HUT77486A - Lipidhasító enzim - Google Patents

Description

A találmány tárgya egy eddig nem leírt, membránálló enzim, amely vérleukociták vagy monociták/makrofágok membránfrakcióiból különíthető el. A találmány tárgya ezenkívül az enzim szubsztrátjainak az alkalmazása gyógyszerek előállításához, amely gyógyszerek ezeket a szubsztrátokat gyógyszerészeti hatóanyagként tartalmazzák. A gyógyszerek gyógyszertanilag aktív anyagok felszabadítására és dúsítására alkalmasak megfelelő célsejtekben. A találmány tárgyát képezik továbbá ezt az enzimet tartalmazó in vitro vizsgálati rendszerek, amelyek az enzim további szubsztrátjainak fellelésére szolgálnak.

Á'W 0COT2

Λ r* 63.950/MA •4

S.B.G. & K.

Nemzetközi Szabadalmi Iroda

H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

Lipidhasító enzim

Boehringer Mannheim GmbH, MANNHEIM, DE

Feltalálók: HERRMANN, Dieter,

OPITZ, Hans-Georg,

ZILCH, Harald,

HEIDELBERG, DE

WEINHEIM, DE

MANNHEIM, DE

A bejelentés napja: 1995.	11.	09.
Elsőbbségei:	1994.	11.	12	. (DE	P 44 40 472.7)
	1995.	05.	18	. (DE	195 18 278.2)

A nemzetközi bejelentés száma

PCT/EP95/04414

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/15234

_ 2 A találmány tárgyát képező lipidhasító emzimkomplex (lipid-cleavage-enzym; LCE) és analógjai eddig nem leírt, membránálló enzimek, amelyek például humán perifériás vérleukociták vagy humán makrofágok membrán-frakcióiból különíthetők el, és amelyek lipidszerű hordozómolekulához kötött, gyógyszertanilag aktív anyagok konjugátjait a gyógyszertanilag aktív anyagnak vagy a gyógyszertanilag aktív anyag monofoszfátjának felszabadulása közben hasítják. A találmány tárgya ezenkívül ennek az enzimkomplexnek a szubsztrátjaiként szolgáló konjugátok alkalmazása gyógyszerek előállításához, amely gyógyszerek ezeket a konjugátokat gyógyszerészeti hatóanyagként tartalmazzák. A gyógyszerek alkalmasak a gyógyszertanilag aktív anyagok célzott felszabadítására és dúsítására megfelelő célsejtekben. A találmány tárgya továbbá ezt az enzimkomplexet tartalmazó, in vitro vizsgálórendszerek ezen enzimkomplex további anyagainak felleléséhez, valamint vizsgálórendszerek LCE-analógok felleléséhez. Az LCE rövidítésen mind az enzimkomplexet, az elkülönített enzimet, mind a lehetséges izoenzimeket értjük.

A rosszindulatú neopláziák (például rák, szarkóma, haemoblastosis, hematológiai neoplasia), a gyulladásos megbetegedések vagy az autoimmun betegségek, valamint vírusok vagy retrovírusok által előidézett megbetegedések, mint például az AIDS, ARC (AIDS related complex), cytomegalia, herpesz vagy hepatitis gyógykezelése az alkalmazott gyógyászati hatóanyagok nem megfelelő hatékonysága mellett gyakran azok extrém mellékhatásaival jár. Ez a hatás az alkalmazott gyógyszertanilag aktív anyagok túl kis in vivő szelektivitásával, illetve korlátozott gyógyászati alkalmazási tartományával magyarázható. A gyógyszertanilag aktív anyagok kedvező gyógyszertani in vitro tulajdonságai gyakran nem ültethetők át az in vivő viszonyokra.

Ezért évek óta történnek próbálkozások a gyógyszertanilag aktív anyagok kémiai szerkezetének módosításával, hogy olyan új anyagok álljanak rendelkezésre, amelyeknek a gyógyászati alkalmazási tartomány szempontjából jobbak a tulajdonságai. Ezenkívül az új gyógyszerészeti beadási formákat gyakran azzal a céllal fejlesztik ki, hogy az aktív anyagokat célzottan arra a hatáshelyükre szállítsák, ahol gyógyászati hatásukat ki kell fejteniük. Ily módon különösen az egészséges sejtekkel való nem kívánatos kölcsönhatást kívánják elkerülni. Daganatos sejtek esetében, amelyeknek megfelelő felületi antigénjeik vannak, például antitesteket állítottak elő, amelyek ezeket a speciális felületi antigéneket felismerik, és így célzottan a rákos sejthez kötődnek. Az antitesteket alkalmas toxinokkal oly módon módosítják, hogy a rákos sejthez való hozzákötődés után a toxin felszabadul, és a rákos sejt elhal. Egy másik lehetőség a gyógyászati alkalmazási tartomány növelésére, hogy a gyógyszertanilag aktív anyag kismértékű módosításával, például savas vagy bázisos addíciós sók előállításával vagy egyszerű észterek [például zsírsavészter,· J. Pharm. Sci. 79, 531 (1990)] előállításával, az alapul szolgáló aktív anyag fizikai tulajdonságait oly módon változtatják meg, hogy javul az aktív anyag oldhatósága vagy összeférhetősége. Ezeket a kémiailag kismértékben módosított vegyületeket gyakran úgynevezett prodrug-oknak is nevezik, mivel a testnedvekkel érintkezve vagy a májban (first ···

-4pass-metabolismus) majdnem közvetlenül a tulajdonképpeni gyógyászatilag aktív ágenssé alakulnak át.

A jelen találmány alapjául szolgáló műszaki probléma az, hogy egy olyan új célanyagot kell találni, amely a lehető legspecifikusabban fordul elő azokon a sejteken vagy azokban a sejtekben, amelyek a gyógyszertanilag aktív anyagok beadásának céltárgyát jelentik. A célanyagnak a megfelelő gyógyszerészeti hatóanyagokkal kölcsönhatásba kellene lépnie úgy, hogy a hatóanyagok a lehető legspecifikusabban ezekhez a célsejtekhez legyenek szállíthatók, ezek fel tudják ismerni, meg tudják kötni és fel tudják venni. A gyógyszerészeti hatóanyagnak lényegében két alkotórészből kellene felépülnie, mégpedig az első alkotórész feladata a felismerés és a célanyaggal való kölcsönhatás (ligand-specifikus rész), a második alkotórész pedig a tulajdonképpeni aktív anyagot jelenti (hatóanyag-specifikus rész), amely hatását csak akkor fejti ki, ha létrejön a specifikus kötődés a célmolekulához, és végbemegy a tulajdonképpeni aktív ágens vagy az aktív ágens monofoszfátjának intracelluláris lehasadása. Ennek célja annak elkerülése, hogy a gyógyszertanilag aktív anyag nem kívánt módon felszabaduljon a testfolyadékokban, úgyhogy a gyógyszertanilag aktív ágens ne legyen negatív hatással az egészséges sejtekre, és a nem kívánatos mellékhatások messzemenően elkerülhetők legyenek. Az erre a célra a gyógyszerforma előállításához alkalmazott gyógyszerészeti hatóanyagnak egyrészt a célanyag ligandjaként kell szolgálnia, másrészt tartalmaznia kell a tulajdonképpeni aktív gyógyszertani ágenst. Ez az ágens különösen már ismert gyógyszerészetileg ha-5tásos szerkezeteken is alapulhat, amelyek gyógyászati alkalmazási tartománya ily módon jelentősen javítható.

Meglepő módon, úgy találtuk, hogy célanyagnak az LCE alkalmas. Az LCE túlnyomórészt vagy rosszindulatú, aktivált vagy vírusfertőzött sejteken vagy sejtekben, különösen humán perifériás vérleukocitákon, makrofágokon, vese-, mellékvese- vagy petefészeksejteken, a nyirokrendszer vagy a nyirokszervek sejtjein vagy az agy sejtjein lokalizálható. Ezt az enzimkomplexet és analógjait a következőkben röviden LCE-ként jelöljük. Az LCE meglepő módon nem mutat az összes szervre elosztott, egyenletes statisztikai eloszlást, hanem főként olyan meghatározott sejtek membránjában figyelhető meg, amelyek gyógyszertanilag aktív anyagok beadására céltárgyként szóba jönnek. A szív-, csontvelő- és májsejtekben csak viszonylag nagyon kis enzimaktivitást lehetett megállapítani. Az LCE elkülönítéséhez alkalmazott sejtek, szervek vagy szövetek homogenátum-, illetve membránfrakciói az LCE-re vonatkozóan különböző specifikus aktivitást vagy affinitást mutatnak, aholis az aktivált sejtekben a specifikus aktivitás vagy az affinitás a nem aktivált sejtekhez képest igen magas. Ez humán perifériás vérleukocitákra vagy limfocitákra és granulocitákra, valamint humán és nem humán, illetve murin egymagvas sejtekre, például monocitákra/makrofágokra bizonyítható.

Az LCE meglepő módon azzal tűnt ki, hogy szubsztrátként hasítja a lipid-alapváz és a hidas szerkezet közötti, ehhez a hídhoz kovalensen kötött, fiziológiailag aktív anyag lipidszerű ···

-6vegyületeit. Az ilyen szubsztrátok az (I) általános képlettel írhatók le

L - B - D (I) ahol L lipidcsoportot, B egy hidat és D egy gyógyszertanilag aktív anyagot, illetve B-D egy foszfonát-hatóanyagot jelent. Az (I) általános képletű gyógyszerészeti hatóanyagoknak meglepő módon nagyobb a gyógyászati alkalmazási tartománya, mint a gyógyszertanilag aktív szabad, illetve módosítatlan D vagy -B-D anyagoké. Ezenkívül gyakran javítják ezek tartózkodási idejét a testben, a gyógyszertanilag aktív anyagok biofelhasználhatóságát vagy a gyakran kritikus tényezőként ismert membránátjárhatóságot (például vér-agy-korlát, sejtmembránok stb.). Az (I) általános képletű szubsztrátok ily módon hordozórendszerként (carrier) szolgálnak a gyógyszertanilag aktív anyagok számára. Az (I) általános képletű konjugátok szerepüket tekintve intracelluláris drug-storage-, drug-targeting- és drug-delivery-rendszernek nevezhetők. Hatásukra a gyógyszertanilag aktív anyag vagy annak prodrug formája orális alkalmazás után intracellulárisan felszabadul. Ez a felszabadulás előnyös módon nem aspecifikusan megy végbe a test valamennyi sejtjében, szervében vagy szövetében, hanem célzottan az olyan sejtekben, amelyek az LCE-t a sejtmembránban vagy részben intracellulárisan is tartalmazzák. Különösen meglepő azonban, hogy a hasítás nem a szubsztrátnak a testfolyadékok - például a vér, a vérsavó vagy a nyirokfolyadék - vagy a máj által végzett szállítása közben, hanem már csak a megfelelő célsejteknél vagy célsejtekben következik be. Ily módon elkerüljük a hasítási termék vese általi nem kívánt kiválasztását vagy a szubsztrát hasadását a májban, úgyhogy a hatóanyag sokkal nagyobb része szállítódik a mindenkori célsejtekhez. Az ilyen sejtek, ahogy fentebb már említettük, különösen patofiziológiásan vagy fiziológiásán aktivált sejtek, amelyek a gyógyszertanilag aktív anyagok céltárgyaként jönnek szóba, mint például az immunológiailag limfás rendszer vérleukocitái, limfocitái, makrofágjai és más sejtpopulációi. Különösen olyan aktivált sejtekről (például makrofágok, granulociták, limfociták, leukociták, trombociták, monociták stb.) van itt szó, amelyek a betegség esetén patológiás, fiziológiás, patofiziológiás vagy szimptómás szerepet j átszanak.

Az LCE egy eddig nem ismertetett enzimkomplex. Ez az enzimkomplex különösen azzal tűnik ki, hogy szubsztrátként a (3'-dezoxi-3'-azido-timidin)-5'-foszforsav-(3-dodecil-merkapto2-deciloxi)-propilészter (a következőkben az AZT-DMDOPE rövidítést használjuk) vegyületet 3'-dezoxi-3'-azido-timidinmonofoszfáttá és (3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propanollá (DMDOP) hasítja. Az LCE egy további előnyös szubsztrátja a (3'dezoxi-3'-fluor-timidin)-5'-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2deciloxi)-propilészter (FLT-DMDOPE) vegyület, amely 3'-dezoxi3'-fluor-timidin-5'-monofoszfáttá és DMDOP-vé hasad. Alternatív módon az (5-fluor-uridin)-5'-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2deciloxi)-propilészter (5-FU-DMDOPE) is (5-fluor-uridin)-5'monofoszfáttá (5-FU-MP) és DMDOP-vé hasad.

Az előállított LCE-tartalmú preparátumok C foszfolipáztól mentesek. Ez mind az LCE-aktivitás eltérő kationfüggőségéből, mind a C foszfolipáz-specifikus inhibitorokból is látható, amelyek az LCE-t nem gátolják.

Az AZT-DMDOPE vegyületnek előnyös módon különféle humán sejttípusok sejthomogenátum-, membrán-, illetve citozolfrakciói általi átalakításának meghatározásához egy enzimmintát hoztunk létre (6. példa).

A vizsgálati elv azon alapszik, hogy az LCE az anyavegyületet AZT-MP-vé és a megfelelő tioéter-lipidrésszé hasítja. Ehhez [¹⁴C]-AZT-DMDOPE-t és nem radioaktívan jelölt AZT-DMDOPE-t alkalmaztunk. A DMDOP tioéterlipid-metabolitot a kiindulási keverékekből kiextraháltuk (7. példa), és a radioaktívan jelölt anyag mennyiségét folyadék-szcintillációs analizátorban mértük. Mivel meghatározott mennyiségű [-AZT-DMDOPE-t alkalmaztunk az enzim-mintában, ezért az enzimatikus hasítás átalakítását meg lehetett határozni.

Az enzimet előnyös módon humán perifériás vérleukocitákból - amelyeket előzőleg PHA-val vagy más stimulálószerrel (például citokin stb.) aktiváltunk - vagy murin vesesejtekből különítjük el. Az előkísérletekben a molekulatömegre körülbelül 120 000 - 160 000 értéket kaptunk, amelyet az SDS-PAGE módszerrel határoztunk meg. Azok a sejtek, amelyek ezt az enzimet tartalmazzák, egyszerű módon azonosíthatók úgy, hogy megfelelő vizsgálati körülmények között AZT-DMDOPE vagy FLT-DMDOPEoldattal elegyítjük, és az AZT-monofoszfát, illetve az FLTmonofoszfát vagy DMDOP hasítási termékeket, például vékonyré·· ·· • · * ···.

teg-kromatográfiás módszerrel vagy radioaktívan jelölt minták esetében szcintillatográfiás eljárással, kimutatjuk (lásd a 47. példákat). A biokémiailag alkalmazott C vagy D foszfolipázokkal ellentétben az LCE-t nem a C vagy D foszfolipázok ismert inhibitoraival gátoljuk vagy a C vagy D foszfolipázok aktivátoraival aktiváljuk. A C foszfolipázzal ellentétben az enzimet D 609 anyaggal (triciklodekán-9-ilxantogenát; C11H15OS2K) aktiváljuk és D 609 C foszfolipázzal gátoljuk.

Az intracelluláris AZT nem foszforilezett alakjában nem gyakorol gátló hatást a vírusos reverz transzkriptázra (RT) (Nakashima et al., 1986, Antimicrob. Agents Chemother. 30, 933937; Mitsuya et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82., 70967100). A timidin szerkezeti analogonjait timidin-kináz, timidilát-kináz és pirimidin-nukleozid-difoszfát-kináz intracelluláris enzimekkel (Yarchoan et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321,. 726-738; Toyoshima et al., 1991, Anal. Biochem. 196,

302-307) szukcesszív foszforilezéssel AZT-MP-n és AZT-DP-n keresztül alakítjuk át a gyógyászatilag hatásos, RT gátló AZT-TPvé. Az AZT-DMDOPE-t, mint tioéterlipid-AZT-konjugátot, intracelluláris enzimatikus hasítással lehetne AZT-vé vagy közvetlenül már foszforilezett alakká, AZT-MP-vé alakítani. A 8. példában az intracelluláris koncentrációkat foszforilezett és nem foszforilezett AZT-re inkubáció után AZT-DMDOPE-re és AZTre vonatkozó ekvipotens koncentrációkkal határozzuk meg.

Az enzimkomplex és analógjai továbbá a különböző fajokban (például ember, egér, patkány, kutya, majom) nem mutatnak

·. .··. ··.. ..

.· ·· · · ···· *..· : ··: * ·

- 10 egyenletes statisztikai eloszlást a szervekben, hanem csak meghatározott sejtek, szervek vagy szövetek membránjaiban fordulnak elő, amelyek célsejtekként szolgálnak az (I) általános képletű hasítható konjugátok számára. Ezeknek az enzimeknek a természetes szubsztrátjai ezidáig nem ismertek. A citozolikus frakciókban az LCE-aktivitás mindig a kimutatási határ alatt vagy éppen a határon van. Nagyon kis aktivitás állapítható meg például a csontvelősejtekben is, ami az LCE szubsztrátjaiként alkalmazott, (I) általános képletű, gyógyszerészeti hatóanyagok nagyon kis vagy akár teljesen hiányzó csontvelő-toxicitására enged következtetni.

Az LCE-aktivitás protein- és időfüggése lineáris, a fémkationoktól való függése specifikus (a Ca2+, Zn2+ és Mn2⁺ gátolják), és klasszikus Michaelis-Menten kinetikát mutat (szusztrátfüggőség) (9. példa). Az enzimkomplex nagyobb aktivitása mellett az aktivált sejtekben ilyen körülmények között az LCE affinitása a szubsztráthoz is nagyobb.

Az elkülönített vagy a membrán-frakciókból erősen dúsított LCE a screeninghez is használható új, potenciálisan hasítható szubsztrátokra vagy természetesen előforduló szubsztrátokra. Az így kapott szubsztrátok messzebbmenően vizsgálhatók esszenciális szerkezeti jellemzőiket tekintve, amelyek a szubsztrát felismeréséhez és az LCE-hez való kötődéshez szükségesek. Az ilyen azonosított szerkezeti tulajdonságok aztán alkalmazhatók kémiailag módosított szubsztrátok előállításához, amelyek tartalmazzák ezeket az esszenciális jellemzőket, ezenkívül alkalmas ···· •· · ·

- i 1 funkciós csoportok előállítására, amelyek gyógyszertanilag aktív anyagokkal való kapcsolódásra alkalmasak.

Ily módon lehetséges screening a lipid-cleavage-enzym (LCE) inhibitoraira vagy aktivátoraira is.

Az elkülönített vagy az erősen dúsított enzim diagnosztikailag használható, ha például a növelt vagy csökkentett lipidcleavage-enzym-aktivitások in vitro vagy in vivő patológiás változásokhoz vezetnek, vagy ezekkel a patológiás változásokkal megfelelő megbetegedések vagy betegségtünetek járnak.

Az LCE diagnosztikai szerek előállításához is alkalmazható, amelyek arra használatosak, hogy a gyógyszerészeti hatóanyag pácienseknek való beadásakor vizsgálják ezeknek a szubsztrátoknak a hasadását, ami ezeknél a pácienseknél a kezelési módok specifikus és egyéni igazításához vezet (drugmonitoring).

Rekombináns LCE-t jól megalapozott eljárások szerint lehet előállítani úgy, hogy LCE-vel vagy LCE-fragmensekkel meghatározzuk az aminosav-szekvenciát, és megfelelően konstruált oligonukleotid mintákkal végigvizsgálunk egy emberi vagy valamilyen emlősállattól származó génbankot. A talált gént azután megfelelő vektorral exprimáljuk egy procaryota és encaryota sejtrendszerben. A rekombináns LCE azután a fehérjekémiában ismert eljárás szerint tisztítható (lásd például Maniatis, Molecular Cloning (Molekuláris klónozás)).

Az LCE különösen azzal tűnik ki, hogy hasítani tudja az (I) általános képletű vegyületeket, • · . ··*· *.

:d az LCE hasításának helye amelyben L egy lipidrészt, B egy hidat és D egy gyógyszertanilag aktív anyagot,·' illetve B-D egy foszfonát-hatóanyagot jelent. A nagyon specifikus hasadás a lipidrész és a foszfátcsoport között megy végbe. Az (I) általános képletű vegyületek nem specifikus hasadását a molekulában más funkciós csoportoknál nem figyeljük.

Az (I) általános képletű konjugát L lipidrésze előnyös módon a következő, (II) általános képletű csoportot jelenti:

R¹—X CH₂ r2-γ-_Ch₂ (II) (CH₂)m— ahol

R¹ egy 1-30 szénatomos, egyenes- vagy elágazó-láncú, telített vagy telítetlen alkillánc, amely adott esetben egyszeresen vagy többszörösen szubsztituálva lehet halogénnel, 5-7 szénatomos cikloalkil-, fenil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-merkapto-, 1-6 szénatomos alkoxi-karbonil-,

- 13 1-6 szénatomos alkil-szulfinil- vagy 1-6 szénatomos alkilszulfonil-csoporttal,

R.2 hidrogén, egy 1-20 szénatomos, egyenes- vagy elágazóláncú, telített vagy telítetlen alkillánc, amely adott esetben egyszeresen vagy többszörösen szubsztituálva lehet halogénnel, 5-7 szénatomos cikloalkil-, fenil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-merkapto-, 1-6 szénatomos alkoxi-karbonilvagy 1-6 szénatomos alkil-szulfonil-csoporttal,

X egy vegyértékvonalat, oxigénatomot, kénatomot, aminokarbonil-, oxikarbonil-, karboxi-amino-, karboniloxi-, karbonil-amido-, amido-karbonil-, a szulfinil- vagy a szulfonilcsoportot jelenti,

Y egy vegyértékvonal, amino-karbonil-, oxikarbonil-, karboxi-amino-, karboniloxi-, karbonil-amido-, amido-karbonilcsoport, oxigén- vagy kénatom és m egy 1 és 5 közötti egész számot jelent.

A (II) általános képletben R^ előnyös módon egy 8-15 szénatomos, egyenes- vagy elágazó-láncú alkilcsoportot jelent, amely még szubsztituálva lehet egy 1-6 szénatomos alkoxi- vagy egy 1-6 szénatomos alkil-merkapto-csoporttal. R^ különösen nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil- vagy tetradecilcsoportot jelent. Az r! 1-6 szénatomos alkoxiszubsztituenseiként előnyös módon a metoxi-, etoxi-, butoxi- és a hexiloxicsoportok jönnek szóba. Ha R·'· egy 1-6 szénatomos alkil-merkapto-csoporttal van szubsztituálva, akkor ezen külö»·, ·

- 14nösen a metil-merkapto-, etil-merkapto-, propil-merkapto-, butil-merkapto- és a hexil-merkapto-csoportot értjük.

R² előnyös módon egy 8-15 szénatomos, egyenes- vagy elágazó-láncú alkilcsoportot jelent, amely még szubsztituálva lehet egy 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal vagy egy 1-6 szénatomos alkil-merkapto-csoporttal. R² különösen oktil-, nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil- vagy tetradecilcsoportot jelent. Az R² 1-6 szénatomos alkoxi-szubsztituenseiként előnyös módon a metoxi-, etoxi-, propoxi-, butoxi- és a hexiloxicsoportok jönnek szóba. Ha R^· egy 1-6 szénatomos alkil-merkapto-csoporttal van szubsztituálva, akkor ezen különösen a metil-merkapto-, etil-merkapto-, butil-merkapto- és a hexil-merkapto-csoportot értjük.

X előnyös módon kénatom, szulfinil- vagy szulfonilcsoport, Y pedig oxigénatom. Az X és Y heteroatomok az L lipidrészben csak kivételes esetekben cserélhetők a lecitinből ismert karbonsavészterekre, mivel különben már a szérumban vagy a májban (first pass-effect) hidrolitikus hasadás menne végbe a megfelelő lizolecitin-származékokká vagy glicerol-észterekké a gyógyszertanilag aktív anyag megfelelően gyors eliminációjával. Ennek a bejelentésnek a tioéter-, illetve éterlipidjei (X, Y = 0, S) különböző fajok szérumában, beleértve az emberét, ezt a hasadást nem mutatják.

Előnyösek azok a vegyületek is, amelyekben X és Y egy vegyértékvonalat jelöl, R² hidrogénatomot, R¹ pedig egy 1-30 szénatomos alkilláncot jelent, amely adott esetben » ο

-w· ) «,* — i · • ·

- 15 szubsztituálva lehet egy 1-6 szénatomos alkoxi- vagy egy 1-6 szénatomos alkil-merkapto-csoporttal.

m előnyös módon egyenlő 1-gyel vagy 2-vel, és különösen előnyös módon egyenlő 1-gyel.

A B.híd egy vegyértékvonalat jelent, vagy a (III) általános képlettel írható le:

-0-[ PZ (OH)A]_n- (III) ahol n = 1, 2 vagy 3 lehet, de előnyös módon 1-gyel vagy 2-vel és különösen 1-gyel egyenlő, Z oxigén vagy kén, és A vagy oxigén, kén vagy egy vegyértékvonal, előnyös módon oxigén.

Az L lipidrésznek és a B foszfáthídnak a fent megadott jelentése van, mimellett L előnyös módon a (II) általános képletű csoportot jelenti, és B előnyös módon egy (III) általános képletű foszfáthíd. Különösen előnyös az a (III) általános képletű foszfáthíd, amelyben n = 1, és az a (II) általános képletű L lipidrész, amelyben Rl és R² egy 8-15 szénatomos alkilcsoportot jelentenek, X kén és Y oxigén. Előnyösek továbbá azok a vegyületek, amelyekben B foszfonátként a hatóanyag-szerkezet egyik alkotórésze, mimellett η = 1 és A egy vegyértékvonal.

A gyógyszertanilag aktív anyag fogalom (az (I) általános képletben a foszfonátoknál a D, illetve a B-D jelölés) ebben a bejelentésben gyógyszerjogi értelemben hatóanyagot jelent. Ez a hatóanyag lehet egy már bevezetett, a gyógyszerészeti hatóságok által engedélyezett gyógyszerkészítmény hatóanyaga, vagy gyógyszerjogi engedélyezés alatt álló hatóanyag. A gyógyszertanilag aktív anyag definíció a hatóanyagok olyan származékait is magában foglalja, amelyek egy vagy több funkciós csoport (például olyan csoportok, amelyek lehetővé teszik a D kapcsolódását az L lipidhordozó résszel, mint például a hidroxi- vagy aminocsoportok) bevitelével kémiailag módosíthatók. A definíció magában foglalja továbbá a D hatóanyagból képződő prodrugformákat, amelyek ugyanúgy fiziológiailag aktívak. Különösen olyan gyógyszertanilag aktív D anyagok jönnek szóba, amelyeknek klinikai fejlesztését a nem kívánatos mellékhatások miatt abbahagyták vagy nem kezdték el, illetve amelyek nagyon kis adaghatás-spektrummal rendelkeznek, úgyhogy a gyógyászatilag szükséges mennyiséget csak nagyon nagy kockázattal vagy gyakorlatilag egyáltalán nem lehetett beadni.

Meglepő módon úgy találtuk, hogy egy gyógyszertanilag aktív D, illetve B-D anyag gyógyászati alkalmazási tartománya foszfonát-hatóanyagok esetében jelentősen javul, ha az anyag egy lipidszerű hordozómolekulához kapcsolódik. Az így előállított konjugát új hatóanyagként szolgál gyógyszerészeti beadási formák előállításához. A kapcsolódás összességében a gyógyszertanilag aktív D, illetve B-D anyag erősebb in vivő hatását eredményezi, mivel a keletkező drug-delivery-transport-system révén a célsejtekben bekövetkezik a gyógyszertanilag aktív anyag lokalizálása, és ezáltal a gyógyszertanilag aktív anyag hatékonysága növekszik. Ez azt jelenti, hogy egyrészt csökkenthető a beadandó gyógyszertanilag aktív anyag mennyisége, vagy másrészt az ugyanakkora hatásos mennyiség megtartása mellett erősebb a gyógyszertani hatás.

• ··

- 17A gyógyszertanilag aktív D, illetve B-D anyagok alapjául szolgáló kémiai szerkezet továbbá úgy módosítható, hogy az anyagok fizikai vagy kémiai tulajdonságai meg vannak változtatva, és például zsíroldhatóságuk nagyobb vagy kisebb, de gyógyászati hatásukat tekintve lényegében ugyanolyanok a tulajdonságaik, mint a módosítatlan D, illetve B-D anyagnak. Különösen előnyös, ha a D anyagot funkciós csoportok bevitelével kémiailag úgy módosítjuk, hogy egy alkalmas hídon keresztül kapcsolódhat az L lipidrészhez. Ez például hidroxicsoportok bevitelével történik, amelyek a B foszfátcsoporton keresztül kapcsolódnak a lipidhez.

A gyógyszertanilag aktív D, illetve B-D anyag egy biológiai hatással rendelkező vegyi anyagot vagy biológiai alapra (antitest, peptid, protein, hormon, toxin stb; INDEX NOMINUM, International Drug Directory, Medpharm) épített anyagot, valamint annak egy funkciós csoport (például egy hidroxicsoport) bevitelével kémiailag módosított származékait jelenti. Ennek feltétele, hogy a gyógyszertanilag aktív anyag vagy prodrugformája a liponukleotid hasadásán - amit a lipid-cleavage-enzym (LCE) idéz elő - keresztül aktiválást nyer ezáltal a testrokon enzim által. A gyógyszertanilag aktív anyagok előnyös módon az LCE által előidézett hasadás után gyógyszertanilag aktív monofoszfát-anyagként in vivő köztitermékként működnek, és ezeket celluláris enzimek tovább foszforilezik, például nukleozid-monofoszfátot nukleozid-trifoszfáttá, vagy szabad gyógyszertanilag aktív anyaggá hasítják (lásd a 8. példát).

···· ·· • ··

- 18 A találmány értelmében különösen valamennyi in vitro hatásos gyógyszertanilag aktív anyag, de in vivő a gyógyászati területen toxikus, gyógyszertanilag aktív anyagok jönnek szóba, azaz valamennyi, kis gyógyászati alkalmazási tartományú anyag, amely rendelkezik egy kémiai funkciós csoporttal a kovalens kötés hozzákapcsolására a foszfáthoz. Ezenkívül olyan anyagok is alkalmazhatók, amelyek gyógyszertanilag aktív alakjukban először nem tartalmaznak funkciós csoportot, amely azonban kémiai módosítással bevihető anélkül, hogy az anyag hatásában veszteség következne be.

Az L lipidcsoporttal végzett konjugációhoz előnyös módon olyan gyógyszertanilag aktív anyagokat alkalmazunk, amelyek rendes körülmények között foszforilezés után érik el aktív alakjukat (mint például a nukleozidok esetében), illetve foszfonát-hatóanyagokat alkalmazunk. A konjugátból azután a gyógyszertanilag aktív foszfát-anyagot a konjugát enzimatikus hidrolízisével szabadítjuk fel. A foszforilezett anyag felszabadulásának különösen azért van jelentősége, mert ez a folyamat olyan sejtekben is végbemegy, amelyek nem rendelkeznek a tiszta gyógyszertanilag aktív anyag felfoszforilezéséhez rendes körülmények között szükséges enzimekkel (kinázok). A konjugált és az LCE révén intracellulárisan vagy a sejtmembránban felszabadult gyógyszertanilag aktív anyagnak például citosztatikus, citotoxikus, antitumorális, antivírusos, antiretrovírusos, immunszuprimáló vagy immunstimuláló hatása lehet.

Gyógyszertanilag aktív D anyagokként olyan vegyületek jönnek szóba, amelyek adott esetben egy a hatást nem jelentősen • · ·

- 19befolyásoló, funkciós csoport bevitelével kapcsolódásra képes származékká vannak alakítva, amely aztán például a daganatnövekedést lassítja, a DNS-be és/vagy az RNS-be beépülő anyag, gátolja a topoizomeráz I-et és II-t, tubulingátló, alkiláns, a riboszómákat inaktiváló vegyület, tirozin-foszfokinázinhibitor, differenciálási induktor, hormon, hormonagonista, hormonantagonista, olyan anyag, amely megváltoztatja a pleiotrop ellenállást a citosztatikumokkal szemben, calmodulininhibitor, C proteinkináz-inhibitor, P glikoprotein-inhibitor, a mitokondriálisan kötött hexokináz modulátora, a g-glutamilciszteintetáz vagy a glutation-S-transzferáz inhibitora, a szuperoxid-diszmutáz inhibitora, A HIV-1 és HIV-2 reverz transzkriptázának inhibitora vagy inhibitorok az A-E hepatitisvírusokhoz .

A gyógyszertanilag aktív D, illetve B-D anyagnak antiinflammatorikus, antireumatikus, antiflogisztikus, analgetikus vagy antipiretikus hatása lehet. Ezenkívül antiarrhythmicum, kalciumantagonista, antihisztaminikum, a foszfodiészteráz gátlója vagy sympathomimeticum, illetve parasympathomimeticum lehet.

Gyógyszertanilag aktív D, illetve B-D anyagokként valamenynyi rövid felezési idejű anyag, különösen szervre, szövetre vagy sejtre vonatkozóan különböző felezési idejű; rossz biofelhasználhatóságú, azaz rossz felszívódású, nagy májhasadású vagy gyorsan kiválasztódó; rossz membránáthatolású (például sejtmembrán, vér-agy-korlát); csontvelő-toxicitással vagy más korlátozó szerv-toxicitással rendelkező (például ···

-20kardio-, máj-, nephro-, neurotoxicitású stb.) vegyületek jönnek szóba, amelyek hatáskoncentrációja in vivő túl kicsi. Ezenkívül olyan anyagok alkalmasak, amelyek célzottan a célsejtek sejtmagjával lépnek kölcsönhatásba, és a DNS vagy RNS síkján kapcsolódnak be a molekuláris eseményekbe, ahogy például antisense-oligonukleotidok, DNS-fragmensek és azok, amelyek a génterápiához alkalmazhatók.

Az (I) általános képletben a gyógyszertanilag aktív D anyagok például: AZT (azido-timidin), FLT (fluor-timidin), 5fluoro-uracil, 5-fluor-uridin, 6-MPR, fludarabin, kladribin, pentosztatin, ara-C, ara-A, ara-G, ara-H, aciklovir, granciklovir, doxorubicin, 4'-epi-doxorubicin, 4'-dezoxidoxorubicin, etopozid, daunomicin, idarubicin, epirubicin, mitoxantron, vinkrisztin, vinblasztin, taxol, kolchicin, melfalán, 3'-dezoxi-2-fluor-adenozin, FdA, 5-etinil-uracil-9-pD-arabino-furanozid, 5-propinil-uracil-9-p-D-arabino-furanozid, d4T, ddU, ddl, ddA, d2T, 2'-dezoxi-2',2'-difluor-citidin, 5trifluor-metil-2'-dezoxi-uridin, 5-klór-2’,3'-didezoxi-3'fluor-uridin, 3'-dezoxi-3'-fluor-mioinozitol, neplanocil A, ribavirin, mioinozitol, fialuridin, 3TC (lamivudin), doxifluridin, tegafur, hipericin, pszeudohipericin, uszevir, famciklovir, penciklovir, foszkarnet, karvedilol, aktinomicin

A, bleomicin, daunorubicin, floxuridin, mitramicin, mitomicin

C, mitoxantron, sztreptozotocin, vindezin, netilmicin, amikacin, gentamicin, sztreptomicin, kanamicin A, tobramicin, neomicin B, plicamicin, papamicin, amfotericin B, vankomicin, idoxuridin, trifluridin, vidarabin, valamint morfin, prosztaglandin, leukotrién vagy cikloszporin. Szóba jön továbbá: terfenadin, dexametazon; terbutalin; predniszolon;

fenoterol; orciprenalin; szalbutamol; izoprenalin; muszkarin;

bupranolol; oxifenbutazon; ösztrogén; szalicilsav; propanolol; aszkorbinsav; spongiadiol; diklofenak; izospongiadiol;

flufenaminsav; digoxin; 4-metil-amino-fenazon; allopurinol; teofillin; epoprosztenol; nifepidin; kinin; rezerpin; metotrexát; klórambucil; spergualin; ibuprofén; indometacin;szulfaszalazin; penicillanamin; klorokvin, azatioprin.

Az (I) általános képletben a gyógyszertanilag aktív B-D anyagok például PMEA és más aciklikus nukleozid-foszfonátanalógok, kinolin-foszfonsavak, MP-101, fosztedil, HAB-439, 2amino-7-foszfono-heptánsav, foszfozál, foszfenitoin, atrinozitol, ciplatát, difficidin, foszkvidon, alafoszfalin, foteumsztin, etopozid, encit/E, 4-oxo-S-foszfono-D-norvalin és más NMDA-antagonista-foszfonátok.

Előnyös gyógyszertanilag aktív anyagok például a peptidek, a proteinek és az oligonukleotidok is, mint például kortikotropin, kalcitonin, deszmopresszin, gonadotropin, gozerelin, inzulin, zipresszin, béta-melanotropin, alfamelanotropin, muramil-dipeptid, oxitocin, vazopresszin, FK-506, oktreotid vagy enalkirén.

A fent említett gyógyszertanilag aktív anyagok és az azokból előállítandó konjugátok csak példákat jelentenek, és nem korlátozzák a találmány szerinti gondolatokat.

• ·

- 22 Az (I) általános képletű vegyületeket és azok előállítását a WO 92/03462 számú, a WO 93/16092 számú, a WO 93/16091 számú, a WO 94/03465 számú nemzetközi szabadalmi iratokban, a

PCT/EP94/02123 számú európai szabadalmi iratban, a DE 4402492 számú és DE 4418690 számú német szabadalmi iratokban, valamint például a WO 91/19726 számú nemzetközi; az EP 0 350 287 számú európai; az US 5,223,263 számú; az US 5,194,654 számú; az US 4,921,951 számú; az US 4,622,392 számú; az US 4,291,024 számú; az US 4,283,394 számú amerikai szabadalmi iratokban ismertetik.

Az antivírusosan hatásos nukleozidok esetében az EP 0 350 287 számú európai és az US 5,223,263 számú amerikai szabadalmi iratokban lipid-származékokat (diacil-glicerol-nukleozid) és azok liposzomális formában való alkalmazását ismertetik. Liposzómák formájában előnyös módon az anyag felvétele a retikuloendoteliális rendszer (RÉS) sejtjei, például makrofágok és monociták, révén lehetséges.

Megfelelő összehasonlító vizsgálatokkal ki lehetett mutatni, hogy az EP 0 595 133 számú európai szabadalmi iratból ismert diacil-glicerol-konjugátok gyógyászati hatásai in vivő gyengébbek a WO92/03462 számú nemzetközi szabadalmi iratban szereplő tioéter- vagy éterlipid-konjugátokéinál. Ez a zsírsavészter aspecifikus, nem a hatás helyén végbemenő hidrolízisére vezethető vissza. A nem hidrolizálható tioéter- és étercsoportoknak ezzel szemben döntő előnyeik vannak, mivel csak a speciális enzim (LCE) szabadít fel a célszövet membránjában, illetve intracellulárisan egy biológiai hatású anyagot vagy a megfelelő köztitermékeket.

Az (I) általános képletű (L-B-D) konjugátoknak döntő előnyeik vannak a nem konjugált gyógyszertanilag aktív D, illetve B-D anyaggal szemben: A specifikus, a gyógyszertanilag aktív anyaghoz kovalensen kötött hordozó (carrier) (L-B-, illetve L) javítja a rosszul felszívódott gyógyszertanilag aktív anyagok biofelhasználhatóságát, a potenciálisan toxikus hatómolekulák összeférhetőségét, a gyorsan kiválasztott vagy metabolizált gyógyszerek tartózkodási idejét és a gyenge membránétjárhatóságú vegyületek (például vér-agy, sejtek stb.) membránáthatolását. Az enzimatikus hasítás in vivő a hordozóban (carrier) és a gyógyszertanilag aktív D anyagban (illetve az anyag származékában), illetve a hordozóban (carrier) és a gyógyszertanilag aktív foszfát-anyagban (D monofoszfát) vagy BD foszfonátban rendszerint nem a szérumban, hanem csak intracellulárisan történik. Ezenkívül a hordozórész lecitinszerű szerkezetével, amely az igényelt hatás szempontjából lényeges, javítja a gyógyszertanilag aktív anyag áthatolását vagy membránátjárhatóságát, és sok esetben retard hatást mutat. Az L-B-D lipid-konjugátok gyomorbél-összeférhetősége továbbá többszörösen jobb, mint a tiszta gyógyszertanilag aktív D anyagoké. A felszívódás esetén is jobb a lipid-konjugát membránszerkezeten való áthatolása, és így jobban leküzdi a felszívódási gátakat. Ez megfelelően érvényes például a vér-agykorlát áthatolására könnyített diffúzióval vagy adott esetben aktív transzporttal. Különösen előnyösek az (I) általános képletű konjugátok a lipidrésznek a (II) általános képlettel való korlátozásával, amelyek az LCE-vel végzett enzimatikus hidrolí_;· .· * · ··

- 24 zis útján egy biológiai hatású anyagot hasítanak le, amely in vivő kevesebb mellékhatást okoz, mint a gyógyszertanilag aktív anyag önmagában történő beadása.

A konjugátnak a plazma- és szövetproteineken való jobb kötése az in vivő eloszlást tovább javítja. Normális biotranszformációval a konjugát először tioéterből (X=S) szulfoxiddá (X=SO) oxidálódik, ami azonban a szulfoxid ekvipotens hatása miatt a tioéterhez viszonyítva nem jelent hátrányt. A gyógyszertanilag aktív anyagnak a konjugátból való lassú felszabadulása révén az aktív anyag szintje alacsony, de hosszú ideig garantáltan állandó, és így a hatás jobb vagy a toxikus mellékhatások elkerülhetők. A monofoszfát alakjában lévő, felszabadult, gyógyszertanilag aktív anyag, nagy hidrofiliája miatt, már nem hatol ki a sejtből.

A gyógyszertanilag aktív anyagnak a konjugáció révén mind a teljes testre, sejtre, mind a szervre vonatkozó felezési ideje jelentősen meghosszabbodik annak következtében, hogy a konjugátnak hosszú tartózkodási ideje van a szervezetben. A hasításhoz szükséges LCE-aktivitás hiánya miatt a szérumban és néhány szervben a hasításhoz majdnem semmi, illetve csak nagyon kevés csontvelő- és szervtoxicitás figyelhető meg. Különösen előnyös, hogy az (I) általános képletű konjugátokat különböző célszervekben, szövetekben vagy sejtekben specifikusan dúsítjuk fel.

Az (I) általános képletű vegyületek olyan gyógyszerek előállításához alkalmazhatók hatóanyagokként, amelyeket minden olyan betegségnél alkalmaznak, amelyeknél a sejtekben, szervek• ....

-25ben vagy szövetekben a gyógyszertanilag aktív anyag magas szintje szükséges vagy segítő. Ehhez a drug-storage-deliverytargeting-nek nevezhető szállítórendszernek lényeges feltétele, hogy a szándékolt gyógykezelés értelmében reagáltatandó sejtek az LCE-t a belső vagy külső sejtmembránjaikban tartalmazzák, úgyhogy egy első lépésben a hatóanyag az LCE-hez kötődik, majd a sejtmembránon át a sejt belsejébe szállítódik, és eközben a hatóanyag hasadása fiziológiailag·aktív anyaggá vagy a sejtmembránon történő szállítással lényegében egyidőben, vagy később részben a sejten belül megy végbe. Az intracelluláris hasadás különösen olyan esetekben fordul elő, amelyeknél az LCE a sejten belül is lokalizálva van. A találmány értelmében a hatóanyagnak a gyógyszertanilag aktív anyag intracelluláris felszabadulásával összekötött hasadása oly módon is végbemehet, hogy vagy közvetlenül a fiziológiailag vagy gyógyszertanilag aktív anyag, vagy egy ennek az anyagnak megfelelő előanyag (prodrug-forma) keletkezik. Alkalmas célsejtek például a vérleukociták (peripheric blood leucocyte; PBL), monociták, vesesejtek vagy makrofágok és az immunológiailag limfás rendszer sejtjei.

Az (I) általános képletű vegyületeknek különösen immunmoduláló, para-/sympatholitikus, /-mimetikus, központi vagy perifériás izomlazító, antihipertóniás, antihipotóniás, antiobstruktív, analgetikus, antiflogisztikus, antiemetikus, antiinflammatorikus, antiallergikus, antiasztmatikus, antipiretikus, antiulceratív, aptacid, antianginás, antiarrhythmiás, antipszichotikus, antidepresszív, ·**. ···. ···· ·« .· ·· .·· · ···· *·.· :

-26antiepileptikus, antikonvulzív, antiparkinsonoid, antihisztaminergikus, antimuscarinergikus, antiserotoninergikus, antigabaergikus, antiadrenergikus, antikolinergikus, glikozidikus, kronotróp, batmotróp, dromotróp, inotróp, diuretikus, antidiuretikus, urikozurikus, urikosztatikus, anti-hipolipidemikus, antifibrinogén, antidiabetikus, vércukorcsökkentő, antiösztrogén, antiandrogén, antigesztagén, antioszteoporotikus, tireosztatikus, csontnövekedés-serkentő, narkotikus, anesztetikus, antihipnotikus, fertőzésgátló, antibiotikus, antituberkulosztatikus vagy hematopoetikus hatása van, vagy vitamint jelentenek.

Az egyik találmány szerinti vegyület erősebb hatása alkalmas gyógyszerek kombinációjával vagy a jelen bejelentés két különböző konjugátjának kombinációjával fokozható.

Ezen bejelentés citosztatikus vagy citotoxikus konjugátjának hatása például más citosztatikus vagy citotoxikus vegyületek kombinációjával fokozható előnyös módon akkor, ha különböző hatásmechanizmusú összetevőket vagy egy citosztatikus vagy citotoxikus konjugátnak egy antivírusos konjugáttal való kombinációját alkalmazzuk (szinergizmus például AIDS-nél).

Különösen előnyösek azok a találmány szerinti konjugátkombinációk, amelyeknél az egyik összetevőnek citosztatikus vagy citotoxikus potenciálja van, a másik összetevő pedig áttöri a multi-drug-ellenállást, vagy az egyik összetevő a HÍV reverz transzkriptázát, a másik összetevő pedig például a proteázt gátolja, vagy a kombináció egyik liponukleotidjának sincs keresztellenállása. Az (I) általános képletű vegyületek • ·· és gyógyszerészeti készítményeik olyan gyógyszerek előállításához is használhatók, amelyek más gyógyszerekkel kombinálva különböző megbetegedések kezelésére és profilaxisára alkalmasak.

Az (I) általános képletű vegyületek lehetséges sóiként mindenek előtt a foszfátcsoport alkálifém-, alkáliföldfém- és ammóniumsói jönnek szóba. Alkálifémsókként a lítium-, nátriumés káliumsók előnyösek. Alkáliföldfémsókként különösen a magnézium- és kalciumsók jönnek szóba. Ammóniumsókon a találmány értelmében azokat a sókat értjük, amelyek tartalmazzák az ammóniumiont, amely 1-4-szeresen szubsztituálva lehet 1-4 szénatomos alkilcsoporttal és/vagy aralkilcsoporttal, előnyös módon benzilcsoporttal. A szubsztituensek lehetnek azonosak vagy különbözők .

Az (I) általános képletű vegyületek tartalmazhatnak bázikus csoportokat, különösen aminocsoportokat, amelyek megfelelő szervetlen vagy szerves savakkal savas addíciós sókká alakíthatók. Savakként ehhez például sósav, hidrogén-bromid, kénsav, foszforsav, fumársav, borostyánkősav, borkősav, citromsav, tejsav, maleinsav, metánszulfonsav jön szóba.

Az (I) általános képletű vegyületek, valamint (II) és (III) általános képlet szerinti részeik mellett ez a bejelentés azok tautomerjeire és azok fiziológiailag összeférő, szervetlen és szerves savakból, illetve bázisokból származó sóira, valamint az előállításukra szolgáló eljárásra és az ezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerekre is kiterjed.

Mivel az (I) általános képletű vegyületek aszimmetrikus szénatomokat tartalmaznak, ezért ezeknek a vegyületeknek az ·· ···· összes optikailag aktív alakja és racém keveréke is a jelen találmány tárgya.

Ennek a bejelentésnek az új liponukleotidok is tárgya. Ezeket a konjugátokat példaképpen a 14-16. példákban mutatjuk be. Az LCE az (V) általános képletű 2-klór-2'-dezoxi-adenozinkonjugátokat (kladribin-konjugátok), a (VI) általános képletű 9-(β-D-arabino-furanozil)-2-fluor-adenin-konjugátokat (fludarabin-konjugátok), a (VII) általános képletű 3-(2-dezoxiβ-D-eritro-pentofuranozil)-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo [4,5-d] [1,3]diazepin-8-ol-konjugátokat (pentosztatin-konjugátok) is hasítja. A megnevezett vegyületek gyógyászatilag jobban alkalmazhatók, mint a megfelelő nukleozidok egyedül, mivel nagyon jó a hatásosságuk és nagy a gyógyászati alkalmazási tartományuk, és ugyanazok az előnyeik, mint a fent említett, (I) általános képletű származékoknak.

L—B-O—

N Cl (V)

OH nh₂

L—B-O —

OH (VI) ··«·

ΟΗ

A jelen találmány értelmében (I) általános képletű vegyületekként különösen a következő hatóanyagokat alkalmazzuk gyógyszerek előállításához:

1. (3’-dezoxi-3'-azido-timidin)-5'-főszfórsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter

2. (3'-dezoxi-3’-azido-timidin)-5'-foszforsav-(3-undecilmerkapto-2-undeciloxi)-propilészter

3. (3'-dezoxi-3'-fluor-timidin)-5'-főszfórsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter

4. (3’-dezoxi-3'-fluor-timidin)-5'-főszfórsav-(3-undecilmerkapto-2-undeciloxi)-propilészter

5. (2',3'-didezoxi-citidin)-5'-főszfórsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter

6. (2’, 3'-didezoxinozin)-5'-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter

-30• .· · . • ·· • · a ···· ·· . (3'-dezoxi-timidin)-5'-főszfórsav-(3-dodecil-merkapto2-deciloxi)-propilészter

8. (5—fluor-uridin)-5'-főszfórsav-(3-dodecil-merkapto-2deciloxi)-propilészter

9. (6-merkapto-purin-9-p-D-ribofuranozid)-5'-foszforsav(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter

10. (5-trifluor-metil-uridin)-5'-főszfórsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter

11. (l-p-D-arabino-furanozil-5-etinil-uracil)-5’foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter

12. (2'-dezoxi-5-propinil-uridin)-5'-foszforsav-(3dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter

13. 2'-(9-{[(1-hidroxi-metil)etoxi]metil}guanin)foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter

14. 2'-[9-(etoxi-metil)guanin]-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter

1. példa:

Az AZT-DMDOPE enzimatikus hasítása mg (3'-dezoxi-3'-azido-timidin)-5'-foszforsav-(3dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilésztert (AZT-DMDOPE) 0,5 ml 0,1 M Tris-pufferoldatba szuszpendálunk, és az enzim (foszfodiészteráz esetén 0,5 mg és foszfolipáz/nukleáz esetén 0,1 mg) hozzáadása után 15 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk. Ezután az oldatot vékonyréteg-kromatográfiásan vizsgáljuk. 5 csepp telített NaHCOg-oidat hozzáadása után további 6 óra hosszat • · * ·

-31 37°C-on inkubáljuk, majd az oldatot vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk.

Különböző eluensekkel végezve a vékonyrétegkromatografálást az oldatot a lehetséges hasadási termékek (AZT, AZT-monofoszfát, DMDOP és lipid-monofoszfát) képződése szempontjából vizsgáltuk.

A fenti vizsgálatban a következő enzimeket alkalmaztuk:

a) C foszfolipáz, származás: Bacillus cereus, 2000 U/0,5 ml, Boehringer Mannheim GmbH

b) D foszfolipáz, I. típus, származás: káposzta, 150 - 300 U/mg, Sigma

c) Foszfodiészteráz, származás: borjúlép, 2 U/mg, Boehringer Mannheim GmbH

d) Foszfodiészteráz, származás: kígyóméreg, Boehringer

Mannheim GmbH

e) Nukleáz, származás: Staphylococcus aureus, 15 000 U/mg, Boehringer Mannheim GmbH

f) LCE (lipid-cleavage-enzym).

Eredmények:

A következő táblázatból kitűnik, hogy csak a D foszfolipáz esetében állapítható meg gyenge fluoreszcencia-kioltás a lipidfoszfát magasságában. Egyik összehasonlító enzimként alkalmazott a)-e) esetben sem volt kimutatható az AZT vagy az AZT-monofoszfát képződése. Ezeknél a kísérleteknél a változatlan AZT-DMDOPE-n kívül nem lehetett járulékos foltot találni a kimutatási határon belül.

-32··« · ·· • ί ····

Enzim	Fluoreszcencia-kioltás vékonyréteg-kromatográfia
C foszfolipáz	negatív
D foszfolipáz	gyenge
Foszfodiészteráz borjúlépből	negatív
Foszfodiészteráz kígyóméregből	negatív
Nukleáz Staphylococcus	negatív
aureusból
LCE	pozitív

2. példa:

Magyarázat az ábrákhoz

1. ábra: Ezen az ábrán az LCE aktivitása látható a proteinkoncentráció függvényében, amely LCE-t humán, PHAstimulált perifériás vérleukociták membrán-frakciójából nyertünk. Az eredmény: lineáris összefüggés a proteinkoncentráció és a képződött DMDOP hasadási termék mennyisége között.

2. ábra: Ezen az ábrán az LCE szubsztrát-kinetikája (MichaelisMenten kinetika) látható, amely LCE-t humán, PHAstimulált perifériás vérleukociták membrán-frakciójából nyertünk.

3. ábra: Ezen az ábrán az LCE szubsztrát-kinetikája (MichaelisMenten kinetika) látható, amely LCE-t humán, PHAstimulált perifériás vérleukociták [ ] és nyugvó (nem ·· • · ·’ ·»·«

- 33 stimulált) perifériás vérleukociták [ ] membránfrakciójából nyertünk.

4. ábra: Ezen az ábrán az LCE specifikus enzimaktivitása látható a kalciumion-koncentráció függvényében, amely LCE-t humán, PHA-stimulált perifériás vérleukociták membránfrakciójából nyertünk.

5. ábra: Ezen az ábrán kezeletlen kutya sejtmembránpreparátumaiból származó LCE szerv- és szövetspecifikus eloszlása látható.

6. ábra: AZT és AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi stimulált humán PBL-ben 1, 3, 6 és 24 órás inkubáció után a következőkkel:

(A) 0,03 μg AZT/ml ( ), illetve 1 pg AZT-DMDOPE/ml ( ) (B) 0,3 μg AZT/ml ( ), illetve 10 μg AZT-DMDOPE/ml ( ) (középérték, n=2 meghatározás)

7. ábra: AZT és AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi nem stimulált humán PBL-ben 1, 3, 6 és 24 órás inkubáció után a következőkkel:

(A) 0,03 μg AZT/ml ( ), illetve 1 ng AZT-DMDOPE/ml ( ) (B) 0,3 μg AZT/ml ( ), illetve 10 μg AZT-DMDOPE/ml ( ) (középérték, n=2 meghatározás)

8. ábra: AZT, illetve AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi stimulált humán PBL-ben 6 és 24 órás inkubáció után a következőkkel:

μg AZT-DMDOPE/ml (A), illetve 10 μg AZT-DMDOPE/ml (B):

kezelés alkálikus foszfatázzal

-34·« • » ···· «V • « ·· alkálikus foszfatázzal való kezelés nélkül (középérték, n=2 meghatározás)

9. ábra: AZT és AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációja

P3X63Ag8.653-sejtekben 6, 24 és 48 órás inkubáció után a következőkkel:

(A) 0,03 μg AZT/ml ( ), illetve 1 μς AZT-DMDOPE/ml ( ) (B) 0,3 μg AZT/ml ( ), illetve 10 μg AZT-DMDOPE/ml ( ) (középérték, n=2 meghatározás)

10. ábra: AZT, illetve AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi P3X63Ag8.653-sejtekben 6, illetve 24 órás inkubáció után a következőkkel:

μς BM 21.1290 Na/ml (A), illetve 10 μg AZT-DMDOPE/ml (B) :

kezelés alkálikus foszfatázzal alkálikus foszfatázzal való kezelés nélkül (középérték, n=2 meghatározás)

11. ábra: AZT és AZT-nukleotidok intracelluláris lecsengési kinetikája stimulált humán PBL-ben 24 órás inkubáció után a következőkkel: 0,3 μg AZT/ml (A), illetve 10 μg AZTDMDOPE/ml (B). AZT és AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációja 1, 3, 6, 24 és 48 órával az AZT-, illetve

AZT-DMDOPE-inkubációs oldat eltávolítása után (középérték, n=2 meghatározás).

12. ábra: [-AZT-DMDOPE enzimatikus hasítása stimulált humán

PBL membrán-frakcióival (100 gg protein/kiindulási keverék) . Az n-heptános fázis vékonyréteg-kromatogramja a szubsztrát Kieselgel 60 H-n való adszorpciója és IBA·»··

-35 rendszerben (2-propanolol : n-butil-acetát : 2x deszt. víz, 10:6:4, v/v/v) Kieselgel 60-nal mint álló fázissal való elválasztása után.

13. ábra: Az LCE specifikus aktivitása [pmol mg^-1 min^-1] stimulált humán PBL sejthomogenátumaiban, citozol és membránfrakcióiban (középérték ± SD, n=6 meghatározás).

14. ábra: Az AZT-DMDOPE hasítása stimulált humán PBL membránfrakcióival a protein-koncentráció függvényében (középérték ± SD, n=3 meghatározás).

15. ábra: Az AZT-DMDOPE hasítása humán monociták/makrofágok (stimulált monociták) membrán-frakcióival a proteinkoncentráció függvényében (középérték ± SD, n=3 meghatározás) .

16. ábra: Az LCE specifikus aktivitása stimulált és nem stimulált humán PBL, valamint humán monociták és monociták/makrofágok (stimulált monociták) membránfrakciói révén (humán PBL:, középérték ± SD, n=6 meghatározás) (humán monociták: középérték ± SD, n=4 meghatározás) .

17. ábra: Az AZT-DMDOPE hasítása stimulált humán PBL membránfrakcióival az inkubációs idő függvényében (középérték ± SD, n=3 meghatározás).

18. ábra: [¹⁴C]-AZT-DMDOPE (A) és a [¹⁴C]-AZT-DMDOPE 5 x 10⁷

CEM-SS-sejt sejthomogenátuma által végzett enzimatikus hasítása (B) és 6 órás 37°C-os inkubáció utáni vékonyréteg-kromatogramja. A tioéter-lipidek extrakciója dietiléter : 2-propanol (9:1, v/v) eleggyel és elválasztása az ·· ·· ···· ·· • · · · · · · , · ·· · ··· ···· ·· ! . ·

-36IBAE-rendszerben (2-propanol : n-butil-acetát : 2x deszt. víz : jégecet, 3:5:1:1, v/v/v/v) Kieselgel 60-nal mint álló fázissal.

····

3. példa:

Különböző enzim-inhibitorok vagy -aktivátorok befolyása az

LCE-aktivitásra

Inhibitor/ aktivátor	A gátlás/ aktiválás támadáspontj a	LCE membrán- frakció	Hatás az LCE- aktivitásra
SQ 22536	adenilát- cikláz	vese (balb/c)	nincs
7-nitro- indazol	NO-szintézis	vese (balb/c)	nincs
RHC-80267	DAG-lipáz	vese (balb/c)	nincs
neomicin	PLC, (PLD)	vese (balb/c)	nincs
wortmannin	PLD, (PLC)	vese (balb/c)	nincs
acetil- szalicilsav	PLC	vese (balb/c)	nincs
GTP-b-S	Gp aktivátor	vese (balb/c)	nincs
D 609	PLC	vese (balb/c) CEM-SS	stimuláció stimuláció

4. példa:

Szubcelluláris frakcionálás

a. Sejthomogenátumok, membrán- és citozol-frakciók előállítása

A membrán- és citozol-frakciók előállítására tenyésztett sejteket polipropilén csövekbe (50 ml) vittük, és Minifuge T típusú centrifugában szobahőmérsékleten 1600 percenkénti fordu-37 latszámon 10 percig ülepítettük. A tenyésztési közeg maradványainak eltávolításához a sejtüledéket háromszor hideg PBS-sel mostuk, és feltáró pufferban 1-5 x 10θ sejt/ml sejtsűrűséggel vettük fel. A sejtszuszpenziót ezután jégen hűtött, üveg homogenizátorba vittük át. Egy teflon lombik többszöri mozgatásával a sejteket mechanikusan feltártuk, miközben a sejtfeltárást fordított-fáziskontraszt-mikroszkóppal optikailag ellenőriztük. A feltárt sejteket azután a sejtmagok és a nem feltárt sejtek eltávolítása céljából Minifuge T típusú centrifugában 4°C-on 1700 percenkénti fordulatszámon 10 percig centrifugáltuk. A felüllévő részt pipettával óvatosan levettük, és 50 mM Tris-pufferral (pH 7,5) 10 tömeg%-os szacharózra hígítottuk. A sejthomogenátumot szétadagolás után -70°C-on tároltuk, vagy felhasználtuk membrán- és citozol-frakciók elkülönítésére. Ehhez 3,2 ml sejthomogenátumot jégen hűtött, vastag falú polikarbonát csövekbe (3,2 ml) vittünk, és TLA-100.4 típusú rotorral felszerelt Beckmann-Tabletop ultracentrifugában 1 óra hosszat 4°C-on 75000 percenkénti fordulatszámon centrifugáltuk. A felüllévő részeket Combitip pipettával óvatosan levettük, és a jól látható membrán-üledékeket 1-1 ml 50 mM Tris-pufferral (pH 7,5) és 10%-os szacharózzal elegyítettük. A membránüledéket egy kanüllel (0,9 x 40 mm) ellátott fecskendő (5 ml) segítségével durván homogenizáltuk. A durva homogenátumokat egyesítettük, és kisebb átmérőjű kanülök (0,8 x 40 mm és 0,45 x 25 mm) alkalmazása közben finomra homogenizáltuk.. A membrán- és citozol-frakciókat szétadagolás után -70°C-on tároltuk.

• ·

Feltáró puffer 50 mM

-38Tris pH 7,5

70tömeg% szacharóz mg/ml

APMSF

A szacharóz feloldásához a puffért keverés közben kissé melegíteni kell.

b. Stimulált humán perifériás vérleukociták (PBL) plazmamembránjának elkülönítése (Record et al. (1985), Biochem. Biophys. Acta 8/9 1-9)

Humán PBL-t centrifugálással izotóniás sűrűséggradiensben elkülönítettünk, és PHA-M-mel 72 órán át stimuláltuk. A tenyésztési közeg maradványainak eltávolításához a sejteket háromszor hideg PBS-sel mostuk, és a sejtszám meghatározása után folyékony nitrogénben befagyasztottuk, majd -70°C-on tároltuk.

A sejtek lízise az 1-es pufferban háromszori felolvasztással és befagyasztással történt. Ezzel 2,5 x 10θ sejt/ml sejtsűrűséget állítottunk be. Ti60 típusú centrifugacsövekbe (30 ml) 11 ml percollból és 2,13 ml 2-es pufferból álló keveréket tettünk, amelynek pH-ját előtte 70 μΐ 2N NaOH-val 9-re állítottuk be. A plazmamembrán elkülönítéséhez 4 ml homogenátumot vittünk a keverékre, majd Ti60-rotorban, 4°C-on, 39000 percenkénti fordulatszámon, 10 percig, kikapcsolt fékkel L 5 50 Beckmann típusú ultracentrifugában frakcionáltuk. A centrifugacsövek felső fázisából 1 ml frakciókat vettünk, és 2 ml 3-as pufferral hígítottuk. Az oldatokat azután Ti50 típusú csövekbe (10,4 ml) vit- 39 tűk át, és az elválasztó közeg maradványainak eltávolításához az L 5 50 Beckmann-ultracentrifugában Ti50-rotorral, 4°C-on, 45000 percenkénti fordulatszámon, 45 percig centrifugáltuk. A felüliévé részeket pipettával levettük, frakcionáltuk, folyékony nitrogénben befagyasztottuk, és -70°C-on tároltuk. A frakciók jellemzése az alkálikus foszfatáz proteintartalmának és enzimaktivitásának meghatározásával történt.

1-es puffer	100 mM	KC1
	5 mM	MgCl2 x 6 H2O
	1 mM	ATP
	2 mM	(4-amedino-fenil)-metán-

szulfonil-fluorid (APMSF) mM Tris pH 9,6

2-es	puffer	400 mM 20 mM 400 mM	KC1 MgCl2 x 6 H2O Tris pH 9,6
3-as	puffer	100 mM	KC1
		5 mM	MgCl2 x 6 H20
		50 mM	Tris pH 7,42

-405. példa:

Szubsztrátoldatok előállítása az LCE-mintához

Az LCE-mintában szubsztrátként [1⁴C]-AZT-DMDOPE-ből és nem radioaktívan jelölt AZT-DMDOPE-ből álló keveréket alkalmaztunk.

[14c]-AZT-DMDOPE törzsoldatból kiindulva etanollal való hígítás révén egy 83,27 kBq/ml specifikus aktivitású oldatot állítottunk elő. Az etanolos oldatot 4°C-on inertgáz alatt 2 hónapig tudtuk tárolni.

Az anyagkeverék nem radioaktívan jelölt összetevőit különválasztott kiindulási keverékben állítottuk elő. Ehhez etanolba pmol/ml koncentrációjú AZT-DMDOPE-oldatot tettünk, és 1 percre jég/vízfürdőben ultrahang-pálcával 30%-os energiaközléssel folyamatosan besugároztuk.

A szubsztrátkeverék radioaktív és nem radioaktív AZTDMDOPE-ből való előállításához ezekből az etanolos oldatokból kiindulási keverékenként 1,67 kBq radioaktívan jelölt [¹⁴C]AZT-DMDOPE-t és 0, 7 - 5 nmol nem jelölt vegyületet vittünk egy üvegcsőbe (10 ml). Az oldószert nitrogénáramban elpárologtattuk, és az AZT-DMDOPE-t megfelelő térfogatú, kétszer desztillált vízben felvettük, és 1 percre hűtés közben jég/vízfürdőben ultrahang-pálcával 30%-os energiaközléssel folyamatosan besugároztuk .

a ·

6. példa:

Lipidhasító enzim (LCE) minta

Az enzimatikus hasítás időtől és protein-koncentrációtól való függésének vizsgálatához szokásos módon 200 μΐ kétszer desztillált vízben 5 nmol AZT-DMDOPE-t és 0,98 nmol [¹⁴C]-AZTDMDOPE-t (1,67 kBq) tettünk az LCE-mintába. A pipettálási vázlat a következő táblázatban látható.

Táblázat

Az LCE-minta pipettálási vázlata az AZT-DMDOPE átalakulás meghatározásához

	Reakcióelegy	Kontroll
EGTA [20 mM]	50	50
Tris, pH: 8,0 [1 M ]	50	50
[μΐ/elegy]
AZT-DMDOPE/[14C]-AZT-DMDOPE
[nmol/elegy]	0,10-5,98	0,10-5,98
[μΐ/elegy]	5-200	5-200
Protein
[mg/elegy]	0,0125-0,2	-
[μΐ/elegy]	X	-
Kétszer desztillált víz
[μΐ ]	500-hoz	500-hoz

-42>· .- ... · • - · .. J ·

Az enzimatikus hasítás szubsztrát-koncentrációtól való függésének vizsgálatához 0,98 nmol []-AZT-DMDOPE és 0,7 nmol AZT-DMDOPE/80 μΐ kétszer desztillált víz törzsoldatát tettük az

LCE-mintába. Az LCE-mintában a különböző szubsztrátkoncentrációkat a szubsztrátoldat térfogatának állandó megkétszerezésével, illetve felezésével állítottuk be. Az elegyeket üvegcsövekbe (5 ml) helyeztük, és a szubsztrátoldat hozzáadásával indítottuk. Az inkubálást 37°C-on vízfürdőben enyhe rázatás közben végeztük.

7. példa:

DMDOP extrakciója vizes mátrixból

O

Az LCE-minta reakcióelegyeit megfelelő inkubációs idő után kivettük a vízfürdőből, és a reakciót 750 μΐ 2-propanol hozzáadásával leállítottuk. Alapos átkeverés után az elegyeket azután 700 μΐ, szobahőmérsékletre melegített n-heptánnal elegyítettük. Az elegyeket újból 30 másodpercig jól összekevertük, és a fázisszétválás gyorsítása érdekében Minifuge T típusú centrifugában 3200 percenkénti fordulatszámon 15 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. Ezután 500 μΐ felső fázist (n-heptán) kivettünk, és új üvegcsövekbe (5 ml) vittük 10 mg Kieselgel 60nal és 200 μΐ n-heptánnal. Az elegyeket 30 másodpercig jól átkevertük, és a Kieselgel kiülepítéséhez 10 percig a fent ismertetett körülmények között centrifugáltuk. Azután levettünk 500 μΐ felüllévő részt, és elkevertük 3 ml szcintillációs folyadékkal. A radioaktivitást 4 percig folyadék-szcintillációs anali-43 zátorban mértük. A radioaktivitás abszolútértékének meghatározásához 200 μΐ szubsztrátoldatot elkevertünk 3 ml szcintilláci ős folyadékkal, és azonos körülmények között folyadékszcintillációs analizátorban mértünk.

8. példa:

A farmako-kinetika in vitro tanulmányozása AZT-DMDOPE-vel és AZT-vel

a. AZT és/vagy AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációinak meghatározása stimulált és nem stimulált humán PBLben AZT-DMDOPE-vel, illetve AZT-vel végzett inkubáció után

Az AZT és/vagy az AZT-nukleotidok intracelluláris koncent rációinak AZT-DMDOPE-vel, illetve AZT-vel végzett inkubáció utáni meghatározásához humán PBL-t különítettünk el buffycoat-ból.

Ehhez összekevertük egészséges donorok buffy-coat-ját, és centrifugálással 1,077 g/ml sűrűségű izotóniás közegben frakcionáltuk. Mivel az egymagvas vérsejteknek (monociták és limfociták) kisebb a sűrűsége, mint az eritrocitáknak és a polimorf magvas granulocitáknak, ezért gyűrűt képeznek az elválasztó közeg és a minta közötti határon, és pipettával levehetők. Az eritrocitákat és a polimorf magvas granulocitákat nagyobb sűrűségük miatt a közeg leülepíti, és így elválaszthatók a PBL-től.

····

-44A sejtburjánzás stimulálásához vörös tűzbabból (Phaseolus vulgáris) származó mitogén lektin-extraktum fitohema-glutinin A-ját (mukoprotein) (PHA-M) alkalmaztuk. A fitohema-glutinin egy öt izolektinből álló család, amelyek tetramerként állnak rendelkezésre. Az alegységek egy limfocita-reaktív L típusból és egy eritrocita-reaktív E típusból állnak. Az L típusnak nagy az affinitása a limfociták felületi receptoraihoz, és így a mitogén tulajdonságok ennek tulajdoníthatók. A limfociták stimulálását KPMI 1640 III-as komplettközegben 72 órán át 37°C-on és 5% CO2~ben végeztük. A stimuláció befejeződése után a sejtszám növeléséhez a sejteket további 24 órára RPMI 1640 IV-es komplettközegben tenyésztettük.

Az AZT és/vagy az AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációinak meghatározásához a sejteket 1 x 10^sejt/ml sűrűségű, RPMI 1640 ΙΙ-es komplettközegben szövettenyésztő üvegekbe (50 ml/25 cm^) vittük, és milliliterenként 0,03, illetve 0,3 ng AZT (15-ös charge) és milliliterenként 1, illetve 10 μg AZT-DMDOPE jelenlétében 1-24 órára inkubáltuk.

Az AZT-DMDOPE és az AZT koncentrációinál az antiretrovírusos hatás IC50-értékeit vettük figyelembe, amelyeket HIV-l-fertőzött humán PBL-ben lévő AZT-re és AZT-DMDOPE-re állapítottunk meg.

A tenyészeteket azután 1, 3, 6 és 24 órára 37°C-on és 5% CO2^_ben inkubáltuk. Az AZT-t és nukleotidjait azután 60% metanollal extraháltuk. Az extrahált nukleotidokat alkálikus foszfatázzal kvantitatíve AZT-vé defoszforileztük, mivel csak

-45 az AZT detektálható radioimmuno elemzés segítségével, a megfelelő nukleotidok viszont nem.

Az intracelluláris AZT koncentrációi, amelyeket radioimmuno elemzés segítségével határoztunk meg, ennek megfelelően az AZT és az AZT-nukleotidok koncentrációjából tevődnek össze. Az AZT-MP, az AZT-DP és az AZT-TP koncentrációk külön mennyiségi meghatározását nem hajtottuk végre. A stimulált PBLen végzett tapasztalati megfigyelések szerint az AZT-DP-vel és az AZT-TP-vel összehasonlítva 40-szer nagyobbak az AZT-MP koncentrációi (Arnér et al., 1992, J. Bioi. Chem. 267, 1096810975). Ennek megfelelően elfogadhatjuk, hogy a nukleotidfrakció csaknem kizárólag AZT-MP-ből áll.

Stimulált humán PBL-ben milliliterenként 0,03, illetve 0,3 gg AZT-vel végzett inkubációnál a 2,90, illetve 30, 97ng/10^sejt értékű maximális koncentrációkat 6, illetve 3 órás inkubáció után értük el (6. ábra). A koncentrációk azután növekvő inkubációs időknél 2,32, illetve 19,88 ng/10^sejt értékre csökkentek. Milliliterenként 1, illetve 10 μg AZT-DMDOPE-vel végzett inkubáció után az AZT-nek és nukleotidjainak intracelluláris szintje a teljes inkubációs idő alatt állandóan emelkedett. 24 órás AZT-DMDOPE-vel és AZT-vel végzett inkubáció után az intracelluláris szintek azonosak maradtak. A további kísérletekben azt tapasztalhattuk, hogy 18-48 órás inkubációs idő után az AZT és AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi AZTDMDOPE-vel végzett inkubáció után még nagyobbak is, mint az AZT ekvipotens koncentrációjával végzett inkubáció után.

-46Nem stimulált humán PBL esetében a viszonyok megfordultak (7. ábra). így az AZT és AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi AZT-DMDOPE-vel végzett inkubáció után a teljes inkubációs idő alatt nagyobbak voltak, mint az AZT ekvipotens koncentrációjával végzett inkubáció után. Milliliterenként 1, illetve 10 μg AZT-DMDOPE-vel végzett inkubáció után az AZT és

AZT-nukleotidok maximális intracelluláris koncentrációira 0,62, illetve 4,74 ng/10^sejt értékeket értünk el, míg milliliterenként 0,03, illetve 0,3 mg AZT-vel végzett inkubáció után 0,10, illetve 0,47 ng/10⁶sejt értékű koncentrációkat tudtunk mérni.

Az AZT és az AZT-nukleotidok külön mennyiségi meghatározásához BM 21.1290 Na-mal végzett inkubáció után az AZT és az AZT-nukleotidok valamennyi intracelluláris koncentrációját alkálikus foszfatázos kezeléssel és anélkül határoztuk meg. Ezeket a kísérleteket stimulált humán PBL-en végeztük.

Ehhez 10⁶sejt/ml sűrűségű sejt-szuszpenziókat milliliterenként 1, illetve 10 μg AZT-DMDOPE-vel 6, illetve 24 órára 37°C-on és 5% C02~ben inkubáltuk. A szabad AZT maximális intracelluláris koncentrációit milliliterenként 1, illetve 10 μς AZT-DMDOPE-vel végzett inkubáció után 6, illetve 24 óra eltelte után mértük 0,03, illetve 0,15 ng/10^sejt értékben (8. ábra). Ha alkálikus foszfatázzal való kezelés után járulékosan a foszforilezett intracelluláris AZT-nukleotidokat is meghatároztuk, akkor 24 óra eltelte után 3,85, illetve 6,41 ng/10^sejt értékű koncentrációkat kaptunk.

···· ··

-47b. AZT és/vagy AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációinak meghatározása P3X63Ag8.653-sejtekben AZT-DMDOPE-vel, illetve AZT-vel végzett inkubáció után

Az AZT és az AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációinak meghatározása timidin-kináz-hiányos sejtekben további ismereteket nyújthat az AZT-DMDOPE tesztanyag intracelluláris hasadásáról. Ezekben a sejtekben az intracelluláris AZT a timidin-kináz (TK) hiánya miatt nem ATZ-MP-vé, hanem így a gyógyászatilag hatásos AZT-TP-vé alakítható. Az AZT és az AZTnukleotidok intracelluláris koncentrációinak meghatározása AZTDMDOPE-vel végzett inkubáció után ily módon további adatot szolgáltathat a tesztanyag hasadásáról.

Ehhez szövettenyésztő tálakban (60 x 15 mm) 1 x 10⁷ sejtet RPMI 1640 I-es komplettközegben milliliterenként 0,03, illetve 0,3 μg AZT és milliliterenként 1, illetve 10 μg AZT-DMDOPE jelenlétében 6, 24 és 48 órán át inkubáltunk. Az AZT és az AZTnukleotidok extrakciója és alkálikus foszfatázzal való kezelés után az AZT koncentrációját radioimmuno elemzés segítségével határoztuk meg.

A kísérleti eredmények ábrázolásából kiviláglik, hogy az

AZT és az AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi AZTDMDOPE-vel jelentősen nagyobbak voltak, mint az AZT ekvipotens koncentrációival végzett inkubáció után. így milliliterenként 1, illetve 10 μg AZT-DMDOPE-vel végzett 6 órás inkubáció után az AZT és AZT-nukleotidok maximális koncentrációira 0,55, illetve 4,40 ng/10^sejt értékeket értünk el (9. ábra).

• · · ··

-48Az AZT és AZT-nukleotidok maximális intracelluláris koncentrációira milliliterenként 0,03, illetve 0,3 μ5 AZT-vel végzett inkubáció után 48 óra eltelte után 0,03, illetve 0,31 ng/10^sejt értékeket határoztunk meg.

A foszforilezett AZT részhányadának mennyiségi meghatározására összehasonlítottuk az AZT és az AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációit a celluláris extraktum alkálikus foszfatázzal való kezelése előtt és után. A foszforilezett AZT anyagszintjére milliliterenként 1, illetve 10 pg AZT-DMDOPE-vel végzett inkubáció után 0,48, illetve 2,42 ng/10⁶sejt értékeket kaptunk (10. ábra). Ha csak az AZT-t határoztuk meg, akkor 24 óra után 0,05, illetve 1,10 ng/ml értékű maximális koncentrációkat értünk el. Az AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációiban meglévő különbségek AZT-vel és AZT-DMDOPE-vel végzett inkubáció után az AZT-DMDOPE tesztanyag AZT-MP-vé való intracelluláris hasadásával magyarázhatók.

c. AZT és AZT-nukleotidok lecsengési kinetikája stimulált humán PBL-ben AZT-DMDOPE-vel, illetve AZT-vel végzett inkubáció után

Stimulált humán PBL-t 24 órára milliliterenként 0,3 μg AZT-vel, illetve 10 pg AZT-DMDOPE-vel inkubáltunk. Azután 1 x 107 sejtet szövettenyésztő üvegekbe (50 ml/25 cm²) RPMI 1640 I-es komplettközegbe vittünk. 1, 3, 6, 24 és 48 óra eltelte után az AZT-t és az AZT-DMDOPE-t extraháltuk a celluláris mát• ·

-49rixból. Alkálikus foszfatázzal való kezelés után az AZT koncentrációját radioimmuno elemzés segítségével határoztuk meg.

A kísérleti eredmények grafikus ábrázolásából kiviláglik, hogy a sejtek AZT-vel végzett inkubációja után az AZT és az

AZT-nukleotidok intracelluláris koncentrációi hirtelen csökkennek, és 6 óra elteltével elérik az állandó 0,40 ng/10^sejt értéket. Az AZT-DMDOPE ekvipotens koncentrációjával végzett inkubáció esetén viszont az AZT, illetve az AZT-nukleotidok kevésbé erősen csökkennek, és 3 óra eltelte után egy lényegesen nagyobb koncentrációnál elérik a 48 órán túl állandó, 1,80 ng/10^sejt értéket (11. ábra). Mivel a nem foszforilezett AZT-t PBS-sel végzett többszöri mosással a sejtből eltávolitottuk, ezért az intracelluláris koncentrációk főleg foszforilezett AZTnukleotidokra vezethetők vissza. Az AZT ekvipotens koncentrációjához képest az AZT-DMDOPE-vel végzett inkubáció így a sejtnek 4,5-szer nagyobb foszforilezett AZT-koncentrációt biztosít. Az AZT-DMDOPE-vel és AZT-vel végzett inkubáció után ezek az AZTnukleotidok celluláris koncentrációiban meglévő nagy különbségek az AZT-DMDOPE tioéterlipid-AZT-konjugátnak AZT-MP-vé és a megfelelő DMDOP tioéter-lipidrésszé való közvetlen intracelluláris hasadásával magyarázhatók.

9. példa:

Az AZT-DMDOPE-hasító enzim/enzimrendszer (LCE) jellemzése

Az AZT-DMDOPE humán PBL és CEM-SS-sejtek sejthomogenátumaival való enzimatikus hasításának vizsgálatai megmutatták,

- 50hogy az AZT-DMDOPE DMDOP-vé és AZT-MP-vé metabolizálódik. A következő vizsgálatok célja az LCE jellemzése volt. így az AZTDMDOPE enzimatikus hasítását a protein-koncentráció, az inkubációs idő és a kétértékű fémkation koncentráció függvényében vizsgáljuk. A különböző szubsztrát-koncentrációk függvényében az emzimkinetikus vizsgálatokban Kj^-et és v_max-ot, a hatásos

Michaelis-Menten paramétereket határozzuk meg.

Ezekhez a vizsgálatokhoz egy enzim-mintát hoztunk létre, amelyben szubsztrátként AZT-DMDOPE-t és [¹⁴C]-AZT-DMDOPE-t használtunk (6. példa). A protein- és időfüggő méréseknél elegyenként 5 nmol AZT-DMDOPE-t és 0,98 nmol (1,67 kBq) [¹⁴C]-AZTDMDOPE-t alkalmaztunk. A szubsztrát-függő átalakításoknál 0,98 nmol [Í⁴C]-AZT-DMDOPE és 0,7 nmol AZT-DMDOPE/80 μΐ törzsoldatot használtunk. A különböző szubsztrát-koncentrációkat azután a szubsztrátoldat térfogatának állandó megkétszerezésével, illetve felezésével állítottuk be.

Enzimforrásként például különböző humán sejtek ismert protein-koncentrációjú sejthomogenátumai, citozol- és membránfrakciói alkalmazhatók.

a. DMDOP elkülönítése és mennyiségi meghatározása az

AZT-DMDOPE enzimatikus hasítása után

Az AZT-DMDOPE enzimatikus hasításának mennyiségi meghatározását a DMDOP metabolit kétlépcsős, n-heptános extrakciójával és az AZT-DMDOPE szubsztrát maradékainak azt követő adszorpciójával végeztük Kieselgel 60 H-n. Ennél a reakcióelegyeket

-· ·. ·

-51 2-propanollal és n-heptánnal kevertük el. A szubsztráthoz képest apoláris DMDOP az n-heptános fázisban feldúsul. Az nheptános fázist azután elkevertük Kieselgel 60 H-val, miáltal az AZT-DMDOPE szubsztrát maradékai adszorbeálódtak. Az nheptános fázist azután centrifugálással elkülönítettük a Kieselgeltől, átvittük 3 ml Aqua lumába, és folyadékszcintillációs analizátorban 5 perc időtartam alatt meghatároztuk a benne lévő radioaktívan jelölt DMDOPE mennyiségét. Ezekből az eredményekből ki tudtuk számítani az AZT-DMDOPE szubsztrát DMDOP-vé való átalakulásának százalékos mennyiségét és az LCE specifikus aktivitását. Specifikus aktivitásnak itt azt a DMDOP mennyiséget tekintettük, amely az alkalmazott sejtpreparátumok 1 mg proteinjéből 1 perc alatt képződött.

A DMDOP reakciókeverékből történő szelektív extrakciójának ellenőrzésére optimálási kísérleteket végeztünk stimulált humán PBL membrán-frakcióival. A protein-koncentráció itt 100 μg/elegy volt. Ezzel párhuzamosan protein nélküli elegyeket is készítettünk. Az extrakció után az n-heptános fázist nitrogénáramban elpárologtattuk, és a maradékot metanolból és etilacetátból álló keverékben (1:1, v/v) vettük fel.

A vékonyréteg-kromatográfiás elemzést IBA-rendszerben végeztük. A reakcióérték alapján csak a [-AZT-DMDOPE anyavegyület csúcsa volt felismerhető. A reakcióelegyben detektáltunk egy anyagcsúcsot az eluensfront végén, amely az Rf-érték alapján egyértelműen a [¹⁴C]-DMDOP metabolitként volt azonosítható (12. ábra). A közvetlenül a DMDOP-csúcs előtt haladó csúcs egyik ismert vegyülethez sem rendelhető hozzá. Feltehetőleg »·** ··

- 52 olyan vegyületről van szó, amely a DMDOP tioéter-lipidrészében lévő kén oxidációjával keletkezett. Ily módon n-heptános extrakcióval tudtuk megvalósítani az enzim-mintából származó

DMDOP enzimatikus hasítási termék elkülönítését. Ezzel biztosítottuk az AZT-DMDOPE-ből felszabadított DMDOP metabolit egyszerű és gyors mennyiségi meghatározását.

b. AZT-DMDOPE hasítása stimulált humán PBL sejthomogenátumaival, membrán- és citozol-frakcióival

Az első kísérletsorozatban az AZT-DMDOPE enzimatikus hasítását stimulált humán PBL sejthomogenátumaival, valamint citozol- és membrán-frakcióival vizsgáltuk.

A protein-koncentrációnak a sejthomogenátumokban, a citozol- és membrán-frakciókban való meghatározása után bicinkoninsav(BCS)-teszt segítségével elegyenként 0,025-0,20 mg proteint alkalmaztunk. A reakcióelegyeket 2 órán át 37°C-on inkubáltuk, majd a DMDOP terméket n-heptános extrakcióval az elegyekből elkülönítettük, és meghatároztuk az LCE specifikus aktivitását (13. ábra).

Az AZT-DMDOPE-hasító aktivitás a sejthomogenátumokban és a citozol-frakciókban 6,48±0,38 (n=6) és l,65±0,40 pmol mg^_]-min^-1 (n=6) értékekkel 1,59-szer, illetve 6,3-szer kisebb, mint a 14,23±0,70 (n=6) pmol mg^-l min“l értékű specifikus aktivitás a membrán-frakciókban. A membrán-frakciók elkülönítésekor az LCE nyilvánvalóan feldúsul. Ezekre az eredményekre alapozva a csat• ·· ·

-53 lakozó kísérletekben az LCE enzimatikus paramétereinek meghatározásához membrán-frakciókat alkalmaztunk.

Az a membrán-frakció, amelyet a sejtek mechanikai feltárásával és a sejthomogenátumok azt követő ultracentrifugálásával nyertünk, a plazma- és magmembrán fragmenseiből, valamint a sejtorganellumok membránjaiból álló keveréket jelent.

A különböző membrán-fragmensek differenciálása percollsűrűséggradiensben lévő sejthomogenátum ultracentrifugálásával és a csatlakozó jellemzés a plazmamembrán-jelölő alkálikus foszfatázzal volt lehetséges.

A plazmamembrán elkülönítéséhez 2,5 x 10θ sejt/ml sejtsűrűségű stimulált humán PBL 2 ml sejtszuszpenzióját háromszori befagyasztással és felolvasztással tártuk fel, és percollsűrűséggradiensben centrifugálással frakcionáltuk. A centrifugátumból kivettünk 10 frakciót (1 ml), az elválasztó közeg maradványait eltávolítottuk, és az egyes frakciókban pnitro-fenil-foszfáttal mint szubsztráttal 305 nm-en mértük az alkálikus foszfatáz aktivitását.

Az alkálikus foszfatáznak a 8-as frakcióban volt a legnagyobb az aktivitása. A többi frakció abszorpciója lényegesen kisebb volt. Ez a plazmamembrán feldúsulására utal a 8-as frakcióban. Valamennyi frakcióban a protein-koncentráció meghatározása után megállapítottuk a specifikus LCE-aktivitást. Ehhez 0,05 mg/elegy protein-koncentrációt állítottunk be, és a reakcióelegyeket 37°C-on 2 órára inkubáltuk. A legnagyobb, 4,40 pmol mg^-1 min^-1 értékű specifikus LCE-aktivitást a 8-as frakcióban határoztuk meg.

·· ·

-54Az összes többi frakcióban kisebb, 1,10-1,90 pmol mg^-1 min^-1 értékű specifikus aktivitást mértünk (4.32 ábra). Az LCE legnagyobb specifikus aktivitását tehát abban a frakcióban határoztuk meg, amelyben ugyanakkor az alkálikus foszfatáznak is a legnagyobb az aktivitása. Ez a tény az LCE előfordulását jelenti abban a frakcióban, amelyben a plazmamembrán fragmenseinek a legnagyobb a részhányada.

c. A specifikus LCE-aktivitás függése a proteinkoncentrációtól

A további vizsgálatok célja az AZT-DMDOPE átalakulásának meghatározása a sejtpreparátumok növekvő proteinkoncentrációinak függvényében.

Ehhez stimulált és nem stimulált humán PBL, valamint humán vérmonociták membrán-frakcióit alkalmaztuk. Az AZT-DMDOPE átalakítása DMDOP-vé stimulált humán PBL membrán-frakcióival

0,025-0,2 mg protein/elegy mennyiségek alkalmazásakor lineáris viselkedést mutatott (14. ábra). A specifikus LCE-aktivitás 14,23±0,7 pmol mg^-1 min^-1 (n=6) volt (16. ábra). Az AZT-DMDOPE átalakításakor nem stimulált humán PBL membrán-frakciójának proteinjével csak a 0,05 mg protein/elegy értékig terjedő koncentrációtartományban mutatkozott lineáris függés. Nagyobb protein-koncentrációknál már nem kaptunk linearitást. A lineáris tartományban lévő átalakulásból számított specifikus LCEaktivitás l,45±0,32 pmol mg^-1 min^-1 volt (n=6).

·· · ·

- 55 Humán vérmonocitákban a specifikus LCE-aktivitás meghatározásához a vérmonocitákat hipertóniás sűrűséggradiensben elkülönítettük. A monociták átlagos 1,068 g/ml sűrűsége valamivel kisebb, mint a limfociták 1,070 g/ml sűrűsége. Ez a sűrűségbeli különbség mindazonáltal nagyon kicsi, úgyhogy ezeknek a vérsejteknek az elválasztása egy izotóniás gradiensben nem lehetséges .

Hipertóniás körülmények között a limfociták gyorsabban vesztenek vizet, mint a monociták, aminek következtében növekszik sűrűségük. Hipertóniás elválasztó közegben ezért lehetséges a monociták elkülönítése a teljes vérből vagy a leukocitákban dús plazmából. A humán vérmonociták elkülönítése szintén buffy coat-ból lehetséges. Ehhez az egymagvas sejteket izotóniás körülmények között sűrűséggradiensben elválasztottuk, majd a monociták szövettenyésztő üvegekben (175 cm^/SOO ml) adhéziójuk révén elváltak.

A nagyság és a szemcsésség meghatározása után, valamint specifikus antitest-festés után átfolyó-citofluometriás elemzés segítségével tudtuk kimutatni adhézió révén ezeknek a sejteknek a stimulációját. Emiatt a stimuláció miatt a szövettenyésztő üvegek fenekén az adhézió révén elkülönült monocitákat a továbbiakban monocitáknak/makrofágoknak (stimulált monociták) nevezzük .

Az AZT-DMDOPE humán monociták membrán-frakciójával történő enzimatikus átalakításánál 0,1 mg protein/elegy koncentrációig lehetett megállapítani lineáris függést (15. ábra). Az említett monocitákat elkülönítésük során adhézió révén stimuláltuk. A

-56• · ··· · ···· ·· • · · • ·· · specifikus aktivitás 8,8+0,26 pmol mg^-1 min^-1 volt (n=4) (16.

ábra). Ha a monocitákat közvetlenül a hipertóniás sűrűséggradiensben különítettük el, akkor csak 0,025 mg protein/elegy protein-koncentrációig mutatkozott lineáris viselkedés az enzimatikus hasításkor. Nagyobb protein-koncentrációknál a szubsZtrát-átalakulás közel állandó maradt. A specifikus aktivitást a nem stimulált humán PBL membrán-frakcióval történő átalakításokkal analóg módon a lineáris tartományból számítottuk, és értéke 3,2±0,60 pmol mg^-! min^-1 volt (n=4).

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az AZT-DMDOPE stimulált humán PBL és monociták membrán-frakcióinak enzimeivel történő átalakításakor nagyobb specifikus LCE-aktivitás figyelhető meg, mint az AZT-DMDOPE nem stimulált sejtek membránfrakcióival történő átalakításakor (16. ábra).

d. A specifikus LCE-aktivitás függése az inkubációs időtől

Az inkubációs idő függvényében az AZT-DMDOPE kísérleti anyag enzimatikus hasítását enzimforrásként stimulált humán PBL membrán-frakcióival végeztük. A reakcióelegyeket 0,5, 1, 2, 3 és 6 órán át 37°C-on inkubáltuk, majd meghatároztuk a DMDOP metabolit mennyiségét. A kísérleti eredmények grafikus ábrázolása után láthatóvá vált, hogy az AZT-DMDOPE DMDOP-vé való átalakulása a 0,5-6 órás inkubáció teljes időtartama alatt lineáris (17. ábra).

-57e. A specifikus LCE-aktivitás függése a kétértékű fémkationoktól

Az AZT-DMDOPE LCE által végzett enzimatikus hasításának a kétértékű fémkationoktól való függését enzimforrásként stimulált humán PBL membrán-frakcióival vizsgáltuk.

A kétértékű fémkationokat 2 mM koncentrációban az LCEmintában alkalmaztuk. A protein-koncentrációt 0,068 mg/elegy értékben határoztuk meg.

Ezzel párhuzamosan egy EGTÁ-t tartalmazó elegyet is készítettünk. Az EGTA a Ca2 + különleges komplexképzője, amely a C foszfolipáz aktivitása szempontjából lényeges. 2 órás inkubációs idő után 37°C-on mértük az anyavegyület átalakulását, és meghatároztuk az LCE specifikus aktivitását (következő táblázat) .

Táblázat

Az AZT-DMDOPE stimulált humán PBL membrán-frakcióival történő hasításának függése az EGTÁ-tól és kétértékű fémkationoktól (középérték ± SD, n=3 meghatározás)

Effektor [2 mM]	DMDOP [pmol]	Specifikus aktivitás [pmol mg-^-min--'-]	Gátlás [%]
EGTA	84,96±11,18	10,41±1,37	Ξ0
CaCl2	50,50±2,13	6, 19±0,26	41,0±2,5
MgCl2	84,36+17,02	10,34±2,08	0
ZnCl2	0	0	100, 0
MnCl2	4,75±0,63	0,58±0,08	94±1

-58.··. .··. ···:

.· .··. .· ···· ·· ·

A legnagyobb specifikus aktivitást EGTA és MgCl2 alkalmazásakor értük el 10,41±l,37 (n=3), illetve 10,34±2,08 pmol mg“l min^-1 (n=3) értékekkel. A mérési pontosságon belül tehát nem volt kimutatható MgCl2 általi gátlás. Ha az enzim-mintában CaCl2^_ot alkalmaztunk, akkor 6,19+0,26 pmol mg^-l min^-l értékű (n=3) specifikus aktivitást tudtunk meghatározni. Ez az EGTÁ-t tartalmazó elegyhez képest az LCE-aktivitás 41,0±0,25% értékű (n-3) gátlását jelenti. ZnCl2 esetén a mérési pontosságon belül nem volt kimutatható DMDOP. A ZnCl2 és a MnCl2 az AZT-DMDOPE

DMDOP-vé és AZT-MP-vé való átalakításának teljes gátlását okozta .

f. Kj4 és v_max, a hatásos Michaelis-Menten paraméterek meghatározása

Az LCE hatásos Michaelis-Menten paramétereinek meghatározásához az AZT-DMDOPE enzimatikus hasítását a növekvő szubsztrát-koncentráció függvényében vizsgáltuk.

Táblázat

Az LCE hatásos Michaelis-Menten paraméterei, és v_max stimulált és nem stimulált humán PBL-ben, valamint humán monocitákban és monocitákban/makrofágokban (stimulált monociták)

-59• ·· • · »· ··

	vmax [pmol mg”Imin-	KM [mM]
nem stimulált humán PBL	2,03±0,19	5,51±0,99
stimulált humán PBL	15,29±0,37	2,26 + 0, 16
humán monociták	1,61±0,37	12,0814,13
humán monociták/makrofágok	9,09±0,44	4,63±0,45
(stimulált monociták)

Ehhez stimulált és nem stimulált humán PBL, valamint humán monociták és monociták/makrofágok (stimulált monociták) membrán-frakcióit alkalmaztuk. A reakcióelegyek állandó, 0,068 mg/elegy mennyiségű proteint tartalmaztak, és 37°C-on 2 órán át voltak inkubálva. Azután meghatároztuk a DMDOP metabolit menynyiségét.

10. példa:

Kísérleti állatok:

Az AZT-DMDOPE kísérleti anyag farmakokinetikus paramétereinek meghatározásához nőstény balb/c egereken (Charles River Wiga, Sulzfeld; Bormholtgard, Ry (Dánia); Iffa Credo, L'Abresle (Franciaország)) végeztünk in vivő kísérleteket. Az állatszállítmányokat a kísérletek megkezdése előtt megvizsgáltuk vírusantitestre (egér-hepatitis vírus, reo-vírus, paro-vírus). A kísérletekben csak olyan állatokat használtunk, amelyeknek az antitest-titere negatív volt.

•••· »·

-60• ·· · • · · · · ·

A kísérleti állatok tartása:

Az állatokat 22-24°C szobahőmérsékletű, 50-70% relatív páratartalmú, teljesen klimatizált állatszobákban tartottuk 12-12 órás nappal-éjszaka ritmussal. Lamináris áramlású boxok biztosították az állatszobákban az óránkénti 15-20 légcserét. Az állatok standard diétát (Ssniff, Soest) és ad libitum vizet kaptak palackos itatóedényből.

11. példa:

Sejttenyésztési eljárások

a. Sejtvonalak kriokonzerválása

A kriokonzerváláshoz a sejtek sejtsűrűségét RPMI 1640 közegben 5 x 10® sejt/ml értékre állítottuk be, és 10 percig Minifuge T típusú centrifugában 1600 percenkénti fordulatszámon ülepítettük. Azután a sejtüledéket felvettük ugyanakkora térfogatú kriokonzerváló közegben. A sejtüledék újraszuszpendálása után 1-1 ml sejtszuszpenziót kriocsövekbe (1,8 ml) vittünk, és 24 órán át -70°C-on befagyasztottuk. A végleges tároláshoz a kriocsöveket folyékony nitrogénes hőtartályba helyeztük. Kriokonzerváló közeg 60térfogat% RPMI 1640 közeg

0,05 mM

100 U/ml

100 mg/ml 30térfogat%

10térfogat%

2-merkapto-etanol penicillin sztreptomicin magzati borjúszérum

DMSO

-61 • * · * · · <9 • ♦· • · · • * * · « ·

b. A törzstenyészet tartása és nevelési körülményei

CEM-SS-sejtek tenyésztése

A CEM-SS szuszpenziós sejtvonalat RPMI 1640 I-es komplettközegben tenyésztettük. Ehhez 1 x ÍO? sejtet 50 ml közeggel töltött szövettenyésztő üvegbe (83 cm²/260 ml) vittünk. Azután a tenyészetet 3 napig 37°C-on és 5% CO2~ben inkubáltuk.

A sejtátmenet (passage) számára a sejteket steril pipettával kivettük a szövettenyésztő üvegből, és Minifuge T centrifugában 10 percig 1600 percenkénti fordulatszámon ülepítettük. A sejteknek a tenyésztési közegben való újraszuszpendálása és a sejtszám Neubauer-számlálókamrában eozinos festéssel való meghatározása után 1 x 10? sejtet az átmenethez 50 ml friss közegbe helyeztünk.

P3X63Ag8.653-sejtek tenyésztése

A P3X63Ag8.653-sejteket monomolekuláris rétegként (monolayer) RPMI 1640 I-es komplettközegben tenyésztettük. Ehhez 5 x 10θ sejtet 40 ml közeggel töltött szövettenyésztő üvegbe (83 cm²/260 ml) vittünk. Azután a sejttenyészetet 5 napig 37°C-on és 5% CC>2-ben inkubáltuk, míg a szövettenyésztő üveg fenekét összefüggő sejtréteg (monolayer) nem fedte. A sejtátmenethez az adherens sejteket sejtkaparóval mechanikusan leválasztottuk az üvegfenékről, majd centrifugálással 10 percig 1600 percenkénti fordulatszámon Minifuge T centrifugában ülepí-62tettük. A sejteknek a tenyésztési közegben való újraszuszpendálása után Neubauer-számlálókamrában eozinos festéssel meghatároztuk a sejtszámot, és 5 x 10® sejtet az átmenethez 40 ml friss közegbe helyeztünk.

c. Sejtszám-meghatározások

A sejtszám meghatározása eozinos festéssel Neubauerszámlálókamrában (Lindl und Bauer, 1989, Zell- und Gewebekultur (Sejt- és szövettenyészet), 75-90, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York)

A sejtszámnak a szuszpenziós és egyrétegű tenyészetekben való meghatározásához PBS-ben 0,1 - 1 x 10® sejt/ml sejtkoncentrációt állítottunk be, és ennek a sejtszuszpenziónak egy adagját elkevertük 20 μΐ eozinnal. Azután a sejtszuszpenziót pipettával óvatosan összekevertük, 2 órára szobahőmérsékleten inkubáltuk, és Neubauer-számlálókamrába vittük. A sejtszámmeghatározást közvetlenül az inkubációs idő után fordítottfáziskontraszt-mikroszkópban végeztük. A sejteket a négy nagy négyzeten belül számláltuk. Az életképes sejtek az életképtelen sejtekkel ellentétben nem színeződtek el. A nehezen színeződő sejteket életképtelennek tekintettük.

Az életképes sejtek milliliterenkénti számát a négy nagy négyzet nem színeződött sejtjeinek számából a 10^ kamratényezővel és az eozinoldatban lévő sejtszuszpenzió hígítási tényezőjével való megszorzással kaptuk.

-63 . · · ·· ···· · · ·„ • ·· · ·· ·· · • ·· · ··· · • · · · · · ···· ·· · ·

A sejtszám. meghatározása elektronikus számlálással

Coulter-számlálóban (Lindl és Bauer, 1989)

A sejtszám mérése Coulter-számlálóban azon alapszik, hogy a sejtek átáramlanak két platina-elektród között. Ha egy sejt áthalad a két elektród nyílásán, akkor az elektródokon átfolyó áram ellenállása a sejt nagyságával arányosan változik. Ez egy feszültségimpulzust kelt, amelyet regisztrálunk, és ily módon lehetséges a sejtek mennyiségi meghatározása.

A sejtszám meghatározásához 25 μΐ sejtszuszpenziót 3 ml isoosmolba, a Coulter-számláló hordozó folyadékába vittünk, és beinjektáltuk a készülékbe.

A sejtszámlálásnak ennél a típusánál a sejtszuszpenzió teljes sejtszámát határozzuk meg. Az életképes és az életképtelen sejtek között nem lehet különbséget tenni.

d. Az adherens sejtek leoldása tripszin-EDTA-oldattal

Az adherens sejteket enzimatikus úton tripszines-EDTÁ-s kezeléssel tudtuk leoldani a mindenkori tenyésztő edény fenekéről. Ehhez a tenyészet felüllévő részét óvatosan dekantáltuk, és a sejteket előmelegített (37°C) tenyésztési közeggel kétszer mostuk. A sejtek leoldására a tenyésztő edény fenekéről a sejteket 5 percre tripszin-EDTA-oldattal (1 x) szobahőmérsékleten inkubáltuk. A tripszin-EDTA-oldat térfogatát úgy választottuk meg, hogy a tenyésztő edény fenekét az enzimes oldat 2-3 mm ·· ·· ·· · · · · • ·· · ·· ·· • ·· · ··· • · · · · ···· ·· · φ φ

-64vastagságban fedje. Az inkubációs idő letelte után a sejteket az üveg óvatos rázásával leválasztottuk a fenékről, eltávolítottuk a tenyésztő edényből, és ugyanakkora térfogatú RPMI 1640 I-es komplettközeggel elkevertük. Azután a sejteket 10 percig 1600 percenkénti fordulatszámon Minifuge T centrifugában ülepítettük. A felüllévő részt elengedtük, a sejtüledéket hideg PBSben újraszuszpendáltuk, és ugyanolyan körülmények között újból centrifugáltuk. A sejteket azután további alkalmazásuknak megfelelően tenyésztési közegben vagy pufferban újraszuszpendáltuk .

e. Egymagvas sejtek elkülönítése humán vérből

Humán PBL elkülönítése buffy-coat-ból centrifugálással izotóniás sűrűséggradiensben (Böyum, 1968, Scand. J. Clin. Láb. Invest. 21 (Suppl. 97), 77-89; Böyum, 1976, Scand. J. Clin.

Láb. Invest. 5 (Suppl. 5), 5-15)

Humán PBL elkülönítésére egészséges donorok buffy-coatját összekevertük, és 1:2 térfogatarányban felhígítottuk RPMI 1640 ΙΙ-es komplettközeggel. Polipropilén-csövekbe (50 ml) 20 ml hideg limfocita-elválasztó közeget tettünk, és óvatosan 15 ml hígított buffy-coat-ot rétegeztünk rá. A frakcionálást centrifugálással szobahőmérsékleten 30 pecig 1600 percenkénti fordulatszámon (4-es gyorsulás / 4-es fék) Minifuge T centrifugában végeztük. A minta és az elválasztó közeg közti jól látható sávot Combitip pipetta segítségével nyertük. Az elválasztó • · · « • · · • · · • · · · · ·

-65 közeg eltávolításához az összegyűjtött frakciókat szobahőmérsékleten 10 pecig 1600 percenkénti fordulatszámon ülepítettük.

A felüllévő részt dekantáltuk, és a sejteket alkalmazásuknak megfelelően RPMI 1640 ΙΙ-es komplettközeggel vagy hideg PBS-sel háromszor mostuk.

Humán PBL stimulálása és tenyésztése

Humán PBL-nek izotóniás sűrűséggradiensben centrifugálással való elkülönítése után lehetséges volt perifériás limfocita-tenyészeteket készíteni. Rendes körülmények között a vérsejtek tenyészetben viszonylag gyorsan elhalnak. A limfociták azonban több generáción át tenyészetben tarthatók. Abból a célból, hogy elérjük ezeknek a sejteknek a szaporodását, PHA-M mitogénnel, a vörös tűzbab (Phaseolus vulgáris) lektin-extraktumával stimuláltuk azokat.

A stimulációhoz az elkülönített sejtek sejtsűrűségét szövettenyésztő üvegekben (175 cm^/SOO ml) RPMI 1640 Il-es komplettközegben 1 x 10® sejt/ml értékre állítottuk be, és 37°C-on, 5% CC>2-ben inkubáltuk. A túl nagy sejtsűrűség elkerülése érdekében 24 óra eltelte után a sejtszuszpenziót 1:1 térfogatarányban tenyésztési közeggel hígítottuk. A stimulálási idő letelte után a PHA-M mitogént eltávolítottuk RPMI 1640 IIes komplettközeggel való háromszori mosással. A sejtterjedéshez a stimulált limfocitákat RPMI 1640 IV-es komplettközegben 5-7 x 10® sejt/ml sejtsűrűségre állítottuk be, és 24 órán át tenyésztettük.

-66Leukocitában dús plazma előállítása teljes vérből (Böyum,

1968)

Egészséges donorok vénás friss vérét az alvadás megakadályozása céljából 49:1 térfogatarányban steril 10tömeg%-os EDTAoldattal elkevertük. Azért, hogy ezek az összetevők gyorsan elkeveredjenek, a donortól kis mennyiségű, 8-9 ml vért vettünk le polisztirol-csőbe (14 ml). Leukocitában dús plazma előállításához EDTA-vért és Dextran 75-öt 10:1 térfogatarányban elegyítettünk. A két összetevőt alaposan elkevertük, és az eritrocitákat szobahőmérsékleten 60 perces időtartam alatt ülepítettük. Azután a majdnem tiszta felüllévő részt, a leukocitában dús plazmát pipettával óvatosan kivettük, és monociták elkülönítéséhez használtuk.

Humán monociták elkülönítése leukocitában dús plazmából centrifugálással hipertóniás sűrűséggradiensben (Böyum, 1983, Scan. J. Clin. Láb. Invest. 17, 429-436)

Hipertóniás oldatban el tudtunk különíteni nem stimulált monocitákat teljes vérből vagy leukocitában dús plazmából. Ehhez polisztirol-csövekbe (14 ml) 3 ml NycoPrep 1.068 típusú hipertóniás elválasztó közeget tettünk, és óvatosan rárétegeztünk 6 ml leukocitában dús plazmát. A csöveket lezártuk, és Minifuge T centrifugában szobahőmérsékleten 15 percig 600g-vel (4-es gyorsulás / 4-es fék) centrifugáltuk. A centrifugálás után a tiszta, akár 5 mm magas plazma-fázist eltávolitottuk a széles, • · · ·

-67diffúz sáv fölül, és elengedtük. A visszamaradó plazma-fázist és a széles, diffúz sáv felét kivettük, és a sejteket centrifugálással Minifuge T centrifugában 7 percig! ugyanolyan körülmények között ülepítettük. A sejtüledéket azután az elválasztó közeg maradékainak eltávolítására kétszer 6 ml mosóoldatban újraszuszpendáltuk és mostuk.

Nycoprep 1.068 13tömeg%

0,58tömeg% (mM) sűrűség

Nycodenz

NaCl tricin/NaOH pH 7,4 l,068±0,001 g/ml (20°C) ozmolaritás

335±5 mOsm

Mosóoldat

0,9tömeg% 0,13tömeg% ltömeg%

NaCl

EDTA

BSA (V frakció)

Humán monociták elkülönítése buffy-coat-ból adhézióval (Andreesen et al., 1983, J. Immun. Methods 56, 295-304)

Buffy-coat-ból centrifugálással izotóniás sűrűséggradiensben egymagvas sejteket különítettünk el, és háromszor mostuk szérummentes RPMI 1640 közeggel. A monociták elkülönítéséhez a sejtek sejtsűrűségét szövettenyésztő üvegekben (175 cm²/800 ml) 20 ml RPMI 1640 ΙΙ-es komplettközeggel 5 x 10θ sejt/ml értékre állítottuk be, és 45 percig 37°C-on és 5% etében inkubáltuk. A nem adherens sejteket az inkubálás befejezése

-68• « · ·.* után a közeg dekantálásával eltávolítottuk. A szövettenyésztő üveg fenekén lévő sejtréteget azután a szuszpenziós sejtek maradékainak eltávolítására temperált (37°C) szérummentes RPMI 1640 közeggel kétszer mostuk. A sejtréteget elkevertük 30 ml RPMI 1640 V-ös komplettközeggel, és további 24 órára ugyanolyan körülmények között inkubáltuk. Az adherens monocitákat tripszines-EDTÁ-s kezeléssel oldottuk le.

12. példa:

Immunológiai eljárások

a. Humán vérből származó sejt-szubpopulációk átfolyócitofluometriás elemzése közvetlen és szekvenciális antitestfestéssel

Az átfolyó-citofluometriás elemzéshez a jellemzendő sejtek sejtsűrűségét FACS-PBS-ben 1 x 10⁷ sejt/ml értékre állítottuk be. Az antitest-törzsoldatokat 1:50 térfogatarányban FACS-PBSsel hígítottuk. A közvetlen és szekvenciális antitest-festéshez 50 μΐ sejtszuszpenziót (1 x 10⁷ sejt/ml) egy kúpos fenekű mikrotiterlemez mélyedéseibe helyeztünk.

Antitestek egymagvas humán vérsejtek átfolyócitof luometriás elemzéséhez ·· · ·

Antitest	Specifikusság	Fluoreszcencia- színezék	Antitest- festés
Anti-Leu-12 (CD19)	Leu-12 (CD19) B-limfociták	PE	közvetlen
Anti-Leu-5b (CD2)	Leu-5 (CD2) T-limfociták	FITC	közvetlen
Anti- monocita (CD14)	gp 55 monociták makrofágok	-	szekvenci- ális
Anti-Leu-2a (CD8)	citotoxikus- T-limfociták	FITC	közvetlen
Anti-Leu-3a (CD4)	segéd- T-limfociták	PE	közvetlen

Azután a sejtszuszpenziót elkevertük ugyanakkora térfogatú antitesttel, amely közvetlen antitest-festéskor fluoreszkáló színezékhez van kötődve. Az elegyeket 30 percre 4°C-on inkubáltuk, majd a sejtek ülepitéséhez 2 pecig 1400 percenkénti fordulatszámon és szobahőmérsékleten Minifuge T centrifugában centrifugáltunk.

A felüllévő részeket eltávolítottuk, a sejtüledéket a nem kötött antitestek maradékainak eltávolítására 200 μΐ FACS-PBSben újraszuszpendáltuk, és ahogy már ismertettük, újból centrifugáltuk. A felüllévő részt eltávolítottuk, és a sejtüledéket közvetlen antitest-festéskor 100 μΐ FACS-PBS-ben újraszuszpendáltuk.

Szekvenciális antitest-festéskor a centrifugálás befejezése után a sejtüledéket felvettük a fikoeritrinnel jelölt kecske-anti-egér Ig-R-Pe antitest (3 pg/ml) 100 μΐ oldatában, és 30

-70percre 4°C-on inkubáltuk. A nem kötött antitestek maradékait 200 μΐ FACS-PBS-es mosással eltávolítottuk, ahogy ezt már ismertettük, és a sejtüledéket átfolyó-citofluometriás sejtelemzéshez 100 μΐ FACS-PBS-ben újraszuszpendáltuk.

b. A sejtek életképességének meghatározása propidiumjodidos festéssel átfolyó-citofluometriás analizátorban

Az életképes és az életképtelen sejtek számának meghatározása átfolyó-citofluometriás elemzéssel lehetséges a sejteknek a fluoreszkáló színezékkel, propidium-jodiddal való festése után. Ezt a színezéket csak az életképtelen sejtek veszik fel.

A meghatározáshoz a sejtszuszpenzió koncentrációját PBS-ben 0.5 - 1 x 10θ sejt/ml értékre állítottuk be. Ebből a sejtszuszpenzióból kivettünk 180 μΐ-t, és elkevertük 20 μΐ propidium-jodid-oldattal (5 μς/ιηΐ) . 5 perc inkubációs idő után 100 μΐ oldatot a sejtanalizátorba injektáltunk. A sejtanalizátor Lysis II programjában lévő statisztikai elemzéssel meg tudtuk határozni az életképes és az életképtelen sejtek százalékos megoszlását.

c. Sejtextraktumokban lévő AZT mennyiségi meghatározása 125i-AZT-radioimmuno elemzéssel

Az AZT mennyiségi meghatározásához kereskedelmi minőségű ¹²⁵I-AZT RIA Test-Kitet használtunk. A pufferokat és az oldatokat a gyártó adatai szerint állítottuk elő és alkalmaztuk a

• · · · • · · · ·· «

-71 Test-Kitben. A reakcióelegyeket az alábbi vázlat (táblázat) szerint pipettáztuk, óvatosan elkevertük, és 2 órára szobahőmérsékleten inkubáltuk. Azután a komplexnek a ¹²^J-AZT-ből és a (házinyúlból származó) AZT-antitestnek a kicsapatásához hozzáadtunk 500 μΐ kecske-anti-házinyúl-antitestet. Az elegyeket elkevertük, és szobahőmérsékleten újból 30 percre inkubáltuk.

125i_AZT-radioimmuno elemzés pipettázási vázlata sejtextraktumokban lévő AZT mennyiségi meghatározásához

	Nem kötő standard	Nullstandard	Standard	Minta
Nullstandard [μΐ]	300	200	-	-
Standard [μΐ]	-	-	200	-
Minta [μΐ]	-	-	-	200
125i-azt [μΐ]	100	100	100	100
AZT-antitest [μΐ]	-	100	100	100

A kicsapatási komplex ülepítéséhez az elegyeket azután lOOOg-vel 20 percig centrifugáltuk. A felüliévé rész dekantálása után folyadék-szcintillációs analizátorban 60 percig mértük az üledék radioaktivitását. Az abszolútérték megállapításához szobahőmérsékleten 2 órás inkubáció után ugyanolyan körülmények között meghatároztuk 100 μΐ ¹²⁵I-AZT radioaktivitását. Az AZT koncentrációit a biológiai mátrixban kalibrációs ·«·· ·· • ·

-72görbe segítségével állapítottuk meg, amelyet a Test-Kit definiált anyag-koncentrációjú standardjaival készítettünk.

13. példa:

BM 21.1290 Na intracelluláris enzimatikus hasításának jellemzése

Az AZT-DMDOPE-vel, illetve AZT-vel stimulált és nem stimulált humán PBL-ben, valamint timidin-kináz-hiányos P3X63Ag8.653-sejtekben végzett in vitro farmakokinetikai tanulmányok eredményei az AZT-DMDOPE intracelluláris enzimatikus hasadására utalnak AZT-MP és DMDOP, a megfelelő tioéter-lipidrész közvetlen felszabadulása közben. Ezt az intracelluláris enzimatikus hasadást a további kísérletekben szubcelluláris szinten a megfelelő metabolitok közvetlen kimutatásával kellett bizonyítani. A hasadás egyértelmű jellemzéséhez így az eddig ismert metabolitok azonosítása volt szükséges, amelyek az AZTDMDOPE anyavegyületből keletkezhetnek. Ehhez tartoznak a DMDOP, az AZT és az AZT-MP anyagok, valamint azok az anyagok, amelyek a tioéter-lipidrészben lévő kén oxidációjával az AZT-DMDOPE anyavegyületből keletkeznek.

a. Eljárások kifejlesztése az AZT-DMDOPE és az AZTDMDOPE potenciális metabolitjai Rf-értékeinek meghatározására

Az AZT-DMDOPE potenciális metabolitjainak azonosítását vékonyréteg-kromatográfia segítségével tudtuk elvégezni. Ehhez a

- 73 nem radioaktívan jelölt tiszta anyagokat különböző elválasztó rendszerekben elemeztük, majd meghatároztuk az Rf-értékeket.

Az anyagokat ehhez feloldottuk egy 4 mg/ml koncentrációjú, etil-acetátból és metanolból (1:1, v/v) álló keverékben. Ebből az oldatból mikrokapilláris segítségével felvittünk 5 ml-t az álló fázisra, és elemeztük.

Az olyan tioéter-lipideket, mint az AZT-DMDOPE és a DMDOP, valamint azokat, amelyek a kén oxidációjával keletkeznek, meg tudtuk jelölni egy jódtartalmú reagenssel, amely megfesti ezeknek a vegyületeknek a tioéter-lipidrészét. Az AZT-t és az AZTMP-t az ultraibolya tartománybeli elnyelésük alapján 254 nm-en kizárólag fluoreszcens indikátorral ellátott vékonyrétegkromatográfiás lemezeken tudtuk láthatóvá tenni. Az AZT-DMDOPE, a tioéter-lipidrésszel és kromofor csoporttal rendelkező anyag mindkét típusú detektálással vizsgálható volt.

Az anyagok vékonyréteg-kromatográfiás elemzéséhez három elválasztó rendszert hoztunk létre, amelyek álló és mozgó fázisaikat tekintve különböztek egymástól.

Az első elválasztó rendszerben, az IBA-rendszerben álló fázisként Kieselgel 60-nal a DMDOP mellett azonosítani tudtuk az AZT-DMDOPE anyavegyületet. Mozgó fázisként 2-propanolból, nbutil-acetátból és kétszer desztillált vízből (10:6:4, v/v/v) álló keveréket alkalmaztunk.

Ennek az elválasztó rendszernek a továbbfejlesztését mozgó fázisként a 2-propanol, n-butil-acetát, kétszer desztillált víz és jégecet 3:5:1:1 arányú (v/v/v/v) keverékének (IBAE-rendszer) alkalmazása jelentette. Ahogy az IBA-rendszernél már ismertet··· ·

-Ί4tűk, az AZT-DMDOPE és a DMDOP anyagokat itt is Kieselgel 60 típusú vékonyréteg-kromatográfiás lemezeken tudtuk elválasztani. Kiegészítőleg az AZT-t és az AZT-MP-t UV-fényben 254 nm-en és fluoreszcens indikátorral ellátott Kieselgel 60-ból álló álló fázis alkalmazásával tudtuk elválasztani. Az AZT-rész miatt az AZT-DMDOPE anyavegyületet és annak oxidációs termékeit is tudtuk detektálni.

A vékonyréteg-kromatográfiás lemezen az anyagok láthatóvá tétele után meghatároztuk az Rf-értékeket.

Az AZT-DMDOPE anyagnak a DMDOP-től való megkülönböztetésére egy további elválasztó rendszer állt rendelkezésre. Ehhez mozgó fázisként n-heptánból és etil-acetátból (4:1, v/v) álló keveréket, álló fázisként Kieselgel 60-at alkalmaztunk. A detektálást a már ismertetett jódtartalmú reagenssel, az anyagok tioéter-lipidrészének festésével végeztük.

Az IBA- és az IBAE-rendszerhez képest ezzel a rendszerrel jóval kisebb Rf-értéket tudtunk meghatározni a DMDOP anyagra.

Ennek oka egy az IBA- és az IBAE-rendszerhez képest apoláris mozgó fázis, amely n-heptánból és etil-acetátból áll. Az anyagok kimutatási határát vékonyréteg-kromatográfiás elemzés és egy jódtartalmú reagenssel való detektálás után valamennyi elválasztó rendszerben 0,1 μg/ml-rel határoztuk meg.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az ismertetett vékonyréteg-kromatográfiás elválasztó rendszerek segítségével valamennyi anyag, amely a jelenlegi ismeretek szerint az AZTDMDOPE potenciális metabolitjaként szóba jön, Rf-értékeivel egyértelműen jellemezhető.

• · ···· ··

-75Táblázat

Az AZT-DMDOPE és a DMDOP Rf-értékei IBA-rendszerben (2propanol : n-butil-acetát : kétszer desztillált víz, 10:6:4, v/v/v) és álló fázisként Kieselgel 60-nal való elválasztás után (középérték ± SD, n=6 meghatározás)

Tesztanyag	Rf-érték
AZT-DMDOPE	0,68±5,2 x 10-3
DMDOP	0,93±0,00

Táblázat

Az AZT-DMDOPE, a DMDOP, az AZT és az AZT-MP Rf-értékei

IBAE-rendszerben (2-propanol : n-butil-acetát : kétszer desztillált víz : jégecet, 3:5:1:1, v/v/v/v) és álló fázisként Kieselgel 60-nal, illetve 60 F 254-gyel való elválasztás után (középérték ± SD, n=6 meghatározás)

Tesztanyag	Rf-érték
AZT-DMDOPE	0,57±l x 10“2
DMDOP	0,99±0,00
AZT	0,85±0,00
AZT-MP	0,14±0,00

- 76 b. AZT-DMDOPE enzimatikus hasítása stimulált és nem stimulált humán PBL, valamint CEM-SS-sejtek sejthomogenátumaival

Az AZT-DMDOPE hasítását olyan enzim-mintával vizsgáltuk, amelyben szubsztrátként [-^C]-AZT-DMDOPE-t és AZT-DMDOPE-t használtunk. Enzimforrásként mindenek előtt CEM-SS-sejtek és humán PBL sejthomogenátumait alkalmaztuk.

Táblázat

Az AZT-DMDOPE és a DMDOP Rf-értékei vékonyrétegkromatográfiás elválasztás után HE-rendszerben (n-heptán : etil-acetát, 4:1, v/v) álló fázisként Kieselgel 60-at alkalmazva (középérték ± SD, n=6 meghatározás)

Tesztanyag	Rf-érték
AZT-DMDOPE	0,0±0,0
DMDOP	0,36±0,00

Az utóbbit mind PHA-M-mel való stimulálás után, mind nem stimulált állapotban közvetlenül elkülönítése után homogenizáltuk, és alkalmaztuk az enzim-mintában.

A sejthomogenátumok előállításához 5 x 10⁷ sejt/ml sűrűségű sejtszuszpenziókat 50 mM Tris pufferral üveg homogenizátorban mechanikusan feltártunk. A feltárt sejteket fordított-fáziskontraszt-mikroszkópban optikailag ellenőriztük.

• ·· • · · ···· ·· »· ·> ·» • · * · « • ··· · • · • ·««·

Táblázat

Az 1-4. anyagok Rf-értékei (18. ábra) 1, 3, 6 és 24 órás inkubáció és a [¹⁴C]-AZT-DMDOPE-nek 5 χ 10⁷ stimulált és nem stimulált humán PBL és CEM-SS-sejt sejthomogenátumai által végzett enzimatikus hasítása után. Elválasztás IBA/IBAErendszerben álló fázisként Kieselgel 60-nal (középérték ± SD, n=4 meghatározás)

	Az 1. anyag Rf-értéke	A 2 . anyag Rf-értéke	A 3. anyag Rf-értéke	A 4 . anyag Rf-értéke
CEM-SS	0, 41 ±2,5 x IO-2	0, 56 ±2,5 χ IO-2	0, 86 ±5,8 χ IO-3	0, 96±0, 0
Stimulált humán PBL	-	0, 65 ±9, 5 x 10~3	0,86 ±5,8 x 10~3	0, 94±0, 0
Nem stimulált humán PBL		0, 65 ±1,7 x IO2		0, 92 ±1,2 x 10~2

Előszöris 1 ml sejthomogenátumot alkalmaztunk az enzimmintában anélkül, hogy előzőleg meghatároztuk volna a proteinkoncentrációt. Szubsztrátként 0,98 nmol [-AZT-DMDOPE-t (1,67 kBq) használtunk.

A szubsztrát-telítettség biztosítása céljából további 50 nmol nem radioaktívan jelölt vegyületet adtunk hozzá. A [¹⁴C]AZT-DMDOPE a radioaktív jelölést a tioéter-lipidrészben hordozza, és így teszi lehetővé a [^^C]-DMDOP potenciális metabolit egyértelmű azonosítását.

Az elegyeket 1, 3, 6 és 24 órára vízfürdőben 37°C-on inkubáltuk. Összehasonlításként egy sejthomogenátum-hozzáadás

-78nélküli elegyet is vizsgáltunk. Azután a hasítási termékeket dietil-éter : 2-propanol (9:1, v/v) elegyével extraháltuk, és vékonyréteg-kromatográfiásan IBA- és IBAE-rendszerben elemeztük (18. ábra). Az anyagok elválasztása után a radioaktívan jelölt anyagok detektálásához a vékonyréteg-kromatográfiás lemezt 15 percig radio-vékonyréteg-kromatográfiás-analizátorban mértük. A metabolitokat egyértelműen végül az Rf-értékek meghatározásával tudtuk azonosítani.

Táblázat

Az 1. és 2. anyag Rf-értékei (18. ábra) a [1⁴C]-BM 21.1290

Na 1, 3, 6 és 24 órás inkubációja után. Elválasztás IBA/IBAErendszerben álló fázisként Kieselgel 60-nal (középérték ± SD, n=4 meghatározás)

	Az 1. anyag Rf-értéke	A 2. anyag Rf-értéke
CEM-SS	0,41 + 5,7 χ 10-3	0,56±5,8 x 10~3
Stimulált humán PBL	-	0,65±9,6 χ 10-3
Nem stimulált humán PBL	-	0,65±1,9 χ 10'2

Az AZT-DMDOPE-nek stimulált és nem stimulált humán PBL sejthomogenátumai által végzett enzimatikus hasításából származó hasítási termékek vékonyréteg-kromatográfiás elemzését IBAelválasztórendszer alkalmazásával végeztük. A CEM-SS-sejthomogenátummal végzett csatlakozó kísérletekben a hasítási termékek ·»4 ·

-79elemzését IBAE-elválasztórendszerben hajtottuk végre. Mivel mindkét elválasztó rendszerben meghatároztuk a tiszta anyagok Rf-értékeit, ezért az AZT-DMDOPE enzimatikus hasítása után az anyagok azonosításához az eredményeket közvetlenül össze tudtuk hasonlítani.

A [-AZT-DMDOPE-nek stimulált, illetve nem stimulált humán PBL sejthomogenátumai által végzett enzimatikus hasítása után a vékonyréteg-kromatogramban három ismeretlen anyagot detektáltunk. A stimulált és nem stimulált humán PBL 0,65±9,5 x 10^-2 (n=4) és 0,65±l,7 x 10^-2 (n=4) nagyságú Rf-értékeivel a 2es anyagcsúcsot egyértelműen a [-AZT-DMDOPE anyavegyülethez tudtuk hozzárendelni. A 0,94±0,0 (n=4) és 0,92±l,2 x 10^-2 (n=4) nagyságú 4-es anyagcsúcs Rf-értékei a DMDOP azon értékeivel voltak azonosak, amelyeket a tiszta anyagok vékonyrétegkromatográfiás elemzésével határoztunk meg. A 3-as anyagcsúcsot a 0,86+5,8 x 10^-3 (n=4) nagyságú Rf-értékkel egyik ismert anyaghoz sem lehetett hozzárendelni. Az eredményeket a AZT-DMDOPE-nek CEM-SS-sejhomogenátumokkal való enzimatikus hasításának elemzésével igazoltuk. A 2-es és 4-es anyagcsúcsot a 0,5612,5 x 10^-2 (n=4) és 0,96±0,0 (n=4) nagyságú Rf-értékekkel egyértelműen AZT-DMDOPE-ként, illetve DMDOP-ként lehetett azonosítani, míg az 1-es anyagcsúcsot a 0,41±2,5 x 10^-2 (n=4) nagyságú Rf-értékkel egy oxidációs termékhez lehetett hozzárendelni. A 3-as anyagcsúcsnak az Rf-értékek összehasonlítása után

IBAE-rendszerben sem tudtunk hozzárendelést találni (18. ábra). Úgy találtuk továbbá, hogy a [¹⁴C]-AZT-DMDOPE inkubálása után • I» ••Uv » « · · «1·· ·· · • * · ·»· · • »·η·

- 80sejthomogenátum hozzáadása nélkül csak az anyavegyületet lehetett detektálni (18. ábra).

A reakcióelegyek vékonyréteg-kromatográfiás elemzéséből így az bizonyítható, hogy a DMDOP anyag az anyavagyületből szabadul fel.

14. példa:

9- (β-D-arabino-furanozil)-2-fluor-adenin-5'-foszforsav-(3dodeci1-merkapto-2-deciloxi)-propilészter (fludarabin-konjugát)

34,8 g (0,07 mól) foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2deciloxi)-propilésztert feloldottunk 130 ml absz. piridinben, nitrogén alatt elkevertük 15 g metánszulfonsav-kloriddal, és 3 órán át szobahőmérsékleten kevertük.

Azután óvatosan bevittünk 20 g fludarabint, és az oldatot további 48 órán át szobahőmérsékleten kevertük. A fludarabint a

J. Heterocyclic Chem. 16, 157 (1979) publikáció szerint állítottuk elő.

A reakciókeverék hidrolízise után 30 ml 1M trietilammónium-bikarbonát-oldat hozzáadásával és egy órás keverés után a piridint vákuumban eltávolítottuk, a maradékot megosztottuk 200 ml t-butil-metiléter (MTB) és 150 ml víz között, a szerves fázist elválasztottuk, és rotációs bepárlóban bepároltuk. A maradékot RP-18 oszlopon eluensként metanollal/0,02 M acetát-pufferral pH 4 8/2 kromatográfiásan tisztítottuk.

A terméket tartalmazó frakciókat a vízhányad kivételével elpárologtattuk, MTB-vel extraháltuk, és az MTB-fázis pH-ját ·>·

.. ·. ^uj*s /·.

·’*· ·* ·’ί *· • ·· « · ···.

- 81 nátrium-metilát-oldattal friszkolittal szemben 7-re állítottuk be.

Az oldószer elpárolgása után a maradékot acetonban szuszpendáltuk, az amorf csapadékot leszívattuk és szárítottuk.

Kitermelés: 23,7 g (43%). Amorf. Rf = 0,45 (vékonyrétegkromatográfiás futtatószer: iozpropanol/butilacetát/víz/ammónia 50/30/15/5).

15. példa:

2- klór-2'-dezoxi-adenozin-5'-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter (kladribin-konjugát)

A kladribin-konjugátot a 14. példával analóg módon 4,2 g foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter, 3 g metánszulfonsav, 100 ml piridin és 2 g kladribin felhasználásával állítottuk elő 35%-os kitermeléssel. Rf = 0,41 (futtatószer mint a 14. példában). A kladribint a J. Am. Chem. Soc. 106,

6379 (1984) publikáció szerint állítottuk elő.

16. példa:

3- (2-dezoxi-p-D-eritro-pentofuranozil)-3, 6,7,8-tetrahidroimidazo [4, 5-d] [1,3]diazepin-8-ol-5’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter (pentosztatin-konjugát)

A pentosztatin-konjugátot a 14. példával analóg módon 4,2 g foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter, 3 g metánszulfonsav, 100 ml piridin és 2,1 g pentosztatin felhasz• ·

- 82nálásával állítottuk elő 27%-os kitermeléssel. Rf = 0,52 (futtatószer mint a 14. példában). A pentosztatint a J. Org.

Chem. 47, 3457 (1982), illetve a J. Am. Chem. Soc. 101, 6127 (1979) publikációk szerint állítottuk elő.

• · • ·

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. C foszfolipáz-aktivitástól mentes lipid-cleavageenzymkomplex (LCE), azzal jellemezve, hogy az enzimkomplex az AZT-DMDOPE konjugátot [(3'-dezoxi-3'-azido-timidin)-5'foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter] AZTMP-vé [3'-dezoxi-3'-azido-timidin-monofoszfát] és DMDOP-vé [(3 dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propanol] hasítja, vagy az FLTDMDOPE konjugátot [(3'-dezoxi-3'-fluor-timidin)-5'-foszforsav(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter] FLT-MP-vé [3'dezoxi-3'-fluor-timidin-5'-monofoszfát] és DMDOP-vé hasítja, vagy az 5-FU-DMDOPE konjugátot [5-fluor-uridin-5'-foszforsav(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter] 5-FU-MP-vé [5fluor-uridin-monofoszfát] és DMDOP-vé hasítja.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti LCE, azzal jellemezve, hogy leukocitákból, monocitákból, daganatos sejtekből, vesesejtekből, limfocitákból, az immun/nyirokrendszer sejtjeiből vagy makrofágokból nyerhető.
3. 3. Elkülönített szubcelluláris rendszerek in vitro vizsgá lati eljárások végrehajtásához, azzal jellemezve, hogy a szubcelluláris rendszerek az 1. vagy a 2. igénypont szerinti enzimmel vannak dúsítva.
4. 4. Eljárás olyan vegyületek fellelésére vagy azonosítására, amelyek az 1. vagy a 2. igénypont szerinti LCE szubsztrátjaként vagy ligandjaként szerepelnek, azzal jellemez ve, hogy az eljárás külön-külön vagy együtt a következő lépése két foglalja magában:

   a) elkészítjük az enzimet,

   b) az enzimet inkubáljuk a vegyülettel,

   c) alkalmas rendszerrel kimutatjuk a hasítási termékeket.
5. 5. Eljárás olyan vegyületek fellelésére vagy azonosítására, amelyek az 1. vagy a 2. igénypont szerinti LCE aktivátoraként vagy inhibitoraként szerepelnek, azzal jellemezve, hogy az eljárás külön-külön vagy együtt a következő lépéseket foglalja magában:

   a) elkészítjük az enzimet,

   b) az enzimet inkubáljuk az anyaggal,

   c) hozzáadunk egy szubsztrátot vagy ligandot,

   d) alkalmas rendszerrel kimutatjuk az enzimaktivitás változását .
6. 6. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti LCE, azzal jellemezve, hogy az L-B-D típusú konjugátoknál, amelyekben L egy lipidszerű csoportot, B egy foszfáthidat vagy egy tiofoszfáthidat és D egy gyógyszertanilag aktív anyagot, illetve B-D egy foszfonát-hatóanyagot jelent, az enzim indukálja az L lipidrész és a -B-D csoport közötti kovalens kötés hasadását.
7. 7. Az 1, 2, vagy 6. igénypont szerinti LCE, azzal jellemezve, hogy az enzim aktivitása az aktivált immunsejtekben, humán leukocitákban, monocitákban, daganatos sejtekben, limfocitákban, vesesejtekben, az immun/nyirokrendszer sejtjeiben vagy makrofágokban lévő konjugát hasításakor a nem aktivált sejtekhez képest legalább kétszer akkora.
8. 8. Egy lipid-származék kovalens konjugátjának és egy gyógyszertanilag aktív anyagnak az alkalmazása gyógyszer előál-85 lításához a -B-D csoport célzott felszabadítására megfelelő célsejtekben, ahol a kovalens konjugát lipidrésze idézi elő a konjugát irányítását a célsejtekhez, a szövetekhez vagy a szervekhez, és a konjugát vagy a -B-D csoport szállítását ezeknek a célsejteknek a sejtmembránján át, a konjugát hasítását az 1., 2., 6. vagy 7. igénypontok bármelyike szerinti membránálló enzim úgy végzi, hogy a -B-D csoport specifikus dúsítása intracellulárisan történik, ahol a konjugát egy L-B-D általános képletű hatóanyag, és L a lipidrészt, B egy vegyértékvonalat, foszfáthidat vagy tiofoszfáthidat és D egy gyógyszertanilag aktív anyagot jelent vagy B-D egy foszfonát-hatóanyag.
9. 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a kovalens konjugát hasadása lényegében a membránon vagy a membránban vagy az illető célsejtekben megy végbe.
10. 10. A 8. vagy a 9. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a célsejtek humán leukociták, monociták, makrofágok, immunológiai sejtek, daganatos sejtek vagy a nyirokrendszer, a vese, a lép, az agy sejtjei.
11. 11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszert olyan adagolóegységben adjuk be, amely a szabad, nem konjugált anyagot tartalmazó beadási formához képest kis egyenértékű mennyiségben tartalmazza a -B-D vagy D konjugált anyagot.
12. 12. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás gyógyszerek előállításához a gyógyszertanilag aktív anyagok szervtoxicitásának csökkentésére.

    • ·· ·

    - 86 13. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás gyógyszerek előállításához gyógyszertanilag aktív anyagok célzott szállítására a vér-agy-korláton át.

    14. A 13. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszertanilag aktív anyagnál orálisan alkalmazható terapeutikumról van szó.

    15. A 8-14. igénypontok bármelyike szerinti L-B-D kovalens konjugát alkalmazása, ahol L a (II) általános képletű csoportot jelenti:

    R¹ —X — CH₂

    R²— Y — CH₂ (II) (CH₂)_mahol

    RÍ egy 1-30 szénatomos, egyenes- vagy elágazó-láncú, telített vagy telítetlen alkillánc, amely adott esetben egyszeresen vagy többszörösen szubsztituálva lehet halogénnel, 5-7 szénatomos cikloalkil-, fenil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-merkapto-, 1-6 szénatomos alkoxi-karbonil-,

    1-6 szénatomos alkil-szulfinil- vagy 1-6 szénatomos alkilszulf onil-csoporttal,

    R² hidrogén, egy 1-20 szénatomos, egyenes- vagy elágazóláncú, telített vagy telítetlen alkillánc, amely adott esetben ···· ·· ·· ·· • · ·

    ....... ► .:..

    - 87 egyszeresen vagy többszörösen szubsztituálva lehet halogénnel, 5-7 szénatomos cikloalkil-, fenil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos alkil-merkapto-, 1-6 szénatomos alkoxi-karbonil-,

    1-6 szénatomos alkil-karbonil vagy 1-6 szénatomos alkilszulfőni1-csoporttal,

    X egy vegyértékvonalat, oxigénatomot, kénatomot, aminokarbonil-, oxikarbonil-, karboxi-amino-, karboniloxi-, a szulfinil- vagy a szulfonilcsoportot jelenti,

    Y egy vegyértékvonal, amino-karbonil-, oxikarbonil-, karbonil-amino-, karboniloxi-csoport, oxigén- vagy kénatom és m értéke 1,2,3,4 vagy 5.

    16. A 15. igénypont szerinti L-B-D kovalens konjugát alkalmazása, ahol R² egy 8-15 szénatomos, egyenes- vagy elágazóláncú alkilcsoportot jelent, amely egy 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal vagy egy 1-6 szénatomos alkil-merkapto-csoporttal szubsztituálva lehet, és különösen oktil-, nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil- vagy tetradecilcsoportot jelent.

    17. A 15. vagy a 16. igénypont szerinti L-B-D kovalens konjugát alkalmazása, ahol m 1-et vagy 2-t jelent.

    18. A 15. vagy a 16. igénypont szerinti L-B-D kovalens konjugát alkalmazása, ahol m egyenlő 1-gyel, X kén-, Y oxigénatom, r! egy dodecilcsoportnak és R² egy decilcsoportnak felel meg.

    19. A 15. igénypont szerinti L-B-D kovalens konjugát alkalmazása, ahol X és Y egy vegyértékvonalat jelöl, R² hidrogénatom, Rl pedig egy 1-30 szénatomos alkilláncot jelent, amely adott esetben szubsztituálva lehet egy 1-6 szénatomos alkilmerkapto-csoporttal.

    20. A 15-19. igénypontok bármelyike szerinti L-B-D kovalens konjugát alkalmazása, ahol B a (III) általános képletű foszfáthidat jelenti:

    -O-[PZ (OH)A]_n (III) amelyben η 1, 2 vagy 3, Z oxigén- vagy kénatom, és A oxigén- vagy kénatom vagy egy vegyértékvonal.

    21. A 15-20. igénypontok bármelyike szerinti L-B-D kovalens konjugát alkalmazása, ahol D vagy B-D egy gyógyszertanilag aktív anyagot jelent, amelyet antivírusos, antiretrovírusos, citotoxikus, citosztatikus, antitumorális, immunszuprimáló vagy immunstimuláló anyagok csoportjából választunk ki.

    22. Eljárás L-B-D konjugátot tartalmazó gyógyszerek előállításához -B-D vagy D anyagok célzott felszabadítására célsejtekben, amely célsejtek tartalmazzák az 1., 2., 6. vagy 7. igénypontok bármelyike szerinti LCE-t (lipid-cleavage-enzym) és a konjugát az L-B-D általános képletű hatóanyag, és L a lipidrészt, B egy vegyértékvonalat, egy foszfáthidat vagy egy tiofoszfáthidat, D pedig egy gyógyszertanilag aktív anyagot jelent, vagy B-D egy foszfonát-hatóanyag, azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépéseket foglalja magában:

    a) kiválasztunk egy gyógyszertanilag aktív anyagot,

    b) a gyógyszertanilag aktív anyagból és egy lipidszerű hordozómolekulából előállítunk egy kovalens konjugátot,

    - 89 ·

    c) előállítunk egy gyógyszerészeti beadási formát, amely hatóanyagként a b) pont szerint előállított konjugátot, valamint további gyógyszerészeti segéd- vagy hordozóanyagokat tartalmaz .

    23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy D vagy B-D a következő anyagcsoportok egyes vegyületeit foglalják magukban:

    antitest; peptid; hormon; toxin; a DNS-be vagy az RNS-be beépülő anyag; tubulingátló; alkiláns; a riboszómákat inaktiváló anyag; tirozin-foszfokináz-inhibitor; differenciálé sí induktor; hormonagonista; hormonantagonista; olyan anyag, amely megváltoztatja a pleiotrop ellenállást a citosztatikumokkal szemben; calmodulin-inhibitor; C proteinkináz-inhibitor; P glikoprotein-inhibitor; a mitokondriálisan kötött hexokináz modulátora; a γ-glutamilciszteintetáz inhibitora; glutation-S-transzferáz-inhibitor; szuperoxid-diszmutáz-inhibitor; az A-E hepatitisz-vírusok inhi bitóra; antiinflammatoricum; antireumatikum; antiflogisztikum; analgetikum; antipiretikum; antiarrhythmikum; kalciumantagonista; antihisztaminikum; a foszfodiészteráz gátlója; sympathomimeticum; parasympathomimeticum; antisenseoligonukleotidok vagy foszfonát-hatóanyagok; ezek prodrug-jai vagy kapcsolódásra képes származékai.

    24. Az L-B-D típusú (I) általános képletű lipidkonjugát, amely a következő anyagok csoportjából származik:

    2-fluor-9-(b-D-arabino-furanozil)adenin-5'-főszfórsav-(3dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propilészter, ·»·· .»

    - 90 2- klór-2'-dezoxi-adenozin-5¹-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter,

    3- (2-dezoxi-3~D-eritro-pentofuranozil)-3,6,7,8-tetrahidroimidazo [4,5-d] [1,3]diazepin-8-ol-5'-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-deciloxi)-propilészter.

    25. Az 1., 2., 6. vagy 7. igénypontok bármelyike szerinti LCE-t' tartalmazó diagnosztikai szer a lipidhasító enzim szubsztrátjai, ligandjai, aktivátorai vagy inhibitorai meghatározási eljárásainak végrehajtására.

    26. Az 1., 2., 6. vagy 7. igénypontok bármelyike szerinti, elkülönített vagy sejtpreparátumokban dúsított LCE-t elegendő mennyiségben tartalmazó szer olyan anyagok fellelésére, amelyek az enzim szubsztrátjaiként vagy ligandjaiként szolgálnak.

    27. L-B-D konjugátot tartalmazó diagnosztikai szer megnövekedett vagy csökkent enzimaktivitás vagy enzimaffinitás miatt bekövetkező patológiai változások meghatározására, amelyek megfelelő megbetegedésekkel vagy betegségtünetekkel járnak, mimellett a konjugát az L-B-D általános képletű hatóanyag, és L a lipidrészt, B egy vegyértékvonalat, foszfáthidat vagy tiofoszfáthidat és D egy gyógyszertanilag aktív anyagot jelent vagy B-D egy foszfonát-hatóanyag.

    3σ ¢+ cLc- < -j- 4 % ív*·'— .M

    A meghatalmazott

    I0S ivó lemzetközi t*gja

    Irány át 113. >, F»x: 34-24-323

    KÖZZÉTÉTELI

    Ή: ooű3_ 1 PÉLDÁNY ' “A¹'

    1/18

    1. ábra

    Maca / [tm János jzabadt (mi ügyvivő az S.B.G./& K. Nemzetközi Szakadt mi Iroda tagja H-1062 BodX ejt, Andríssy út 113 t Telefon: 34-24 950, Fax: 34-24-32:

    ···* • t ···

    2/18

    ΑΖΤ-DMDOPE (μΜ)

    2. ábra

    Ándríuy út 113. Tfelefon: ^930, Fix: 34-24-323

    WO 96/15234

    PCT/EP95/04414

    3/18

    AZT-DMDOPE (μΜ) ábra

    Macby¹ sínbe az S.B.G. &

    Szabadalrjii H-1062 Budape ,

    Telefon: 34-24-j K). Fax: 34-24-Ú23

    WO 96/15234 PCT/EP95/04414

    4/18 specifikus LCE-aktivitás (pmol/mg.perc) kalcium-koncentráció (mM)

    4. ábra íb János iügyvivő Nemzetközi jWda tagja Andrüuy út 113. ~Telefon: 34-24 >30. Fax: 34-24-323

    WO 96/15234

    5/18 ···· ··· * · ··» ·

    PC17EP95/C4414 ©

    H-tOÓ^Budapetf, Andríuy ól 113. Telefon: 34-34-950, Fax: 34-24-323 ·· ··

    WO 96/15234

    PCT/FP95/04414

    6/18

    N C < inkubációs idő (óra)

    WO 96/15234

    PCT/EP95/04414 • ·· ·

    7/18

    WO 96/15234

    PCT/EP95/04414

    8/18

    WO 96/15234

    9/1S

    PCT/EP95/04414

    9. ábra

    H-1062___

    Telefon: 34 '

    7 ^L ^**7™^** I«Mfc tagja , Muyűt ]j 950. Fax: 34-24-3

    WO 96/15234

    PCT/EP95/04414 ··· ·

    10/18

    Eh Οϊ n c inkubációs idő (óra)

    10. ábra azS.B.C. Si_ H-W62Bo· TWefcn/34 . Andris M-950, Fax:

    ··

    WO 96/15234

    PCT/EP95/04414

    11/13

    11. ábra az S.B.G. 4. Szabadalmi H-1062 Budap TUefon: 34-24

    WO 96/15234

    FCT/EP95/04414 ···· ··

    12/18

    WO 96/15234

    PCT/EP95/04414
13. 13/18 specifikus aktivitás (pmol/mg.perc)

    1 34 0 0 e ε I—1 C o 3 0 ΊΤ5 Λ -μ N M 4-) VÖ 0 43 •n C •P ε Φ φ •H <υ cn σ> o ε

    13. ábra

    Mach szaba az S.B.G. &. Szabadak i