JP2005095178A - 脂質切断酵素 - Google Patents

Abstract

【課題】 血液白血球又は単球／マクロファージの細胞膜画分から単離できる膜系酵素の提供。
【解決手段】 ホスホリパーゼＣ活性をもたない脂質切断酵素複合体（LCE)であって、コンジュゲートAZT-DMDOPEをAZT-MP及びDMDOPへと切断せしめるか、又はコンジュゲートFLT-DMDOPEをFLT-MP及びDMDOPへと切断せしめるか、又はコンジュゲート5-FU-DMDOPEを5-FU-MP及びDMDOPへと切断せしめるLCE。
【選択図】 なし

Description

本発明の対象物である脂質切断酵素複合体（脂質切断酵素；LCE)及びそのアナログは先に開示されていない膜酵素である。それは例えばヒト末梢血液白血球又はヒトマクロファージの細胞膜画分から単離される得、脂質様担体分子に結合した薬理的に活性な物質のコンジュゲートを切断して薬理学的に活性な物質又はその一リン酸塩を遊離させる。本発明は、薬理的に活性な物質としてこれらのコンジュゲートを含む医薬剤の製造のためのこの酵素の基質として役立つこれらのコンジュゲートの使用にも関する。その医薬剤は適切な標的細胞における薬理的に活性な物質の特異的な遊離及び蓄積に適している。更に本発明は、この酵素複合体の更なる基質をスクリーニングし、及びLCE アナログを見い出すためのシステムをテストするためのこの酵素複合体を含む試験管内テストシステムに関する。LCE は酵素複合体、単離された酵素、及び潜在的なイソ酵素として理解される。

用いられる治療的に活性な物質の不十分な効能と関係なく、悪性新形成（癌、肉腫、血芽球症、血液の新形成）、炎症性の病気又は自己免疫病、並びに例えばAIDS，ARC (AIDS 関連複合体）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス又は肝炎ウイルスのようなウイルス又はレトロウイルスにより引きおこされる病気の療法はしばしばそれらの極度の副作用を伴う。この効果は、用いられる薬理的に活性な物質の不十分な生体内選択性又は限定された治療範囲のためである。薬理的に活性な物質の有利な薬理的試験管内特性は、しばしば生体内条件に移され得ない。

それゆえ、何年も、治療範囲に関して改良された特性を有する新しい物質を提供するために薬理的に活性な物質の化学構造を改良するための試みが行われてきた。更に新しい投与の医薬形態が、その治療作用を示すことが意図されるその作用の部位に特異的に活性物質を輸送する目的と共にしばしば開発されている。それは特に健康な細胞との要求されない相互作用を避けることが意図される。対応する表面抗原を有する腫瘍細胞の場合、例えばこれらの特有の表面抗原を認識し、これにより癌細胞に選択的に結合する抗体が作られている。その抗体は、癌細胞に結合した後、毒素が遊離され、癌細胞が死ぬように適切な毒素で修飾される。治療範囲を改良するための他のかわりのものは、活性物質の溶解度又はコンパチビリティーが改良されるように、例えば酸もしくは塩基付加塩を形成すること又は単純なエステル（例えば脂肪酸エステル；J. Pharm. Sci. 79, 531 (1990))を調製することにより薬理的に活性な物質の少しの修飾により潜在的な活性物質の物理的特性を変えることである。これらの少し化学修飾した化合物は、体液との接触又は肝臓（第１の通過代謝）において、それらはほとんど直ちに実際に治療的に活性な薬剤に転化されるので、いわゆる“プロドラッグ”としてしばしば言及される。

本発明の基礎をなす技術的問題は、薬理的に活性な物質の投与のための標的である細胞上又はその中の可能な限り特異的に発生する新しい標的を見い出すことであった。その標的は、これらの標的細胞に可能な限り特異的に輸送され、これらに結合して取り込まれるように適切な医薬的に活性な物質と相互作用すべきである。この場合、その医薬的に活性な物質は２つの構成物からなるべきである。それは、認識の原因となり、標的と相互作用する第１の構成物（リガンド度特異的部分）と、標的分子に特異的に結合した後その活性を進展させるのみである実際の活性物質である第２の構成物（活性物質特異的部分）であり、その実際の活性剤又はその一リン酸塩は細胞内で切断される。これは、健康な細胞が薬理的に活性な物質により逆に影響を受けず、要求されない副作用が実質的に避けられるように体液中の薬理的に活性な物質の要求されない遊離を避けるべきである。これに関連して、医薬形態の製造のためにこの目的のために用いられる医薬的に活性な物質は、一方で標的のためのリガンドとして働き、他方で実際の活性薬理剤を含むべきであり、それによりこれは、この様式において治療範囲を大きく改良することが意図される既に周知である医薬的に活性な構造にも特に基づき得る。

驚くことに、LCE が標的として適していることが見い出された。ここでLCE は、特にヒト末梢血液白血球、マクロファージ、腎臓、副腎もしくは卵巣の細胞、リンパ系もしくはリンパ様器官の細胞又は脳の細胞上の悪性、活性化又はウイルス感染した細胞上又はその中に主に位置する。以下の記載において、この酵素複合体及びそのアナログはLCE としても略記される。驚くことに、LCE は全ての器官にわたって均一な統計的分布を示さないが、薬理的に活性な物質の投与のための標的として考慮に入れられる特定の細胞の膜において主に観察される。心臓、骨髄及び肝臓細胞において相対的に極めて低い酵素活性が見い出される。LCE を単離するのに用いられる細胞のホモジネート及び膜画分、器官又は組織はLCE の異なる特異活性又はアフィニティーを有し、ここでその特異活性又はアフィニティーは非活性化細胞と比較して活性化された細胞において大きく増加されている。これは、ヒト末梢血液白血球、リンパ球及び顆粒球、並びに例えば単球／マクロファージのようなヒト及び非ヒト並びにネズミ単核細胞について証明され得る。

驚くことに、LCE の特徴は、基質としての脂質様の化合物を、その脂質骨格とその結合に共有結合した薬理的に活性な物質のリンカー構造との間で切断することである。このような基質は、式Ｉ：
Ｌ−Ｂ−Ｄ （Ｉ）
（ここにＬは脂質残基を示し、結合Ｂ及びＤは薬理的に活性な基質を表すか、又はＢ−Ｄは活性な基質表現型を示す）により表され得る。驚くことに、式Ｉの医薬的に活性な物質は薬理的に活性な遊離又は未修飾の基質Ｄ又は−Ｂ−Ｄと比較してより大きな治療範囲を有する。更に、それらは体の中の保持時間、バイオアベイラビリティー又は薬理的に活性な物質の重大な因子（例えば血液−脳バリアー、細胞膜等）としてしばしば知られる膜透過性をしばしば改善する。それゆえ、式Ｉの基質は薬理的に活性な物質のための担体システム（担体）として働く。式Ｉのコンジュゲートはその機能に関して細胞内薬剤貯蔵体、薬剤標的体及び薬剤送出システムとして言及され得る。それらの効果は、薬理的に活性な物質又はそのプロドラッグ形態が経口投与後に細胞内で遊離され、この遊離が体の全ての細胞、器官又は組織内で非特異的におこるばかりでなく細胞膜内に又は部分的に細胞内にもLCE を含むこれらの細胞内でむしろ特異的におこる。しかしながら、血液、血清又はリンパ液のような体液を通して、又は肝臓を通しての基質の輸送の間に切断はまだおこらず、各々の標的細胞上又はその中でのみおこることに特に驚かされる。この様式において、腎臓による切断産物の要求されない排出又は肝臓における基質の切断が避けられ、主要割合の活性物質が各々の標的細胞に輸送される。先に既に言及されるように、このような細胞は、特に、例えば血液白血球、リンパ球、マクロファージ及び免疫学的リンパ系の他の細胞集団のような薬理的に活性な物質の投与のための標的として考慮に入れられる病態生理的又は生理的に活性化された細胞である。これらは特に、各々の病気の過程において病理的、生理的、病態生理的又は症候的役割を果たす活性化細胞（例えばマクロファージ、顆粒球、リンパ球、白血球、血小板、単球等）である。

LCE は以前には開示されていない酵素複合体である。特にそれは基質として（以下にAZT-DMDOPEとして略記される) 化合物（３′−デオキシ−３′−アジドチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステルを切断して３′−デオキシ−３′−アジドチミジン−モノホスフェート及び（３′−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロパノール（DMDOP)を形成する。LCE の更なる好ましい基質は、３′−デオキシ−３′−フルオロチミジン−５′−モノホスフェート及びDMDOPに切断される化合物（３′−デオキシ−３′−フルオロチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルヒステル（FLT-DMDOPE）である。あるいは、（５−フルオロウリジン）−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル（５−FU-DMDOPE)も（５−フルオロウリジン）−５′−モノホスフェート（５-FU-MP）及びDMDOP に切断される。

作製されているLCE を含む調製物はホスホリパーゼＣを含まない。これは、LCE 活性の異なるカチオン依存性により、及びLCE を阻害しないホスホリパーゼＣ特異的インヒビターにより証明されている。

好ましくは種々のヒト細胞タイプの細胞ホモジネート、膜及び細胞質画分によるAZT-DMDOPEの代謝回転速度を測定するための酵素アッセイが確立された（実施例６）。

そのテスト原理はAZT-MP及び対応するチオエステル脂質部分へのLCE による親基質の切断に基づく。（¹⁴C)-AZT-DMDOPE 及び非放射能標識AZT-DMDOPEがこのために用いられた。チオエステル脂質代謝物DMDOP は混合物から抽出され（実施例７）、放射能標識された物質の量は脂質シンチレーションアナライザーで測定された、規定された量の（¹⁴C)-AZT-DMDOPE をその酵素アッセイに用いたので、酵素による切断の代謝回転速度を決定することが可能であった。

その酵素は、好ましくは、PHA もしくは他の刺激物（例えばサイトカイン等）により先に活性化されている末梢血液白血球から、又はネズミ腎臓細胞から単離される。予備的研究において、SDS-PAGE法により約 120,000〜160,000 の分子量が測定された。この酵素を含む細胞は、それらをAZT-DMDOPE又はFLT-DMDOPEの溶液で適切なテスト条件下で混合し、例えば薄層クロマトグラフィー法により、又は放射能標準サンプルの場合、シンチレートグラフィック法（実施例４〜７を参照のこと）により、切断産物 AZT−モノホスフェートもしくは FLT−モノホスフェート又はDMDOP を検出することにより、簡単に同定され得る。生化学的に関連したホスホリパーゼＣ又はＤと対照的に、LCE はホスホリパーゼＣ又はＤの周知のインヒビターにより阻害されず、更にホスホリパーゼＣ又はＤのアクティベーターにより活性化されない。ホスホリパーゼＣと対照的に、その酵素は物質Ｄ609 （トリシクロデカン−９−イル−キサントゲネート；C₁₁H₁₅OS₂K）により活性化され、他方Ｄ609 はホスホリパーゼＣを阻害する。

その非リン酸化形態において、細胞内AZT はウイルスの逆転写酵素に対して阻害効果を有さない（Nakashima et al., 1986, Antimicrob. Agents Chemother. 30, 933-937; Mitsuya et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7096-7100)。チミジンの構造的アナログは、細胞内酵素チミジンキナーゼ、チミジレートキナーゼ及びピリミジンヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（Yarchoan et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321, 726-738; Toyoshima et al.,1991, Anal. Biochem. 196, 302-307)による連続的リン酸化によりAZT-MP及びAZT-DPを通して治療的に活性なRT阻害性AZT-TPに転化される。チオエステル脂質AZT コンジュゲートとしてのAZT-DMDOPEは、細胞内酵素による切断によりAZT に、又は直接、既にリン酸化された形態のAZT-MPに転化される。実施例８において、リン酸化されたAZT 及びリン酸化されていないAZT の細胞内濃度は等効力濃度のAZT-DMDOPE及びAZT と共にインキュベーションした後に決定される。

更に酵素複合体及びその類似体は種々の種（例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、サル）において均一な統計的器官分布を示さないが、式Ｉの切断可能コンジュゲートのための標的細胞として働く特定の細胞、器官、及び組織の膜内でのみ見い出される。これらの酵素の天然の基質はまだ未知である。細胞質画分において、LCE 活性は常に検出限界未満又はちょうど検出限界である。極めて低い活性が例えば骨髄細胞においても見い出され、それはLCE の基質として用いられる式Ｉの医薬的活性を物質の極めて低い骨髄毒性又はその完全な欠如さえ示す。

LCE 活性は、線形的蛋白質及び時間依存性、金属カチオンに対する特異的依存性（Ca²⁺, Zn²⁺及びMn²⁺による阻害）及び古典的ミカエリス−メンテンの反応速度（基質依存性）を示す（実施例９）。活性化細胞中の酵素複合体のより高い活性に加えて、これらの条件下においてLCE のその基質へのより高いアフィニティーもある。

膜画分から相当に豊富にされた単離されたLCE 又はLCE は、新しい潜在的に切断可能な基質について、又は自然に発生する基質についてスクリーニングするのにも用いられ得る。この方法で見い出された基質は、次に基質の認識及びLCE への結合のために必要とされるそれらの本質的構造的特徴に関して更に広範囲に研究され得る。このように同定された構造特性は、次にこれらの本質的特徴並びに医薬的に活性な物資に結合するのに適した適切な官能基を含む化学修飾された基質を形成するのに用いられ得る。

これは、脂質切断酵素のインヒビター又はアクティベーターについてスクリーニングすることも可能にする。

単離され、又は相当に豊富にされた酵素は、例えば脂質切断酵素活性の増加もしくは減少が試験管内もしくは生体内で病理的変化を導く場合、又は対応する病気もしくは病気の症状がこれらの病理的変化と関連する場合に診断に用いられ得る。

LCE は、医薬的に活性な物質が患者に投与される場合にこれらの基質の切断を検査するのに用いられ、結果としてこれらの患者における治療代謝物の特定の及び個々の適合性を検査する（薬剤モニター）のに用いられる診断剤を製造するのにも用いられ得る。

組換えLCE は、LCE 又はLCE フラグメントのアミノ酸配列を決定し、適切に作製されたオリゴヌクレオチドプローブでヒト又は他の哺乳動物遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより、十分に確立された方法により作製され得る。次にその見い出された遺伝子は、原核又は真核細胞系において適切なベクターにより発現される。次に組換えLCE は蛋白質化学において周知の方法（例えばManiatis, Molecular Cloning を参照のこと）により精製され得る。

LCE の特有の特徴は、それが一般式Ｉ：

（ここで、Ｌは脂質成分を表し、Ｂは結合を表しＤは医薬的に活性な物質を表すか又はＢ−Ｄは活性物質ホスホネートを示す）の切断化合物であることである。脂質成分とリン酸残基との間に極めて特異的な切断がおこる。その分子内の他の官能基における式Ｉの化合物の非特異的切断は観察されない。

これに関連して、式Ｉのコンジュゲートの脂質成分Ｌは式II：

（ここで、Ｒ¹ は、ハロゲン、Ｃ₅ 〜Ｃ₇ シクロアルキル、フェニル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシ、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルキルメルカプト、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシカルボニル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルキルスルフィニル又はＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルスルホニル基により１回又は数回任意に置換され得る１〜30炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和アルキル鎖であり、
Ｒ² は、ハロゲン、又はハロゲン、Ｃ₅ 〜Ｃ₇ シクロアルキル、フェニル、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシ、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルキルメルカプト、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシカルボニルもしくはＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルスルホニル基により１回もしくは数回任意に置換され得る１〜20炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和アルキル鎖であり、
Ｘは単結合、酸素、硫黄、アミノカルボニル、オキシカルボニル、カルボキシアミノ、カルボニルオキシ、カルボニルアミノ、アミドカルボニル、スルフィニル又はスルホニル基を表し、
Ｙは単結合、アミノカルボニル、オキシカルボニル、カルボキシアミノ、カルボニルオキシ、カルボニルアミド、アミドカルボニル、酸素又は硫黄原子であり、そしてｍは１〜５の間の整数を表す）
の残基を表す。

一般式IIにおけるＲ¹ は、好ましくは、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシ又はＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルメルカプト基により更に置換され得る直鎖又は分枝鎖のＣ₈ 〜Ｃ₁₅アルキル基を示す。Ｒ¹ は特にノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル又はテトラデシル基を表す。メトキシ、エトキシ、ブトキシ及びヘキシロキシ基が好ましくはＲ¹ のＣ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシ置換基として考慮される。Ｒ¹ がＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルメルカプト残基により置換されるなら、これは特に、メチルメルカプト、エチルメルカプト、プロピルメルカプト、ブチルメルカプト及びヘキシルメルカプト残基として理解される。

Ｒ² は好ましくは、Ｃ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシ基又はＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルメルカプト基により更に置換され得る直鎖又は分岐鎖のＣ₈ 〜Ｃ₁₅アルキル基を示す。Ｒ² は特に、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル又はテトラデシル基を表す。メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ及びヘキシロキシ基が好ましくはＲ² のＣ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシ置換基として考慮される。Ｒ² がＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルメルカプト残基により置換されるなら、これは特にメチルメルカプト、エチルメルカプト、ブチルメルカプト及びヘキシルメルカプト残基として理解される。

Ｘは好ましくは、硫黄、スルフィニル又はスルホニルでありＹは酸素である。脂質成分Ｌ中のヘテロ原子Ｘ及びＹは、薬理的に活性な物質の対応するより迅速な除去を伴う対応するリゾレシチン誘導体又はグリセロールエステルを形成する加水分解切断が血清中で又は肝臓内で既におこっているだろうので（第１の通過効果）、特定の場合、カルボン酸エステルにより置換されるのみである。この適用のチオエステル脂質及びエーテル脂質（Ｘ，Ｙ＝Ｏ，Ｓ）は、ヒトを含む種々の種の血清中でこの切断を示さない。

Ｘ及びＹが単結合であり、Ｒ² が水素であり、そしてＲ¹ がＣ₁ 〜Ｃ₆ アルコキシ又はＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルメルカプトにより任意に置換され得るＣ₁ 〜Ｃ₃₀アルキル鎖を表す化合物も好ましい。

ｍは好ましくは１又は２であり、特に好ましくは１である。

結合Ｂは単結合を表すか、又は式III ：
−O−［(PZ)(OH)A］_n − （III ）
（ここで、ｎは１，２又は３であり得るが、好ましくは１又は２、特に１であり、ＺはＯ又はＳのいずれかであり、そしてＡはＯ，Ｓ又は単結合であり、好ましくはＯである。

脂質成分Ｌ及びホスフェート結合Ｂは、Ｌが好ましくは式IIの残基を表し、Ｂが好ましくは式III のホスフェート結合である先に記載の意味を有する。式III のホスフェート結合は、ｎ＝１であるものが特に好ましく、式IIの脂質成分は、Ｒ¹ 及びＲ² が８〜15炭素原子を有するアルキル残基を表し、Ｘが硫黄でありＹが酸素であるものが特に好ましい。更に、ホスホネートとしてのＢが活性物質の構造の構成物である化合物が好ましく、この場合、ｎ＝１で、Ａは単結合である。

（式Ｉにおけるホスホネートの場合にＤ又はＢ−Ｄと呼ばれる）“薬理的に活性な物質”という言葉は、本願において、法律上の医薬的意味の範囲内で活性な物質を表す。この活性物質は医薬の権威者らにより既に導入され、認可されている医薬剤の活性物質又は現在、医薬剤として登録されている活性物質であり得る。“薬理的に活性な物質”の定義は、１又はいくつかの官能基（例えばＤが例えばヒドロキシ又はアミノ基のような脂質担体成分Ｌに結合することを可能にするような基）を導入することにより化学的に修飾され得る活性物質ノ誘導体も含む。その定義は、生理的に活性でもある活性物質Ｄから形成されたプロドラッグ形態も含む。その臨床的開発が要求されない副作用のため中止され、もしくは開始されないこと、又は治療に要求される量の投与が高い危険性に関連し、もしくは制御下で得ることが実質的に不可能である薬理的に活性な物質Ｄが考慮に入れられる。

驚くことに、活性物質のホスホネートの場合における薬理的に活性な物質Ｄ又はＢ−Ｄの治療範囲は、その物質が脂質様担体分子に結合される場合に重大に改良されることが見い出された。この方法で調製された複合体は、投与の医薬形態の製造のための活しい活性物質として働く。全体のその結合は、形成された薬剤送出輸送システムのため、薬理的に活性な物質が標的細胞内に局在化し、これにより薬理的に活性な物質の効能が増加されるので、生体内での医薬的に活性な物質Ｄ又はＢ−Ｄの活性を増加させる。これは、一方で投与されなければならない薬理的に活性な物質の量が削減され、又は他方で同じ効果的量を保持しながら薬理的効果の増加が達成されることを意味する。

薬理的に活性な物質Ｄ又はＢ−Ｄの化学構造は、その物質がそれらの物理的又は化学的特性に関して変化させられ、例えばより高い又はより低い疎水性を有するか、それらの治療効果に関して未修飾の物質Ｄ又はＢ−Ｄと同じ特性を本質的に有するように更に修飾され得る。特に、物質Ｄが、適切なブリッジにより脂質成分Ｌに結合され得るように官能基の導入により化学的に修飾される場合に有利である。これは、例えばリン酸基Ｂにより脂質Ｄに結合した水酸基の導入により達成され得る。

その薬理的に活性な物質Ｄ又はＢ−Ｄは、生物的効果を有する化学的又は生物的な物質（抗体、ペプチド、蛋白質、ホルモン、毒素等；INDEX NOMINUM, International Drug Directory, Medpharm)、並びにその官能基（例えば水酸基）の導入により化学的に修飾された誘導体である。必要条件は、薬理的に活性な物質又はそのプロドラッグ形態が、脂質切断酵素によるリポヌクレオチドの切断によりこの内因性酵素により活性化されることである。これに関連して、LCE による切断の後に薬理的に活性な物質のモノホスフェートとしての中間産物として生体内で作用し、そして例えばヌクレオシドモノホスフェートのような細胞の酵素によりヌクレオシドトリホスフェートに更にリン酸化されるか、又は切断されて遊離した薬理的に活性な物質を形成する薬理的に活性な物質が好ましい（実施例６を参照のこと）。

本発明の理解内で、試験管内で効果的であるが治療範囲内で生体内である全ての薬理的に活性な物質、即ちホスフェートへの共有結合のための化学的官能基を有する狭い治療範囲の全ての物質が考慮される。更に、最初はそれらの薬理的に活性な形態において官能基を含まないが、その物質の効果を失うことなく化学修飾により導入されるものを有し得るこれらの物質も用いられ得る。

これらの薬理的に活性な物質は、好ましくは、（ヌクレオシドの場合のような）リン酸化後のそれらの活性形態又はその活性物質のホスホネートに通常達する脂質残基Ｌとの接合に用いられる。次に薬理的に活性な物質のホスフェートがコンジュゲートの酵素による加水分解によりコンジュゲートから遊離される。リン酸化された物質の遊離は、この過程が純粋な薬理的に活性な物質をリン酸化するための必要な酵素（キナーゼ）を通常有さない細胞内でもおこり得るので、特に重要である。LCE により細胞内又は細胞膜内で遊離された接合された薬理的に活性な物質は、例えば細胞静止、細胞毒性、抗腫瘍、抗ウイルス、抗レトロウイルス、免疫抑制又は免疫刺激効果を有し得る。

例えば後に腫瘍増殖を遅くさせるその作用に大きく影響を与えない官能基の導入により結合することができる誘導体に任意に転化され得る薬理的に活性な物質Ｄとして適した化合物は、DNA 及び／又はRNA 内に介在する物質であり、トポイソメラーゼＩ及びIIを阻害する物質であり、チューブリンインヒビターであり、アルキル化剤であり、リボソーム不活性化化合物であり、チロシンホスホキナーゼインヒビターであり、分化インデューサーであり、ホルモンであり、ホルモンアゴニストもしくはホルモンアンタゴニストであり、細胞静止剤に対する多面的耐性を変化させる物質であり、カルモジュリンインヒビターであり、プロテインキナーゼＣインヒビターであり、Ｐ−グリコプロテインインヒビターであり、ミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼのモジュレーターであり、γ−グルタミルシステインシンセターゼもしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのインヒビターであり、スーパーオキシドジスムターゼのインヒビターであり、HIV-1 及びHIV-2 の逆転写酵素のインヒビターであり、又は肝炎ウイルスＡ−Ｅのインヒビターである。

薬理的に活性な物質Ｄ又はＢ−Ｄは抗炎症、抗リウマチ、消炎、鎮痛、解熱作用を有し得る。それは更に抗不整脈剤、カルシウムアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、ホスホジエステラーゼのインヒビター又は交感神経作用剤もしくは副交感神経作用剤であり得る。

短い半減期を有する全ての物質、特に異なる器官、組織もしくは細胞半減期、不十分なバイオアベイラビリティー、即ち不十分な吸収、高い肝臓切断性もしくは脂質排除性、不十分な膜透過性（例えば細胞膜、血液−脳バリアー）、骨髄毒性又は他の限定的器官毒性（例えば心臓毒性、肝臓毒性、腎毒性、神経毒性等）を有する化合物であって、その生体内活性濃度が極めて低いものが薬理的に活性な物質Ｄ又はＢ−Ｄとして適している。更に、標的細胞の細胞核と特異的に相互作用し、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、DNA フラグメント及び遺伝子療法に用いられ得るもののようなDNA 又はRNA レベルにおいて分子過程を妨害するこれらの物質が適している。

式Ｉにおける薬理的に活性な物質Ｄは、例えば AZT（アジドチミジン）、FLT （フルオロチミジン）、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、６−MPR 、フルダラビン、グラドリブン、ペントスタチン、ara-C, ara-A, ara-G, ara-H, Acyclovir, Ganciclovir、ドキソルビシン、４′−エピ−ドキソルビシン、４′−デオキシ−ドキソルビシン、エトポシド、ダウノマイシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Taxol 、ユルヒチン、メルファラン、３′−デオキシ−２−フルオロ−アデノシン、FdA 、５−エチニルウラシル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシド、５−プロピニルウラシル−９−β−Ｄ−アラビノ−フラノシド、d4T ，ddV, ddI, ddA, d2T, ２′−デオキシ−２′，２′−ジフルオロシチジン、５−トリフルオロメチル−２′−デオキシウリジン、５′−クロロ−２′，３′−ジデオキシ−３′−フルオロウリジン、３′−デオシキ−３′−フルオロミオイノシトール、ネプラノシンＡ、リバビリン、ミオイソシトール、フィアルウリジン、3TC (Lamivudine)、ドキシフルウリジン、Tegafur 、ハイペリシン、シュードハイペリシン、Usevir, Famciclovir, Penciclovir, Foscarnet, Carvedilol 、アクチノマイシンＡ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、フロキシウリジン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ストレプトゾトシン、ビンデシン、ネチルマイシン、アミカシン、ゼンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシンＡ、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、プリカマイシン、パパマイシン、アンホテリシンＢ、バンコマイシン、イドクスリジン、トリフルリジン、ビダラビン並びにモルフィン、プロスタグランジン、ロイコトリエン又はシクロスポリンである。更にテルフェナジン、デキサメタゾン、テルブタリン、プレドニゾロン、フェノテロール、オルシプレナリン、サルブタモル、イソプレナリン、ムスカリン、ブプラノロール、オキシフェンブタゾン、エストロゲン、サリチル酸、プロプラノロール、アスコルビン酸、スポンギアジオール、ジクロフェナック、イソスポンギアジオール、フルフェナム酸、ジゴキシン、４−メチル−アミノフェナゾン、アロプリノール、セオフィリン、エポブロステノール、ニフェジピン、キニン、レセルピン、メトトレキセート、クロロアンブシル、スペルグアリン、イブプロフェン、インドメタシン、スルファサラジン、ペニシルリナミン、クロロキノン、アザチオプリンも考慮に入れられる。

式Ｉ中の薬理的に活性な物質Ｂ−Ｄは、例えば、PMEA及び他の非環式ヌクレオシドホスホネートアナログ、キノリン−ホスホン酸、MP-101、ホステジル、HAB-439 、２−アミノ−７−ホスホノヘプタン酸、ホスホサル、ホスフェニトイン、アトルイノシトール、シプラテート、ジフィシジン、ホスキドン、アラホスファリン、ホテウムスチレ、エトポシド、encyt/E 、４−オキソ−Ｓ−ホスホノ−Ｄ−ノルバリン及び他のNMDA−アンタゴニストホスホネートである。

好ましい薬理的に活性な物質は、例えば、マルチコトロピン、カルシトニン、デスモプレッシン、ゴナバトロピン、ゴセレリン、インスリン、ジプレッシン、β−メラノトロピン、α−メラノトロピン、ムラミルジペプチド、オキシトシン、バソプレッシン、FK-506、オクトレオチド又はエナルキレンである。

先に言及される薬理的に活性な物質及びそれから調製されるべきコンジュゲートは例を示すのみであり、本発明の考えを限定しない。

式Ｉの化合物及びその製造方法は、例えば、出願WO 92/03462, WO 93/16092, WO 93/16091, WO 94/03465, PCT/EP94/02123, DE 4402492, DE 4418690 as well as for example in WO 91/19726; EP O 350 287; US 5,223,263; US 5,194,654; US 4,921,951; US 4,622,392; US 4,291,024; US 4,283,394に記載される。抗ウイルス的に有効なヌクレオシド脂質誘導体（ジアシルグリセロールヌクレオシド）及びそのリポソーム形態での使用の場合はEPO 350 287 及び US 5,223,263 に記載される。網内細胞系(RES) の細胞、例えばマクロファージ及び単球によるリポソームの形態における物質の取込みが可能なはずである。

EPO 595 133 から知られるジアシルグリセロールコンジュゲートの生体内治療効果がWO 92/03462 からのチオエーテル又はエーテル脂質コンジュゲートに優ることは、適切な比較実験により示すことが可能である。これは、作用の部位でおこるだけではない脂質酸エステルの非特異的加水分解のためである。対照的に、加水分解不可能なチオエステル及びエーテル残基は、生物活性を有する物質又は適切な中間産物が特有の酵素(LCE）により標的組織の膜内で、又は細胞内で遊離されるだけであるので、重大な利点を示す。

式Ｉのコンジュゲート（Ｌ−Ｂ−Ｄ）は、非接合の薬理的に活性な物質Ｄ又はＢ−Ｄと比較して重大な利点を示す。薬理的に活性な物質に共有結合した特定の担体（Ｌ−Ｂ−又はＬ）は、不十分に吸収された薬理的に活性な物質のバイオアベイラビリティー、潜在的毒性活性分子の許容量、迅速に排除され又は代謝される医薬剤の保持時間並びに不十分な膜透過性を有する化合物の膜透過性（例えば血液−脳、細胞等）を改善する。担体及び薬理的に活性な物質Ｄ（又はその誘導物質）へ又は担体及び薬理的に活性なホスフェート物質（Ｄ−モノホスフェート）又はホスホネートＢ−Ｄへの生体内酵素切断は、通常、血清内でおこらず、細胞内でおこる。更に、主張される効果に本質的であるそのレシチン様構造を有する担体成分は、薬理的に活性な物質の浸透性及び膜透過性を改善し、多くの場合、貯蔵所効果を示す。更に脂質コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの胃腸許容量は純粋な薬理的に活性な物質Ｄのそれよりかなり優れている。その脂質コンジュゲートは、吸収の間に膜構造を通るより優れた透過性も示し、これにより吸収バリアーをより克服することができる。それは、促進された拡散又はあるいは活性化された輸送により、例えば血液−脳バリアーの浸透にも適用される。薬理的に活性な物質単独の投与後より生体内での少い副作用を導く脂肪切断酵素との酵素加水分解により生物活性を有する物質を切断する式IIにより限定されるような脂質成分を有する式Ｉのコンジュゲートが特に好ましい。

更に、生体内分散は血漿及び組織蛋白質へのコンジュゲートのより優れた結合により改善される。コンジュゲートはチオエステル（Ｘ＝Ｓ）からの通常の生体内変化によりスルホキキシド（Ｘ＝SO）に最初に酸化される。しかしながらそれは、チオエステルと比較して等しい効力のスルホキシドの作用は不利な点を示さない。しかしながらそのコンジュゲートからの薬理的に活性な物質のゆっくりとした遊離は、より長期にわたり一定である活性物質の低いレベルを確実にし、これにより効能を改善し、又は毒性副作用を避ける。モノホスフェートの形態における遊離された薬理的に活性な物質はその高い親水性のため細胞の外にもはや浸透して出ることはない。

薬理的に活性な物質の全体の体、細胞及び器官半減期は生物中のコンジュゲートのより長い保持時間のため接合によりかなり伸ばされる。血清中及びいくつかの器官中の切断のためのLCE 活性の欠如のため、ほとんど又は少しだけしか骨髄及び器官毒性が観察され得ない。式Ｉのコンジュゲートが標的器官、組織又は細胞内に特異的に蓄積されることが特に有利である。

式Ｉの化合物は、細胞、器官又は組織中の高レベルの薬理的に活性な物質が要求され、又は利益がある全ての病気のために用いられ得る医薬剤の製造のための活性物質として用いられ得る。“薬剤−貯蔵−送出−標識づけ”と呼ばれるこの輸送システムのための本質的要求は、意図された療法に従って応答する細胞が、活性物質が最初のステップにおいてLCE に結合し、次に活性物質が切断されて細胞膜を通して又は後に部分的に細胞内での輸送のいずれかと本質的に同時に生理的に活性な物質を形成する過程において細胞の内部に細胞膜を通して輸送されるように内部又は外部細胞膜中に脂質切断酵素を有することである。細胞内切断は、特にLCE が細胞内にも位置した場合におこる。本発明の理解において、薬理的に活性な物質の細胞内遊離に関連した活性物質の切断は、生理的又は薬理的に活性な物質のいずれかがこの方法又はこの物質の適切な前駆体（プロドラッグ形態）において直接形成される。適切な標的細胞は、例えば血液白血球(PBL）、単球、腎細胞又はマクロファージ及び免疫学的リンパ系の細胞である。

式Ｉの化合物の効果は特に、免疫調節、副／交感神経遮断／交感神経作用、中枢及び／又は末梢筋肉弛緩；抗血圧、抗低血圧、抗閉塞、鎮痛、消炎、制吐作用、抗炎症、抗アルルギン、ぜん息鎮静、解熱、抗潰瘍、制酸、抗狭心、抗不整脈、抗精神病、抗うつ、鎮痙、抗振せん麻痺、抗ヒスタミン作用、抗ムスカリン作用、抗セロトニン作用、抗ガベリン作用、抗アドレナリン作用、抗コリン作用、グリコシド、変時性、変閾、変伝導、変力、利尿、抗利尿、尿酸排泄、尿酸静止、抗脂質欠乏、抗フィブリノーゲン、抗糖尿病、低血糖、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、抗ケスタゲン、抗骨粗しょう症、骨成長刺激、麻酔性、抗催眠、抗感染、抗生物質、抗結核菌静菌性もしくは造血であり、又はそれらはビタミンを示す。

本発明に従う化合物の１つの有利な効果は、適切な医薬剤又は本願の２つの異なるコンジュゲートの組合せにより増加され得る。

この適用の細胞静止性又は細胞毒性コンジュゲートの効果は、例えば、好ましくは異なる作用のメカニズムを有する化合物が用いられるか、又は抗ウイルスコンジュゲートとの細胞静止又は細胞毒性コンジュゲートの組合せが用いられる場合（例えばAIDSの場合における共力作用）、他の細胞静止又は細胞毒性化合物との組合せにより増加され得る。

そのコンジュゲートの組合せは、１の構成物が細胞静止又は細胞毒性能力を有し、他の構成物が例えば多重の薬剤耐性を克服するか、又は１の構成物がHIV の逆転写酵素を阻害し、他の構成物がそのプロテアーゼを阻害するか、又はその組合せの両方のリポヌクレオチドが交差抵抗性を示さない場合に本発明に従い、特に適切である。式Ｉの化合物及びその医薬的調製物は、他の医薬剤と組み合わせた種々の病気の治療及び診断に適した医薬剤の製造のためにも用いられ得る。

リン酸基のアルカリ、アルカリ土類及びアンモニウム塩は、一般式Ｉの化合物の可能な塩として全てが考慮される。リチウム、ナトリウム及びカリウム塩がアルカリ塩として好ましい。マグネシウム及びカルシウム塩がアルカリ土類塩として特に考慮される。アンモニウム塩は、１〜４炭素原子を有するアルキル残基により、及び／又はアルアルキル残基、好ましくはベンジル残基により４回まで置換され得るアンモニウムイオンを含む塩として本発明に従って理解される。この場合、その置換基は、同じ又は異なり得る。

一般式Ｉの化合物は適切な無機又は有機酸を用いて酸付加塩に転化され得る塩基性基、特にアミノ基を含み得る。考慮される酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸又はメタンスルホン酸である。

一般式Ｉの化合物及び式II及びIII に従う説明に加えて、本願は、その互変異性体及びその無機及び有機酸又は塩基の生理的に許容される塩並びにそれらの製造方法及びこれらの化合物を含む医薬剤もクレームする。

一般式Ｉの化合物は不斉炭素原子を含むので、これらの化合物の全ての光学的に活性な形態及びラセミ混合物も本発明の対象物である。

本願は、新しいリポヌクレオチドにも関する。これらのコンジュゲートの合成は実施例14〜16に例示される。LCE は、式Ｖの２−クロロ−２′−デオキシ−アデノシンコンジュゲート（クラドリビンコンジュゲート）、式VIの９−（β−Ｄ−アラビノ−フラノシル）−２−フルオロアデニンコンジュゲート（フルダラビンコンジュゲート）、式VII の３−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）−３，６，７，８−テトラヒドロイミダゾ〔４，５−ｄ〕〔１，３〕ジアゼピン−８−オルコンジュゲート（ペントスタチンコンジュゲート）も切断する。前記化合物は、それらが極めて優れた効能及び大きな治療範囲を有するので対応するヌチレオシド単独より治療に優れて用いられ得、式Ｉの先に言及される誘導体：

として同じ利点を有する。

本発明において、特に医薬剤を製造するための式Ｉの化合物として次の活性物質が用いられる。

１．（３′−デオキシ−３′−アジドチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
２．（３′−デオキシ−３′−アジドチミジン）−５′−リン酸−（３−ウンデシル−メルカプト−２−ウンデシルオキシ）−プロピルエステル
３．（３′−デオキシ−３′−フルオロチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
４．（３′−デオキシ−３′−フルオロチミジン）−５′−リン酸−（３−ウンデシル−メルカプト−２−ウンデシルオキシ）−プロピルエステル
５．（２′，３′−ジデオキシシチジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
６．（２′，３′−ジデオキシイノシン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
７．（３′−デオキシチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
８．（５′−フルオロウリジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
９．（６−メルカプトプリン−９−β−Ｄ−リボフラノシド）−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
10．（５−トリフルオロメチルウリジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
11．（１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−エチニルウラシル）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
12．（２′−デオキシ−５−プロピニルウリジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
13．２′−（９−｛〔１−ヒドロキシメチル）エトキシ〕メチル｝グアニン）リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル
14．２′−〔９−（エトキシメチル）グアニン〕リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）プロピルエステル

実施例１：
AZT-DMDOPEの酵素切断
10mgの（３′−デオキシ−３′−アジドチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル（AZT-DMDOPE）を 0.5mlの 0.1Ｍ Tris 緩衝液中に懸濁して、酵素（0.5mg ホスホジエステラーゼ及び 0.1mgホスホリパーゼ／ヌクレアーゼ）の添加後37℃で15時間、インキュベートする。次にその溶液を薄層クロマトグラフィーにより検査する。飽和NaHCO₃溶液を５滴加えた後、それを更に６時間37℃でインキュベートし、次にその溶液を薄層クロマトグラフィーにより検査した。

その溶液を、種々の溶出剤を用いる薄層クロマトグラフィーにより可能性ある切断産物（AZT, AZT−モノホスフェート、DMDOP 及び脂質モノホスフェート）のために検査した。

先のテストにおいて次の酵素を用いた。
ａ）バチルス・セレウス（Bacillus cereus)からのホスホリパーゼＣ、2000Ｕ／ 0.5ml, Boehringer Mannheim GmbH
ｂ）キャベツからのホスホリパーゼＤ、 150〜300 Ｕ／mg，Sigma
ｃ）ウシ脾臓からのホスホジエステラーゼ、２Ｕ／mg, Boehringer Mannheim GmbH
ｄ）ヘビ毒液からのホスホジエステラーゼ、Boehringer Mannheim GmbH
ｅ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)からのヌクレアーゼ、15,000Ｕ／mg，Boehringer Mannheim GmbH
ｆ）LCE(脂質切断酵素）

結果：
次の表は、ホスフェート脂質のレベルにおける弱い蛍光の消光がホスホリパーゼＤの場合にのみ見い出されることを示す。標準対照として用いられたａ）−ｅ）の場合は、AZT 又はAZT モノホスフェート形成は検出されなかった。未変換のAZT-DMDOPEは別にして、検出限界内でこれらの実験で更なるスポットは発見されなかった。

実施例２：
LCE 活性に対する種々の酵素インヒビター又はアクティベーターの影響

実施例３：
副次細胞分画
ａ：ホモジネート、膜及び細胞質画分の調製
膜及び細胞質画分の調製のために培養された細胞をポリプロピレンチューブ（50ml）に移し、室温でMinifuge T内で1600rpm で10分、沈降させた。その培養培地の残物を除去するために、その細胞沈降物を冷やしたPBS で３回、洗浄し、１〜５×10⁸ 細胞／mlの細胞密度で溶解緩衝液中にとった。その細胞懸濁液を次に氷上で冷やされたガラスホモジエナイザーに移した。その細胞を、その細胞破壊が逆位相差顕微鏡で任意にモニターしながら、テフロンピストンを数回動かすことにより機械的に破壊した。次にその破壊された細胞をMinifuge T中４℃で1700rpm で10分、遠心して細胞核及び破壊されていない細胞を除去した。その上清を注意深くピペットで除去し、50mM Tris 緩衝液（pH7.5)での10％（ｗ／ｖ）スクロースに希釈した。その細胞ホモジネートをいくつかの部分に分けて−70℃で保存し、又は膜及び細胞質画分を単離するのに用いた。このため、 3.2mlの細胞ホモジネートを氷上で冷却された厚壁ポリカルボネートチューブ(3.2ml）に移し、TLA-100.4 ローターを備えたBeckman テーブルトップ超遠心機中で75,000rpm で４℃で１時間、遠心した。その上清をCombitibピペットで注意深く除去し、直ちに見える膜沈降物を各々、１mlの50mM Tris 緩衝液（pH7.5)／10％スクロースと混合した。その膜沈降物をカニューレ(0.9×40mm）と共にシリンジ（５ml）で粗くホモジナイズした。その粗ホモジネートを組み合わせて、より小さな径のカニューレ(0.8×40mm及び0.45×25mm）を用いて細かくホモジナイズした。その膜及び細胞質画分をいくつかの部分に分け、−70℃で保存した。

溶解緩衝液 50mM Tris pH7.5
70％（ｗ／ｖ）スクロース
50μｇ／ml APMSF
スクロースを溶かすために、緩衝液を撹拌しながら静かに温めなければならない。

ｂ．刺激されたヒト末梢血液リンパ球の血漿膜の単離（Record et al. (1985)， Biochem. Biophys. Acta 8/9 1〜9)
ヒトPBL を、等張密度勾配における遠心により単離し、PHA-M で72時間、刺激した。その細胞を冷やしたPBS で３回、洗浄して培養培地の残りを除去し、細胞数を測定した後、液体Ｎ₂ 中に凍らせ、次に−70℃で保存した。その細胞を凍結させることにより溶解し、緩衝液１中で３回、解凍し、それにより細胞密度を 2.5×10⁸ 細胞／mlに調節した。11mlのPercoll 及び2.13mlの緩衝液２の混合物を、先に70μｌの２ＮのNaOHでpH９に調節されているTi60遠心チューブ内に入れた。血漿膜の単離のために、４mlのホモジネートをその混合物に適用し、次にブレーキ・スイッチ・オフを有するBeckman超遠心機L5 50 のTi60ローター内で39,000rpm で４℃で10分、遠心した。１mlの画分をその遠心チューブの上相からとり、２mlの緩衝液３で希釈した。次にその溶液をTi50チューブ（10.4ml）に移し、Ti50ローターを備えたBeckman 超遠心機L5 50 内で45,000rpm で４℃で45分、遠心分離した培地の残物を除去した。その上清をピペットで除き、分画して、液体Ｎ₂ で凍結して−70℃で保存した。その画分を、蛋白質成分を決定し、アルカリホスフェートの酵素活性を測定することによりキャラクタライズした。

緩衝液１ 100mM KCl
5mM MgCl₂ × 6 H₂O
1mM ATP
2mM （４−アメジノフェニル）−メタン
スルホニルフルオリド（APMSF)
25mM Tris pH 9.6

緩衝液２ 400mM KCl
20mM MgCl₂ × H₂O
400mM Tris pH 9.6
緩衝液３ 100mM KCl
5mM MgCl₂ × 6 H₂O
50mM Tris pH 7.42

実施例４：
LCE アッセイのための基質溶液の作製
[¹⁴C]-AZT-DMDOPE 及び非放射能標識AZT-DMDOPEの混合物をLCEアッセイ中の基質として用いた。

[¹⁴C]-AZT-DMDOPE 保存溶液で開始して、83.27kBq／mlの特異活性を有する溶液が、エタノールでの希釈により調製された。そのエタノール溶液は不活性ガス下で４℃で２ケ月、保存され得た。

別個の混合物中で、物質混合物の非放射能標識構成物を調製した。このために、エタノール中１μmol ／mlの濃度のAZT-DMDOPEの溶液を調製し、超音波プローブと共に氷／水浴中で１分間、30％エネルギー放出で連続的に音波処理した。

放射性及び非放射性AZT-DMDOPEの基質混合物を調製するために、1.67kBq の放射能標識 [¹⁴C]-AZT-DMDOPE 及び 0.7〜５nmolの非標識化合物をこれらのエタノールの溶液から混合物当りガラスチューブ（10ml）に移した。その溶媒をＮ₂ スチーム中でエバポレートし、AZT-DMDOPEを適切な容量の再蒸留した水中にとり、氷／水浴中で冷やしながら、１分間、30％エネルギー放出で連続的に音波処理した。

実施例５：
脂質切断酵素(LCE) アッセイ
時間及び蛋白質濃度に対する酵素切断を検査するために、 200μｌの再蒸留水容量中の５nmolのAZT-DMDOPE及び0.98nmolの [¹⁴C]-AZT-DMDOPE (1.67kBq）をLCE アッセイに通常用いた。ピペッティングスキームを以下の表に示す。

表 AZT-DMDOPEのターンオーバーを測定するためのLCE アッセイのためのピペッティングスキーム

基質濃度に対する酵素切断を検査するために、0.98nmol [¹⁴C]-AZT-DMDOPE 及び0.7nmol AZT-DMDOPE／80μｌの基質保存液をLCE アッセイに用いた。基質溶液の容量を連続的に２倍又は半分にすることにより、種々の基質濃度をLCE アッセイにおいて調整した。その混合物をガラスチューブ（５ml）内に入れ、基質溶液を加えることにより開始した。静かに撹拌しながら、水浴中37℃でインキュベーションを行った。

実施例６：
水性マトリックスからのDMDOP の抽出
LCE アッセイの反応混合物を、適切なインキュベーション期間の後に水浴からとり、 750μｌの２−プロパノールを加えることによりその反応を停止した。

混合した後、室温まで加温された 700μｌのｎ−ヘプタンを混合物に加えた。その混合物を30秒間、再び全体的に混合し、相分離を促進するために室温で3200rpm でMinifuge T中で15分、遠心した。次に 500μｌの上相（ｎ−ヘプタン）を除き、10mgのシリカゲル60Ｈ及び 200μｌのｎ−ヘプタンを含む新しいガラスチューブ（５ml）に移した。その混合物を30秒間、全体的に混合し、シリカゲルを沈降させるために先に記載される条件下で10分間、遠心した。次にその上清から 500μｌをとり、３mlのシンチレーション液と混合した。液体シンチレーションアナライザーで４分間、放射能を測定した。放射能の絶対値を測定するために、 200μｌの基質溶液を３mlのシンチレーション液と混合し、脂質シンチレーションアナライザー中で同じ条件下で測定した。

実施例７：
AZT-DMDOPE及びAZT での試験管内薬物動力学的研究
ａ）AZT-DMDOPE及びAZT と共にインキュベーションした後の刺激した及び刺激されていないヒトPBL 中のAZT 及び／又はAZT ヌクレオチドの細胞内濃度の測定
AZT-DMDOPE及びAZT と共にインキュベーションした後のAZT 及び／又はAZT ヌクレオチドの細胞内濃度を測定するためにヒトPBL を軟膜から単離した。

このために、健康なドナーの軟膜を混合し、 1.077ｇ／mlの密度の等張媒体中での遠心により分画する。単核血液細胞（単球及びリンパ球）は赤血球及び多形核顆粒球より低い密度を有するので、それらは分離媒体とサンプルとの間の境界にリングを形成し、ピペットにより除去され得る。赤血球及び多形核顆粒球の沈降物はそれらの高い密度の結果としてその媒体を通過し、これによりPBL から分離され得る。

細胞増殖を刺激するために、レッド・スカーレット・ランナー（Phaseolus vulgaris）から抽出されたマイトジエンのレシチン抽出物であるフィトヘマグルチニンＡ（ムコ蛋白質)(PHA-M)を用いた。フィトヘマグルチニンはテトラ２−として存在する５のイソレクチンのファミリーである。そのサブユニットは、リンパ球反応性タイプＬ及び赤血球反応性タイプＥからなる。タイプＬはリンバ球表面レセプターに高アフィニティーを有し、これによりマイトジエン特性の原因となる。リンパ球をKPMI1640完全培地III 中５％ CO₂で37℃で72時間、刺激した。その刺激を終えた後、その細胞を細胞数を増加させるためにRPMI1640完全培地IV中で更に24時間、培養した。

AZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度の測定のために、細胞を組織培養フラスコ（50ml／25cm²)中に１×10⁶ 細胞／mlの密度でRPMI 1640 完全培地IIに移し、0.03及び 0.3μｇ AZT／ml（lot 15）及び１又は10μｇ AZT-DMDOPE ／mlの存在下で１〜24時間、インキュベートした。

この場合のAZT-DMDOPE及びAZT の濃度はHIV-1 感染したヒトPBL中のAZT 及びAZT-DMDOPEのために決定された抗レトロウイルス活性についてのIC50値に依存する。

その培養物を次に５％ CO₂で１，３，６及び24時間、37℃でインキュベートした。AZT 及びそのヌクレオチドを次に60％メタノールで抽出した。その抽出されたヌクレオチドを、AZT のみがラジオイムノアッセイにより検出され、それに対応するヌクレオチドが検出され得ないので、アルカリホスフェートで定量的に脱リン酸化してAZT とした。

従って、ラジオイムノアッセイにより測定された細胞内AZT の濃度は、AZT のそれ及びAZT ヌクレオチドのそれと一緒になる。AZT-MP, AZT-DP及びAZT-TPの濃度の別個の定量は行わなかった。刺激されたPBL に基づく実験の観察は、AZT-DP及びAZT-TPと比較してAZT-MPの40倍高い濃度を証明し得た(Arner et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 10968〜10975)。結果として、ヌクレオチド画分はほとんど排他的にAZT-MPからなることが仮定され得る。

刺激されたヒトPBL において、0.03及び 0.3μｇ AZT／ml各々の場合に各々６及び３時間のインキュベーションの後に2.90及び 30.97ng／10⁶ 細胞の最大濃度に達した（図６）。次にその濃度を各々 2.3Ｌ及び 19.88ng／10⁶ 細胞に、インキュベーション期間を増加させながら減少させた。１及び10μｇ AZT-DMDOPE／mlでのインキュベーションの後、AZT 及びそのヌクレオチドの細胞内レベルは全体のインキュベーション期間にわたり連続的に増加した。AZT-DMDOPE及びAZT と共に24時間、インキュベーションした後、細胞内レベルは同一であった。更なる実験において、18〜48時間、AZT-DMDOPEと共にインキュベーョンした後のAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度は同じ能力のAZT の濃度でインキュベーションした後より更に高いことを示すことが可能であった。

刺激されていないヒトPBL の場合、反対の関係が見い出された（図７）、これにより、AZT-DMDOPEと共にインキュベーションした後、AZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度は全体のインキュベーション期間にわたる等しい能力のAZT の濃度でのインキュベーション後より高かった。１及び10μｇ AZT-DMDOPE／mlでのインキュベーョンの後、各々0.62及び4.74μｇ／10⁶ 細胞のAZT 及びAZT ヌクレオチドの最大細胞内濃度に達したが、0.03及び 0.3μｇ AZT／mlでのインキュベーションの後には各々0.10及び0.47μｇ／10⁶ 細胞の濃度が検出された。

BM21.1290Na と共にインキュベーションした後、AZT 及びAZT ヌクレオチドを別個に定量するために、AZT 及びAZT ヌクレオチドの全ての際を細胞内濃度を、アルカリホスフェートでの処理のあるものとないもので測定した。これら実験を刺激したヒトPBL 上で行った。

このために、１及び10μｇ AZT-DMDOPE／mlを含む10⁶ 細胞／mlの密度の細胞懸濁液を５％ CO₂で37℃で６及び24時間、インキュベートした。１及び10μｇ AZT-DMDOPE／mlでのインキュベーションの後に遊離したAZT の最大細胞内濃度を６及び24時間各々後の各々0.03及び0.15μｇ／10⁶ 細胞として検出した。アルカリホスファターゼで処理した後にリン酸化された細胞内AZT ヌクレオチドを更に測定した場合、24時間後に各々3.85及び6.41μｇ／10⁶ 細胞の最大濃度が見い出された。

ｂ．AZT-DMDOPE及びAZT と共にインキュベーションした後のP3X63Ag8.653細胞中のAZT 及び／又はAZT ヌクレオチドの細胞内濃度の測定
チミジンキナーゼ欠如細胞中のAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度の測定は、テスト物質AZT-DMDOPEの細胞内切断についての更なる情報を供する。細胞内AZT はこれらの細胞内のチミジンキナーゼ（TK）の欠如のため、AZT-MPへ転化され得ず、これにより治療に有効なAZT-TPに転化される。AZT-DMDOPEでのインキュベーションの後のAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度の測定は、テスト物質の切断に基づく新たな情報を与える。

このため、0.03又は 0.3μｇ AZT／ml及び１又は10μｇ AZT-DMDOPE／mlを含むRPMI1640完全培地Ｉ中の１×10⁷ 細胞を組織培養プレート（60×15mm）中で６，24及び48時間、インキュベートした。AZT 及びAZT ヌクレオチドを抽出し、アルカリホスフェートで処理
した後、ラジオイムノアッセイによりAZT の濃度を測定した。

本実験のグラフ様のプロットは、AZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度が等しい能力のAZT の濃度でのインキュベーション後よりAZT-DMDOPEでかなり高かったことを示す。これにより、１及び10μｇ AZT-DMDOPE／mlでの６時間のインキュベーションの後、各々0.55及び4.40ng／10⁶ 細胞のAZT 及びAZT ヌクレオチドの最大濃度が達成された（図９）。

0.03及び 0.3μｇ AZT／mlとのインキュベーションの後のAZT 及びAZT ヌクレオチドの最大細胞内濃度を、各々0.03及び0.31ng／10⁶ 細胞として決定した。

リン酸化されたAZT の割合を定量するために、AZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度をアルカリホスフェートでの細胞抽出の処理の前及び後で比較した。１及び10μｇ AZT-DMDOPE／mlでのインキュベーション後のリン酸化されたAZT の物質レベルは、この場合において各々0.48及び2.42μｇ／10⁶ 細胞の値を示した（図10）。AZT のみを測定した場合、24時間後各々0.05及び1.10ng／mlの最大濃度に達した。AZT 及びAZT-DMDOPEとのインキュベーションの後のAZT ヌクレオチドの細胞内濃度の差はテスト物質AZT-DMDOPEのAZT-MPへの細胞内切断により説明される。

ｃ．AZT-DMDOPE及びAZT とのインキュベーション後の刺激化ヒトPBL 中のAZT 及びAZT ヌクレオチドの減少速度
刺激化ヒトPBL を 0.3μｇの AZT／ml又は10μｇのAZT-DMDOPE／mlと24時間インキュベートした。次いで、１×10⁷ 個の細胞をRPMI完全培地Ｉを含む組織培養フラスコ（50ml／25cm²)の中に移し入れた。１，３，６，24及び48ｈ後、AZT 及びAZT ヌクレオチドを細胞マトリックスから抽出した。アルカリホスファターゼによる処理後、AZT の濃度を、ラジオイムノアッセイの助けにより決定した。

実験結果のグラフ図は、細胞をAZT とインキュベートした後、AZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度は急降下し、そして６ｈ後に0.40ng／10⁶ 細胞の一定値に達した。一方、等濃度のAZT-DMDOPEとのインキュベーションにおいては、AZT 及びAZT ヌクレオチドは急降下し、そして３ｈ後、1.80ng／10⁶ 細胞のかなり高い濃度に達し、それにおいて48ｈ一定であり続けた（図11）。非ホスホリル化AZT はPBS による数回の洗浄により細胞から除去してあるため、細胞内の濃度は主としてホスホリル化AZT ヌクレオチドに寄因する。かくして、AZT-DMDOPEとのインキュベーションは、等濃度のAZT と比べ、 4.5倍高い濃度のホスホリル化AZT を供する。AZT-DMDOPE及びAZT とのインキュベーション後のAZT ヌクレオチドの細胞濃度におけるこのような大差はチオエーテル−脂質−AZT コンジュゲートAZT-DMDOPEからAZT-MP及び対応のチオエーテル脂質成分DMDOP に至る直接的な細胞内分解により説明できうる。

実施例８：
AZT-DMDOPE切断酵素／酵素系(LCE) の特性決定
ヒトPBL 及びCEM-SS細胞の細胞ホモジネートによるAZT-DMDOPEの酵素切断についての研究は、AZT-DMDOPEがDMDOP 及びAZT-MPへと代謝されることを示した。LCE の濃度を以下の研究の対象とした。即ち、タンパク質濃度、インキュベーション時間及び二価金属カチオンに対するAZT-DMDOPEの酵素切断の依存性を調べた。様々な基質濃度に対する見かけ上のミカエリス−メンテンパラメーター K_M 及びＶmax の依存性を酵素反応速度実験において決定した。

これらの実験のため、AZT-DMDOPE及び [¹⁴C]-AZT-DMDOPE を基質として用いる酵素アッセイを樹立した（実施例５）。タンパク質及び時間依存式測定においては、一混合物当り５nmolのAZT-DMDOPE及び0.98nmol（1.67kBq)の [¹⁴C]-AZT-DMDOPE を使用した。基質−依存式転換においては、0.98nmolの [¹⁴C]-AZT-DMDOPE 及び 0.7nmolのAZT-DMDOPE／80μｌのストック溶液を使用した。様々な基質濃度を次いで基質溶液の容量で連続式に二倍又は半分にすることにより調整した。

例えば様々なヒト細胞に由来する既知のタンパク質濃度の細胞ホモジネート、細胞質ゾル及び膜画分が酵素源として使用できる。

ａ．AZT-DMDOPEの酵素切断後のDMDOPEの単離及び定量化
AZT-DMDOPEの酵素切断の定量をｎ−ヘプタンによる代謝物DMDOPの二段式抽出及びその後のシリカゲル60Ｈに対する基質AZT-DMDOPEの残渣の収着により実施した。

このため、反応混合物を２−プロパノール及びｎ−ヘプタンと、基質よりも極性の弱いDMDOP でｎ−ヘプタン相にたまる工程において混合した。次いでｎ−ヘプタン相を、基質AZT-DMDOPEの残渣に収着するシリカゲル60Ｈと混合した。その後ｎ−ヘプタン相を遠心によりシリカゲルから分離し、３mlのアクアルーマ（aqua luma)に移し、そしてその中に含まれる放射能ラベルされたDMDOP を液体シンチレーション分析器で５分間にわたり決定した。これらの結果から、基質AZT-DMDOPEからDMDOP に至るパーセンテージ転換及びLCE の比活性を計算することが可能となった。この場合、比活性は使用した細胞調製品のタンパク質１mg当たり、１分間につき生成されるDMDOP の量と定義する。

反応混合物からのDMDOP の選択抽出物をチェックするため、刺激化ヒトPBL の膜画分により最適化実験を実施した。この場合、タンパク質濃度は 100μｇ／混合物とした。タンパク質抜きの混合物を平行して試験した。抽出後、ｎ−ヘプタン相をＮ₂ 気流下でエバポレーションに付し、そしてその残渣をメタノール及び酢酸エチル（１：１，ｖ／ｖ）の混合物に含ませた。

薄相クロマトグラフィーによる分析をIBA 系で実施した。この場合の反応値では、親物質 [¹⁴C]-AZT-DMDOPE のみ検出可能であった。この反応混合物において、物質ピークは移動溶媒の終りにおいて検出され、その前では代謝物 [¹⁴C]-DMDOPE がそのＲ_f 値に基づき同等に同定できた（図12）。DMDOP 物質の直前にあるピークはいづれの既知の化合物にも割り当てることができなかった。それはおそらくDMDOP のチオエーテル脂質成分中の硫黄の酸化により生成される化合物である。従って、ｎ−ヘプタンによる抽出は酵素切断生成物DMDOP を酵素アッセイから単離することを可能にする。AZT-DMDOPEから遊離した代謝物DMDOP の簡単、且つ迅速な定量がかくして確実となった。

ｂ．刺激化ヒトPBL の細胞ホモジネート物、膜及び細胞質ゾルによるAZT-DMDOPEの切断
一連の実験において、刺激化ヒトPBL の細胞ホモジネート物による並びに細胞質ゾル及び膜画分によるAZT-DMDOPEの酵素切断を調べた。

ビシンコニニン酸（bicinchoninic acid) (BCS) 試験の助けによる細胞ホモジネート、細胞質ゾル及び膜画分中のタンパク質濃度の決定後、0.025 〜0.20mgのタンパク質／混合物を使用した。この反応混合物を37℃で２ｈインキュベートし、次いでその生成物DMDOP
をｎ−ヘプタンによる抽出によりその混合物から単離し、そしてLCE の比活性を決定した（図13）。

6.48±0.38（ｎ＝６）及び1.65±0.40pmol・mg^-1・ min^-1（ｎ＝６）の細胞ホモジネート物及び細胞質ゾル画分におけるAZT-DMDOPE切断活性は、 14.23±0.70（ｎ＝６）pmol・mg^-1・ min^-1である膜画分における比活性よりも1.59分の１及び 6.3分の１小さかった。明らかに、膜画分を単離するときにLCE の濃縮が起こる。このような結果に基づき、LCE の酵素パラメーターを決定するための次の実験において膜画分を使用した。

細胞の機械式破砕及びその後の細胞ホモジネートの超遠心分離により得られた膜画分はプラスマ膜及び核膜並びに細胞オルガネラの膜の断片の混合物である。

様々な膜断片はパーコル密度勾配での細胞ホモジネート物の超遠心分離、それに次ぐプラスマ膜マーカーであるアルカリホスファターゼによるその後の特性決定により識別可能であった。

プラスマ膜の単離のため、 2.5×10⁸ 細胞／mlの細胞密度をもつ刺激化ヒトPBL の細胞懸濁物２mlを３回の凍結融解により破砕し、そしてパーコル密度勾配での遠心分離により分画した。遠心物から10本の画分（１ml）をとり、分離媒質の残渣を除き、そして個々の画分中のアルカリホスファターゼの活性を基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて 305nmで測定した。

最大のアルカリホスファターゼ活性は画分８において認められた。残りの画分の吸収ははるかに低かった。これは、画分８におけるプラスマ膜の濃縮を示唆している。LCE 比活性をタンパク質濃度の決定後に各画分について決定した。このため、タンパク質濃度を0.05mg／混合物に調整し、そしてその反応混合物を37℃で２ｈインキュベートした。これにおいて、4.40pmol・mg^-1・min ^-1の最大LCE比活性が画分８において決定された。

その他の全ての画分においては低めの1.10〜1.90pmol・mg^-1・min ^-1の比活性が測定された（図4.3)。最大のLCE 比活性はかくして最大のアルカリホスファターゼ活性を同時にもつ画分において決定された。従って、この発見はLCE が最高量のプラスマ膜断片を有する画分の中にあることを示す。

ｃ．タンパク質濃度に対するLCE 比活性の依存性
更なる研究においては、細胞調整品の上昇していくタンパク質濃度に対するAZT-DMDOPEの代謝回転を決定することを意図した。

このため、刺激化及び非刺激ヒトPBL 並びにヒト血液単球の膜画分を使用した。刺激化ヒトPBL の膜画分によるAZT-DMDOPEからDMDOP に至る転換は 0.025〜0.2mg のタンパク質／混合物を用いたとき、直線状の挙動を示した（図14）。LCE 比活性は 14.23±0.7 pmol・mg^-1・min ^-1（ｎ＝６）であった（図16）。AZT-DMDOPEが非刺激ヒトPBL の膜画分タンパク質により転換されるとき、0.05mgのタンパク質／混合物までの濃度域においてのみ直線関係があった。より高いタンパク質濃度では、もはや直線性はなかった。直線域での代謝回転率から計算したLCE 比活性は14.5±0.32pmol・mg^-1・min ^-1であった（ｎ＝６）。

ヒト血液単球におけるLCE 比活性を決定するため、これらを高張密度勾配で単離した。単球は平均して 1.068ｇ／mlの密度を有し、これは 1.070ｇ／mlであるリンパ球のそれより若干小さい。この密度の差はしかしながら非常に小さく、従って等張勾配でこれらの血
液細胞を分離させることは不可能である。

高張条件下では、リンパ球は単球よりも迅速に水を失い、その密度が上昇する。従って、高張分離媒質において全血又は白血球濃度血漿から単球を単離することが可能である。ヒト血液単球をバッフィーコートから単離することも可能である。このため、単球細胞を密度勾配において等張条件下で分離させ、次いで単球を組織培養フラスコ（175cm²／800ml)の中でその収着力に基づいて分離させる。

フローサイトフルオロメトリー分類の助けにより、これらの細胞の刺激化を、サイズ及び粒度の決定の後、並びに特異的抗体染色の後に付着力により検定することが可能であった。この刺激の結果、組織培養ボトルの底への付着により単離された単球を以降において単球／マクロファージ（刺激化単球）と命名した。

付着によるその単球の際に刺激を受けたヒト単球の膜画分によるAZT-DMDOPEの酵素的代謝回転において、 0.1mgのタンパク質／混合物の濃度に至るまで直線式依存性が認められた（図15）。比活性は 8.8±0.26pmol・mg^-1・min ^-1であった（ｎ＝４）（図16）。単球を高張密度勾配において直接単離したとき、 0.025mgのタンパク質／混合物のタンパク質濃度に至るまでのみ、酵素切断の直線状挙動があった。より高いタンパク質濃度では、基質代謝回転はほぼ一定となった。比活性を非刺激ヒトPBL の膜画分による代謝回転と類似の直線域から計算し、そして 3.2±0.60pmol・mg^-1・min ^-1であった（ｎ＝４）。

まとめると、AZT-DMDOPEを刺激化ヒトPBL 及び単球の膜画分の酵素により転換させたときの方が、AZT-DMDOPEを非刺激細胞の膜画分により転換させたときよりも高いLCE 比活性が認められた（図16）。

ｄ．インキュベーション時間に対するLCE 比活性の依存性
インキュベーション時間に対する実験物質AZT-DMDOPEの酵素切断を酵素源として刺激化ヒトPBL の膜画分により実施した。その反応混合物を37℃で 0.5，１，２，３及び６ｈインキュベートし、そして代謝物DMDOP の量を決定した。受験結果をグラフ上にプロットにより、AZT-DMDOPEのDMDOP に至る転換が 0.5〜６ｈのインキュベーション時間全体にわたって示されることが可能となった（図17）。

ｅ．二価金属カチオンに対するLCE 比活性の依存性
二価金属カチオンに対するLCE によるAZT-DMDOPEの酵素切断の依存性を酵素源としての刺激化ヒトPBL の膜画分により調べた。

二価金属カチオンをLCE アッセイにおいて２mMの濃度で使用した。タンパク質濃度は 0.068mg／混合物に固定した。

EGTAによる実験を平行に行った。EGTAはCa²⁺にとっての特異的な錯形成剤であり、これはホスホリパーゼＣの活性にとって必須である。37℃で２ｈのインキュベーション時間の後、親物質の転換を測定し、そしてLCE の比活性を決定した（以下の表）。

表：EGTA及び二価金属カチオンに対する刺激化ヒトPBL の膜画分によるAZT-DMDOPEの切断依存性（平均±SD，ｎ＝３回の測定値）

EGTA及びMgCl₂ を用いたときに達成される最大の比活性はそれぞれ 10.41±1.37（ｎ＝３）及び 10.34±2.08pmol・mg^-1・min ^-1（ｎ＝３）であった。即ち、測定精度限界内でMgCl₂ による任意の阻害を検出することはできなかった。CaCl₂ を酵素アッセイに用いたとき、6.19±0.26pmol・mg^-1・min ^-1（ｎ＝３）の比活性が決定された。EGTAを含む混合物と比較して、これはLCE 活性の 41.0 ±0.25％（ｎ＝３）の阻害を意味する。ZnCl₂ の場合、測定精度限界内でDMDOP は検出されなかった。ZnCl₂ 及びMgCl₂ はAZT-DMDOPEのDMDOP 及びAZT-MPに至る転換の完全阻害を招く。

ｆ．見かけ上のミカエリス−メンテンパラメーターＫ _M 及びＶmax の決定
LCE についての見かけ上のミカエリス・メンテンパラメーターを決定するため、上昇していく基質濃度に対するAZT-DMDOPEの酵素切断依存性を調べた。

表：刺激化及び非刺激ヒトPBL における並びにヒト単球及び単球／マクロファージ（刺激化単球）におけるLCE の見かけ上のミカエリス−メンテンパラメーターＫ_M 及びＶmax

このため、刺激化及び非刺激ヒトPBL 並びにヒト単球及び単球／マクロファージ（刺激化単球）の膜画分を使用した。反応混合物は 0.068mg／混合物の一定量のタンパク質を含み、そして37℃で２ｈインキュベートした。次いで、代謝物DMDOP の量を決定した。

実施例９：
実験動物
実験物質AZT-DMDOPEの薬理動力学的パラメーターを決定するため、雌のBalb/cマウス（Charles River Wiga, Sulzfeld; Bormholtgard, Ry (Denmark); lffa Credo, L'Abresle (France)) でin vivo実験を実施した。ウイルス抗体（マウス肝炎ウイルス、レオウイルス、パロウイルス）について、実験を始める前に動物を調べた。この実験において陰性の抗体力価のみをもつ動物を使用した。

実験動物の保管
動物を完全エアーコンディション動物ケージの中で20〜24℃の室温、50〜70％の相対大気湿度及び12時間日夜のリズムで保管した。層流箱は動物ケージの中の空気が１時間当り15〜20回交換されることを確実にした。動物に標準食（Ssniff Soest) を与え、そしてドリンキングボトルを介して水を自由に与えた。

実施例10：
細胞培養法
ａ．細胞系の低温保存
低温保存のため、細胞をRPMI 1640 培地の中で５×10⁶ 細胞／mlの細胞密度に調整し、そしてMinifuge Tで1600rpm で10min 沈降させた。次に、細胞沈降物を等容量の低温保存用培地の中に入れた。細胞沈降物の懸濁後、１mlの細胞懸濁物をそれぞれクライオ・チューブ(1.8ml）に移し、そして−70℃で２ｈ凍結しておいた。このクライオ・チューブを最終保管のために液体Ｎ₂ を含むサーモ容器に移した。

低温保存用培地 60％（ｖ／ｖ）のRPMI 1640 培地
0.05mMの２−メルカプトエタノール
100 Ｕ／mlのペニシリン
100 μｇ／mlのストレプトマイシン
30％（ｖ／ｖ）の胎児牛血清
10％（ｖ／ｖ）のDMSO

ｂ．タイプ培養及び増殖条件
CEM-SS細胞の培養
懸濁細胞系CEM-SSをRPMI 1640 改善培地Ｉの中で培養した。このため、１×10⁷ 個の細胞を50mlの培地を含む組織培養フラスコ（83cm² ／260ml)に移し入れた。次にこの培養物を37℃及び５％のCO₂ で３日間インキュベートした。細胞継代のため、細胞を滅菌ピペットで組織培養フラスコから取り出し、そしてMinifuge Tで1600rpmで10分沈降化させた。細胞を培養培地に再懸濁し、そしてNeubauerカウンティングチャンバーでエオシン染色により細胞数を決定後、継代のために１×10⁷ 個の細胞を用いて50mlの新鮮培地に入れた。

P3X63Ag8.653細胞の培養
P3X63Ag8.653細胞 をRPMI 1640 完全培地Ｉの中で単層として培養した。このため、５×10⁶ 個の細胞を40mlの培地を含む組織培養フラスコ（83cm² ／260ml)に移した。この細胞培養物を37℃及び５％のCO₂ で、組織培養フラスコの底が集密細胞単層で覆われるまで５日間インキュベートした。細胞継代のため、付着細胞をセルスクラッパーを用いてフラスコの底から機械的に剥し、次いでMinifuge Tの中で1600rpm で10分の遠心分離により沈降化させた。培養培地の中で細胞を再懸濁させた後、細胞数をNeubauerカウンティングチャンバーの中でのエオシン染色により決定し、そして５×10⁶ 細胞を継代のために用い、40mlの新鮮培地に入れた。

ｃ．細胞数の決定
Neubauerカウンティングチャンバーでのエオシン染色による細胞数の決定（Lindl 及びBauer, 1989,「Zell und Gewebekultur 」,p75-70, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York)
懸濁物及び単層培養物中の細胞数の決定のため、 0.1〜１×10⁶ 細胞／mlの細胞濃度を、PBS の中で調整し、そしてこの細胞懸濁物の一部を20μｌのエオシンと混合した。次に、細胞懸濁物を静かにピペットで混合し、室温で２min インキュベートし、そしてNeubauerカウンティングチャンバーに移した。細胞数を逆位相差顕微鏡でこのインキュベーション時間の直後に決定し、これでは細胞を４つの大きな四角形内で測定する。この方法において、生きた細胞は死んだ細胞と異なり、染色されない。弱く染まった細胞は死んだ細胞と考える。

生きた細胞の数／mlは、大型の四角形の非染色細胞数にチャンバー係数４及びエオシン溶液中の細胞懸濁物の希釈係数を乗じたものである。

Coulter カウンターでの電子測定による細胞数の決定（Lindl 及びBauer, 1989)
Coulter カウンターでの細胞数の測定は２枚のプラチナ電極の間の細胞流動に基づく。細胞が２本の電極の通路を通ると、電極間を流れる電流の抵抗が細胞のサイズに比例して変動する。これは電圧インパルスを発生させ、それは記録され、それ故細胞の定量化を可能にする。

細胞数を決定するめた、25μｌの細胞懸濁物をCoulter カウンター用の担体液Iso-Osmol ３mlに移し、そしてこの装置に注入した。

このタイプの細胞計測においては、細胞懸濁物の全細胞数が決定される。生きた及び死んだ細胞との区別はできない。

ｄ．トリプシン／EDTAによる付着細胞の脱離
付着細胞は対応の培養槽の底からトリプシン／EDTAによる処理により酵素的に脱離させることができる。このため、培養上清液を静かにデカンテーションし、そして細胞を温めておいた（37℃）培養培地で２回洗った。際を保を培養槽の底から脱離させるため、これらをトリプシン／EDTA溶液（１×）と室温で５分インキュベートした。トリプシン／EDTA溶液の容量は、対応の培養槽の底が２〜３mmの酵素溶液で覆われるようにこの場合選んだ。インキュベーション時間の終了時に、フラスコを静かに振ることにより細胞を底から脱離させ、培養槽から取り出し、そして等容量のRPMI 1640 完全培地Ｉと混合した。その後、細胞をMinifuge Tの中で1600rpm で10分沈降させた。その上清液を捨て、細胞沈降物を低温PBS の中に再懸濁し、そして再び同一条件下で遠心分離させた。次いで細胞をその更なる用途に依存して培養培地又はバッファーの中に再懸濁した。

ｅ．ヒト血液からの単核細胞の単離
等張密度勾配中での遠心分離によるバッフィーコートからのヒトPBL の単離（Boeyum, 1968, Scand, J. Clin. Lab. Invest. 21（付録97）,77-89; Boevum 1976, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 5（付録５), 5-15)
ヒトPBL を単離するため、健康なドナーのバッフィーコートをRPMI 1640 完全培地IIと１：２の容量比で混合及び希釈した。20mlの低温リンパ球分離培地をポリプロピレンチューブ（50mm）に移し、そして15mlの希釈バッフィーコートの層で静かに覆った。分画はMinifuge Tでの室温で30分、1600rpm （加速４回／ブレーキ４回）での遠心分離により実施した。サンプルと分離培地との間の容易に目に見えるバンドをCombitipピペットで単離した。集めた画分を室温及び1600rpm で10分かけて沈降させ、分離培地を除いた。上清液をデカンテーションし、そして細胞をその用途に応じてRPMI 1640 完全培地II又は低温PBS で３回洗った。

ヒトPBL の刺激及び培養
等張密度勾配での遠心分離によるヒトPBL の単離を経て、末梢リンパ球培養物を用意することが可能となった。正常血液細胞は培養中に比較的早く死んでしまう。しかしながら、リンパ球は何世代にもわたって培養し続けることができる。これらの細胞の増殖を達成せしめるため、細胞をマイトジエンPHA-M 、即ち、ベニバナインゲン（red scarlet runner)(Phaseolus vulgaris) 由来のレクチン抽出物で刺激した。

刺激のため、単離細胞を組織培養フラスコ（175cm²／800ml)の中でRPMI 1640 完全培地II中で１×10⁶ 細胞／mlの細胞密度を調整し、そして37℃及び５％のCO₂ で72ｈインキュベートした。細胞密度が高すぎてしまうことを避けるため、24ｈ後に細胞懸濁物を培養培地で１：１の容量比で希釈した。刺激期間の経過後、マイトジエンPHA-M をRPMI 1640 完全培地IIで３回洗うことにより除去した。細胞増殖のため、刺激化リンパ球をRPMI 1640 完全培地IVの中で５〜７×10⁶ 細胞／mlの細胞密度に調整し、そして24時間培養した。

全血からの白血球濃厚血漿の調整（Boeyum, 1968)
健康なドナー由来の静脈鮮血を無菌の10％（ｗ／ｖ）のEDTA溶液と49：１の容量比で混合し、凝血を防いだ。これらの成分の迅速混合を成し遂げるため、ドナー由来の少容量の８〜９mlの血液をポリスチレンチューブ（14ml）の中に集めた。白血球濃厚血漿を調製するため、EDTA−血液及びデキストラン75を10：１の容量比で混合した。この２成分をよく混合し、そして赤血球を室温で60分かけて沈降化させた。次にほぼ透明となった上清液である白血球濃厚血漿を静かに取り出し、そして単球の単離に用いた。

高張密度勾配での遠心分離による白血球濃厚血漿からのヒト単球の単離（Boeyum, 1983, Scan, J. Clin. Lab. Invest. 17, 429-436）
高張溶液中の全血又は白血球濃厚血漿から非刺激単球を単離することが可能であった。このため、３mlの高張分離培地NycoPrep 1.068をポリスチレンチューブ（14ml）に入れ、そして６mlの白血球濃厚血漿層で静かに覆った。このチューブに栓をし、そしてMinifuge Tで 600ｇで15分（４回の加速／４回のブレーキ）遠心分離した。遠心分離後、透明な血漿相を除去し、そしてブロードな拡散バンドの上５mmまで捨てた。残りの血漿相及びブロードな拡散バンドの半分を除去し、そして細胞を同一条件下でのMinifuge Tでの遠心分離により沈降化させた。細胞沈降物を次に再懸濁し、そして６mlの洗浄溶液で２回洗い、分離培地の残渣を除去した。

Nycoprep 1.068 13％（ｗ／ｖ） Nycodenz
0.58％（ｗ／ｖ） NaCl
５mM トリシン／NaOH pH7.4
密度 1.068 ±0.001 ｇ／ml
（20℃）
浸透圧 335 ±５mOsm
洗浄溶液 0.9 ％（ｗ／ｖ） NaCl
0.13％（ｗ／ｖ） EDTA
１％（ｗ／ｖ） BSA （画分Ｖ）

付着によるバッフィーコートからのヒト単球の単離（Andreesen ら, 1983, J. Immun. Methods 56, 295-304)
等張密度勾配での遠心分離によりバッフィーコートから単核細胞を単離し、そして無血清RPMI 1640 培地で３回洗った。単球を単離するため、細胞を20mlのRPMI 1650 完全培地IIを含む組織培養フラスコ（175cm²／800ml)の中で５×10⁶ 細胞／mlの細胞密度に調整し、そして37℃及び５％のCO₂ で45分インキュベートした。非付着細胞を、インキュベーションの終了後、培地をデカンテーションすることにより除去した。組織培養フラスコの底にある細胞層を次に予め温めておいた（37℃）無血清RPMI 1640 培地で２回洗って懸濁細胞の残渣を除去した。細胞層を30mlのRPMI 1640 完全培地Ｖと混合し、そして同一の条件下で更に24ｈインキュベートした。付着単球をトリプシン／EDTAによる処理により脱離させた。

実施例11：
免疫学的方法
ａ．直接及び順次式抗体染色によるヒト血液由来の細胞サブ集団のフローサイトフルオロメトリー分析
フローサイトフルオロメトリー分析のため、特性決定すべき細胞をFACS-PBSの中で１×10⁷ 細胞／mlの細胞密度に調整した。抗体ストック溶液をFACS-PBSで１：50の容量比に希釈した。直接及び順次式抗体染色のため、50μｌの細胞懸濁物（１×10⁷ 細胞／ml）を円錐形の底をもつマイクロタイタープレートのウェルに入れた。

単核ヒト血液細胞のフローサイトフルオロメトリー分析のための抗体

次に、細胞懸濁物を、直接抗体染色を蛍光色素と組合せるとき、等容量の抗体と混合した。この混合物を４℃で30分インキュベートし、次いでMinifuge Tで1,400rpmで室温にて２分遠心分離し、細胞を沈降化させた。

その上清液を除去し、そして細胞沈降物を 200μｌのFACS-PBSの中に再懸濁し、そして上記の通りに再度遠心分離して未結合抗体の残渣を除去した。その上清液を除去し、そして細胞沈降物を、直接抗体染色の場合、 100μｌのFACS-PBSに再懸濁した。順次式抗体染色の場合、細胞沈降物を、細胞沈降物の完全な遠心分離の後にフィコエリトリンでラベルしたヤギ抗マウス Ig-R-PE（３μｇ／ml）の抗体溶液 100μｌに入れ、そして４℃で30分インキュベートした。未結合抗体の残渣を 200μｌのFACS-PBSによる洗浄により上記の通りに除去し、そして細胞沈降物をフローサイトフルオロメトリー細胞分析のために 100μｌのFACS-PBSの中に再懸濁した。

ｂ．フローサイトフルオロメトリー分析器でのプロピジウムヨージド染色による細胞生存の決定
生存及び死んだ細胞の数は蛍光色素プロピジウムヨージドによる細胞の染色後にフローサイトフルオロメトリー分析により決定できうる。この色素は生存細胞によってのみ取り込まれる。このため、細胞懸濁物をPBS で 0.5〜１×10⁶ 細胞／mlの濃度に調整した。 180μｌをこの細胞懸濁物から取り出し、そして20μｌのプロピジウムヨージド溶液（５μｇ／ml）と混合した。５min のインキュベーション後、 100μｌの溶液を細胞分析器に注入した。生存及び死んだ細胞のパーセンテージ分布は細胞分析器のLysis IIプログラムでの統計分析により決定できる。

ｃ． ¹²⁵ I-AZTラジオイムノアッセイによる細胞抽出物中のAZT の定量決定
市販の¹²⁵I-AZT RIA検査キットをAZT の定量決定のために用いた。バッファー及び溶液はその製造者の仕様書に従って調製し、そしてその検査キットに用いた。反応混合物を以下の示す系列（表）に従って分注し、静かに混合し、そして室温で２ｈインキュベートした。次いで 500μｌのヤギ抗ウサギ抗体を加えて¹²⁵I-AZTとAZT 抗体（ウサギ由来）との複合体を沈殿させた。その混合物を混合し、そして室温で更に30分インキュベートした。

細胞抽出物中のAZT の定量決定のための¹²⁵I-AZTラジオイムノアッセイの分注系列

この混合物を1000ｇで20分遠心分離して沈殿複合体を沈降させた。上清液のデカンテーション後、この沈降物の放射能を液体シンチレーション分析器で 60sec測定した。絶対値を決定するため、 100μｌの¹²⁵I-AZTの放射能を室温で２ｈのインキュベーション後、同じ条件下で決定した。生物マトリックス中のAZT の濃度を、規定の物質の濃度を有する検査キットの標準品より樹立した検量曲線により決定した。

実施例12：
BM 21.1290Naの細胞内酵素切断の特性決定
刺激化及び非刺激ヒトPBL 並びにチミジンキナーゼ欠損P3X63Ag8.653細胞におけるAZT-DMDOPE及びAZT についてのin vitro薬理動力学的研究の結果は、AZT-MP及び対応のチオエーテル脂質成分DMDOPの直接遊離を伴うAZT-DMDOPEの細胞内酵素切断を示唆する。それはこの細胞内酵素切断を確証することを意図し、対応の代謝物の直接検出によるサブ細胞レベルでの更なる実験において実証される。従い、切断の明確な特性決定のため、親物質AZT-DMDOPEより生成されうる既知の代謝物の同定が必須であった。これらには物質DMDOP ，AZT 及びAZT-MP、並びに親物質AZT-DMDOPEのチオエーテル脂質成分中の硫黄の酸化により生成される物質が含まれる。

ａ．AZT-DMDOPE及びその潜在的な代謝物のＲ _f 値の決定のための方法の開発
TLC によりAZT-DMDOPEの潜在的代謝物を同定することが可能である。このため、非放射能ラベルした純粋な物質を様々な分離系により分析し、そしてＲ_f 値を決定した。

このため、物質を酢酸エチルとメタノールとの混合物（１：１／ｖ／ｖ）の中に４mg／mlの濃度で溶かした。５μｌのこの溶液を毛細現象により定常相に移し、そして分析した。

チオエーテル脂質、例えばAZT-DMDOPE，DMDOP 及び硫黄の酸化により生成されるものは、これらの化合物のチオエーテル脂質成分を染色するヨウ素を含む試薬によりラベルできる。AZT 及びAZT-MPは、紫外域における 254nmでのその吸収に基づき、蛍光インジケーターによりTLC プレート上でのみ可視化できうる。チオエーテル脂質成分及び発色団を有する物質であるAZT-DMDOPEは両タイプの検出法により検出されうる。

３通りの分離系を物質の薄層クロマトグラフィー分析のために樹立し、それらはその定常及び移動相に関して相違し合う。

定常相としてシリカゲル60を用いる第一の分離系IBA 系においては、親物質AZT-DMDOPEがDMDOPEに加えて同定されうる。２−プロパノール：ｎ−ブチルアセテート：再蒸留水（10：６：４ ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を移動相として使用した。

この分離系を移動相として２−プロパノール：ｎ−ブタノールアセテート：再蒸留水：氷酢酸（３：５：１：１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いることによって更に開発した（IBAE系）。物質AZT-DMDOPE及びDMDOP はこの場合、IBA 分離系について記載した通りにして、シリカゲル60TLC プレート上で分離しうる。更に、AZT 及びAZT-MPは 254nmのUV光においてシリカゲル60の定常相を用い蛍光インジケーターにより分離できうる。AZT 成分は寄因して、親物質AZT-DMDOPE及びその酸化生成物を検出することも可能である。

物質がTLC プレート上で可視化されたら、Ｒ_f 値を決定する。

物質AZT-DMDOPEをDMDOP から区別する更なる分離系ができた。このため、ｎ−ヘプタンと酸酸エチル（４：１，ｖ／ｖ）との混合物を移動相として、そしてシリカゲル60を定常相として用いた。検出は物質のチオエーテル脂質成分を染色することにより既に上記したヨウ素含有試薬により実施できる。

IBA 及びIBAE系と比べ、この分離系では物質DMDOP に関してかなり低いＲ_f 値が決定された。この理由は、ｎ−ヘプタン及び酢酸エチルより成るIBA 及びIBAE系と比べてこれが非極性な移動相であるためである。薄層クロマトグラフィー分析及びヨウ素含有試薬による検出後の物質の検出限界は全ての分離系において、 0.1μｇと決定された。

まとめると、記載の薄層クロマトグラフィー分離系により、AZT-DMDOPEの潜在的代謝物としての現状の認識状態を考慮し、そのＲ_f 値を介して全ての物質を明確に特性決定することが可能である。

表 IBA 系において分離後のAZT-DMDOPE及びDMDOP のＲ_f 値（２−プロパノール：ｎ−ブチルアセテート：再蒸留水 10：６：４ｖ／ｖ／ｖ；定常相としてシリカゲル60を使用（平均±SD，ｎ＝６回の測定))

表 IBAE系において分離後のAZT-DMDOPE，DMDOP ，AZT 及びAZT-MPのＲ値（２−プロパノール：ｎ−ブチルアセテート：再蒸留水：氷酢酸 ３：５：１：５ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ；定常相としてシリカゲル60及び60F 254 を使用（平均±SD，ｎ＝６回の測定))

ｂ．刺激化及び非刺激ヒトPBL 及びCEM-SS細胞の細胞ホモジネートによるAZT-DMDOPEの酵素切断
AZT-DMDOPEの切断を媒質として [¹⁴C]-AZT-DMDOPE 及びAZT-DMDOPEを用いる酵素アッセイにより調べた。まずCEM-SS細胞及びヒトPBL の細胞ホモジネート物を酵素源として用いた。

表 HE系において薄層クロマトグラフィー分離後のAZT-DMDOPE及びDMDOP のＲ_f 値（ｎ−ヘプタン：酢酸エチル ４：１（ｖ／ｖ）；定常相としてシリカゲル60を使用（平均±SD，ｎ＝６回の測定))

後者を、PHA-M による刺激の後に及び非刺激状態でその単離を行った直後にホモジナイズし、そして酵素アッセイに用いた。

細胞ホモジネート物を調製するため、細胞懸濁物をガラスホモジナイザーの中で５×10⁷ 個の細胞／50mMのトリス（pH7.4)1 mlの密度において機械的に破砕した。この場合、細胞破砕は逆位相差顕微鏡で光学的にモニターした。

表 １，３，６及び24ｈのインキュベーション並びに５×10⁷ 個の刺激及び非刺激ヒトPBL 及びCEM-SS細胞の細胞ホモジネート物による [¹⁴C]-AZT-DMDOPE による酵素切断の後の物質１〜４のＲ_f 値（図18）。定常相としてシリカゲル60を用いて IBA／IBAE系で分離（平均±SD，ｎ＝４回の測定）

まず１mlの細胞ホモジネート物を、タンパク質濃度の事前決定の前に酵素アッセイにおいて用いた。0.98nmol [¹⁴C]-AZT-DMDOPE (1.67kBq）を基質として用いた。

基質飽和を確実にするため、更に50nmolの非放射能ラベル化合物を加えた。 [¹⁴C]-AZT-DMDOPE はチオエーテル脂質成分の中に放射能ラベルを担持し、それ故潜在的な代謝物 [¹⁴C]-DMDOPの明確な同定を可能にする。

これらの混合物を37℃の湯浴の中で１，３，６及び24ｈインキュベーションした。細胞ホモジネート物の添加抜きの混合物も対照として実施した。次いで、この切断生成物をジエチルエーテル：２−プロパノール（９：１，ｖ／ｖ）で抽出し、そしてIBA 及びIBAE系において薄層クロマトグラフィーにより分析した（図18) 。この物質を分離後、TLC プレートをラジオTLC 分析器で15分測定し、放射能ラベル物質を検出した。最終的に、Ｒ_f 値を決定することによって代謝物を明確に同定することが可能であった。

表 [¹⁴C]-BM 21.1290 Naの１，３，６及び24ｈインキュベーション後の物質１及び２のＲ_f 値（図18）。定常相としてシリカゲル60を用いる IBA／IBAE系で分離（平均±SD，ｎ＝４回の測定）

刺激化及び非刺激ヒトPBL の細胞ホモジネート物によるAZT-DMDOPEの酵素切断生成物の薄層クロマトグラフィー分析をIBA 分離系を用いて実施した。CEM-SS細胞ホモジネート物による次の実験において、切断生成物の分析をIBAE分離系において実施した。純粋な物質のＲ_f 値が双方の分離系に関して決定できたため、AZT-DMDOPEの酵素切断の後にその物質を同定するためにその結果を直接比較することが可能であった。

刺激化及び非刺激ヒトPBL の細胞ホモジネート物による [¹⁴C]-AZT-DMDOPE の酵素切断の後、３種類の未知の物質をTLC クロマトグラフィーにおいて検出した。刺激化及び非刺激ヒトPBL についての0.65±9.5 ×10^-2（ｎ＝４）及び0.65±1.7 ×10^-2（ｎ＝４）のＲ_f 値により、物質ピーク２は親物質 [¹⁴C]-AZT-DMDOPE に明確に属しうる。0.94±0.00（ｎ＝４）及び0.92±1.2 ×10^-2（ｎ＝４）の物質ピーク４のＲ_f 値は、純粋物質のTLC 分析により決定されたDMDOP の値と同じであった。0.86±5.8 ×10^-3（ｎ＝４）のＲ_f 値を有する物質ピーク３は既知の物質のいづれにも該当しなかった。その結果はCEM-SS細胞ホモジネート物による [¹⁴C]-AZT-DMDOPE の酵素切断の分析により確認した。0.56±2.5 ×10^-2（ｎ＝４）及び0.96±0.00（ｎ＝４）のＲ_f 値を有する物質ピーク２及び４はAZT-DMDOPE及びDMDOP として明確に同定され得、一方0.41±2.5 ×10^-2（ｎ＝４）のＲ_f 値を有する物質ピーク１は酸化生成物に該当し得た。Ｒ_f 値の比較の後のIBAE系においてさえも物質ピーク３を割り当てることができなかった（図18）。更に、 [¹⁴C]-AZT-DMDOPE のインキュベーション後、細胞ホモジネート物を加えなかったとき、親物質のみが検出されることを示すことができた（図18）。

この反応混合物の薄層クロマトグラフィーは従って親物質から物質DMDOP が遊離することを証明した。

実施例13：
９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−２−フルオロアデニン−５−リン酸（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル（フルダラビンコンジュゲート）
34.8ｇ（0.07mol)のリン酸（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステルを 130mlの無水ピリジンに溶かし、窒素下で15ｇのメタンスルホン酸クロリドと混ぜ、そして室温で３時間撹拌した。

次いで20ｇのフルダラビンを静かに加え、そしてこの溶液を室温で更に48時間撹拌した。フルダラビンはJ. Heterocyclic Chem. 16, 157 (1979)に類似して合成した。

30mlの１Ｍのトリエチルアンモニウムビカーボーネート溶液の添加及び１時間の撹拌による反応混合物の加水分解後、ピリジンを真空で除去し、そしてその残渣を 200mlのｔ−ブチルメチルエーテル(MTB) 及び 150mlの水に分配し、有機相を分け、そしてロータリーエバポレーターでエバポレーションした。

その残渣をRP-18 で溶出液としてのメタノール／0.02Ｍの酢酸バッファーpH４（８／２）を用いるクロマトグラフィーにより精製した。

生成物含有画分を水部分に至るまで濃縮し、MTB で抽出し、そしてMTP 相をフリスコリット(Friscolyt) に対するナトリウムメチレート溶液によりpH７に調整した。

溶媒をエバポレーションにより除去後、その残渣をアセトンに懸濁し、アモルファス沈渣を吸引濾過し、そして乾かした。

収量：23.7ｇ（43％）。アモルファス。Ｒ_f ＝0.45(TLC−移動溶媒：イソプロパノール／ブチルアセテート／水／アンモニア 50／30／15／５）。

実施例14：
２−クロロ−２′デオキシアデノシン−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル（クラドリビンコンジュゲート）
クラドリビンコンジュゲートは実施例14に類似して、 4.2ｇのリン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル、３ｇのメタンスルホン酸、 100mlのピリジン及び２ｇのクラドリビンを用いて35％の収率で調製した。Ｒ_f ＝0.41（移動相は実施例14と同）。クラドリビンはJ. Am. Chem. Soc. 106, 6379(1984)に記載と類似して調製した。

実施例15：
〔３−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）−３，６，７，８−テトラヒドロイミダゾ〔４，５−ｄ〕〔１，３〕ジアゼピン−８−オル〕−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル（ペントスタチンコンジュゲート）
ペントスタチンコンジュゲートは実施例13に類似して、 4.2ｇのリン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル、３ｇのメタンスルホン酸、 100mlのピリジン及び 2.1ｇのペントスタチンを用いて27％の収率で調製した。Ｒ_f ＝0.52（移動相は実施例14と同）。ペントスタチンはJ. Org. Chem. 47, 3457 (1982) 及びJ. Am. Chem. Soc. 101, 6127 (1979)に記載と類似して調製した。

蛋白質濃度に関連したヒトのPHA 刺激された末梢血液白血球の膜画分から得られたLCE の活性を示す。蛋白質濃度と形成された切断産物の量との間に直線関係がある。 ヒトのPHA 刺激された末梢血液白血球の膜画分から得られたLCE の基質速度（ミカエリス−メンテン速度）を示す。 ヒトのPHA 刺激された末梢血液白血球の膜画分（黒四角）及び静止（非刺激）末梢血液白血球（□）から得られたLCEの基質速度（オカエリス−メンテン速度）を示す。 人のPHA 刺激された末梢血液白血球の膜画分から得られたLCE の特異酵素活性のカルシウムイオン濃度への依存性を示す。 未処理のイヌにおける細胞膜調製物のLCE の器官特異的及び組織特異的分布を示す。 以下の（Ａ),（Ｂ）と一緒の１，３，６及び24時間のインキュベーション後の刺激されたヒトPBL におけるAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度： （Ａ）0.03μｇ AZT/ml(黒四角）又は１μｇ AZT-DMDOPE/ml（□） （Ｂ）0.3 μｇ AZT/ml(黒四角)又は10μｇ AZT-DMDOPE/ml（□） （平均、ｎ＝２測定）。 以下の（Ａ),（Ｂ）と一緒の１，３，６及び24時間のインキュベーション後の刺激されていないヒトPBL におけるAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度： （Ａ）0.03μｇ AZT/ml(黒四角）又は１μｇ AZT-DMDOPE/ml（□） （Ｂ）0.3 μｇ AZT/ml(黒四角)又は10μｇ AZT-DMDOPE/ml（□） （平均、ｎ＝２測定）。 １μｇ AZT-DMDOPE／ml（Ａ）及び10μｇ AZT-DMDOPE／ml（Ｂ）と共に６及び24時間、インキュベーションした後の刺激されたヒトPBL におけるAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度： 黒四角アルカリホスフェートでの処理 □アルカリホスフェートでの処理なし （平均、ｎ＝測定）。 以下の（Ａ),（Ｂ）と共に６，24及び48時間インキュベーションした後のP3X63-Ag8.653 細胞内のAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度： （Ａ）0.03μｇ AZT/ml(黒四角）又は１μｇ AZT-DMDOPE/ml（□） （Ｂ）0.3 μｇ AZT/ml(黒四角)又は10μｇ AZT-DMDOPE/ml（□） （平均、ｎ＝２測定）。 １μｇ BM21.1290Na／ml（Ａ）及び10μｇ AZT-DMDOPE／ml（Ｂ）と共に６及び12時間、インキュベーションした後のP3X63-Ag8.653 細胞中のAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度： 黒四角アルカリホスフェートで処理 □アルカリホスフェートでの処理なし （平均、ｎ＝測定）。 0.3μｇ AZT／ml（Ａ）又は10μｇ AZT-DMDOPE １ml（Ｂ）と共に24時間、インキュベートした後の刺激されたヒトPBL 中のAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内崩壊速度。AZT 又はAZT-DMDOPEインキュベーション溶液を除去した後、１，３，６，24及び48時間後のAZT 及びAZT ヌクレオチドの細胞内濃度（平均、ｎ＝２測定）。 刺激されたヒトPBL の膜画分(100μｇ蛋白質／調製物）による（¹⁴C)-AZT-DMDOPE の酵素切断。シリカゲル60Ｈへの基質の吸着及び定常相としてシリカゲル60を用いるIBA システム（２−プロパノール：ｎ−ブチルアセテート：再蒸留水、10：６：４，ｖ／ｖ／ｖ）における分離の後のｎ−ヘプタン相の薄層クロマトグラム。 刺激されたヒトPBL の細胞ホモジネート、細胞質及び膜画分中のLCE の特異活性（pmol・ng^-1・ min ^-1）（平均±SD，ｎ＝６測定）。 蛋白質濃度に対する刺激されたヒトPBL の膜画分によるAZT-DMDOPEの切断（平均±SD，ｎ＝３測定）。 蛋白質濃度に対するヒト単球／マクロファージ（刺激された単球）の膜画分によるAZT-DMDOPEの切断（平均、ｎ＝２測定）。 刺激された及び刺激されていないヒトPBL の、並びにヒト単球及び単球／マクロファージ（刺激された単球）の膜画分におけるLCE の特異活性 （ヒトPBL ：平均±SD，ｎ＝６測定） （ヒト単球：平均±SD，ｎ＝４測定）。 インキュベーション時間に対する刺激されたヒトPBL の膜画分によるAZT-DMDOPEの切断（平均±SD，ｎ＝３測定）。 37℃で６時間のインキュベーション後の [¹⁴C]-AZT-DMDOPE の（Ａ）、及び５×10⁷ CEM-SS細胞の細胞ホモジネートによる酵素切断後の [¹⁴C]-AZT-DMDOPE の薄層クロマトグラム。ジエチルエーテル：２−プロパノール（９：１，ｖ／ｖ）でのチオエステル脂質の抽出及び定常相としてシリカゲル60を用いるBAE システム（２−プロパノール：ｎ−ブチルアセテート：再蒸留水：氷酢酸、３：５：１：１，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）における分離。

Claims (42)

1. ホスリパーゼＣ活性をもたない脂質切断酵素複合体(LCE) であって、コンジュゲートAZT-DMDOPE〔（３′−デオキシ−３′−アジドチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシル−メルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル〕をAZT-MP〔３′−デオキシ−３′−アジドチミジン−モノホスフェート〕及びDMDOP 〔（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロパノール〕へと切断せしめるか、又はコンジュゲートFLT-DMDOPE〔（３′−デオキシ−３′−フルオロチミジン）−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル〕をFLT-MP〔３′−デオキシ−３′−フルオロチミジン−５′−モノホスフェート〕及びDMDOP へと切断せしめるか、又はコンジュゲート5-FU-DMDOPE 〔５−フルオロウリジン−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシ）−プロピルエステル〕を5-FU-MP 〔５−フルオロウリジンモノホスフェート〕及びDMDOP へと切断せしめる、前記LCE 。
2. 白血球、単球、腫瘍細胞、腎細胞、リンパ球、免疫／リンパ系の細胞又はマクロファージから得られるものである、請求項１記載のLCE 。
3. in vitro試験手順を実施するための単離されたサブ細胞系であって、請求項１又は２のいづれか１項記載の酵素が濃厚であるサブ細胞系。
4. 適当なin vitro試験系において前記LCE の基質、リガンド、インヒビター又はアクチベーターを発見又は同定するための請求項１又は２のいづれか１項記載の酵素の利用。
5. 適当なin vitro試験系において前記LCE の基質、リガンド、インヒビター又はアクチベーターを発見又は同定するための請求項３記載の酵素の利用。
6. 請求項１又は２のいづれか１項記載のLCE の基質、リガンド、インヒビター又はアクチベーターを担う化合物を発見するための方法であって、前記切断生成物を適当な試験系において検出する方法。
7. LCE 類似体の発見のための方法であって、請求項６記載の方法において発見した化合物をスクリーニング系において使用する、方法。
8. 請求項７記載の方法により得られるLCE 類似体。
9. 請求項１，２又は８のいづれか１項記載のLCE 又はLCE 類似体であって、Ｌ−Ｂ−Ｄタイプのコンジュゲートの場合（式中、Ｌは脂質様残基を表わし、Ｂはホスフェート結合又はチオホスフェート結合を表わし、そしてＤは薬理学的に活性な物質を表わすか、又はＢ−Ｄは活性物質ホスホネートを表わす）、その酵素が脂質成分Ｌと残基−Ｂ−Ｄとの間の共有結合の切断を誘導するものである、LCE 又はLCE 類似体。
10. 前記コンジュゲートを切断するうえでの前記酵素の活性が、非活性化細胞と比べ、活性化免疫細胞、ヒト白血球、単球、腫瘍細胞、リンパ球、腎細胞、免疫／リンパ系の細胞又はマクロファージにおいて２倍以上高いものである、請求項１，２，８又は９のいづれか１項記載のLCE 又はLCE 類似体。
11. 前記酵素の活性がCa²⁺, Zn²⁺又はMn²⁺により阻害される、請求項１，２又は８〜10のいづれか１項記載のLCE 又はLCE 類似体。
12. 適当な標的細胞における残基−Ｂ−Ｄの標的化遊離のための薬剤を製造するための脂質誘導体と薬理学的に活性な物質との共有コンジュゲートの利用であって、ここでこの共有コンジュゲートの脂質成分の作用はこのコンジュゲートを細胞、組織又は器官に対して標的化せしめること及びこれらの標的細胞の細胞膜にわたってこのコンジュゲート又は残基−Ｂ−Ｄを輸送せしめることにあり、ここで前記コンジュゲートが請求項１，２又は９〜11のいづれか１項記載の膜系酵素により切断され、残基−Ｂ−Ｄ又はＤの特異的な細胞内蓄積をもたらしめるものである、前記利用。
13. 前記共有コンジュゲートが本質的に前記膜の上でもしくは中で、又は対応の標的細胞の中で切断されるものである、請求項12記載の利用。
14. 前記薬剤が、脂質には結合しない遊離残基−Ｂ−Ｄ又はＤの投与と比べて副作用を抑えるものである、請求項12記載の利用。
15. 血漿又は肝臓の中では前記コンジュゲートの有意な切断がない、請求項12又は13記載の利用。
16. 前記標的細胞がヒト白血球、単球、マクロファージ、免疫細胞、腫瘍細胞、又はリンパ系、腎臓、脾臓もしくは脳細胞である、請求項12又は13記載の利用。
17. 前記薬剤が、標的細胞中の残基−Ｂ−Ｄ又はＤの細胞内濃度を、リパーゼ残基に結合しない遊離−Ｂ−Ｄ又はＤの投与と比べ、少なくとも10％上昇させることができる、請求項12〜16のいづれか１項記載の利用。
18. 前記標的細胞中の活性物質の濃度が少なくとも50％上昇する、請求項17記載の利用。
19. 前記薬剤を、遊離な非コンジュゲーション型物質を含む投与形態と比べ、コンジュゲーションされた物質−Ｂ−Ｄ又はＤを低い当量含有量で含む投与単位において投与する、請求項12〜18のいづれか１項記載の利用。
20. 前記コンジュゲーションされた−Ｂ−Ｄ又はＤの当量含有量が遊離の非コンジュゲーション型物質を含む投与形態の50％未満である、請求項19記載の利用。
21. 薬理学的に活性な物質の器官毒性を抑えるための薬剤の製造のための請求項12〜19のいづれか１項記載の利用。
22. 薬理学的に活性な物質の骨髄毒性を抑えるための薬剤の製造のための請求項12〜20のいづれか１項記載の利用。
23. 薬理学的に活性な物質の心臓毒性、腎毒性、血液毒性、肝毒性又は神経毒性を抑えるための薬剤の製造のための請求項12〜20のいづれか１項記載の利用。
24. 薬理学的に活性な物質の血液−脳バリヤーの標的化輸送のための薬剤の製造のための請求項12〜20のいづれか１項記載の利用。
25. 前記薬理学的に活性な物質が脳細胞の中で蓄積するものである、請求項24記載の利用。
26. 前記薬理学的に活性な物質が、経口投与できる治療剤である、請求項24又は25記載の利用。
27. 前記コンジュゲートが式Ｌ−Ｂ−Ｄの活性物質であり、そしてＬが脂質成分であり、Ｂが単結合、ホスフェート結合又はチオホスフェート結合であり、そしてＤが薬理学的に活性な物質を表わすか、又はＢ−Ｄが活性物質ホスホネートである、請求項12〜26記載の利用。
28. 前記Ｌが式IIの残基を表わす
    

    

    （式中、
    Ｒ¹ は１又は複数個のハロゲン、Ｃ₅ −Ｃ₇ シクロアルキル、フェニル、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルキルメルカプト、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルコキシカルボニル、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルキルスルフィニル又はＣ₁ −Ｃ₆ アルキルスルホニル基により任意的に置換されていることのある１〜30個の炭素原子を有する直鎖又は枝分れした飽和又は不飽和アルキル鎖であり；
    Ｒ² は水素であるか、又は１もしくは複数個のハロゲン、Ｃ₅ −Ｃ₇ シクロアルキル、フェニル、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルキルメルカプト、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルコキシカルボニルもしくはＣ₁ −Ｃ₆ アルキルスルホニル基により任意的に置換されていることのある１〜20個の炭素原子を有する直鎖又は枝分れした飽和又は不飽和アルキル鎖であり；
    Ｘは単結合、酸素、硫黄、アミノカルボニル、オキシカルボニル、カルボキシアミノ、カルボニルオキシ、スルフィニル又はスルホニル基を表わし；
    Ｙは単結合、アミノカルボニル、オキシカルボニル、カルボニルアミノ、カルボニルオキシ、酸素、又は硫黄原子を表わし；そして
    ｍは１〜５の整数を表わす）、請求項27記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
29. 前記Ｒ¹ がＣ₁ −Ｃ₆ アルコキシ又はＣ₁ −Ｃ₆ アルキルメルカプト基により置換されていることのある直鎖又は枝分れしたＣ_{8 -15} アルキル、そして特にノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル又はテトラデシル基を表わす、請求項28記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
30. 前記Ｒ² がＣ₁ −Ｃ₆ アルコキシ又はＣ₁ −Ｃ₆ アルキルメルカプト基により置換されていることのある直鎖又は枝分れしたＣ_8-15アルキル、そして特にノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル又はテトラデシル基を表わす、請求項28又は29記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
31. 前記Ｘが硫黄原子、スルフィニル又はスルホニル基を表わす、請求項27〜30記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
32. 前記Ｙが酸素原子である、請求項27〜31のいづれか１項記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
33. 前記ｍが１又は２の数値である、請求項27〜32のいづれか１項記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
34. 前記ｍが１であり、ＸがＳであり、ＹがＯであり、Ｒ¹ がドデシル残基であり、そしてＲ² がデシル残基である、請求項27〜32のいづれか１項記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
35. 前記Ｘ及びＹが単結合を表わし、Ｒ² が水素であり、そしてＲ¹ がＣ₁ −Ｃ₆ アルコキシ又はＣ₁ −Ｃ₆ アルキルメルカプトにより任意的に置換されていることのあるＣ₁ −Ｃ₃₀アルキル鎖を表わす、請求項27記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
36. 前記Ｂが式III のホスフェート結合
    −O−［PZ(OH)A］− （III ）
    （式中、ｎは１，２又は３の数値を表わし、そしてＺはＯ又はＳであり、そしてＡはＯ，Ｓ又は単結合を表わす）を表わす、請求項27〜35のいづれか１項記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
37. 前記Ｄ又は−Ｂ−Ｄが抗ウイルス、抗レトロウイルス、細胞障害性、細胞増殖抑制性、抗腫瘍性、免疫抑制又は免疫刺激性物質の群から選ばれる薬理学的に活性な物質を表わす、請求項27〜36のいづれか１項記載の共有コンジュゲートＬ−Ｂ−Ｄの利用。
38. 標的細胞の中での物質−Ｂ−Ｄ又はＤの標的化遊離のための薬剤の製造のための方法であって、ここで前記標的細胞は請求項１，２又は８〜10のいづれか１項記載の脂質切断酵素又はLCE 類似体を含むものであり、下記の工程
    ａ）薬理学的に活性な物質を選択する；
    ｂ）この薬理学的に活性な物質と脂質様担体分子との共有コンジュゲートを作る；そして
    ｃ）ｂ）に従って作ったコンジュゲートと、更なる薬理助剤又は担体物質とを含む薬理投与形態を作る；
    を含んで成る方法。
39. 下記の物質の群から選ばれるタイプＬ−Ｂ−Ｄ（Ｉ）の式Ｉの脂質コンジュゲート：
    ２−フルオロ−９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシプロピル）エステル；
    ２−クロロ−２′−デオキシアデノシン−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシプロピル）エステル；
    ３−（２−デオキシ−ｂ−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３，６，７，８−テトラヒドロ−イミダゾ−〔４，５−ｄ〕〔１，３〕−ジアゼピン−８−オル−５′−リン酸−（３−ドデシルメルカプト−２−デシルオキシプロピル）エステル。
40. 脂質切断酵素の基質、リガンド、アクチベーター又はインヒビターの決定のための方法を実施するための請求項１，２又は８〜11のいづれか１項記載のLCE 又はLCE 類似体を含む診断薬。
41. 単離形態又は細胞調製品の中で濃縮された適量の請求項１，２又は８〜11のいづれか１項記載のLCE 又はLCE 類似体と、適当な安定化剤とを含む、酵素の基質又はリガンドを担う物質の発見のための剤。
42. 酵素活性又は酵素親和性が関係する対応の病気又は病的症状の酵素活性又は酵素親和性の上昇又は低下に基づく病理変化の決定のための請求項27記載の化合物を含む診断薬。

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