.5分間でB液45%までグラジエントをかけ、目的の物質を溶出させた。その後、B液99%でカラムを2分間洗浄し、B液30%で3分間保持した。なお、流速は、0.3mL/分に設定した。MS/MS分析はESIネガティブモードで分析した。MS/MSの分析条件は、カーテンガス流量30psi、コリジョンガス流量9psi、イオンスプレー電圧-4500V、ターボガス温度600℃、イオンソースガス70psiに設定した。
結果は表4および図7に示される通りであった。投与後60分、480分において、ゲニステイン群に比べ、ゲニステイン+ヨーグルト群において、ゲニステイン抱合体の血清中濃度が有意に上昇した。その他の全ての時点において、ゲニステイン抱合体の血清中濃度が上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、ゲニステイン群に比べ、ゲニステイン+ヨーグルト群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がゲニステインの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でゲニステイン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにエピカテキン、エピカテキン(シグマアルドリッチ社製)とヨーグルトをそれぞれ投与した。なお、エピカテキンは50mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、説明の便宜上、エピカテキンを投与したラット群(コントロール)を「エピカテキン群」と呼び、エピカテキンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「エピカテキン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
エピカテキン代謝物であるエピカテキン抱合体を、以下のとおり測定した。すなわち、血清50μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させたグルクロニダーゼ溶液を45μL(10000U/mL、シグマアルドリッチ社製)、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させた0.1Mアスコルビン酸溶液を5μL加え、37℃で2時間加温させた。メタノールを300μL加え、酵素反応を停止させ、遠心分離(12000rpm 、10分、 4℃)した。上清を別のチューブに移し、遠心濃縮により溶媒を除去した。300μLの0.1%ギ酸含有の50%メタノール溶液に溶解させ、HPLC用のサンプルを調製した。
HPLCは、Nexera XR(島津製作所製)、MS/MS検出器は4500QTRAP(サイエックス社製)を使用した。カラムは、ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×50mm)(Waters社製)を使用し、カラム温度は40℃に設定した。移動相はA液として0.1%含有ギ酸溶液、 B液として0.1%ギ酸含有メタノール溶液を調製した。B液10%で1分間保持し、その後9分間でB液40%までグラジエントをかけ、目的の物質を溶出させた。その後、B液99%でカラムを2分間洗浄し、B液10%で3分間保持した。なお、流速は、0.3mL/分に設定した。MS/MS分析はESIネガティブモードで分析した。MS/MSの分析条件は、カーテンガス流量30psi、コリジョンガス流量9psi、イオンスプレー電圧-4500V、ターボガス温度600℃、イオンソースガス70psiに設定した。
結果は表5および図8に示される通りであった。投与後60分、120分、240分において、エピカテキン群に比べ、エピカテキン+ヨーグルト群において、エピカテキン抱合体の血清中濃度が有意に上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、エピカテキン群に比べ、エピカテキン+ヨーグルト群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がエピカテキンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でエピカテキン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにβカロテン、βカロテン(三栄源エフ・エフ・アイ株式会社.製)とヨーグルトをそれぞれ投与した。なお、βカロテンは5mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、説明の便宜上、βカロテンを投与したラット群(コントロール)を「βカロテン群」と呼び、βカロテンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「βカロテン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
血清50μLに、生理食塩水を90μL加え、ジクロロメタンメタノール溶液(ジクロロメタン:メタノール=1:2)を300μL加えた。さらに、ヘキサンを150μL加えβカロテンを抽出した。上層を別のチューブに移し、窒素還流により溶媒を除去した。150μLの0.1%酢酸アンモニウム含有30%酢酸エチル70%メタノール溶液に溶解させ、HPLC用のサンプルを調製した。
HPLCは、1200シリーズ(アジレントテクノロジーズ社製)を使用した。カラムは、TSKgel ODS―80TsQA(5.0×250mm)(東ソー株式会社製)を使用し、カラム温度は40℃に設定した。移動相は0.1%酢酸アンモニウム含有30%酢酸エチル70%メタノール溶液を調製した。なお、流速は、0.3mL/分に設定し、450nmの吸光波長を測定した。
結果は表6および図9に示される通りであった。いずれの時点においても、βカロテン群に比べ、βカロテン+ヨーグルト群において、βカロテンの血清中濃度が有意に上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、βカロテン群に比べ、βカロテン+ヨーグルト群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がβカロテンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でβカロテン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いた脱脂粉乳およびヨーグルト
脱脂粉乳として実験例1(1)で用いた培地を、ヨーグルトとして実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにβカロテンと脱脂粉乳、βカロテンとヨーグルトをそれぞれ投与した。なお、βカロテンは5mg/kg体重、脱脂粉乳とヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、説明の便宜上、βカロテンと脱脂粉乳を投与したラット群を(コントロール)を「βカロテン+脱脂粉乳群」と呼び、βカロテンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「βカロテン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
実験例6に記載の方法および条件に従い行った。
結果は表7および図10に示される通りであった。投与後60分において、βカロテン+脱脂粉乳群に比べ、βカロテン+ヨーグルト群において、βカロテンの血清中濃度が有意に上昇した。その他の全ての時点において、βカロテンの血清中濃度が上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、βカロテン+脱脂粉乳群に比べ、βカロテン+ヨーグルト群において増加した。本結果は、乳酸菌による発酵がβカロテンの吸収速度を増大させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でβカロテン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いた多糖体濃縮物
実験例3で調製した多糖体濃縮物を用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにβカロテン、βカロテンと多糖体濃縮物をそれぞれ投与した。なお、βカロテンは5mg/kg体重、多糖体濃縮物は70mg/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、説明の便宜上、βカロテンを投与したラット群を(コントロール)を「βカロテン群」と呼び、βカロテンと多糖体濃縮物を投与したラット群(実施例)を「βカロテン+多糖体濃縮物群」と呼ぶこととする。
実験例6に記載の方法および条件に従い行った。
結果は表8および図11に示される通りであった。投与後60分、120分において、βカロテン群に比べ、βカロテン+多糖体濃縮物群において、βカロテンの血清中濃度が有意に上昇した。その他の全ての時点において、βカロテンの血清中濃度が上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、βカロテン群に比べ、βカロテン+多糖体濃縮物群において有意に増加した。本結果は、多糖体を含有する乳酸菌産生物の摂取がβカロテンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でβカロテン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
(2)実験方法
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにリコペン(和光純薬工業株式会社製)、リコペンとヨーグルトをそれぞれ投与した。ここで、リコペンは5mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与後120分後に腹部大静脈より採血を行い、血清を得た。以下、リコペンを投与したラット群(コントロール)を「リコペン群」と呼び、リコペンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「リコペン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
血清500μLに、エタノールを500μL加えた。さらに、ヘキサンを2500μL加えリコペンを抽出した。上層を別のチューブに移し、窒素還流により溶媒を除去した。200μLの0.1%酢酸アンモニウム含有30%酢酸エチル70%メタノール溶液に溶解させ、HPLC用のサンプルを調製した。
HPLCは、1200シリーズ(アジレントテクノロジーズ社製)を使用した。カラムは、TSKgel ODS―80TsQA(5.0×250mm)(東ソー株式会社製)を使用し、カラム温度は40℃に設定した。移動相は0.1%酢酸アンモニウム含有30%酢酸エチル70%メタノール溶液を調製した。なお、流速は、0.3mL/分に設定し、470nmの吸光波長を測定した。
結果は表9に示される通りであった。投与120分後のリコペンの血清中濃度は、リコペン群に比べて、リコペン+ヨーグルト群で有意に上昇した。本結果は、ヨーグルトの摂取がリコペンの吸収を促進させることを意味する。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
(2)実験方法
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにαグルコシルルチン(和光純薬工業株式会社製)、αグルコシルルチンとヨーグルトをそれぞれ投与した。ここで、αグルコシルルチンは27mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、αグルコシルルチンを投与したラット群(コントロール)を「αGルチン群」と呼び、αグルコシルルチンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「αGルチン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
ケルセチンの代謝物であるケルセチン抱合体濃度と、イソラムネチン抱合体濃度の測定を、実験例1に記載の方法および条件に従い行った。
結果は表10並びに図12および13に示される通りであった。図12はケルセチン抱合体の血清中濃度を、図13はイソラムネチン抱合体の血清中濃度をそれぞれ表すグラフである。αGルチン群とαGルチン+ヨーグルト群の間に、ケルセチン抱合体の血清中濃度、イソラムネチン抱合体の血清中濃度に違いはみられなかった。また、ケルセチン抱合体、イソラムネチン抱合体の血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、αGルチン群とαGルチン+ヨーグルト群の間に違いはみられなかった。
(1)実験方法
エピカテキン(シグマアルドリッチ社製)、カテキン(東京化成工業株式会社製)、ケルセチン(和光純薬工業株式会社製)、ゲニステイン(東京化成工業株式会社製)、ルチン(和光純薬工業株式会社製)、αグルコシルルチン(和光純薬工業株式会社製)、ヘスペリジン(和光純薬工業株式会社製)、ナリンジン(シグマアルドリッチ社製)、ナリンゲニン(シグマアルドリッチ社製)、ケンフェロール(Extra Synthase社製)、βカロテン(和光純薬工業株式会社製)、リコペン(和光純薬工業株式会社製)を用いた。実験例に用いた投与用量に従い、エピカテキン、カテキン、ケルセチン、ゲニステイン、ナリンゲニン、ケンフェロール、ルテオリンはそれぞれ33.3mgに10mLの超純水を加えた。配糖体のフィトケミカルはアグリコン(配糖体を加水分解すると得られる糖質以外の部分)量として33.3mgと等しくなるように、ルチンは67.3mg(ケルセチンとして33.3mg)、αグルコシルルチンは89.6mg(ケルセチンとして33.3mg)、ヘスペリジンは67.3mg(ヘスペレチンとして33.3mg)、ナリンジンは71.0mg(ナリンゲニンとして33.3mg)に10mLの超純水を加えた。実験例に用いた投与用量に従い、テルぺノイドは、βカロテン、リコペンをそれぞれ3.3mgに10mLの超純水を加えた。調製した溶液を3時間振とうした後、2000×g、10分間遠心分離した。遠心上清を0.45μLのフィルターを用い濾過した。遠心上清の吸光度(エピカテキン、カテキン、ヘスペリジン、ナリンジン、ナリンゲニンは280nm、ゲニステインは260nm、ケルセチン、ルチン、αグルコシルルチン、ケンフェロールは360nm、βカロテンは450nm、リコペンは470nm)を、分光光度計を用い測定した。それぞれの化合物を80%メタノールまたはメタノールを用い溶解し、検量線を作成し、遠心上清の濃度を求めた。なお、以上の一連の操作は21±2℃の温度条件下で行った。そして、以下の式に従い、溶解率を算出した。
溶解率(%)=((振とう溶解後の遠心上清液の濃度(w/v)÷(振とう溶解前の溶液の濃度(w/v))× 100
結果は表11および表12に示される通りであった。カテキン、αグルコシルルチンは溶解率が89%以上であり水溶性のフィトケミカルであった。一方、エピカテキン、ゲニステイン、ケルセチン、ルチン、ケンフェロール、ヘスペリジン、ナリンジン、ナリンゲニン、βカロテン、リコペン、ルテオリンは溶解率が88%以下であり、難水溶性であった。これらの結果は、溶解率が88%以下の難水溶性のフィトケミカルにおいて、多糖体を含有する乳酸菌産生物の摂取がフィトケミカルの吸収を促進させることを意味する。また、溶解率測定にあたり得られた「(振とう溶解後の遠心上清液の濃度(w/v))を「飽和溶解度」と呼び、表11および表12に併せて記載した。なお、配糖体のフィトケミカルは、アグリコン換算値として記した。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにルテオリン(東京化成工業株式会社製)、ルテオリンとヨーグルトをそれぞれ投与した。なお、ルテオリンは50mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、説明の便宜上、ルテオリンを投与したラット群(コントロール)を「ルテオリン群」と呼び、ルテオリンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「ルテオリン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
ルテオリン代謝物であるルテオリン抱合体を、以下のとおり測定した。すなわち、血清50μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させたグルクロニダーゼ溶液を45μL(10000U/mL、シグマアルドリッチ社製)、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させた0.1Mアスコルビン酸溶液を5μL加え、37℃で2時間加温させた。メタノールを300μL加え、酵素反応を停止させ、遠心分離(12000rpm 、10分、 4℃)した。上清を別のチューブに移し、遠心濃縮により溶媒を除去した。300μLの0.1%ギ酸含有の50%アセトニトリル溶液に溶解させ、HPLC用のサンプルを調製した。
HPLCは、Nexera XR(島津製作所製)、MS/MS検出器は4500QTRAP(サイエックス社製)を使用した。カラムは、ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×50mm) (Waters社製)を使用し、カラム温度は40℃に設定した。移動相はA液として0.1%含有ギ酸溶液、 B液として0.1%ギ酸含有アセトニトリル溶液を調製した。B液30%で1分間保持し、その後4.5分間でB液45%までグラジエントをかけ、目的の物質を溶出させた。その後、B液99%でカラムを2分間洗浄し、B液30%で3分間保持した。なお、流速は、0.3mL/分に設定した。MS/MS分析はESIネガティブモードで分析した。MS/MSの分析条件は、カーテンガス流量30psi、コリジョンガス流量9psi、イオンスプレー電圧-4500V、ターボガス温度600℃、イオンソースガス70psiに設定した。
結果は表13および図14に示される通りであった。投与後60分、120、240分において、ルテオリン群に比べ、ルテオリン+ヨーグルト群において、ルテオリン抱合体の血清中濃度が有意に上昇した。その他の全ての時点において、ルテオリン抱合体の血清中濃度が上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、ルテオリン群に比べ、ルテオリン+ヨーグルト群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がルテオリンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でルテオリン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにナリンゲニン(東京化成工業株式会社製)、ナリンゲニンとヨーグルトをそれぞれ投与した。なお、ナリンゲニンは50mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。以下、説明の便宜上、ナリンゲニンを投与したラット群(コントロール)を「ナリンゲニン群」と呼び、ナリンゲニンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「ナリンゲニン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
ナリンゲニン代謝物であるナリンゲニン抱合体を、以下のとおり測定した。すなわち、血清50μLに、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させたグルクロニダーゼ溶液を45μL(10000U/mL、シグマアルドリッチ社製)、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させた0.1Mアスコルビン酸溶液を5μL加え、37℃で2時間加温させた。メタノールを300μL加え、酵素反応を停止させ、遠心分離(12000rpm 、10分、 4℃)した。上清を別のチューブに移し、遠心濃縮により溶媒を除去した。300μLの0.1%ギ酸含有の50%アセトニトリル溶液に溶解させ、HPLC用のサンプルを調製した。
HPLCは、Nexera XR(株式会社島津製作所製)、MS/MS検出器は4500QTRAP(サイエックス社製)を使用した。カラムは、ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm(2.1×50mm)(Waters社製)を使用し、カラム温度は40℃に設定した。移動相はA液として0.1%含有ギ酸溶液、 B液として0.1%ギ酸含有アセトニトリル溶液を調製した。B液30%で1分間保持し、その後4.5分間でB液45%までグラジエントをかけ、目的の物質を溶出させた。その後、B液99%でカラムを2分間洗浄し、B液30%で3分間保持した。なお、流速は、0.3mL/分に設定した。MS/MS分析はESIネガティブモードで分析した。MS/MSの分析条件は、カーテンガス流量30psi、コリジョンガス流量9psi、イオンスプレー電圧-4500V、ターボガス温度600℃、イオンソースガス70psiに設定した。
結果は表14および図15に示される通りであった。投与後60分において、ナリンゲニン群に比べ、ナリンゲニン+ヨーグルト群において、ナリンゲニン抱合体の血清中濃度が有意に上昇した。その他の全ての時点において、ナリンゲニン抱合体の血清中濃度が上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、ナリンゲニン群に比べ、ナリンゲニン+ヨーグルト群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がナリンゲニンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でナリンゲニン群に対して有意差があることを示している。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにリコペン(リコレッド社製)、リコペンとヨーグルトをそれぞれ投与した。ここで、リコペンは5mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。リコペンの血清中濃度の測定は実験例9に記載の方法および条件に従い行った。また、以下では、リコペンを投与したラット群(コントロール)を「リコペン群」と呼び、リコペンとヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「リコペン+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
結果は表15および図16に示される通りであった。投与後60分、120分、240分において、リコペン群に比べ、リコペン+ヨーグルト群において、リコペンの血清中濃度が有意に上昇した。また、血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、リコペン群に比べ、リコペン+ヨーグルト群において増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がリコペンの吸収を促進させることを意味する。なお、図中、「*」の記号はP<0.05でリコペン群に対して有意差があることを示している。
(1)ヨーグルトの調製
10質量%の脱脂粉乳および0.5mMギ酸ナトリウムを含む培地にラクトバチルス・ブルガリクスOLL1224菌、ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌をそれぞれ接種した後、その培地を43℃でpH4.6になるまで発酵させて加熱した。このようにして得られたヨーグルトには、多糖体がそれぞれ88μg/g、68μg/g含まれていた。
24匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにβカロテン、βカロテンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1224菌)、βカロテンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌)をそれぞれ投与した。ここで、βカロテンは5mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。βカロテンの血清中濃度の測定は実験例6に記載の方法および条件に従い行った。
以下、βカロテンを投与したラット群(コントロール)を「βカロテン群」と呼び、βカロテンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1224菌)を投与したラット群(実施例)を「βカロテン+OLL1224群」、βカロテンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌)を投与したラット群(実施例)を「βカロテン+OLL1247群」と呼ぶこととする。
結果は表16に示される通りであった。血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、βカロテン群に比べ、βカロテン+OLL1224群、βカロテン+OLL1247群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がβカロテンの吸収を促進させることを意味する。
(1)ヨーグルトの調製
10質量%の脱脂粉乳および0.1重量%のカゼインペプチド(DOMO製)を含む培地にストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3290菌、ストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌を接種した後、その培地を43℃でpH4.6になるまで発酵させて加熱した。このようにして得られたヨーグルトには、多糖体がそれぞれ76.3μg/g、45.8μg/g含まれていた。
24匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにβカロテン、βカロテンとヨーグルト(ストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3290菌)、βカロテンとヨーグルト(ストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌)をそれぞれ投与した。ここで、βカロテンは5mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。βカロテンの血清中濃度の測定は実験例6に記載の方法および条件に従い行った。以下、βカロテンを投与したラット群(コントロール)を「βカロテン群」と呼び、βカロテンとヨーグルト(ストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3290菌)を投与したラット群(実施例)を「βカロテン+OLS3290群」、βカロテンとヨーグルト(ストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌)を投与したラット群(実施例)を「βカロテン+OLS3078群」と呼ぶこととする。
結果は表17に示される通りであった。血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、βカロテン群に比べ、βカロテン+OLS3290群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がβカロテンの吸収を促進させることを意味する。
(1)ヨーグルトの調製
10質量%の脱脂粉乳を含む培地に、市販のスターター(カスピ海ヨーグルト、フジッコ株式会社製)、ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌およびストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌を接種した後、その培地を43℃でpH4.6に達するまで発酵させて加熱した。このようにして得られたヨーグルトには、多糖体が15μg/g、54μg/g含まれていた。
24匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにβカロテン、βカロテンとヨーグルト(カスピ海ヨーグルト)、βカロテンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌およびストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌)をそれぞれ投与した。ここで、βカロテンは5mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。βカロテンの血清中濃度の測定は実験例6に記載の方法および条件に従い行った。以下、βカロテンを投与したラット群(コントロール)を「βカロテン群」と呼び、βカロテンとヨーグルト(カスピ海ヨーグルト)を投与したラット群(実施例)を「βカロテン+カスピ海YG群」、βカロテンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌およびストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌)を投与したラット群(実施例)を「βカロテン+OLL1247×OLS3078群」と呼ぶこととする。
結果は表18に示される通りであった。血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、βカロテン群に比べ、βカロテン+OLL1247×OLS3078群において有意に増加した。本結果は、ヨーグルトの摂取がβカロテンの吸収を促進させることを意味する。
(1)用いたヨーグルト
10質量%の脱脂粉乳を含む培地に、市販のスターター(明治ブルガリアヨーグルト(株式会社明治製)より単離したラクトバチルス・ブルガリクス2038菌およびストレプトコッカス・サーモフィラス1131菌)、ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌およびストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌を接種した後、その培地を43℃でpH4.6に達するまで発酵させて加熱し、ヨーグルトを調製した。
24匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにケルセチン、ケルセチンとヨーグルトをそれぞれ投与した。ここで、ケルセチンは50mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。ケルセチン代謝物であるケルセチン抱合体と、イソラムネチン抱合体の血清中濃度の測定は、実験例1に記載の方法および条件に従い行った。以下、ケルセチンを投与したラット群(コントロール)を「ケルセチン群」と呼び、ケルセチンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクス2038菌およびストレプトコッカス・サーモフィラス1131菌)を投与したラット群(実施例)を「ケルセチン+LB81群」、ケルセチンとヨーグルト(ラクトバチルス・ブルガリクスOLL1247菌およびストレプトコッカス・サーモフィラスOLS3078菌)を投与したラット群(実施例)を「ケルセチン+OLL1247×OLL3078群」と呼ぶこととする。
結果は表19に示される通りであった。ケルセチン抱合体の血中濃度-時間曲線下面積(AUC)は、ケルセチン群に比べ、ケルセチン+LB81群、ケルセチン+OLL1247×OLS3078群において有意に増加した。本結果は、乳酸菌による発酵がケルセチンの吸収を促進させることを意味する。
(1)用いたヨーグルト
実験例1で調製したヨーグルトを用いた。
16匹のラット(SD、雄、8週齢、日本エスエルシー株式会社)を7日間馴化させた後、それらのラットを8匹ずつの群に分けた。16時間の絶食後、各群のラットにカカオ豆抽出物、カカオ豆抽出物とヨーグルトをそれぞれ投与した。カカオ豆抽出物は、未発酵カカオ豆を脱脂して得たカカオ豆パウダーを、50%エタノール(v/v)で抽出した後、抽出液を濃縮、凍結乾燥させて調製した。得られたカカオ豆抽出物中には、エピカテキンが188 mg/g含まれていた。なお、カカオ豆抽出物はエピカテキンとして50mg/kg体重、ヨーグルトは11.3g/kg体重で投与した。投与前、投与後60分、120分、240分、480分に尾静脈より採血を行い、血清を得た。エピカテキン代謝物であるエピカテキン抱合体の血清中濃度の測定は、実験例5に記載の方法および条件に従い行った。以下、説明の便宜上、カカオ豆抽出物を投与したラット群(コントロール)を「カカオ豆抽出物群」と呼び、カカオ豆抽出物とヨーグルトを投与したラット群(実施例)を「カカオ豆抽出物+ヨーグルト群」と呼ぶこととする。
Claims (6)
- 多糖体を含有する乳酸菌産生物を有効成分として含んでなる、難水溶性フィトケミカル吸収促進剤であって、
前記乳酸菌産生物が、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)またはストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)のいずれかによって生成されるものであり、かつ前記難水溶性フィトケミカルは、その溶解率が88%以下のものであって、ケルセチン、ゲニステイン、エピカテキン、ルテオリン、ナリンゲニン、βカロテンおよびリコペンから選択されるものである、難水溶性フィトケミカル吸収促進剤。 - 前記乳酸菌産生物が、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)とストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)との組合せによって生成されるものである、請求項1に記載の難水溶性フィトケミカル吸収促進剤。
- 前記乳酸菌産生物が発酵乳である、請求項1または2に記載の難水溶性フィトケミカル吸収促進剤。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の難水溶性フィトケミカル吸収促進剤を含んでなる、難水溶性フィトケミカル吸収促進用の食品添加剤であって、
前記難水溶性フィトケミカルは、その溶解率が88%以下のものであって、ケルセチン、ゲニステイン、エピカテキン、ルテオリン、ナリンゲニン、βカロテンおよびリコペンから選択されるものである、難水溶性フィトケミカル吸収促進用の食品添加剤。 - 請求項1~3のいずれか一項に記載の難水溶性フィトケミカル吸収促進剤を含んでなる、難水溶性フィトケミカル吸収促進用の飲食品または飲食品組成物であって、
前記難水溶性フィトケミカルは、その溶解率が88%以下のものであって、ケルセチン、ゲニステイン、エピカテキン、ルテオリン、ナリンゲニン、βカロテンおよびリコペンから選択されるものである、難水溶性フィトケミカル吸収促進用の飲食品または飲食品組成物。 - 請求項1~3のいずれか一項に記載の難水溶性フィトケミカル吸収促進剤の製造のための、多糖体を含有する乳酸菌産生物の使用。
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HERBERT, Michlmayr et al.,β-Glucosidase activities of lactic acid bacteria:mechanisms, impact on fermented food and human hea,FEMS Microbiol. Lett.,2014年,Vol.352,p.1-10,全文,特に抄録,第3頁左欄第12-26行 |
KANO, Mitsuyoshi et al.,Bioavailability of Isoflavones after Ingestion of Soy Beverages in Healthy Adults,The Journal of Nutrition,2006年,Vol.136,p.2291-2296,全文,特に抄録,第2292頁左欄第11-28行,表1-2,図1-2 |
TAMURA, Motoi et al.,Role of Intestinal Flora on the Metabolism,Absorption, and Biological Activity of Dietary Flavonoids,Bioscience Microflora,2003年,Vol.22, No.4,p.125-131,全文,特に抄録 |
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Publication number | Publication date |
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JPWO2018169027A1 (ja) | 2020-01-16 |
WO2018169027A1 (ja) | 2018-09-20 |
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