IT201600112535A1 - Miscela di sostanze attive per il benessere del cuoio capelluto e del capello. - Google Patents
Miscela di sostanze attive per il benessere del cuoio capelluto e del capello.Info
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Description
Titolo: “Miscela di sostanze attive per il benessere del cuoio capelluto e del capello.”
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda una associazione per uso topico ad attività osmoprotettrice.
DESCRIZIONE
STATO DELL’ARTE
La struttura nativa di una proteina è essenziale in ambito biologico alla corretta funzionalità dei processi metabolici di un organismo vivente.
Variazioni delle condizioni ambientali possono alterare la stabilità delle biomolecole, sensibili a variazioni di temperatura, pressione ed alla concentrazione di sali ed altri soluti.
In condizioni fisiologiche pertanto, le proteine necessitano di sistemi di adattamento che consentano di controbilanciare ogni significativa perturbazione dell’equilibrio termodinamico cellulare, al fine di evitare alterazioni importanti nella struttura secondaria e terziaria.
Con l’intento di adattarsi alle variazioni ambientali, la natura ha creato meccanismi fisiologici di risposta, uno dei quali prevede l’accumulo di piccoli soluti organici, gli osmoliti, a livello cellulare.
Naturalmente presenti in natura, gli osmoliti (osmoprotettori) sono generalmente neutri a pH fisiologico e vengono stoccati nell’ambiente intracellulare a concentrazioni relativamente alte, esercitando un’azione di stabilizzazione termodinamica, senza interferire con le normali funzionalità cellulari.
In condizioni di stress osmotico per esempio, gli organismi viventi aumentano la sintesi de novo degli osmoprotettori endogeni a livello cellulare, in modo tale da ripristinare i corretti valori di pressione osmotica tra l’ambiente intra- ed extracellulare, oltre che stabilizzare le strutture terziarie delle proteine funzionali.
Nonostante la varietà chimica degli osmoprotettori presenti in natura, in quasi tutti gli organismi viventi si possono riconoscere tre grandi classi di osmoliti endogeni: alcuni derivati amminoacidici (taurina, betaina etc.), i polioli (sorbitolo, glicerolo, saccarosio, trealosio, etc.) e le metilammine (Trimetilamina-N-ossido, colina-O-solfato).
Il profilo chimico fisico di ciascuno dei suddetti soluti è diverso da quello degli osmoliti delle altre classi, rendendo difficile da comprendere come, ed in che misura, le proprietà degli uni possano alterare la funzione degli altri nell’esibizione dell’effetto osmoprotettivo di mantenimento dell’omeostasi, nonché del meccanismo d’azione messo in atto per la stabilizzazione termodinamica del ripiegamento proteico.
Tra le diverse teorie proposte in letteratura per giustificare il complesso effetto osmoprotettore dei soluti compatibili, quella più accreditata prevede che l’interazione osmolita-biomolecola sia la risultante di due effetti stabilizzanti, uno rivolto direttamente alla macromolecola, l’altro indiretto, mediato attraverso il solvente.
L’effetto diretto che l’osmoprotettore esercita sulla catena proteica è detto effetto osmofobico e prevede che gli osmoliti siano preferenzialmente esclusi dalla superficie proteica, favorendo il ripiegamento della biomolecola mediante un’interazione termodinamicamente sfavorevole con la catena principale della proteina stessa.
In aggiunta a questo primo effetto, se ne aggiunge un secondo rivolto al rafforzamento dell’ordine locale della struttura microscopica del solvente, mediante la formazione di una rete di legami ad idrogeno tra soluto compatibile e molecole d'acqua circostanti.
Il solvente così strutturato risulta meno incline ad interagire con i residui idrofobici della proteina, che si ripiegano a formare il core della struttura peptidica tridimensionale e che garantiscono così la formazione di una struttura terziaria termodinamicamente stabile.
Le proprietà idratanti ed antiossidanti degli osmoliti presenti in natura sono già note allo stato dell’arte, che elenca diverse formulazioni a base di osmoliti dirette al benessere ed alla bellezza della pelle, per l’attenuazione dei primi segni del tempo.
La domanda europea di brevetto EP2695600 (A1) della stessa Richiedente descrive una composizione cosmetica ad attività osmoprotettiva, comprendente ectoina e trealosio per l’uso nel trattamento della secchezza della pelle.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La Richiedente ha ora trovato che inositolo ed arginina, quando combinate insieme in rapporti molari specifici, esibiscono un effetto osmoprotettivo notevole, maggiore rispetto all’effetto esercitato dai singoli principi attivi o da combinazione di soluti alternativi.
La presente invenzione riguarda pertanto composizioni cosmetiche, dispositivi medici comprendenti l’associazione di inositolo/arginina per uso in trattamenti mirati al miglioramento del cuoio capelluto e del capello e per il mantenimento dell’omeostasi degli stessi.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1: Andamento della funzione di distribuzione radiale ossigeno-ossigeno dell’acqua in assenza (wat) ed in presenza di attivi singoli ed in miscela: arginina (arg); mio-inositolo (myo); taurina (tau); miscela mio-inositolo/arginina 1:1 (mol/mol) (myo_arg_1_1); miscela mio-inositolo/arginina 2:1 (mol/mol) (myo_arg_2_1); miscela mio-inositolo/taurina 1:1 (mol/mol) (myo_arg_1_1); miscela mioinositolo/taurina 2:1 (mol/mol) (myo_arg_2_1); miscela mioinositolo/arginina/taurina 2:1:1 (mol/mol) (mix_ter_2_1_1).
Figura 2: Particolare del primo picco di figura 1 della funzione di distribuzione radiale ossigeno-ossigeno dell’acqua.
Figura 3: Coefficiente di autodiffusione dell’acqua in assenza (wat) ed in presenza degli attivi singoli ed in miscela di Figura 1.
Figura 4: Superficie accessibile al solvente (SASA) normalizzata per il mio-inositolo, nelle diverse soluzioni in funzione della durata della simulazione.
Figura 5: Struttura rappresentativa della distribuzione di una soluzione 1 M di arginina attorno alla cheratina. Il solvente (acqua) è omesso per chiarezza.
Figura 6: Struttura rappresentativa della distribuzione di una soluzione 1 M di mioinositolo attorno alla cheratina. Il solvente (acqua) è omesso per chiarezza.
Figura 7: Andamento del coefficiente preferenziale dell’arginina in funzione della distanza dalla proteina.
Figura 8: Andamento del coefficiente preferenziale del mio-inositolo in funzione della distanza dalla proteina.
Figura 9: Andamento dei coefficienti preferenziali di mio-inositolo ed arginina in miscela 1:1 (mol/mol) in funzione della distanza dalla proteina.
Figura 10: Struttura rappresentativa della distribuzione di mio-inositolo e arginina in miscela 1:1, attorno alla cheratina. L’arginina è in grigio-chiaro, il mio-inositolo in grigio scuro. Il solvente (acqua) è omesso per chiarezza.
Figura 11: Andamento dei coefficienti preferenziali di mio-inositolo e arginina in miscela 1:2 in funzione della distanza dalla proteina.
Figura 12: Struttura rappresentativa della distribuzione di mio-inositolo e arginina in miscela 1:2, attorno alla cheratina. L’arginina è in grigio-chiaro, il mio-inositolo in grigio scuro. Il solvente (acqua) è omesso per chiarezza.
Figura 13: Andamento dei coefficienti preferenziali di mio-inositolo e arginina in miscela 2:1 in funzione della distanza dalla proteina.
Figura 14: Struttura rappresentativa della distribuzione di mio-inositolo e arginina in miscela 2:1, attorno alla cheratina. L’arginina è in grigio-chiaro, il mio-inositolo in grigio scuro. Il solvente (acqua) è omesso per chiarezza.
Figura 15: Contenuto di ATP (nM) dopo 24H di trattamento; CN= Controllo Negativo.
Figura 16: Contenuto di ATP (nM) dopo 120H di trattamento; CN= Controllo Negativo.
Figura 17: Valutazione morfologica di MTs mediante colorazione H&E.
Figura 18: Espressione CK6, rivelata per ciascun campione in duplicato mediante immuno-colorazione della proteina con un anticorpo specifico, marcato con colorazione DAB; Ingrandimento 40X; CN = controllo negativo.
Figura 19: Valutazione in duplicato di COLIV mediante immunofluorescenza (bianco e nero); CN = controllo negativo, Cyclosporin A = Ciclosporina A; Inositol = Inositolo; Inositol Arginin = Inositolo e Arginina
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda una associazione dei principi attivi ad azione osmoprotettrice inositolo ed arginina, in cui il rapporto molare inositolo: arginina è compreso tra 10:1 e 1:10.
Negli scopi della presente invenzione per associazione si intende l’insieme di due o più principi attivi, considerati isolatamente rispetto alla forma farmaceutica in cui sono veicolati, in grado di esibire uno specifico effetto biologico in vitro ed in vivo.
L’inositolo è un importante osmolita sintetizzato dall’organismo umano, che protegge le cellule da stress di tipo osmotico, mediante i meccanismi sopra descritti nello stato dell’arte e comuni a diversi osmoliti endogeni.
L’inositolo esiste sotto forma di nove diversi isomeri: myo-, cis-, allo-, epi-, muco-, neo-, scyllo-, e gli isomeri ottici D e L chiro-inositolo.
Di tutti, quello più comune in natura è il mio-inositolo, l’isomero cis-1, 2, 3, 5-trans-4, 6 dell’inositolo.
Diversamente dall’inositolo, l’arginina non è generalmente considerata un osmoprotettore (Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry, Analysis and Functions of Amino acids and Peptides; John Wiley & Sons, View on Google Scholar), in quanto è caratterizzata da proprietà chimico-fisiche e biologiche tali da non renderla conforme al profilo degli osmoliti classici.
L’arginina infatti, a pH fisiologico, è dotata di una carica netta positiva a livello del gruppo guanidinico che la rende poco propensa al passaggio attraverso le membrane plasmatiche, semipermeabili a piccoli soluti lipofili, privi di carica.
Detto amminoacido inoltre è noto in letteratura per essere incompatibile con alcuni processi biologici, agendo talvolta da denaturante e destabilizzante proteico, limitando pertanto l’espansione delle sue applicazioni (Water and Life: Comparative Analysis of Water Relationships at the Organismic, Cellular, and Molecular Levels; a cura di George N. Somero,Charles B. Osmond,Carla L. Bolis; Chemical Assistance in Refolding of Bacterial Inclusion Bodies; Mona Alibolandi and Hasan Mirzahoseini; Medical Biotechnology Research Center, Pasteur Institute of Iran, Tehran 13169 43551, Iran; P. H. Yancey, M. E. Clark, S. C. Hand, R. D. Bowlus, and G. N. Somero, “Living with water stress: evolution of osmolyte systems,” Science, vol.217, no.4566, pp. 1214–1222, 1982. View at Google Scholar).
Nonostante l’arginina si caratterizzi per proprietà apparentemente sfavorevoli nell’ambito dell’osmoprotezione, la Richiedente ha trovato che la combinazione inositolo/arginina in rapporto molare compreso tra 10:1 e 1:10 consente di ottenere una associazione di attivi con notevoli proprietà osmoprotettive, stabilizzanti nei confronti della cheratina.
Dette proprietà inoltre si sono rivelate superiori a quelle esibite dai singoli componenti inositolo/arginina e migliori rispetto a quelle ottenute dalla associazione di due osmoliti classici.
L’efficacia osmoprotettiva esibita dalla associazione della presente invenzione è stata interpretata dalla Richiedente mediante studi di dinamica molecolare e simulazioni di modelli di cheratina in silico, riportati nella sezione sperimentale della presente domanda di brevetto, nonché dimostrata sperimentalmente attraverso studi in vitro su colture cellulare micro-tissutali (MTs).
Alla luce dei risultati ottenuti dai test computazionali, si ritiene che la combinazione dei soluti organici in esame riesca ad aumentare la disponibilità di inositolo in soluzione, riducendo le aggregazioni tra molecole di inositolo stesso.
Rimandando alla sezione sperimentale della presente domanda di brevetto per una più esaustiva spiegazione dei meccanismi molecolari coinvolti nella miscela di osmoprotettori secondo l’invenzione, le simulazioni in soluzione di mio-inositolo ed L-arginina in forma salina suggeriscono che il poliolo ciclico mostri il maggior effetto di strutturazione dell’acqua e l’arginina esibisca il maggior effetto di riduzione del coefficiente di autodiffusione del solvente.
I due parametri sopra descritti, coinvolti nel ripiegamento proteico e stabilizzanti la struttura terziaria della proteina, sono però inficiati dalla tendenza dell’inositolo ad aggregare in soluzione e dal comportamento denaturante che l’arginina esibisce nei confronti delle macromolecole biologiche.
La combinazione di inositolo ed arginina secondo l’associazione della presente invenzione, consente di attenuare i suddetti comportamenti indesiderati, generando una miscela osmolitica con notevoli proprietà osmoprotettrici, che conserva simultaneamente i comportamenti peculiari delle due sostanze e massimizza la possibilità di influenza reciproca.
L’inositolo compreso nell’associazione della presente invenzione è preferibilmente mio-insoitolo.
Per gli scopi della presente invenzione per arginina si intende l’acido 2-ammino-5-guanidilpentanoico ed i sali biologicamente accettabili del suddetto composto.
Più preferibilmente, per arginina si intende la forma levogira dell’amminoacido (L-arginina).
In una forma preferita arginina è in forma di sale cationico, in cui il controione anionico è scelto preferibilmente tra cloridrato, solfato, citrato, carbonato, acetato, tartrato, fosfato ed ancor più preferibilmente è cloridrato.
Per sale biologicamente accettabile si intende un sale adatto all’uso medico/cosmetico che non induca reazioni di tossicità, irritazione o allergia a contatto con i tessuti vivi dell’uomo e dell’animale e che presenti, in termini di attività biologica, un rapporto rischio/beneficio ragionevole.
Nella forma di realizzazione preferita, il rapporto molare tra inositolo e arginina è preferibilmente 1:1.
L’associazione secondo la presente invenzione è preferibilmente impiegata nel mantenimento dell’omeostasi del cuoio capelluto e del capello, dove per omeostasi si intende la capacità di un organismo, e delle unità costituenti lo stesso, di mantenere costanti, in condizioni fisiologiche, le condizioni chimico-fisiche interne anche al variare delle condizioni ambientali esterne.
Ulteriore scopo della presente invenzione è una composizione comprendente l’associazione oggetto della presente invenzione in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti dove per adatti eccipienti o diluenti si intendono tutti quei componenti che possono rendere la formulazione tecnologicamente adatta alla sua somministrazione.
Un altro scopo della presente invenzione è l’uso della composizione osmoprotettiva descritta nella presente domanda di brevetto nella cosmesi del cuoio capelluto.
Nell’ambito della presente invenzione, per cosmesi del cuoio capelluto e del capello si intende il trattamento degli inestetismi cutanei e strutturali che possono alterare la bellezza e la funzionalità della cute e del capello.
Tra gli inestetismi cutanei più comuni che possono affliggere il cuoio capelluto, si annoverano disidratazione e secchezza cutanea, danni da stress ossidativo, irritazione, prurito locale, forfora, sebo in eccesso etc.
Tra gli inestetismi strutturali più comuni che possono affliggere il capello, si annoverano danni da stress ossidativo, caduta, rottura del fusto, perdita di volume e lucentezza, invecchiamento precoce del capello (capelli bianchi), etc.
Il cuoio capelluto è una zona ultra specializzata della cute dove sono impiantati i capelli che, come gli altri peli, originano da un follicolo pilifero, detto bulbo. Il cuoio capelluto essendo costituito da pelle come tutte le altre zone del corpo, è soggetto a problemi quali alterazioni, anomalie, disturbi o malattie vere e proprie e richiede pertanto un’igiene ed una cura dedicate, che consentano il mantenimento della sua funzionalità e del suo benessere.
Per gli scopi della presente invenzione, per secchezza cutanea o asteatosi si intende un problema del cuoio capelluto, risultato della carenza di lipidi e che si associa spesso ad una situazione di accentuata disidratazione. La cute, essiccata e disidratata, è fragile e friabile e tende a desquamarsi.
Il ridotto contenuto idrolipidico della cute determina forfora, capelli secchi e prurito alla testa. Utilizzo di phon con aria troppo calda disidrata la cheratina e la rende friabile e fragile. L’uso di shampoo con tensioattivi aggressivi, lozioni alcoliche con effetto disidratante, ridotto apporto nutrizionale in vitamine e minerali, stress, inquinamento possono causare disidratazione della cute.
Per gli scopi della presente invenzione per danni da stress ossidativo si intendono le alterazioni funzionali micro e macroscopiche degli organismi viventi, indotte a livello cellulare da una condizione patologica (lo stress ossidativo) causata dalla rottura dell'equilibrio fisiologico fra la produzione ed eliminazione di specie chimiche ossidanti, da parte dei sistemi di difesa fisiologici.
In ambito tricologico, uno dei primi effetti dello stress ossidativo è l’indebolimento e l’incanutimento dei capelli, causato dal danneggiamento dei melanociti operato dai radicali liberi. Gli effetti dell’ossidazione non si limitano alla depigmentazione del capello, ma possono danneggiare anche le cellule del bulbo pilifero, inducendo la nascita di un capello fragile e tendente alla caduta.
Un altro scopo della presente invenzione riguarda la formulazione della composizione della presente invenzione in adatti prodotti cosmetici, destinati agli usi sopra citati. Detti prodotti cosmetici (leave on e rinse off) sono preferibilmente nella forma di Shampoo, Olio, Balsamo, Gel, Lozione, Schiuma, Crema, Maschera, Tonico, Burri, soluzioni alcoliche.
Ulteriore oggetto della presente invenzione sono dispositivi medici comprendenti la composizione oggetto della presente domanda, preferibilmente nella forma di shampoo, olio, balsamo, gel, lozione, schiuma, crema, maschera, tonico, burri e soluzioni alcoliche.
STUDI SPERIMENTALI
1. Studi in silico
1.1. Metodologia
I sistemi acqua-attivi simulati sono costituiti da scatole cubiche di acqua (scatole di solvatazione), descritte utilizzando il modello TIP4P ed aventi lato di 50 Å, in cui gli osmoprotettori sono stati inseriti in posizioni casuali. Nel caso dell’arginina (carica positivamente) l’elettroneutralità del sistema è stata mantenuta aggiungendo un opportuno numero di ioni cloruro.
La struttura iniziale del modello di cheratina è stata ottenuta dalla banca dati PDB (codice 3TNU). Anche in questo caso, la proteina è stata inserita al centro di una scatola virtuale di dimensioni 170 x 60 x 60 Å (612000 Å<3>di volume), in cui è stata aggiunta una quantità di molecole di attivo necessaria a raggiungere la concentrazione desiderata (complessivamente 1 M). Gli attivi sono stati inseriti in posizioni casuali all’interno della scatola di solvatazione e successivamente il sistema è stato solvatato con acqua, descritta dal modello TIP4P. L’elettroneutralità del sistema contenente la proteina è stata garantita aggiungendo un numero adeguato di ioni cloruro, secondo la quantità di arginina eventualmente presente.
Le simulazioni sono state effettuate utilizzando il pacchetto software GROMACS 4.5.3. Il sistema così preparato, è stato sottoposto a 10000 passi di ottimizzazione di geometria utilizzando alternativamente i metodi della discendente più ripida (SD) e del gradiente coniugato (CG), in particolare 1 passo SD ogni 10 passi GC. Il sistema è stato quindi equilibrato per 100 ps (picosecondi), a volume e temperatura costante, seguiti da ulteriori 100 ps a pressione e temperatura costante. Nel corso dell’equilibrazione, gli atomi Cα della proteina sono stati fissati alla loro posizione originale con un vincolo armonico. L’equilibrazione è stata seguita da una fase produttiva della durata di 20 ns, in condizioni di pressione e di temperatura costanti, in cui sono stati rimossi i vincoli sui Cα. La temperatura del sistema è stata mantenuta al valore di riferimento (310 K) riscalando secondo un opportuno algoritmo le velocità delle particelle costituenti il sistema, mentre la pressione è stata mantenuta al valore medio di 1 bar accoppiando il sistema isotropicamente ad un bagno barico mediante l’algoritmo di Berendsen. Le distanze di legame tra tutti gli atomi sono state mantenute al loro valore di equilibrio utilizzando l’algoritmo LINKS, il che ha consentito di utilizzare un passo di integrazione di 2 fs (femtosecondi).
Tutte le simulazioni sono state svolte utilizzando condizioni periodiche al contorno, le interazioni elettrostatiche sono state valutate utilizzando il metodo Particle Mesh Ewald, mentre per le interazioni di Van der Waals si è applicato un cut-off di 14 Å.
Per descrivere la proteina è stato utilizzato il campo di forza AMBER99SBildn, mentre gli osmoprotettori sono stati descritti dal campo di forza GAFF. Le analisi sulle simulazioni sono state effettuate con moduli dedicati del pacchetto GROMACS e con programmi realizzati presso il gruppo di ricerca.
1.2. Simulazioni di soluzioni acqua-attivi
Al fine di valutare il comportamento di inositolo ed arginina in forma salina in soluzione acquosa, la Richiedente ha svolto delle simulazioni di dinamica molecolare di ciascuna delle due molecole in acqua ad una concentrazione 1 M.
Dette simulazioni di dinamica molecolare sono state svolte selezionando specificatamente mio-inositolo e L-arginina, che rappresentano gli isomeri più comunemente presenti in vivo delle due molecole in esame.
L’elettroneutralità della soluzione di L-arginina è stata garantita aggiungendo uno ione cloruro per ogni molecola di amminoacido.
La prima analisi visiva delle traiettorie ha rivelato immediatamente una differenza qualitativa tra l’amminoacido salificato ed il mio-inositolo. Mentre l’arginina durante la simulazione resta uniformemente distribuita nel volume della scatola di solvatazione, il mio-inositolo tende a formare rapidamente degli aggregati.
Questa differenza è attribuibile alla struttura ed alle proprietà delle diverse molecole. Il sale di L-arginina, per via della sua struttura ionizzata, non ha alcuna tendenza ad aggregarsi e tende ad essere ben solvatata in soluzione.
Il mio-inositolo invece, neutro e ricco di gruppi ossidrilici, tende a formare una rete di interazioni di legami ad idrogeno, sia con le molecole del solvente che con altre molecole di mio-inositolo. Inoltre le interazioni di carattere idrofobico e Van der Waals tra gli anelli alifatici del mio-inositolo contribuiscono a rendere favorevole, da un punto di vista entropico ed energetico, la formazione di aggregati di mio-inositolo.
Successivamente sono stati analizzati gli effetti esercitati dalle due molecole sulla struttura locale dell’acqua (i risultati sono riportati nelle figure 1 e 2).
Analizzando le traiettorie si è ottenuta, per ciascuna soluzione, la funzione distribuzione radiale tra gli ossigeni dell’acqua (g(r)o-od’ora innanzi), il cui andamento fornisce informazioni sulla struttura microscopica e sul livello di ordine dell’acqua.
In figura 1 si può osservare come la g(r)o-o abbia in tutti i casi un picco principale attorno a 2.8 Å, corrispondente al primo guscio di solvatazione della molecola d’acqua, ossia ai legami ad idrogeno che essa forma con le molecole sue prime vicine, conferendo al liquido una struttura localmente ordinata.
Un picco secondario è localizzato intorno agli 4.5 Å ed è dovuto al secondo guscio di solvatazione, mentre un terzo picco appena percettibile è ascrivibile ad un terzo guscio di solvatazione. Oltre la soglia di 10 Å la g(r)o-oconverge correttamente al valore unitario.
In figura 2, che riporta il dettaglio ingrandito del primo picco di solvatazione, si osserva come la presenza di uno o più osmoprotettori aumenti il valore del massimo del picco senza modificarne la posizione, quale indice del fatto che gli osmoprotettori rafforzano l’ordine locale nella struttura microscopica dell’acqua.
In particolare si noti (fig.2) che il massimo incremento del primo picco della g(r)o-o, quando confrontato con il riferimento dell’acqua pura, lo si osserva per la soluzione 1M di mio-inositolo, mentre il secondo maggior picco tra le soluzioni di singoli attivi, lo si osserva nel caso della soluzione 1M di arginina.
Per quanto riguarda le miscele invece, si noti che l’incremento del picco della g(r)o-orispetto al riferimento dell’acqua pura, sia intermedio rispetto a quello dei singoli componenti, con una media pesata rispetto ai rapporti reciproci in cui i soluti compatibili sono stati combinati.
Le miscele più ricche in mio-inositolo (myo_arg 2:1; myo_tau 2:1) mostrano quindi, a parità di altro cosolvente, un picco più pronunciato di quelle in cui il rapporto è 1:1 (myo_arg 1:1; myo_tau 1:1).
Le miscele mio-inositolo-L-arginina cloridrato mostrano una strutturazione dell’acqua maggiore rispetto alle combinazioni contenenti mio-inositolo - taurina, dimostrando come la miscela di due osmoprotettori classici non sia egualmente efficace in termini di osmoprotezione della combinazione di soluti della presente invenzione.
Si è poi calcolato il coefficiente di diffusione dell’acqua nelle diverse soluzioni, confrontandolo con quello dell’acqua pura. La figura 3 mostra come la soluzione 1 M di L-arginina eserciti la diminuzione del coefficiente di autodiffusione più efficiente di tutte le soluzioni. Anche in questo caso, i valori osservati per le miscele mioinositolo-L-arginina e mio-inositolo-taurina sono sostanzialmente una media pesata di quelli dei singoli cosolventi.
Si è infine indagato un aspetto particolare delle miscele, legato agli effetti della presenza di un secondo o eventualmente un terzo cosolvente sul comportamento del mio-inositolo.
Come detto in precedenza, la caratteristica peculiare del mio-inositolo rispetto agli altri osmoprotettori, è la tendenza a formare aggregati. Tale tendenza è messa in evidenza in figura 4, dove è rappresentato l’andamento nel tempo della superficie accessibile al solvente (SASA: Solvent-Accessible Surface Area) normalizzata del mio-inositolo in soluzione.
Una diminuzione della SASA nel tempo indica la formazione di aggregati compatti di mio-inositolo. In figura 4 si può notare come la SASA del mio-inositolo, quando è presente da solo in soluzione, si riduce di circa il 50% nel corso della dinamica.
La contemporanea presenza di L-arginina cloridrato e mio-inositolo in rapporto 1:1 ha mostrato di limitare la riduzione di SASA a meno del 20%.
Il dato suggerisce la formazione di aggregati meno compatti di mio-inositolo, frammisto a molecole di acqua e L-arginina.
Questa maggiore omogeneità della soluzione può essere vista come un elemento favorevole per la biodisponibilità dei suoi componenti.
La combinazione di mio-inositolo con un altro osmoprotettore, quale la taurina, in proporzione 1:1 ha un effetto molto più limitato di quanto elicitato dalla combinazione secondo la presente invenzione.
La miscela a tre componenti mio-inositolo/taurina/L-arginina in rapporto 2:1:1 è stata testata senza successo, in quanto la contemporanea presenza di due osmoprotettori si è rivelata meno efficacie della sola L-arginina nel ridurre l’aggregazione in soluzione del mio-inositolo.
1.3. Simulazioni di cheratina con mio-inositolo ed L-arginina
Nella seconda fase della ricerca si è studiata l’interazione di un modello di cheratina con la soluzione di mio-inositolo ed L-arginina cloridrato analizzate nella fase precedente dello studio.
La cheratina è una proteina fibrosa costituita da un gran numero di eliche, interconnesse da ponti disolfuro il cui reciproco avvolgimento crea le fibre dei capelli. Non essendo stato possibile simulare un’intera fibra, si è scelto di utilizzare come modello una unità fondamentale della cheratina, costituita da due α-eliche cheratiniche, unite a formare un dimero.
Il modello proteico scelto è stato simulato in una soluzione 1M di ciascuno dei due componenti considerati. Anche in questo caso essi hanno mostrato un comportamento diametralmente opposto.
Come si può vedere nelle figure 5 e 6, mentre la L-arginina cloridrato appare uniformemente distribuita nella scatola di solvatazione (rappresentata schematicamente dalla figura geometrica del parallelepipedo), il mio-inositolo si addensa chiaramente attorno alla proteina, mostrando sia la già citata tendenza all’aggregazione, che una preferenziale distribuzione nell’immediato intorno proteico.
Successivamente il comportamento di L-arginina cloridrato e mio-inositolo è stato analizzato in modo più quantitativo, calcolando il coefficiente preferenziale rispetto alla proteina per ciascuno di essi, dove per coefficiente preferenziale si intende una misura dell’addensamento o della rarefazione della molecola organica in funzione della distanza dalla superficie proteica.
Un coefficiente preferenziale positivo indica un addensamento dell’attivo rispetto al bulk della soluzione, mentre un coefficiente negativo indica una rarefazione.
In figura 7 possiamo osservare come il coefficiente preferenziale di L-arginina cloridrato abbia l’andamento di quello di un osmoprotettore classico, essendo negativo a basse distanze dalla proteina (indice di effetto osmofobico).
Il coefficiente preferenziale del mio-inositolo al contrario (fig.8) risulta positivo anche alle basse distanze, assumendo valori globalmente più elevati, indice di un notevole addensamento del mio-inositolo attorno alla superficie proteica.
Quando le due molecole sono presenti simultaneamente in rapporto 1:1 (figure 9 e 10), ciascuna di esse mantiene il suo comportamento di base, con il mio-inositolo addensato intorno alla cheratina e la L-arginina cloridrato più uniformemente distribuita nella scatola di solvatazione.
La tendenza del mio-inositolo all’auto-aggregazione è tuttavia limitata dalla presenza della L-arginina cloridrato.
Si crea così quello che potrebbe figurativamente essere definito un doppio strato di osmoprotettori attorno alla cheratina, con il mio-inositolo più prossimo alla proteina e la L-arginina più distante.
Nelle soluzioni L-arginina/mio-inositolo in rapporti 1:2 e 2:1 osserviamo una prevalenza del comportamento del cosolvente più abbondante.
In particolare nella soluzione 1:2 la L-arginina cloridrato, presente in difetto, non riesce a ridurre significativamente l’aggregazione del mio-inositolo, che è preferenzialmente addensato sulla cheratina.
Quando invece è la L-arginina cloridrato ad essere presente in eccesso, la sua azione distrugge la struttura a doppio strato di osmoprotettori ed il mio-inositolo risulta ampiamente disperso nella scatola di solvatazione, ripartendosi in misura molto minore in prossimità della cheratina (fig.11-14).
2. Studi in vitro
2.1 Introduzione e scopo dello studio
La tecnologia Microtissutale (MTs) rappresenta un nuovo metodo di coltura cellulare in vitro in cui le cellule, anziché aderire ad un substrato, formando un monostrato bidimensionale, si aggregano tra loro in piccoli volumi del mezzo di coltura, formando una struttura tridimensionale in cui le interazioni spaziali e molecolari cellula-cellula e cellula matrice sono meglio rappresentative delle interazioni caratterizzanti i tessuti vivi in natura. Le cellule coltivate secondo la tecnologia MTs possono crescere ed organizzarsi secondo la loro naturale fisiologia, riproducendo in vitro (almeno parzialmente) la morfologia e la funzionalità tipiche dei loro tessuti di origine. Per queste ragioni, i test in vitro condotti in MTs sono potenzialmente meglio predittivi dei test in vitro condotti in coltura bi-dimensionale. La tecnologia MTs consente, mediante l’azione della forza di gravità, la formazione di aggregati microtissutali all’interfaccia liquido-aria di gocce di mezzo di coltura. Evitando il contatto con eventuali materiali di supporto, le cellule ricreano il tessuto in maniera naturale ed l’aggregato microtissutale derivante costituisce un sistema in vitro rilevante per la ricerca e le applicazioni pre-cliniche.
2.2. Applicazione della tecnologia MTs al follicolo pilifero
Il follicolo pilifero (HF: Hair follicle bulb) è un “mini-organo” capace di autorigenerarsi e che continua ad alternare fasi di crescita e di regressione, secondo una precisa successione. Il processo di rinnovamento inizia nel bulbo pilifero a livello della papilla dermica (DP: dermal papilla), un core sferico di cellule mesenchimali, interessando successivamente le cellule epiteliali del follicolo, che circondano e racchiudono la papilla dermica. Il meccanismo molecolare che soggiace al ciclo di crescita del follicolo pilifero è molto complesso e ancora non totalmente delucidato. È noto però che le interazioni epiteliali-mesenchimali, ed in particolare la reciproca comunicazione tra i fibroblasti della papilla dermica (DPF) ed i cheratinociti della guaina radicolare esterna (ORSK: Outer Root Sheath Keratinocytes), giocano un ruolo decisivo nel ciclo di crescita/rigenerazione del pelo.
La disponibilità di un modello in co-coltura di DPF-ORSK consente di investigare i meccanismi che regolano il ciclo di crescita del follicolo pilifero e di studiare gli effetti di composti attivi in fase di ricerca pre-clinica. Come riportato nello studio di Higgins et al. (2013, PNAS), il profilo di espressione genica delle cellule della papilla dermica si modifica profondamente quando le stesse vengono cresciute con tecniche di coltivazione monostrato, ma può essere parzialmente ripristinato quando le cellule della papilla dermica vengono coltivate in sferoidi 3D (MTs). Quanto appena detto, richiama l’attenzione sul fatto che la distribuzione spaziale delle cellule, e quindi la loro possibilità di comunicazione, è fondamentale per riprodurre un modello tissutale realistico e l’uso delle colture co-sferoidali di DPF e ORSK risulta quindi il metodo ottimale per riprodurre un “proto-follicolo”, poiché non include un substrato artificiale.
Il modello tissutale di coltura co-sferoidale DPF-ORSK è stato pertanto impiegato negli studi in vitro presentati di seguito per la riproduzione di un “proto-follicolo” nella valutazione degli effetti biologici di arginina e inositolo e miscele degli stessi circa:
- Aumento del ricambio e del benessere del capello
- Miglioramento della struttura, della morfologia e del metabolismo del follicolo pilifero
- Miglioramento della struttura e della resistenza del capello.
2.3. Metodologia
Il proto-follicolo ricostituito è stato ottenuto usando cellule di fibroblasti e cheratinociti di origine umana mediante il metodo Gravity<PLUS>™, un sistema sviluppato dalla InSphero (InSphero AG, Zurich, Switzerland), che permette la formazione di sferoidi o micro-tessuti di dimensioni omogenee mediante la tecnologia “hanging drops”. I micro-tessuti sono stati trasferiti in piastre Gravity<TRAP>per il trattamento ed il controllo delle condizioni di coltura: incubatore 37°C, 5% CO2, atmosfera opportunamente saturata di mezzo di coltura.
Il lotto di fibroblasti e di cheratinociti sono stati testati per verificarne l’assenza di HIV, epatite B, epatite C, micoplasma. Il mezzo di mantenimento è stato testato per la sterilità.
L’effetto delle seguenti composizioni di attivi è stato valutato sulle colture microtissutali di cui sopra:
- Inositolo 0,5%
- Inositolo 0,25% L-arginina 0,25%
I risultati ottenuti con le suddette composizioni sono stati confrontati con i risultati ottenuti da:
- Controllo negativo (non trattato)
- Controllo positivo: Ciclosporina A 10 ng/mL, quale sostanza di riferimento, nota per essere attiva nella stimolazione della fase anagen di proliferazione cellulare del follicolo pilifero in colture cellulari in vivo ed ex vivo (Havlicova et al.2009).
Al fine di valutare l’effetto biologico di ciascuna delle sopra citate composizioni sulle colture micro-tissutali in questione, sono stati misurati i seguenti parametri:
- Quantificazione dell’ATP, quale marker della vitalità cellulare.
- Valutazione morfologica durante la coltura del proto-follicolo, mediante colorazione con ematossilina-eosina (H&E).
- Valutazione immunoistochimica di Citocheratina 6 (CK6), in cui CK6 è una cheratina di tipo II presente a livello della pelle e del follicolo pilifero, che ha un ruolo importante nella formazione del filamento intermedio e che risulta coinvolta nel rimodellamento tissutale durante fenomeni di stress.
CK6 sembra coinvolta nella formazione della corretta architettura cellulare, idonea alla migrazione e resistenza cellulari (Wojcik 2001) e conseguentemente responsabile della struttura e della resistenza della pelle e delle sue appendici (Wong 2003).
- Determinazione semi-quantitativa di Collagene di tipo IV (COLIV), dove COLIV è il maggiore componente della lamina basale ed è parte della giunzione follicolare dermico-papillare, ma è anche presente in forma granulare extracellulare all’interno della guaina follicolare dove esercita una funzione di ancoraggio durante la fase (anagen) di crescita attiva del follicolo pilifero (Jahoda 1992).
Al fine di osservare l’effetto a breve e a lungo termine delle composizioni sopra citate, la valutazione dei parametri sopra menzionati è stata fatta a 24H (T2) e a 120H (T6) di distanza dall’inizio della terapia.
2.4. Risultati
2.4.1. Contenuto di ATP
Le Figure 15 e 16 mostrano il contenuto di ATP a 24H e 120H dopo l’inizio del trattamento, nei campioni trattati con inositolo 0,5% e inositolo 0,25%/L-arginina 0,25% a confronto con il controllo negativo non trattato ed il campione trattato con Ciclosporina A.
Nessuna alterazione significativa del contenuto di ATP è stato registrato a 24H e 120H dopo l’inizio del trattamento, ad indicare che nessuna delle composizioni in esame ha causato modificazioni sostanziali dell’omeostasi e dell’attività metabolica della colture.
2.4.2 Valutazione morfologica durante la coltura del proto-follicolo.
La Figura 17 mostra la valutazione qualitativa morfologica dei micro-tessuti (MTs) mediante colorazione H&E.
Come atteso, il micro-tessuto presenta una struttura pluri-stratificata con un core denso di fibroblasti dermopapillari circondati da una stratificazione di cheratinociti. I cheratinociti appaiono perfettamente stratificati e polarizzati attorno al core dermico, con alcune differenze evidenziabili:
- Controllo Negativo: Gli strati di cheratinociti a T6 appaiono più spessi rispetto ai risultati preliminari a T2 e parzialmente distaccati dal core dei fibroblasti.
Questo distaccamento è intrinsecamente legata alla fragilità delle colture micro-tissutali (MTs).
- Ciclosporina A: a T6 i nuclei cellulari appaiono molto più densi a confronto con il citoplasma circostante, indicando un possibile effetto tossico del composto, in questo caso impiegato alle concentrazioni di riferimento in letteratura per le condizioni sperimentali adottate.
- Inositolo 0,5%: Sia a T2 che a T6 gli strati di cheratinociti circostanti i fibroblasti appaiono strettamente connessi al core dermico e lo strato cellulare di cheratinociti ha una struttura lamellare più compatta.
- Miscela Inositolo/Arginina 0,25%/0,25%: A T2 la morfologia non è differente da quanto osservato per il campione trattato con Inositolo; al contrario a T6 la morfologia indica un aumento della differenziazione cellulare risultante in un parziale distaccamento degli strati epiteliali dal core dermico. In ogni caso, i micro-tessuti presentano una migliore organizzazione della struttura lamellare ed un maggiore spessore rispetto al controllo negativo, dove gli strati epiteliali risultavano più sottili e meno compatti, caratteristiche indicanti una maggiore fragilità tissutale.
In conclusione, il trattamento con la miscela attiva comprendente inositolo e L-arginina sembra promuovere, a 120H dall’inizio della terapia, una differenziazione cellulare consistente senza indurre fragilità e perdita cellulare.
2.4.3. Valutazione immunoistochimica della citocheratina 6 (CK6) del follicolo pilifero.
Nella Figura 18 è riportata la valutazione immunoistochimica di CK6.
L’espressione di CK6 follicolare risulta diversa a seconda del trattamento a cui la coltura è stata sottoposta ed in particolare:
- Ciclosporina A: gli strati di cheratinociti sembrano in buona connessione con il core papillare rispetto al controllo negativo che mostra invece un parziale distaccamento nello strato esterno. I risultati sono coerenti con le proprietà note della molecola nella stimolazione della crescita del follicolo pilifero.
- Inositolo 0,5%: La struttura del proto-capello e la colorazione non sono differenti da quelli mostrati dai campioni trattati con Ciclosporina A, suggerendo un’efficacia sulla crescita cellulare dell’inositolo 0,5%.
- Miscela Inositolo/Arginina 0,25%/0,25%: I campioni trattati con la suddetta miscela mostrano, rispetto a quelli trattati con ciclosporina e con il solo inositolo, uno specifico effetto a livello dello strato dei cheratinociti, che risulta maggiormente differenziato, più spesso e strutturato, con un conseguente distaccamento parziale del suddetto strato dal core dermico. Il risultato più rilevante consta nella rivelazione di un forte segnale corrispondente alla CK6, che indica una sovra espressione della proteina a confronto con gli altri campioni. Questo risultato suggerisce la presenza di un possibile effetto della miscela Inositolo/Arginina 0,25%/0,25% sulla differenziazione terminale dei cheratinociti. Il forte segnale relativo a CK6, proteina con funzione strutturale, corrisponderebbe infatti ad una migliore organizzazione degli strati cellulari responsabile, in vivo, di un aumento dello spessore e della forza del fusto del capello.
2.4.4. Valutazione del Collagene IV al microscopio confocale.
La Figura 19 riporta i risultati, in duplicato, ottenuti dalla valutazione di COLIV mediante immunofluorescenza.
La tabella 1 riporta i risultati, in duplicato, ottenuti dall’analisi semi-quantitativa di CN, inositolo e miscela Inositolo/Arginina 0,25%/0,25%: si evince in modo diretto che l’espressione di COLIV è significativamente aumentata in seguito al trattamento con la miscela attiva di cui sopra.
Il segnale emesso dal collagene IV nel campione trattato con la miscela Inositolo/Arginina 0,25%/0,25% è particolarmente forte in prossimità dei bordi della papilla dermica, vicino allo strato dei cheratinociti, indicando un aumento della produzione della proteina strutturale a livello della lamina basale. L’aumento a livello microscopico della sintesi di COLIV riflette a livello macroscopico un aumento della resistenza e della solidità del follicolo pilifero. Nei campioni trattati con la miscela Inositolo/Arginina 0,25%/0,25% è stata registrata una certa variabilità del segnale relativo a COLIV, associata alla normale variabilità biologica del campione. Infatti, anche dall’analisi visiva dell’immagine, il primo replicato mostra un segnale più debole rispetto al secondo replicato, in cui lo strato epiteliale è molto ben marcato.
Nonostante la variabilità registrata tra i replicati, il segnale rivelato nei campioni trattati con la miscela attiva di cui sopra risulta molto più forte rispetto a quello ottenuto nel controllo negativo e nel campione trattato con inositolo.
CN
(120 H) Inositolo [0,5%] (120H) Inositolo Arginina [0,25% 0,25%] (120 H) 198 69 288
129 94 729
3. Conclusioni
I risultati conseguiti con gli studi in vitro sopra presentati possono essere riassunti come segue:
Nessuna delle composizioni testate induce un alterazione significativa dei livelli di ATP sull’equilibrio metabolico del-proto-follicolo che, in assenza di uno stimolo stressorio, è in grado di mantenere in coltura le condizioni fisiologiche di omeostasi fino al sesto giorno.
Da un punto di vista morfologico, sia la ciclosporina A (nota per gli effetti sul ciclo di crescita del capello), sia la miscela inositolo/arginina hanno modificato la morfologia complessiva della proto-papilla, che risulta più strutturata, compatta e meno fragile quando confrontata con il controllo non trattato.
In merito all’espressione delle specifiche proteine citocheratina 6 e collagene IV, la miscela inositolo/arginina ha esibito un effetto positivo sulla loro produzione a livello follicolare, migliore rispetto a quello esibito dal solo inositolo. In particolare:
- La miscela attiva comprendente inositolo/arginina esibisce un effetto sinergico sull’espressione della proteina CK6, mantenendo la morfologia dello strato di cheratinociti simile a quello del controllo negativo. Questi risultati suggeriscono che la miscela abbia un effetto sulla differenziazione cellulare e sulla produzione di cheratine follicolari, con il risultato finale di un aumento dello spessore e della robustezza del fusto del capello.
- Per quanto concerne il collagene IV, i campioni trattati con la miscela inositolo/arginina registrano una elevata espressione della proteina a livello dello strato dei cheratinociti, indicando un aumento della produzione della proteina strutturale a livello della lamina basale, molto maggiore di quanto registrato per il solo inositolo e per il controllo negativo.
Considerando le funzioni strutturali e di ancoraggio svolte da COLIV a livello del follicolo pilifero, i risultati registrati in vitro si tradurrebbero in vivo in una aumento della stabilità e della robustezza del follicolo pilifero, suggerendo l’uso potenziale della miscela inositolo/arginina nel trattamento del capello e per il mantenimento del suo benessere.
ESEMPI
Si riportano a scopo illustrativo, ma non limitativo di alcuni esempi di formulazioni cosmetiche contenenti l’associazione di arginina e inositolo oggetto dell’invenzione.
Esempio 1: balsamo
Acqua 75-100%
Agenti emulsionanti 1 - 5%
Siliconi 1 - 5%
Emollienti, umettanti 1 - 5%
Inositolo 0.1 - 1 %
L-Arginina 0.1 - 1 %
Surfattanti cationici ≥ C12 0.1 - 1%
Ingredienti aggiuntivi 0.1 - 1%
Addensanti 0.1 - 1%
Conservanti, antimicrobic 0.1 - 1%
Esempio 2: lozione per capelli
Acqua 75-100%
Etanolo e/o isopropanolo 5 - 10%
Umettanti 1 - 5%
Agenti emulsionanti 1 - 5%
Ingredienti aggiuntivi 1 - 5% Inositolo 0.1 - 1 %
L-Arginina 0.1 - 1 % Olii 0.1 - 1% Conservanti, antimicrobici 0.1 - 1% Polimeri 0.1 - 1%
Esempio 3: shampoo – liquido, crema, pasta Acqua 75-100% Surfattanti anionici 10 - 25% Surfattanti anfoteri 1 - 5% Inositolo 0.1 - 1 %
L-Arginina 0.1 - 1 % Agenti chelanti 0.1 - 1% Ingredienti aggiuntivi 0.1 - 1% Conservanti, antimicrobici 0.1 - 1%
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1. Associazione dei principi attivi ad azione osmoprotettrice inositolo ed arginina, in rapporto molare inositolo : arginina compreso tra 10:1 e 1:10.
- 2. Associazione secondo la rivendicazione 1, in cui il rapporto molare tra inositolo ed arginina è 1:1.
- 3. Associazione secondo la rivendicazione 1 o 2, per uso nel mantenimento dell’omeostasi del cuoio capelluto e del capello.
- 4. Associazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui l’inositolo è mio-inositolo.
- 5. Composizione comprendente l’associazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti.
- 6. Uso topico della composizione secondo la rivendicazione 5, per la cosmesi del cuoio capelluto e del capello.
- 7. Prodotto cosmetico comprendente la composizione secondo le rivendicazioni 5-6 nella forma di shampoo, olio, balsamo, gel, lozione, schiuma, crema, maschera, tonico, burri, soluzioni alcoliche.
- 8. Dispositivo medico comprendente la composizione secondo la rivendicazione 5-6 nella forma di shampoo, olio, balsamo, gel, lozione, schiuma, crema, maschera, tonico, burri, soluzioni alcoliche.
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- 2017-11-06 EP EP17807936.4A patent/EP3538062A1/en active Pending
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| DATABASE GNPD [online] 31 March 2016 (2016-03-31), "Hyaluronic Density Conditioner", XP002769052, retrieved from Mintel accession no. 3866053 Database accession no. 3866053 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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